下调人类免疫细胞活化的特异性双功能BY-001(嵌合蛋白PD-L1/Fc-gamma1的同源多聚体组合成的活性成分)及其应用

摘要

本发明所展示的是嵌合蛋白PD‑L1/Fc‑gamma 1(BY‑001)的同源多聚体的活性形式，而这种同源多聚体可以有25％的二聚体，30％的四聚体和45％的六聚体的组成。处于聚合状态下的BY‑001由两个不同功能的结构域组成，其中一个是PD‑L1的细胞外结构域，另一个是IgG1 Fc功能结构域。处于聚合状态的PD‑L1作为第一功能结构域能更有效地抑制CD3+和CD28+的T细胞活性；而另一个功能结构域，处于聚合状态的FC‑gamma1可以对带有Fc‑gamma受体的免疫细胞也产生抑制作用。因此，本发明提供的实验结果表明BY‑001可以调节负责外周免疫耐受的免疫细胞亚群的功能，这使得BY‑001具有帮助恢复或维持人体外周免疫耐受从而达到治疗自身免疫性疾病的潜力，以及也可以保护受者接受同种异体移植后的异体器官。

说明书

1.本发明基于的背景知识

免疫系统通常只识别并防御外来病原体，但却不针对自身的组织成分，这种内 在的免疫耐受状态是机体通过建立完美和精确的调控系统而得以维持的。当效应 性B细胞和T细胞[1,2]以及调节性Treg细胞和树突状细胞之间的关系失调时，机体 可能会由此而导致自身免疫反应性T细胞和B细胞的产生，从而使得一个或多个器 官发生系统性炎症损害[3]。因此，恢复免疫耐受状态是治疗自身免疫性疾病的最 终目标[4,5]。

细胞表面分子，例如CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4或CD152)和PD-1 (程序性死亡1，也称为CD279)通过识别并与CD80(B-7.1)或CD86(B-7.2)结合 而提供抑制性免疫调节信号，这些信号被认为对维持免疫耐受性至关重要[6,7]。 根据这些发现，制药公司Bristol-Myers Squibb开发了一种嵌合蛋白(CTLA-4/ Fc，商业名为Abatacept)，该蛋白由免疫球蛋白IgG1的Fc区和CTLA-4的胞外域组 成，2011年被FDA批准用于临床。但是，Abatacept的药理机制是作为CD28的拮抗 剂来中断TCR的第二信号，即阻断CD28与B-7结合由此而不能激活TCR，而不是通过 CTLA-4传递检查点信号。因此，Abatacept会中断全身细胞免疫反应，而副作用可 能会导致严重的传染病，甚至癌症。

负责免疫检查点的第二个细胞表面分子是PD-1(程序性细胞死亡蛋白1，也称 为CD279)，其在胸腺细胞，活化的T细胞和pro-B细胞上严格表达。据研究认为， PD-1与它的两个已鉴定的配体之一相结合所导致的结果与维持外周免疫耐受性密 切相关，因为：1)，程序性死亡-1配体1(PD-L1)，也称为CD274或B7-H1，在包 括肿瘤细胞在内的造血和非造血细胞上广泛表达；2)，程序性死亡1配体2(PD- L2)，也称为CD273，或B7-DC，它只表达在树突状细胞和巨噬细胞上。PD-1与PD- Ls的结合能抑制T细胞的活化或导致B细胞的成熟分化。迄今为止，已经阐明了PD- 1/PD-L1信号途径在免疫耐受中所起关键作用的三种机制：(1)通过PD-L1结合 PD-1诱导的失能或称T细胞无反应[8]，然后激活SHP2来抑制TCR/CD28信号传导； (2)通过PD-L1结合前B细胞上表达的PD-1来抑制B细胞成熟，然后激活SHP2以抑制 BCR信号传导[9]；(3)产生调节性T细胞(特别是1型(Tr1))[10]，并将人TH1 转化为Treg细胞(iTreg细胞)[11]。此外，外周血中可溶性的PD-1(sPD-1)和PD- L1(sPD-L1)也可能是免疫调节中PD-1/PD-L1途径的来源[12,13]。这种机制的 完美体现是某些肿瘤细胞在其细胞膜上过度地表达PD-L1，并同时进入循环系统， 从而成功地使肿瘤细胞逃脱了免疫攻击[14]。

与肿瘤中情况相反，根据自身免疫性疾病的最新发现，免疫细胞中PD-1/PD- L1通路的减弱或缺失与外周免疫耐受的不稳定或破坏直接相关[10]。越来越多的 证据表明，受损的PD-1/PD-L1功能在多种自身免疫性疾病中发挥重要作用，例如 SLE(系统性红斑狼疮)和RA(类风湿关节炎)等[15]，动物模型表明，根据遗传 背景，PD-1/PD-L1(PD-1基因敲除小鼠)信号丢失会发展为狼疮样自身免疫性疾 病[16]或自身免疫性扩张型心肌病[17]。PD-L1缺乏症会增强实验性自身免疫性 脑脊髓炎[18]，自身免疫性糖尿病的非肥胖糖尿病(NOD)模型[19,20]和多发性 硬化症(MS)的小鼠模型[21],PD-L1的组织表达介导外周T细胞耐受性[22]。

负责免疫耐受的第三个细胞表面分子是Fc-gamma受体IIB型(Fc-gammaRIIA/ B之一，统称为CD32)。迄今为止，已经鉴定出人类Fc-gamma受体是hFc-gammaRI (CD64)，hFc-gammaRII(A和B型，CD32)和hFc-γRIII(A和B型，统称为CD16)。 每种类型的受体都表现出独特的组织分布，结构和对各种IgG亚类的结合特异性 (7,8)。Fc-gammaRIIB仅在人的B细胞，单核细胞/巨噬细胞和树突细胞上表达， 而在小鼠中仅在嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞和肥大细胞上表达。Fc-gammaRII对 单体IgG的亲和力很低，但对聚合的多聚体IgG的亲和力高，这在免疫应答过程中对 抗体-抗原复合物的识别和结合中尤为重要[23]。最近已经定义了Fc-gammaRIIB在 B细胞分化阶段发挥自身耐受性的守门员作用[24,25]。Fc-gammaRIIB的主要功 能是抑制激活信号，这是通过Fc-gammaRIIB与激活Fc-gammaRs或BCR通过免疫复合 物的共连接而实现的[26]。这导致Fc-gammaRIIB的细胞内结构域ITIM被Src家族激 酶IYN磷酸化。认为该磷酸化事件要求Fc-gammaRIIB进入鞘脂筏，其中活化的Fc-gammaR和BCR在交联后位于其中。随后包含SH2结构域的肌醇磷酸酶(SHIP)，特别 是SHIP1的结合，导致下游靶点的脱磷酸并抑制激活的信号传递。越来越多的证据 表明，Fc-gammaRIIB在B细胞成熟的晚期阶段具有介导其功能，因此这也代表了一 个控制B细胞成熟的远端检查点[25]。通过对DNA基因缺失小鼠模型的分析，可以确 定缺乏Fc-gammaRIIB会导致分泌自身反应性抗体的IgG(自身抗体)阳性浆细胞扩 增(Fukuyama等，2005)。此处，Fc-gammaRIIB可能是阻止这些具有潜在有害BCR 的特异性的B细胞成熟为浆细胞的最终屏障，否则这些浆细胞会通过分泌大量自身 反应性抗体而诱发自身组织的病理变化。树突状细胞是Fc-gamagRIIB可能在调节免 疫力和耐受性中发挥重要作用的另一种细胞类型[27-29]。已证明许多慢性炎症性 疾病与Fc-gamma受体遗传变异有关，包括(但不限于)自身免疫病，例如系统性红 斑狼疮(SLE)[30]，类风湿性关节炎[31]，急性同种异体移植排斥[32]和血管炎 性和血栓性疾病，例如冠状动脉狭窄，外周动脉粥样硬化和血管炎[33,34]。

由于PD-1在活化的T细胞和B细胞中表达，因此可以预期，PD-L1蛋白将可以有 效地用作特异性靶向并抑制那些活化了的免疫细胞从而达到对炎症反应的治疗效 果，如在自身免疫疾病中，或在器官移植中。由于Fc-gammaRIIB在树突状细胞和单 核细胞/巨噬细胞中的表达，因此，也可以预期Fc-gamma1的聚集形式可用作特异性 靶向那些异常活化的免疫细胞从而抑制自身免疫过程中的炎症反应而达到治疗目 的。因为外周免疫耐受的建立和维持取决于所有类型的这些细胞群之间和谐的相互 作用和调控。迄今为止，尚未开发出通过同步调节PD-1/PD-L1和Fc-gamma/Fc- gamma受体的两条信号通路途径而重建外周免疫耐受性的免疫治疗剂。也即，该治 疗剂不仅靶向针对自身反应性T细胞和B细胞，而且也针对炎症组织中不该被活化的 单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞，同时，这种治疗剂要避免有抗体依赖的细胞介 导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)，从而避免因为激活Fc-gammaRI 可能的负作用。

2.本发明简介

第一方面，本发明是一种被命名为BY-001的双特异性生物制剂(PD-L1/FC-gamma1的嵌合蛋白)，其可以是二聚体，四聚体和六聚体的同源多聚体形式的组合 物，其中所述形式的比率为25％的二聚体，30％的四聚体和45％的六聚体。

第二方面，本发明提供了BY-001的双特异性功能的验证结果，其多聚体状态下 的PD-L1仍可以激发PD-1的信号传导途径以抑制活化了的T细胞系(表达PD-1的 jurkate细胞系)的细胞因子的产生，并且多聚体状态下的Fc-gamma1对单核细胞/ 巨噬细胞细胞系(表达Fc-gamma1RI和II的THP-1细胞)和类红细胞系(只表达Fc- gamma1RII的K562细胞)也具有抑制作用。

第三方面，本发明还证明，BY-001中的PD-L1和Fc-gamma1功能结构域的功能与 它们在其亲本蛋白中的功能特征一致，而所述亲本蛋白的功能已被许多实验室在体 外和体内实验所广泛证实，结果也已被科学期刊出版。因此，显而易见的观点是， 本发明的BY-001对于由自身免疫异常或防止同种异体移植引起的排斥反应具有治 疗性潜力。

3.披露

3.1.技术问题与解决方案

本发明的目的是展示BY-001(一种双功能的嵌合蛋白PD-L1/Fc-gamma1的同 源多聚体形式的组合物)的医药开发潜能，该混合物中的二聚体，四聚体和六聚体 的形式的比例为25％，30％和45％。其中嵌合蛋白PD-L1/Fc-gamma1的单体形式 由两个不同的功能结构域组成。保留免疫球蛋白Fc-gamma1区域中的半胱氨酸氨基 酸以形成多聚体PD-L1/Fc-gamma1，这种同聚体形式提供了聚集的Fc-gamma1(BY- 001)来与Fc-gammaRIIB结合却避免了与Fc-gammaRI的结合。本发明的另一个目 的是展示了PD-L1蛋白的细胞外功能结构域的聚合体形式(BY-001)对T细胞的活性 显示出优异的调节作用。本发明的第三个目的是展示了Fc-gamma1功能结构域的聚 合体形式仅与Fc-gamma1RIIA和B结合并且抑制了单核细胞/巨噬细胞和前红细胞中 促炎因子的产生。

3.2.有利效果

本发明的BY-001是二聚体，四聚体和六聚体形式的嵌合蛋白PD-L1/Fc- gamma1的混合物。嵌合蛋白PD-L1/Fc-gamma1的这种聚集状态显示出对PD1和Fc- gammaRII很好的调节功效。因此，也有可能在自身免疫性疾病的活动期用于调节 免疫细胞的活性，包括Th细胞，细胞毒性T细胞和B细胞，以及调节单核细胞/巨噬 细胞，树突状细胞和iTreg细胞的活性以恢复，以此来维持外周围免疫耐受。因此， 本发明的BY-001对于由自身免疫异常或防止同种异体移植引起的排斥反应具有治 疗性潜力。

4.附图说明

图1.PD-L1/Fc-gamma1(BY-001)嵌合肽的设计及其氨基酸序列

A.设计示意图，嵌合蛋白PD-L1/Fc-gmma1是由人PD-L1的细胞外部分和人 IgG1Fc恒定区组成的，请注意：

1).保留V-set，C-set和IgG1Fc区中的半胱氨酸，让-S-S-“二硫键”可以形 成高级结构形式。

2).PD-L1/Fc-gamma1共449个氨基酸

3).PD-L1的信号肽包含氨基酸1-18，当蛋白质分泌到培养基中时，该信号肽 将被消化去除。因此，本发明的纯化的PD-L1/Fc-γ1总共包含431个氨基酸。

4).免疫球蛋白V样区(V集，19～127个氨基酸，外显子2)

5).免疫球蛋白恒定样区(C-set，133～220个氨基酸，外显子3)

6).人IgG1重链恒定结构域(C区，221～449)是Fc-gamma1的区域。

B.(SEQ ID NO：<400>2)嵌合蛋白PD-L1/Fc-gamma1中包含的PD-L1的AA 序列。开头突出显示的序列是信号序列的一部分，用于将蛋白质引导至分泌途径， 该途径随着蛋白质释放到培养基中而被切除。阴影中突出显示的序列是Fc-gamma1 区域。

图2.显示在SDS-Page电泳凝胶和Western-blot印迹中的BY-001蛋白

将(图1.B)中所述的编码PD-L1氨基酸序列的DNA片段插入购自INVIVOGEN USA，10515Vista Sorrento Pkwy，San Diego，CA 92121，USA的pFUSE-hIgG1-Fc-gamma1 的基因载体中。用293细胞转染pFuse-PD-L1/Fc-gamma1的DNA。利用Monofinity A 层析柱纯化(GenScript，860Centennial Avenue，Piscataway，NJ 08854)从293 细胞培养上清液中纯化BY-001。单体形式的预期蛋白质的分子重量约为60千道尔顿 (KD)。使用Westen-blot印迹分析蛋白质产物，用还原和非还原条件进行凝胶电 泳(前者没有二硫苏糖醇(DTT)，后者没有DTT)，DTT用于打破BY-001高级结构 中的二硫键。

A.SDS-page凝胶，考马斯亮蓝染色。泳道M1：蛋白质分子量标记(Cat.No. 3452)；泳道1：在还原条件下的BY-001(单体)，泳道2：在非还原条件下的BY- 001(没有单体，但有二聚体，四聚体和六聚体)。

B.用第一抗体探测蛋白质的印迹：山羊抗人IgG-HRP。泳道M2：蛋白质分子量 标记(GenScript，cat#M00521)，泳道P：人IgG1，kapa(Sigma,Cat.No.I5154) 作为阳性对照。在非还原条件下，PD-L1/Fc-gamma1带的单体的泳道1；泳道2，BY- 001，二聚体，四聚体和六聚体的多聚体形式。

C.用人PD-L1/B7-H1抗体(R&D，cat#AF156)探测的蛋白质印迹。泳道 M2：蛋白质分子量标记(GenScript，cat#：M00521)；泳道1，在非还原条件下， PD-L1/Fc-gamma1带的单体的；泳道2，BY-001，二聚体，四聚体和六聚体的多聚 体形式。

D.BY-001的示意图，D，E和F的卡通图是用于以二聚体，四聚体和六聚体形式 显示BY-001的图形。

图3.BY-001抑制Jurkate细胞系产生IL-2

Jurkate(购自美国ATCC)是一种由人T细胞白血病发展而来的T细胞系。这种 细胞的表面表达分子CD3，CD28和PD-1。OKT3是抗CD3的抗体，其结合和交联将激 活T细胞。CD28是共刺激分子B7家族的受体。抗CD28与CD28的结合将大大增强基于 OKT3体外刺激的T细胞活化。IL-2的产生通常是显示T细胞活化的生物标记之一。 该实验的目的是验证BY-001在体外调节T细胞活化中的功能。将5ug/ml的OKT3(抗 人CD3，克隆OKT3，BD bioscience)包被到96孔U底微孔板中，置其于4℃下过夜。 Jurkate细胞以3,000,000/ml的细胞悬浮液在含有10％FBS的RPMI1640培养基中。

A.然后，将100ul的3百万/ml浓度的细胞悬液加入到每个孔中，根据设计 将BY-001加到板孔中。将该板在37℃和5％CO 2的培养箱中保持过夜。从孔中收集 培养物上清液以测量IL-2的产生。使用人IL-2高灵敏度ELISA试剂盒(eBioscience， 1030Vienna，Austria)来测量IL-2。结果表明，BY-001在BY-001的起始浓度(0.1ug /ml)下有效抑制IL-2的产生。在浓度为0.1ug/ml的BY-001时，CD3信号伴随(没 有CD28第二信号)的抑制率为87.5％，这种抑制作用在浓度范围为0.1ug/ml至 1ug/ml时是持续的。

B.将抗人CD28(BD bioscience，克隆CD28.2)以2ug/ml混合到与(A)中 所使用的相同的jurkate细胞悬浮液中。将该板在37℃和5％CO 2下孵育过夜。按照 (A)中的方法从孔中收集培养物上清液以测量IL-2的产生。结果表明，TCR信号在 共刺激信号的帮助下使Jurkate细胞产生更高水平的IL-2(从OKT3的30pg/ml到 OKT3+抗CD28的60pg/ml)，但是它使BY-001产生在浓度为0.5至2ug/ml时抑 制IL-2产生为梯度型模式，在0.5ug/ml时抑制率为13.1％，在1.0ug/ml时抑制 率为43％，在2ug/ml时抑制率为67.6％。

图4.BY-001抑制PBMC人原代细胞产生IL-2

PBMC获自于健康人供体，在PBMC细胞中仅包含单核的血液细胞。在PBMC中， CD3在所有T细胞上表达，而CD3和CD28双重阳性T细胞占所有T细胞的大部分。B7家 族和PD-1在大多数PBMC细胞表面表达。Fc受体在树突状细胞，单核细胞等上表达。 该实验的目的是验证BY-001在调节人类正常原代细胞中T细胞活化中的作用，也以 此显示它在临床治疗上的潜能力。在4℃下，用3ug/ml OKT3将96孔板包被过夜。 100ul浓度为3百万/ml的Jurkate细胞溶液在有(2μg/ml浓度的抗CD28抗体)或 没有抗人CD28抗体(对照组)的情况下，将该板在37℃和5％CO 2的培养箱中保持 过夜，从孔中收集上清液，再用人IL-2高灵敏度ELISA试剂盒进行IL-2的检测。

A.CD3信号伴随(无CD28第二信号)在0.25ug/ml的BY-001浓度下抑制率为90.8％，在BY-001的浓度从0.25至4ug/ml时抑制作用持续存在。

B.CD3信号与CD28第二信号一起，抑制模式从BY-001的0.25ug/ml的抑制率17.5％到4ug/ml的74.1％变为梯度下降。

图5.BY-001调节K562细胞的IL-4和TGF-betta产生

K562细胞(来自美国ATCC)是由人骨髓性白血病(红白血病类型)产生的前红 细胞，此细胞不表达CD3，CD28和PD-1分子，并且，据报道，仅Fc-gamma1受体II在 其细胞表面表达，而不表达Fc-gamma1受体I。因此，只有聚和状态的Fc-gamma1能 够结合并触发Fc-gamma1/Fc-Gamma1RII途径。为了确定BY-001的Fc-gamma1聚合体 的功能，我们检测了K562细胞中IL-4和TGF-betta产生的调节。很明显，此实验所 展示出的结果是抑制性的。

A.K562中IL-4产生的基础水平很高(84pg/ml)。按照设计将BY-001加入 细胞培养物中可降低IL-4水平。在浓度为4ug/ml的BY-001时，抑制作用足够， 这表明聚合状态的Fc-gamma1与Fc-Gamma1RII结合并触发抑制途径。

B.K562中TGF-betta产生的基础水平很高(1250pg/ml)。根据设计，将BY- 00-1加入细胞培养物中可降低TGF-betta水平。在浓度为2或4ug/ml的BY-001时， 抑制作用足够，这表明聚合状态的Fc-gamma1与Fc-Gamma1RII结合并触发抑制途 径。

C.BY-001与Fc-gammaRII结合并触发其后续的抑制信号传递的示意图。ITAM 代表存在于免疫受体中的酪氨酸活化基团，其中酪氨酸残基在Fc-gamma1和Fc- gamma1RII之间结合后被磷酸化。而ITIM代表存在于免疫受体中的酪氨酸抑制性 基团，当聚合状态的BY-001的Fc-gamma1结合Fc-gammaRIIA或C并交联，其中的酪氨 酸残基被磷酸化，此后，磷酸酶SHIP1或2被激活再使ITAM中的磷酸化酪氨酸脱磷酸。

图6.BY-001调节THP-1细胞的IL-4和TGF-betta生成

THP-1细胞(来自美国ATCC)是一种源自急性单核细胞白血病的人单核细胞系， 此细胞不表达CD3，CD28和PD-1分子，然而，据报道，Fc-gamma1受体I和II均在其 细胞表面表达。目前一致认为单克隆抗体的Fc区对Fc-γ1RI具有高亲和力，但对Fc- γRII却只具有非常低的亲和力。相反，抗原-抗体复合物的Fc部分仅结合Fc- gammaRII而不是Fc-gammaRI。因此，为了确定聚合状态的BY-001 Fc-gamma1结合并 能激活Fc-gamma1/Fc-gamma1RII途径的功效，我们检测了THP-1细胞中IL-4和 TGF-betta产生的变化。显然，在该实验结果中传递出的信息是抑制性的，这也表 明聚合状态的BY-001的Fc-gamma1触发了Fc-γ/Fc-gammaRIIB的抑制途径。

A.THP-1中IL-4产生的基础水平很高(86pg/ml)。按照设计将BY-00-1加 入细胞培养物中可降低THP-1分泌IL-4水平。在浓度为2和4ug/ml的BY-001时， 抑制作用很明显，这表明聚合状态的Fc-gamma1与Fc-Gamma1RII结合并仅触发抑 制途径。

B.THP-1中TGF-betta产生的基础水平很高(485pg/ml)。根据设计，将BY- 00-1加入细胞培养物中可降低THP-1分泌TGF-betta水平。在浓度为2和4ug/ml 的BY-001处观察到抑制作用，这表明聚合状态的Fc-gamma1与Fc-Gamma1RII结合 并仅触发抑制途径。

C.BY-001与Fc-gammaRII结合并触发其后续的抑制信号传递的示意图。ITAM 代表存在于免疫受体中的酪氨酸活化基团，其中酪氨酸残基在Fc-gamma1和Fc- gamma1RII之间结合后被磷酸化。而ITIM代表存在于免疫受体中的酪氨酸抑制性 基团，当聚合状态的BY-001的Fc-gamma1结合Fc-gammaRIIA或C并交联，其中的酪氨 酸残基被磷酸化，此后，磷酸酶SHIP1或2被激活再使ITAM中的磷酸化酪氨酸脱磷酸。

图7BY-001与抗原抗体复合物的高级结构差异

特异性抗体通过静电吸引和疏水键或氢键与抗原结合，在蛋白质电泳的SDS凝 胶中易于分离。尽管没有抗原的成分包含在本发明中，但本发明的PD-L1/Fc- gamma1分子中二硫键(SS)将多个PD-L1/Fc-gamma1单体结合在一起而成聚合体。

A.该图是由S-S绑定在一起的BY-001的二聚体

B.该图是BY-001的由S-S绑定而成的四聚体与

C.该图是BY-001的由S-S绑定而成的六聚体，

D.该图是抗原-抗体复合物

图8.BY-001重建外周免疫耐受的预期机制

基因改变(基因突变或多态性)可能导致个体难以维持免疫系统的外周免疫耐 受性。树突状细胞，巨噬细胞，T细胞变得非常敏感，无法抵抗微环境的改变。然 后，容易被不适当地激活。结果是针对自身组织的攻击性T细胞或B细胞的产生。 BY-001的添加将直接降低自身组织的攻击性T细胞或B细胞的活性，从而诱导自身组 织的攻击性T细胞或B细胞的细胞无能，另一方面，BY-001还将调节Th细胞，Treg细 胞和树突状细胞的活性，巨噬细胞对重建外周免疫耐受至关重要。

5.发明详述

5.1.定义：在更详细地描述本发明之前，提供以下定义。除非另有说明，否 则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所 理解的含义相同。具有与本文描述的那些功能相似或等同的功能的任何方法和材 料都可以用于本发明的实验或测试中，在这里描述的方法，仪器装置和材料适用 于以上声明。凡本发明中使用的方法，试剂和仪器设备是来自于公开出版的参考 文献的，本文在参考文献中列出了所有出版物。

根据本发明的目的，一方面，展示了一种融合蛋白，其包含PD-L1蛋白的细胞 外功能结构域或其片段和人免疫球蛋白Fc-gamma1功能结构域(或亦称：“PD-L1 /Fc-gamma1嵌合蛋白”，“PD-L1/Fc-gamma1蛋白”，“PD-L1嵌合蛋白”，或 “嵌合蛋白”)。PD-L1的细胞外结构域可以是包含PD-L1的似免疫球蛋白V(V-set) 结构域和PD-L1的似免疫球蛋白C(C-set)结构域的多肽。PD-L1的细胞外结构域 是暴露于细胞膜外部的结构域，并且可以是包含在本发明的图1B的序列的19至220 位的氨基酸的多肽。另外，PD-L1的细胞外结构域或其片段是来源于人的。另外， PD-L1的细胞外结构域可具有约70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93 ％，94％，95％，96％，97％，与由图1B的序列的19至220位氨基酸组成的多肽序 列具有98％，99％或更高的同源性。另外，图1B的序列的人IgG1重链恒定结构域(C 区，221～449)是Fc-gamma1的区域。在本发明中，所有PD-L1/Fc-gamma1的V-和 C-集合中的半胱氨酸和人免疫球蛋白Fc-gamma1区域均保留用于-S-S-“二硫键”以 形成高级结构。

如本文所用，术语“BY-001”是指双功能嵌合蛋白PD-L1/Fc-gamma1的同源 多聚体形式的混合物，其比例为二聚体25％，四聚体30％和六聚体45％。

如本文所用，术语“免疫细胞”包括造血起源的并且在免疫应答中起作用的细 胞，例如B细胞，T细胞，树突状细胞，天然杀伤细胞，单核细胞和巨噬细胞等。

如本文所用，术语“T细胞”包括CD4+Th1和Th2细胞，CD3+和CD8+细胞毒 性T细胞，包括自身反应性T细胞，CD25+和FOX3+Treg细胞以及诱导型Treg细胞 (iTreg)。

如本文所用，术语“B细胞”是指能产生包括自身反应性抗体和抗体潜能的B细 胞。

如本文所用，术语“聚合体的PD-L1”是指人或小鼠来源的PD-L1处于其聚集状 态的细胞外部分。

本文所用的术语“聚合体的Fc-gamma1”是指人或小鼠来源的人IgG1重链的铰 链区，CH2和CH3处于聚合状态。

如本文所用，术语“抑制信号”是指经由免疫细胞上的抑制受体分子传递的信 号。如CTLA-4，PD-1和Fc-gammaRIIB。

5.2.发明模式

在下文中，据于实例对本发明的阐述并不限制对本发明在应用范围上的进一 步扩展。

根据本发明的目的，一方面，本发明提供了双功能嵌合蛋白质的一级结构，其 包括第一功能结构域，即PD-L1蛋白的胞外结构域，以及第二功能结构域，即人免 疫球蛋白Fc-gamma1区。本发明的双功能嵌合蛋白被称为“PD-L1/Fc-gamma1嵌合 蛋白”或“PD-L1/Fc-gamma1蛋白”或“PD-L1嵌合蛋白”或“嵌合蛋白”。PD- L1的细胞外结构域可以是包含PD-L1的免疫球蛋白V(V-set)样结构域和PD-L1的免 疫球蛋白C(C-set)样结构域的多肽。PD-L1的细胞外结构域是暴露于细胞膜外部 的结构域，并且可以是包含在本发明的图1B的氨基酸序列的19至220位的多肽。另 外，PD-L1的细胞外结构域或其片段是来源于人的。另外，PD-L1的细胞外结构域可 具有约70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％， 97％，98％，99％或更高的与由图1B提供序列的19至220位氨基酸组成的多肽序列具 有的同源性。另外，图1B的序列的人IgG1重链恒定结构域(C区，221～449)是Fc-gamma1的功能区域。

在另一方面，本发明提供的蛋白质高级结构是仍具有双功能的嵌合蛋的白蛋 白质高级结构同型多聚体的复合物，其包含PD-L1/Fc-gamma1嵌合蛋白(BY-001) 的二聚体，四聚体和六聚体。在本发明中，所有PD-L1/Fc-gamma1的V-和C-区域 中的半胱氨酸和人免疫球蛋白Fc-gamma1区域中的半胱胺酸均得以保留以便用于S- S-“二硫键”形成而构建蛋白质高级结构。因此，一旦将PD-L1与第二结构域成分 Fc-gamma1融合，它就是天然由二聚体，四聚体和六聚体组成的复合物。事实上， PD-L1二聚体，四聚体和六聚体形成了，而Fc-L1 gamma1二聚体，四聚体和六聚体 也相应形成，如本发明的图2所示。

迄今为止已一致认为，免疫细胞亚群T细胞，B细胞和树突状细胞的活化与同种 异体移植物排斥反应和自身免疫性疾病是有相关性的，而单核细胞/巨噬细胞是与 炎症反应，特别是与慢性炎症有相关性的关键免疫细胞亚群之一，并已更进一步地 认识到，细胞信号通路PD-1/PD-L1和Fc-gammaRII/Fc-gamma在调节上述免疫细胞 亚群的功能中至关重要。

在生理条件下，PD-1在活化的T细胞和B细胞中表达，并由单体PD-L1结合而激 活，然后，PD-1/PD-L1途径传递免疫检查点的细胞信号。现已证实了，PD-1/ PD-L1细胞信号通路是建立和维持免疫耐受中发挥关键作用的途径之一。本发明中 所展示的嵌合蛋白中的PD-1是处于其聚合状态的，而这种聚合状态下的PD-1预期也 有结合并激活PD-1信号通路的功能。

为了验证本发明中所述的(图2)处于其聚合状态下的PD-L1的功能，对本发明 提供了在科学实验上的验证，如图3和图4结果中所展示的，聚合状态下的PD-L1(BY- 001)能激活并传递免疫检查点的细胞信号从而调剂免疫细胞的活性，所以，包含 在双功能嵌合蛋白PD-L1/Fc-gamma1中的第一功能结构域PD-L1是具备结合并激活 PD-1的功能的。例如，如本发明中所示，在用OKT3抗体或OKT3抗体+CD28抗体处理 Jurkate细胞或人健康供体的PBMC后，BY-001可以抑制Jurkate细胞(图3)和人健 康供体的PBMC产生IL-2(图4)。OKT3抗体与CD28抗体一起作为共同刺激剂通常用 于触发TCR信号传导，以激活CD3+T细胞。IL-2的产生通常是T细胞活化的生物标 记之一。通常认为，自身免疫性的炎症反应或同种异体移植的排斥反应是由于外周 免疫耐受性破坏引起的自反应性T细胞和自反应性B细胞的不适当活化引起的[1- 3]。目前治疗自身免疫性疾病或保护同种异体移植物的方法是抑制上述自身反应 性T细胞和自身反应性B细胞的活性[5,35]。迄今为止，已经认识到细胞表面受体PD-1仅在活化的T细胞和B细胞中表达[35]。PD-1和PD-L1之间的结合可诱导活化 的T无反应性细胞或B细胞无反应性或凋亡，或者，该结合可诱导Treg细胞从Th细胞 分化[36]。因此，本发明所展示的可溶性PD-L1/Fc-gamma1的同源多聚体形式(BY- 001)是为一种新的嵌合蛋白，它具有在一定程度上治疗某些自身免疫性疾病的潜 力，以及或保护同种异体移植物的潜力。

根据激活或抑制免疫应答的能力，Fc-gamma受体分为两类：hFc-gammaRI，hFc-gammaRIIA和hFc-gammaRIIIA是通过受体的细胞质部分中的ITAM(immunoreceptortyrosine-based activation motif)激活的受体。-gammaRIIB通过细胞质ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)抑制受体[37]。Fc- gammaRI是一种高亲和力受体，仅与单体IgG结合，并在人和小鼠的树突状细胞，单 核细胞和巨噬细胞中一直表达[38]。相对于Fc-gammaRI，其他三种类型Fc受体则表 达在除B细胞以外的大多数其他亚群的免疫细胞，并且仅对抗原-抗体复合物中的 IgG的Fc-gamma具有高亲和力，而其中的Fc-gammaRIIB通过其与抗原-抗体复合中的 一个Fc-gamma而另外的Fc-gamma可以结合，因而使Fc-gammaRIIB与Fc-gammaRIIA交 联而传递抑制性细胞信号。此外，Fc-gammaRIIB也可以在B细胞上表达，并且这种 抑制性细胞信号似乎是以B细胞自主的方式发挥功能，以此调节周围的自身反应性 细胞。据广泛报道，Fc-gammaRII在自身免疫和炎性疾病中起着关键作用。Fc- gammaRII/Fc-gamma信号通路支配着树突状细胞和单核细胞/巨噬细胞的激活和化 学细胞因子的产生，这对炎症过程至关重要，也是维持免疫耐受的关键作用。本发 明中所展示的嵌合蛋白中的Fc-gamma1是处于其聚合状态的，这种聚合状态下的嵌 合蛋白中的Fc-gamma1预期也有激活Fc-gammaRII信号通路的功能

为了验证本发明中所述的(图2)处于其聚合状态下的Fc-gamma1的功能，从另 外一个侧面对本发明在科学实验上的提供了验证，如图5和图6结果中所展示的，作 为一种新的可溶性嵌合蛋白，聚合状态下的Fc-gamma1(BY-001)能激活并传递抑 制性的细胞信号从而调剂免疫细胞的活性。在本发明中，在四聚体和六聚体中的PD- L1/Fc-gamma1(BY-001)与在Ag-Ab复合物中的Fc形式的结构是不同的，如本发明 中的图7所示。比如，BY-001抑制了来自K562细胞和THP-1细胞的IL-4和TGF-β产生。 据报道，K562细胞仅表达Fc-gamma受体II[39]，而THP-1细胞在细胞表面却表达 Fc-gamma受体I和II[40]。很显然，Fc-gammaRI在THP-1细胞上的Fc-gammaRI并没 有影响Fc-gammaRIIB/Fc-gamma1的抑制信号途径。抑制途径的机制可以包括与 Fc-gammaRIIB结合的聚合状态下的一个Fc-gamma1和聚合体中的其他Fc-gamma1与 Fc-gammaRIIA或RIIC交联，然后，通过该途径传递抑制信号并降低细胞的活性。

总体而言，BY-001具有双重功能，它一方面通过多聚体状态下的PD-L1结合并 激活PD-1细胞信号途径，另一方面通过多聚体状态下的Fc-gamma1与Fc-gamma1RIIB 结合以触发抑制性信号传导至细胞。此后，BY-001是能够调节免疫细胞活化的T细 胞和B细胞，同时还能调节树突状细胞和单核细胞/巨噬细胞的亚群，这些免疫细胞 群与自身免疫和同种异体移植的保护密切相关。因此，BY-001有治疗自身免疫性疾 病潜力。在自身免疫和自身免疫炎性疾病的情况下，本发明所展示的嵌合蛋白的同 源多聚体形式可以通过一种或多种机制减少自身免疫性疾病的症状。例如，本发明 的嵌合蛋白的同源多聚体形式中的PD-L1胞外功能域可以结合免疫细胞上的PD-1， 例如活化的T细胞或pre-B细胞。而同源多聚体形式的嵌合蛋白中的第二个功能域则 与树突状细胞和巨噬细胞以及其他带有Fc-gammaRII或RIII等免疫细胞的FC受体结 合并交联。通过这些结合和交联事件，第一个功能结构域的受体PD-1触发T细胞无 反应，抑制B细胞成熟，Treg细胞和调节性树突状细胞分化。嵌合蛋白第二功能结 构域则可以结合并激活其相应的FC受体而抑制在炎症部位已被活化了的树突状细 胞和巨噬细胞等。所有这些事件对于诱导和维持人体的免疫耐受至关重要。

另外，一旦嵌合蛋白中所含的FC-gamma1锚定在树突状细胞和巨噬细胞的细胞 表面的FC受体上，则本发明的嵌合蛋白可以通过跨越两个相邻细胞来介导其活性， 并且从而在炎症部位建立免疫耐受的微环境。或者，例如，含有PD-L1的嵌合蛋白 可与抗原呈递细胞上的B7-1共刺激物结合，从而干扰其共刺激，免疫激活功能。

如图8的示意图所示，BY-001具有治疗自身免疫性疾病和保护同种异体移植物 的潜力。例如1型糖尿病(T1D，系统性红斑狼疮(SLE)，类风湿关节炎(RA)和 炎症性肠病(IBD)(包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD))，多发性硬化 症(MS)，硬皮病，以及其他疾病和病症，例如PV(寻常性天疱疮)，牛皮癣，特 应性皮炎，乳糜泻，慢性阻塞性肺疾病，桥本甲状腺炎，Graves病(甲状腺)，Sjogren 综合征，Guillain-Barre综合征，Goodpasture综合征，Addison's综合征疾病，韦 格纳肉芽肿病，原发性胆管硬化症，硬化性胆管炎，自身免疫性肝炎，风湿性多肌 痛雷诺现象，颞动脉炎，巨细胞性动脉炎，自身免疫性溶血性贫血，恶性贫血，结 节性多发性动脉炎。发烧，强直性脊柱炎，肾小球肾炎，结节病，皮肌炎，重症肌 无力，多肌炎，斑秃和白癜风。

9.参考文献:

1.Davidson,A.and B.Diamond,自身免疫性疾病.N Engl J Med,2001. 345(5):p.340-50.

2.Goding,J.W.,自身免疫性疾病.N Engl J Med,2001.345(23):p. 1707-8.

3.Bluestone,J.A.,耐受机制.Immunol Rev,2011.241(1):p.5-19.

4.Smilek,D.E.,M.R.Ehlers,and G.T.Nepom,恢复平衡:自体免疫性疾 病的免疫治疗组合.Dis Model Mech,2014.7(5):p.503-13.

5.Brackmann,H.H.,et al.,免疫耐受诱导:随着时间的推移，我们学到了 什么？血友病,2018.24Suppl 3:p.3-14.

6.Boonman,Z.F.,et al.,免疫耐受的维持依赖于正常的组织稳态.J Immunol,2005.175(7):p.4247-54.

7.Schep,S.J.,et al.,A型血友病免疫耐受诱导研究进展.Blood Rev, 2018.32(4):p.326-338.

8.Bardhan,K.,T.Anagnostou,and V.A.Boussiotis,PD1:PD-L1/2通路， 从发现到临床施用.Front Immunol,2016.7:p.550.

9.Thibult,M.L.,et al.,PD-1是一种新型的人B细胞活化调节因子.IntImmunol,2013.25(2):p.129-37.

10.Francisco,L.M.,P.T.Sage,and A.H.Sharpe,PD-1通路在耐受和 自身免疫中的作用.Immunol Rev,2010.236:p.219-42.

11.Amarnath,S.,et al.,PDL1-PD1轴将人TH1细胞转化为调节性T细胞. SciTransl Med,2011.3(111):p.111ra120.

12.Zhu,X.and J.Lang,可溶性PD-1和PD-L1在癌症预测和预后中的意 义.Oncotarget,2017.8(57):p.97671-97682.

13.Li,Y.,et al.,可溶性程序性死亡-1(sPD-1)和sPD-配体1在囊性 包虫病患者中的作用.Exp Ther Med,2016.11(1):p.251-256.

14.Alsaab,H.O.,et al.,PD-1和PD-L1检查点信号通路抑制癌症免疫治 疗:机制、组合和临床结果.Front Pharmacol,2017.8:p.561.

15.Zamani,M.R.,et al.,PD-1/PD-L和自身免疫：不断增长的关系.细 胞免疫,2016.310:p.27-41.

16.Liao,W.,et al.,PD-1和PD-L1检查点信号通路抑制肿瘤免疫治疗: 程序性死亡1-PD-L1轴的系统性激活保护系统性红斑狼疮模型免受肾炎的影响.Am J Nephrol,2017.46(5):p.371-379.

17.Nishimura,H.,et al.,PD-1受体缺失小鼠的自身免疫性扩张性心肌 病.科学,2001.291(5502):p.319-22.

18.Dinesh,R.K.,B.H.Hahn,and R.P.Singh,PD-1，性别，和自身免 疫.AutoimmunRev,2010.9(8):p.583-7.

19.Wang,C.J.,et al.,程序性死亡1配体1(PD-L1)在非肥胖性糖尿病 小鼠中的保护作用：转基因模型中的悖论.糖尿病,2008.57(7):p.1861-9.

20.Martinov,T.,et al.,PD-1通路介导的对自身免疫性糖尿病中胰岛 特异性CD4(+)T细胞亚群的调节.Immunoendocrinology(Houst),2016.3.

21.Constantinescu,C.S.,et al.,实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)作 为多发性硬化症(MS)模型.Br J Pharmacol,2011.164(4):p.1079-106.

22.Keir,M.E.,et al.,PD-L1的组织表达介导外周血T细胞的耐受.J Exp Med,2006.203(4):p.883-95.

23.Shashidharamurthy,R.,et al.,人IgG亚型免疫复合物与表达R和H 等位基因低亲和力Fcγ受体CD32A的细胞相互作用的动力学.J Immunol,2009. 183(12):p.8216-24.

24.Pritchard,N.R.and K.G.Smith,B细胞抑制受体与自身免疫. Immunology,2003.108(3):p.263-73.

25.Chu,S.Y.,et al.,CD19和FcgammaRIIb与Fc工程化抗体共作用抑制B 细胞受体介导的人B细胞原代活化.Mol Immunol,2008.45(15):p.3926-33.

26.Bruhns,P.and J.L.Teillaud,抑制性IgG受体表达细胞：抗CD40免 疫调节单克隆抗体功效的必备元件.癌症细胞,2016.29(6):p.771-773.

27.Desai,D.D.,et al.,树突状细胞上的Fc gamma受体IIB通过抑制效应 T细胞反应增强外周耐受性.J Immunol,2007.178(10):p.6217-26.

28.Dhodapkar,K.M.,et al.,选择性阻断人树突状细胞和单核细胞中的 抑制性Fcgamma受体(FcgammaRIIB)可诱导I型干扰素应答程序.J Exp Med,2007. 204(6):p.1359-69.

29.Gordon,J.R.,et al.,用于免疫疾病的免疫治疗的调节性树突状细 胞.FrontImmunol,2014.5:p.7.

30.Smith,K.G.and M.R.Clatworthy,FcgammaRIIB在自身免疫和感染： 进化和治疗的意义.Nat Rev Immunol,2010.10(5):p.328-43.

31.Nakamura,A.and T.Takai,FcgammaRIIB在胶原诱导关节炎发展中 的作用.Biomed Pharmacother,2004.58(5):p.292-8.

32.Callaghan,C.J.,et al.,抑制FcgammaRIIb信号通路对同种异体移 植存活的调节作用.J Immunol,2012.189(12):p.5694-702.

33.Watkins,A.A.,et al.,在狼疮相关动脉粥样硬化小鼠模型中，IRF5 的缺失可以改善狼疮，但会促进动脉粥样硬化和代谢功能障碍.J Immunol,2015. 194(4):p.1467-79.

34.Sage,A.P.and Z.Mallat,动脉粥样硬化的适应性免疫应答治疗策 略.Br JPharmacol,2017.174(22):p.3926-3939.

35.Fife,B.T.and K.E.Pauken,PD-1通路在自身免疫和外周耐受中的 作用.AnnN Y Acad Sci,2011.1217:p.45-59.

36.Ulges,A.,et al.,调节性T细胞对免疫和耐受的环境和组织特异性 调节.AdvImmunol,2016.132:p.1-46.

37.Roghanian,A.,et al.,旧受体的新发现:抑制性Fcγ受体 FcgammaRIIB(CD32B)的免疫调节功能.J Leukoc Biol,2018.

38.Mancardi,D.A.,et al.,高亲和力的人IgG受体FcgammaRI(CD64)促 进IgG介导的炎症、过敏反应和抗肿瘤免疫治疗.血液,2013.121(9):p.1563- 73.

39.Chiofalo,M.S.,et al.,Fc受体对人IgG在K562上的亚型特异性.细 胞免疫,1988.114(2):p.272-81.

40.Scholl,P.R.,D.Ahern,and R.S.Geha,IgG受体FcγRi和FcγRII 在人单核细胞系THP-1中诱导的蛋白酪氨酸磷酸化.J Immunol,1992.149(5):p. 1751-7.

序列表

<110> 陆云彪

<120> 下调人类免疫细胞活化的特异性双功能BY-001（嵌合蛋白PD-L1 /Fc-gamma1的同源多聚体组合成的活性成分）及其应用

<130> sequencelistingBY-001

<150> 62/689214

<151> 2018-06-24

<150> 16/190641

<151> 2018-11-14

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1350

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact 60

gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc 120

aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag 180

gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga gaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc 240

tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag 300

atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt 360

gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga 420

attttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac 480

cccaaggccg aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc 540

accaccaatt ccaagagaga ggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac 600

acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccat 660

agatctgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1080

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg cacgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1350

<210> 2

<211> 449

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu

1 5 10 15

Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr

20 25 30

Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu

35 40 45

Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile

50 55 60

Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser

65 70 75 80

Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn

85 90 95

Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr

100 105 110

Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val

115 120 125

Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val

130 135 140

Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr

145 150 155 160

Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser

165 170 175

Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn

180 185 190

Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr

195 200 205

Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Arg Ser Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys