一种从海南粗榧中提取三尖杉碱的方法

摘要

本申请公开了一种从海南粗榧中提取三尖杉碱的方法，加入提取溶剂后以超声提取装置提取海南粗榧粉末得第一提取液，其中硫酸水溶液或甲醇溶液作为提取溶剂，可实现经济节约、环境友好，有利于实现工业化生产；将第一提取液进行离心后倒出上清液，重复执行加入提取溶剂、超声提取、离心、离心结束后倒出上清液操作1~4次，合并上清液得第二提取液，采用制备型高效液相色谱分离纯化三尖杉碱的方法，成功将第二提取液分离纯化出三尖杉碱单体，多次提取可增加三尖杉碱的提取质量、效率高，解决了现有三尖杉属植物中提取三尖杉碱均是采用乙醇等有机溶剂，成本高、不利于实现工业化生产，且分离纯化时多采用柱层析法，该方法溶剂用量大、效率低的技术问题。

说明书

技术领域

本申请涉及三尖杉碱提取方法技术领域，尤其涉及一种从海南粗榧中提取三尖杉碱的方法。

背景技术

海南粗榧是三尖杉科三尖杉属乔木，海南粗榧叶、枝、种子和根含有三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱等11种三尖杉酯类生物碱。三尖杉酯类生物碱抗肿瘤功效显著，在植物中含量极低，其天然产量不能满足市场需求，但大多数含有相同的核心骨架—三尖杉碱。因此从植物中提取获得三尖杉碱，再通过半合成的方法得到三尖杉酯类生物碱，有望解决三尖杉酯类生物碱的资源供应问题。现有三尖杉属植物中提取三尖杉碱均是采用乙醇、三氯甲烷等有机溶剂，成本高、不利于实现工业化生产，且分离纯化时多采用柱层析法，该方法溶剂用量大、消耗时间长、效率低。

发明内容

本申请提供了一种从海南粗榧中提取三尖杉碱的方法，用于解决现有三尖杉属植物中提取三尖杉碱均是采用乙醇、三氯甲烷等有机溶剂，成本高、不利于实现工业化生产，且分离纯化时多采用柱层析法，该方法溶剂用量大、消耗时间长、效率低的技术问题。

有鉴于此，本申请提供了一种从海南粗榧中提取三尖杉碱的方法，包括以下步骤：

步骤1、粉碎海南粗榧叶片后过筛备用；

步骤2、称取预置粒径大小的海南粗榧粉末置于离心管中，按照预置料液比加入提取溶剂，再放入超声提取装置中进行超声提取，得第一提取液，其中，提取溶剂为硫酸水溶液或甲醇溶液；

步骤3、将第一提取液放入离心装置中离心，离心结束后倒出上清液，重复执行加入提取溶剂、超声提取、离心、离心结束后倒出上清液操作1～4次，合并上清液，得第二提取液；

步骤4、通过UPLC-MS检测第二提取液中三尖杉碱的含量；

步骤5、使用制备型高效液相色谱分离法，从第二提取液中分离纯化出三尖杉碱单体。

可选地，在步骤1之前，还包括：

将采摘的海南粗榧叶片烘干至恒重。

可选地，步骤1具体包括：

将海南粗榧叶片放入粉碎机中粉碎，得到棕黄色均匀粉末，将棕黄色均匀粉末过10～200目标准检验筛，得到不同粒径的海南粗榧粉末，放入4℃恒温箱中保存备用。

可选地，硫酸水溶液的pH值为1.0～5.0。

可选地，硫酸水溶液的pH值为1.0。

可选地，步骤2中，料液比为1:20～1:60。

可选地，步骤3之后，步骤4之前，还包括：

将第二提取液稀释5倍后过0.22μm的微孔滤膜。

可选地，步骤2中，超声提取装置的超声功率为240～600W，提取温度为28℃～75℃，提取时间为10～40min。

可选地，步骤3中，离心装置的离心转速为10000r/min，离心时间为5min。

从以上技术方案可以看出，本申请实施例具有以下优点：

本申请中提供了一种从海南粗榧中提取三尖杉碱的方法，包括以下步骤：步骤1、粉碎海南粗榧叶片后过筛备用；步骤2、称取预置粒径大小的海南粗榧粉末置于离心管中，按照预置料液比加入提取溶剂，再放入超声提取装置中进行超声提取，得第一提取液，其中，提取溶剂为硫酸水溶液或甲醇溶液；步骤3、将第一提取液放入离心装置中离心，离心结束后倒出上清液，重复执行加入提取溶剂、超声提取、离心、离心结束后倒出上清液操作1～4次，合并上清液，得第二提取液；步骤4、通过UPLC-MS检测第二提取液中三尖杉碱的含量；步骤5、使用制备型高效液相色谱分离法，从第二提取液中分离纯化出三尖杉碱单体。

本申请提供的从海南粗榧中提取三尖杉碱的方法，加入提取溶液后以超声提取装置提取海南粗榧粉末获得第一提取液，其中硫酸水溶液或甲醇溶液作为提取溶剂，可实现经济节约、环境友好，有利于实现工业化生产；将第一提取液进行离心后倒出上清液，重复执行加入提取溶剂、超声提取、离心、离心结束后倒出上清液操作1～4次，合并上清液获得第二提取液，采用制备型高效液相色谱分离纯化三尖杉碱的方法，成功将第二提取液分离纯化出少量三尖杉碱单体，多次提取可增加三尖杉碱的提取质量，有利于提高提取率，且消耗时间短、效率高，解决了现有三尖杉属植物中提取三尖杉碱均是采用乙醇、三氯甲烷等有机溶剂，成本高、不利于实现工业化生产，且分离纯化时多采用柱层析法，该方法溶剂用量大、消耗时间长、效率低的技术问题。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

实施例1

本申请提供的一种从海南粗榧中提取三尖杉碱的方法的一个实施例，一种从海南粗榧中提取三尖杉碱的方法，包括以下步骤：

步骤1、粉碎海南粗榧叶片后过筛备用；

步骤2、称取预置粒径大小的海南粗榧粉末置于离心管中，按照预置料液比加入提取溶剂，再放入超声提取装置中进行超声提取，得第一提取液，其中，提取溶剂为硫酸水溶液；

步骤3、将第一提取液放入离心装置中离心，离心结束后倒出上清液，重复执行加入提取溶剂、超声提取、离心、离心结束后倒出上清液操作1～4次，合并上清液，得第二提取液；

步骤5、通过UPLC-MS检测第二提取液中三尖杉碱的含量；

步骤6、使用制备型高效液相色谱分离法，从第二提取液中分离纯化出三尖杉碱单体。

将采摘的海南粗榧叶片烘干至恒重，将海南粗榧叶片放入粉碎机中粉碎，得到棕黄色均匀粉末，将棕黄色均匀粉末过10～200目标准检验筛，得到不同粒径的海南粗榧粉末，放入4℃恒温箱中保存备用。在进行提取实验时，本申请实施例中选取过10目标准检验筛的海南粗榧粉末。

称取0.2g海南粗榧粉末置于15mL离心管中，按料液比为1:40加入8mL的硫酸水溶液(pH＝1)进行超声提取，超声条件：温度为28℃，时间为30min，功率为600W，超声结束后即得第一提取液；将第一提取液放入离心装置中离心，离心条件：转速10000r/min，时间为5min，离心结束后倒出上清液，重复执行加入提取溶剂、超声提取、离心、离心结束后倒出上清液操作2次，合并每次离心所得上清液，得第二提取液，稀释5倍后过0.22μm的微孔滤膜，通过UPLC-MS检测三尖杉碱的含量，海南粗榧中三尖杉碱的含量为2.33mg/g，使用制备型高效液相色谱分离法，从第二提取液中分离纯化出三尖杉碱单体。

实施例2

一种从海南粗榧中提取三尖杉碱的方法，包括以下步骤：

步骤1、粉碎海南粗榧叶片后过10目筛；

步骤2、称取0.2g海南粗榧粉末置于15mL离心管中，按料液比为1:40加入8mL的硫酸水溶液(pH＝1)进行超声提取，超声条件：温度为28℃，时间为30min，功率为600W，超声结束后即得第一提取液；

步骤3、将第一提取液放入离心装置中进行离心，离心条件：转速10000r/min，时间为5min，离心结束后倒出上清液，重复执行加入提取溶剂、超声提取、离心、离心结束后倒出上清液操作4次，合并每次离心所得上清液，得第二提取液，稀释5倍后过0.22μm的微孔滤膜；

步骤4、通过UPLC-MS检测三尖杉碱的含量，海南粗榧中三尖杉碱的含量为2.49mg/g；

步骤5、使用制备型高效液相色谱分离法，从第二提取液中分离纯化出三尖杉碱单体。

实施例3

一种从海南粗榧中提取三尖杉碱的方法，包括以下步骤：

步骤1、粉碎海南粗榧叶片后过10目筛；

步骤2、称取0.1g海南粗榧粉末置于15mL离心管中，按料液比为1:20加入2mL的硫酸水溶液(pH＝1)进行超声提取，超声条件：温度为28℃，时间为10min，功率为600W，超声结束后即得第一提取液；

步骤3、将第一提取液放入离心装置中进行离心，离心条件：转速10000r/min，时间为5min，离心结束后倒出上清液，重复执行加入提取溶剂、超声提取、离心、离心结束后倒出上清液操作1次，合并每次离心所得上清液，得第二提取液，稀释5倍后过0.22μm的微孔滤膜；

步骤4、通过UPLC-MS检测三尖杉碱的含量，海南粗榧中三尖杉碱的含量为2.06mg/g；

步骤5、使用制备型高效液相色谱分离法，从第二提取液中分离纯化出三尖杉碱单体。

实施例4

一种从海南粗榧中提取三尖杉碱的方法，包括以下步骤：

步骤1、粉碎海南粗榧叶片后过10目筛；

步骤2、称取0.1g海南粗榧粉末置于15mL离心管中，按料液比为1:30加入3mL的硫酸水溶液(pH＝1)进行超声提取，超声条件：温度为28℃，时间为10min，功率为600W，超声结束后即得第一提取液；

步骤3、将第一提取液放入离心装置中进行离心，离心条件：转速10000r/min，时间为5min，离心结束后倒出上清液，重复执行加入提取溶剂、超声提取、离心、离心结束后倒出上清液操作1次，合并每次离心所得上清液，得第二提取液，稀释5倍后过0.22μm的微孔滤膜；

步骤4、通过UPLC-MS检测三尖杉碱的含量，海南粗榧中三尖杉碱的含量为1.95mg/g；

步骤5、使用制备型高效液相色谱分离法，从第二提取液中分离纯化出三尖杉碱单体。

实施例5

一种从海南粗榧中提取三尖杉碱的方法，包括以下步骤：

步骤1、粉碎海南粗榧叶片后过10目筛；

步骤2、称取0.1g海南粗榧粉末置于15mL离心管中，按料液比为1:20加入2mL的硫酸水溶液(pH＝1)进行超声提取，超声条件：温度为28℃，时间为10min，功率为480W，超声结束后即得第一提取液；

步骤3、将第一提取液放入离心装置中进行离心，离心条件：转速10000r/min，时间为5min，离心结束后倒出上清液，重复执行加入提取溶剂、超声提取、离心、离心结束后倒出上清液操作1次，合并每次离心所得上清液，得第二提取液，稀释5倍后过0.22μm的微孔滤膜；

步骤4、通过UPLC-MS检测三尖杉碱的含量，海南粗榧中三尖杉碱的含量为2.32mg/g；

步骤5、使用制备型高效液相色谱分离法，从第二提取液中分离纯化出三尖杉碱单体。

实施例6

一种从海南粗榧中提取三尖杉碱的方法，包括以下步骤：

步骤1、粉碎海南粗榧叶片后过10目筛；

步骤2、称取0.1g海南粗榧粉末置于15mL离心管中，按料液比为1:20加入2mL的硫酸水溶液(pH＝1)进行超声提取，超声条件：温度为30℃，时间为10min，功率为480W，超声结束后即得第一提取液；

步骤3、将第一提取液放入离心装置中进行离心，离心条件：转速10000r/min，时间为5min，离心结束后倒出上清液，重复执行加入提取溶剂、超声提取、离心、离心结束后倒出上清液操作1次，合并每次离心所得上清液，得第二提取液，稀释5倍后过0.22μm的微孔滤膜；

步骤4、通过UPLC-MS检测三尖杉碱的含量，海南粗榧中三尖杉碱的含量为2.05mg/g；

步骤5、使用制备型高效液相色谱分离法，从第二提取液中分离纯化出三尖杉碱单体。

实施例7

步骤1、粉碎海南粗榧叶片后过60目、100目筛；

步骤2、称取0.2g 60-100目的海南粗榧粉末置于15mL离心管中，按料液比为1:40加入8mL的20％甲醇溶液(体积分数，pH＝2)进行超声提取，超声条件：温度为28℃，时间为30min，功率为600W，超声结束后即得第一提取液；

步骤3、将第一提取液放入离心装置中进行离心，离心条件：转速10000r/min，时间为5min，离心结束后倒出上清液，重复执行加入提取溶剂、超声提取、离心、离心结束后倒出上清液操作2次，合并每次离心所得上清液，得第二提取液，稀释5倍后过0.22μm的微孔滤膜；

步骤4、通过UPLC-MS检测三尖杉碱的含量，海南粗榧中三尖杉碱的含量为4.21mg/g；

步骤5、使用制备型高效液相色谱分离法，从第二提取液中分离纯化出三尖杉碱单体。

实施例8

步骤1、粉碎海南粗榧叶片后过60目、100目筛；

步骤2、称取0.2g 60-100目海南粗榧粉末置于15mL离心管中，按料液比为1:40加入8mL的50％甲醇溶液(体积分数，pH＝2)进行超声提取，超声条件：温度为28℃，时间为30min，功率为600W，超声结束后即得第一提取液；

步骤3、将第一提取液放入离心装置中进行离心，离心条件：转速10000r/min，时间为5min，离心结束后倒出上清液，重复执行加入提取溶剂、超声提取、离心、离心结束后倒出上清液操作2次，合并每次离心所得上清液，得第二提取液，稀释5倍后过0.22μm的微孔滤膜；

步骤4、通过UPLC-MS检测三尖杉碱的含量，海南粗榧中三尖杉碱的含量为4.41mg/g；

步骤5、使用制备型高效液相色谱分离法，从第二提取液中分离纯化出三尖杉碱单体。

实施例9

步骤1、粉碎海南粗榧叶片后过60目、100目筛；

步骤2、称取0.2g 60-100目海南粗榧粉末置于15mL离心管中，按料液比为1:40加入8mL的80％甲醇溶液(体积分数，pH＝2)进行超声提取，超声条件：温度为28℃，时间为30min，功率为600W，超声结束后即得第一提取液；

步骤3、将第一提取液放入离心装置中进行离心，离心条件：转速10000r/min，时间为5min，离心结束后倒出上清液，重复执行加入提取溶剂、超声提取、离心、离心结束后倒出上清液操作2次，合并每次离心所得上清液，得第二提取液，稀释5倍后过0.22μm的微孔滤膜；

步骤4、通过UPLC-MS检测三尖杉碱的含量，海南粗榧中三尖杉碱的含量为4.46mg/g；

步骤5、使用制备型高效液相色谱分离法，从第二提取液中分离纯化出三尖杉碱单体。

实施例10

通过UPLC-MS检测方法，取实施例1～6的实验数据，按照海南粗榧粉末克数、料液比、硫酸水溶液体积、超声温度、超声时间、超声功率、重复次数的不同，可得海南粗榧中三尖杉碱的含量不同的实验数据表，如表1所示。

表1

结论：由表1可以得出，实施例1和实施例2相比，海南粗榧粉末克数、料液比、硫酸水溶液体积、超声温度、超声时间、超声功率都一样，而重复次数越多，所测得三尖杉碱的含量越高。

实施例3和实施例4相比，海南粗榧粉末克数、超声温度、超声时间、超声功率、重复次数一样，而料液比越小，所测得的三尖杉碱的含量越高。

实施例3和实施例5相比，海南粗榧粉末克数、料液比、硫酸水溶液体积、超声温度、超声时间、重复次数都一样，而超声功率越小，所测得的三尖杉碱的含量越高。

实施例5和实施例6相比，海南粗榧粉末克数、料液比、硫酸水溶液体积、超声时间、超声功率、重复次数都一样，而超声温度越高，所测得的三尖杉碱的含量越低。

实施例11

通过UPLC-MS检测方法，取实施例7～9的实验数据，海南粗榧粉末克数、料液比、甲醇溶液体积、超声温度、超声时间、超声功率和重复次数相同的情况下，而甲醇体积分数的不同，所得海南粗榧中三尖杉碱的含量不同的实验数据表，如表2所示。

表2

结论：由表2可以得出，实施例7、实施例8和实施例9相比，海南粗榧粉末克数、料液比、甲醇溶液体积和重复次数都一样，而甲醇体积分数越高，所测得三尖杉碱的含量越高，结合表1进行对比分析，可发现，使用甲醇溶液的三尖杉碱检测含量比使用硫酸水溶液的检测含量高。

本申请实施例中提供的从海南粗榧中提取三尖杉碱的方法，加入提取溶剂后以超声提取装置提取海南粗榧粉末获得第一提取液，其中硫酸水溶液或甲醇溶液作为提取溶剂，可实现经济节约、环境友好，有利于实现工业化生产；将第一提取液进行离心后倒出上清液，重复执行加入提取溶剂、超声提取、离心、离心结束后倒出上清液操作1～4次，合并上清液获得第二提取液，采用制备型高效液相色谱分离纯化三尖杉碱的方法，成功将第二提取液分离纯化出少量三尖杉碱单体，多次提取可增加三尖杉碱的提取质量，有利于提高提取率，且消耗时间短、效率高，解决了现有三尖杉属植物中提取三尖杉碱均是采用乙醇、三氯甲烷等有机溶剂，成本高、不利于实现工业化生产，且分离纯化时多采用柱层析法，该方法溶剂用量大、消耗时间长、效率低的技术问题。

以上所述，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的精神和范围。