草酸青霉菌K10及其产的几丁质酶和利用几丁质酶制备几丁寡糖的方法

摘要

本发明提供一种草酸青霉菌K10及其产的几丁质酶和利用几丁质酶制备几丁寡糖的方法，及利用草酸青霉菌K10产的几丁质酶对胶体几丁质进行酶解产几丁寡糖。一种草酸青霉菌K10，草酸青霉菌K10菌株已于2020年10月6日保藏在中国典型培养物保藏中心（武汉大学），保藏号为CCTCC NO：M 2020571。

说明书

技术领域

本发明涉及由几丁寡糖的制备，尤其涉及一种草酸青霉菌K10及其产的几丁质酶和利用几丁质酶制备几丁寡糖的方法。

背景技术

几丁质是自然界中含量除纤维素外的第二大天然多糖，广泛存在于虾蟹贝壳、昆虫的外骨骼和真菌细胞壁中。由于几丁质的结晶度高，且不溶于水，其应用受到很大的限制。而几丁质的降解产物几丁寡糖，由2-10个 N−乙酰氨基葡萄糖以糖苷键连接而成的一种小分子，具有优良的特性，如水溶性、温度和pH稳定性、抗菌、抗肿瘤、降血糖等活性，广泛用于农业、食品和制药等行业，具有广阔的市场发展前景。

目前市场上已有的几丁寡糖产品主要是通过化学法（酸水解几丁质）获得，但是化学法所使用的浓酸会对环境造成危害。相比于化学法，生物法（微生物发酵产酶）制备具有绿色、环境友好、反应温和、得率较高等特性，已经成为制备几丁寡糖的有效手段。

几丁质酶是目前生产几丁寡糖主要的酶，主要切割几丁质内部位点中的β-1,4糖苷键产生几丁寡糖。几丁质酶来源广泛，主要存在于细菌与真菌中。如采用嗜热古细菌

本发明是利用草酸青霉以胶体几丁质为底物，在发酵过程中降解几丁质的同时产生几丁质酶，再利用产生的几丁质酶对新配制的胶体几丁质进行酶解，完全转化为几丁寡糖。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种草酸青霉菌K10及其产的几丁质酶和利用几丁质酶制备几丁寡糖的方法，及利用草酸青霉菌K10产的几丁质酶对胶体几丁质进行酶解产几丁寡糖。

本发明的目的是以下述方式实现的：一种草酸青霉菌K10，草酸青霉K10（

一种几丁质酶，利用草酸青霉菌K10菌株以胶体几丁质为底物，在发酵过程中产生。

产几丁质酶的方法步骤为，（1）制备胶体几丁质；（2）制备包含胶体几丁质的产孢子培养基；（3）草酸青霉菌K10菌株产孢子培养；（4）制备包含胶体几丁质的产几丁质酶培养基；（4）在产几丁质酶培养基中添加孢子进行发酵产几丁质酶，并进行酶分离。

产孢子培养基，按质量分数计，包括胶体几丁质1-2%、胰蛋白胨2-4%、FeSO

产几丁质酶培养基，按质量分数计，包括胶体几丁质1-6%、胰蛋白胨2%-8%、FeSO

所述步骤（3）中，草酸青霉菌产孢子培养中，培养温度为26℃-30℃，培养时间为3d -7d。

所述步骤（5）中，在产几丁质酶培养基中添加孢子进行发酵产几丁质酶，并进行酶分离：接种草酸青霉菌K10菌株孢子后，于温度25℃-32℃、200rpm-250rmp下，发酵3d-5d；

发酵结束后，抽滤进行固液分离，收集滤液，滤液中含几丁质酶与几丁寡糖；往滤液中加入终质量分数为20%-50%的硫酸铵，于4℃缓慢搅拌，将几丁质酶盐析沉淀，然后离心分离，分别收集上清与沉淀物，上清中含几丁寡糖，沉淀物用pH6的磷酸缓冲液重悬，得含几丁质酶的粗酶液。

利用所述的几丁质酶制备几丁寡糖的方法，包括以下步骤，（1）制备包含胶体几丁质底物；（2）加入几丁质酶，酶解制备几丁寡糖；（3）.几丁寡糖浓缩、干燥。

胶体几丁质底物中，胶体几丁质的浓度为3-8% (m/v)。

所述步骤（2）中，酶解条件为：底物与酶用量比例为1g:（10-15）U、温度40-50℃，反应时间4-8h。

所述步骤（3）中，酶解产物几丁寡糖经过真空蒸发浓缩后浓度为10%-30%，或经喷雾干燥为粉末。

相对于现有技术，本发明提供一种草酸青霉菌K10，草酸青霉菌K10以胶体几丁质为底物，在发酵过程中降解几丁质的同时产生几丁质酶，产生的几丁质酶对胶体几丁质可以进行酶解，使几丁质完全转化为几丁寡糖。发酵后分离的几丁质酶酶活性可以达到30-54 U/mL，酶解产物几丁寡糖浓度可以达到28-75 mg/mL。

具体实施方式

一种草酸青霉菌K10，草酸青霉菌K10菌株已于2020年10月6日保藏在中国典型培养物保藏中心（武汉大学），保藏号为CCTCC NO：M 2020571。

一种几丁质酶，利用草酸青霉菌K10菌株以胶体几丁质为底物，在发酵过程中产生。

产几丁质酶的方法步骤为，（1）制备胶体几丁质；（2）制备包含胶体几丁质的产孢子培养基；（3）草酸青霉菌K10菌株产孢子培养；（4）制备包含胶体几丁质的产几丁质酶培养基；（4）在产几丁质酶培养基中添加孢子进行发酵产几丁质酶，并进行酶分离。

产孢子培养基，按质量分数计，包括胶体几丁质1-2%、胰蛋白胨2-4%、FeSO

产几丁质酶培养基，按质量分数计，包括胶体几丁质1-6%、胰蛋白胨2%-8%、FeSO

所述步骤（3）中，草酸青霉菌产孢子培养中，培养温度为26℃-30℃，培养时间为3d -7d。

所述步骤（5）中，在产几丁质酶培养基中添加孢子进行发酵产几丁质酶，并进行酶分离：接种草酸青霉菌K10菌株孢子后，于温度25℃-32℃、200rpm-250rmp下，发酵3d-5d；

发酵结束后，抽滤进行固液分离，收集滤液，滤液中含几丁质酶与几丁寡糖；往滤液中加入终质量分数为20%-50%的硫酸铵，于4℃缓慢搅拌，将几丁质酶盐析沉淀，然后离心分离，分别收集上清与沉淀物，上清中含几丁寡糖，沉淀物用pH6的磷酸缓冲液重悬，得含几丁质酶的粗酶液。这里的终质量分数为滤液中硫酸铵的最终质量分数。

利用所述的几丁质酶制备几丁寡糖的方法，包括以下步骤，（1）制备包含胶体几丁质底物；（2）加入几丁质酶，酶解制备几丁寡糖；（3）.几丁寡糖浓缩、干燥。

胶体几丁质底物中，胶体几丁质的浓度为3-8% (m/v)。

所述步骤（2）中，酶解条件为：底物与酶用量比例为1g:（10-15）U、温度40-50℃，反应时间4-8h。

所述步骤（3）中，酶解产物几丁寡糖经过真空蒸发浓缩后浓度为10%-30%，或经喷雾干燥为粉末。

本发明提供一种草酸青霉菌K10，草酸青霉菌K10以胶体几丁质为底物，在发酵过程中降解几丁质的同时产生几丁质酶，产生的几丁质酶对胶体几丁质可以进行酶解，使几丁质完全转化为几丁寡糖。

下面结合具体实例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是实例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。

结晶态几丁质粉末：80-200目，水分≤12%，购买于国内青岛云宙生物科技有限公司；其他物质来源是市售或者自配，分析纯级别；仪器为常规设备。

1、草酸青霉菌K10菌株分离:

（1）分散采集中国农业科学院油料作物研究所武汉基地的油菜田5个点的土壤，混合均匀，取50克混合样；

（2）配制富集培养基：以胶体几丁质为唯一碳源进行菌种富集。按以下质量分数配置富集培养基：胶体几丁质1%、硫酸铵2%、FeSO

（3）将50克混合土样加入400ml的富集培养基中，28℃200rpm培养3d；

（4）配制筛选培养基

按以下质量分数配置筛选培养基：胶体几丁质1%、胰蛋白胨2%、FeSO

（5）取富集培养好的菌液，进行系列稀释，分别将不同稀释度的菌液在筛选培养基平板上涂布分离，于28℃培养3d，能利用几丁质的微生物就可在平板上生长，形成单菌落；

（6）挑选单菌落进行鉴定，筛选到一株能分解利用几丁质为碳源的草酸青霉，记为K10，并进行保藏，草酸青霉菌K10菌株已于2020年10月6日保藏在中国典型培养物保藏中心（武汉大学），保藏号为CCTCC NO：M 2020571。

2、草酸青霉斜面培养：

（1）配制培养基：胶体几丁质1%、胰蛋白胨2%、FeSO

（2）待试管内培养基冷却后形成斜面，挑起筛选平板上生长的草酸青霉菌落，在斜面上划线接种，于28℃培养3d以上，待形成绿色孢子，即为斜面菌种，备用。

实施例1：

1.胶体几丁质制备，包括以下步骤：

（1）取1份质量的结晶态几丁质粉末，粒径为80目-200目，缓慢加入3-5倍体积的浓盐酸质量分数为37%，这里加入的为4倍，加入时同时缓慢搅拌，然后于4℃冰箱搅拌过夜12小时。

（2）从冰箱取出后，加入40%（m/v）的氢氧化钠，调节pH至中性。

（3）于8000rpm离心20min，去除上清，收集沉淀，即为胶体几丁质，其含水量为32%。

2. 草酸青霉产孢子培养，包括以下步骤：

（1）配制产孢子培养基

按以下质量分数配置产孢子培养基：胶体几丁质1%、胰蛋白胨2%、FeSO

（2）培养基121℃灭菌30min后，冷却，倒平板；

（3）挑取草酸青霉K10斜面菌种一环，于5mL无菌水中，摇匀分散，得孢子悬浮液；

（4）吸取200ul孢子悬浮液，均匀涂布于平板培养基表面；

（5）平板于28℃，倒置培养5d，平板上长满孢子。

3. 发酵产几丁质酶及酶的分离，包括以下步骤：

（1）配制产几丁质酶培养基（1000mL的三角瓶装液量100mL）；

按以下质量分数配置产几丁质酶培养基：胶体几丁质1%、胰蛋白胨2%、FeSO

（2）制备种子液

往长满草酸青霉孢子的平板中加入8mL无菌水，将孢子全部洗到无菌水中；

（3）接种

吸取2mL的种子液，接入产几丁质酶培养基中；

（4）发酵产酶

接种后的三角瓶于30℃、200rpm，发酵3d；

（5）酶的分离

发酵结束后，抽滤进行固液分离，收集滤液，其中含几丁质酶与几丁寡糖。往滤液中加入终质量分数为30%的硫酸铵，于4℃缓慢搅拌过夜13小时，将几丁质酶盐析沉淀。过夜后，于10000 rpm 4℃下离心15min，分别收集上清与沉淀物，上清中含几丁寡糖，沉淀物用pH6的磷酸缓冲液30mL重悬，得含几丁质酶的粗酶液，其酶活性为 30 U/mL。

4.几丁寡糖的制备，包括以下步骤：

（1）配制胶体几丁质底物

用纯水将胶体几丁质配成浓度为3%(m/v)的底物，用1mol/L的盐酸调pH至5.0左右。

（2）添加几丁质酶

往胶体几丁质底物中加入几丁质酶，其底物与酶用量对应比例为1g:10U。

（3）酶解反应

反应体系于水浴中磁力搅拌酶解，温度为45℃，反应时间6h。反应后，体系中初始浑浊的胶体几丁质转化为清澈溶液，说明几丁质酶解彻底，都转化为水溶性的几丁寡糖，几丁寡糖浓度为28 mg/mL。

（4）几丁寡糖收集

将前面发酵产酶过程中得到的几丁寡糖与酶解得到的几丁寡糖合并一起，经过真空蒸发（60℃、-0.08MPa）浓缩，得到10%浓度的液态几丁寡糖。

实施例2：

1.胶体几丁质制备，包括以下步骤：

（1）取1份质量的结晶态几丁质粉末，粒径为80目-200目，缓慢加入3-5倍体积的浓盐酸质量分数为37%，这里加入的为3倍，加入时同时缓慢搅拌，然后于4℃冰箱搅拌过夜14小时。

（2）从冰箱取出后，加入40%（m/v）的氢氧化钠，调节pH至中性。

（3）于8000rpm离心20min，去除上清，收集沉淀，即为胶体几丁质，其含水量为35%。

2. 草酸青霉产孢子培养，包括以下步骤：

（1）配制产孢子培养基

按以下质量分数配置产孢子培养基：胶体几丁质1.5%、胰蛋白胨3%、FeSO

（2）培养基121℃灭菌30min后，冷却，倒平板；

（3）挑取草酸青霉K10斜面菌种一环，于10mL无菌水中，摇匀分散，得孢子悬浮液；

（4）吸取200ul孢子悬浮液，均匀涂布于平板培养基表面；

（5）平板于28℃，倒置培养4d，至平板上长满孢子为止。

3. 发酵产几丁质酶及酶的分离，包括以下步骤：

（1）配制产几丁质酶培养基（1000mL的三角瓶装液量100mL）；

按以下质量分数配置产几丁质酶培养基：胶体几丁质3%、胰蛋白胨4%、FeSO

（2）121℃灭菌30min后，冷却；

（3）制取种子液：

往草酸青霉长满孢子的平板中加入8mL无菌水，将孢子全部洗到无菌水中；

（4）接种

吸取3mL的种子液，接入产几丁质酶培养基中；

（5）发酵产酶

接种后的三角瓶于28℃、220rpm，发酵4d；

（6）酶的分离

发酵结束后，抽滤进行固液分离，收集滤液，其中含几丁质酶与几丁寡糖。往滤液中加入终质量分数为40%的硫酸铵，于4℃缓慢搅拌过夜14小时，将几丁质酶盐析沉淀。过夜后，10000 rpm 4℃离心15min，分别收集上清与沉淀物，上清中含几丁寡糖，沉淀物用pH6的磷酸缓冲液40mL重悬，得含几丁质酶的粗酶液，其酶活性为 41U/mL。

4.几丁寡糖制备，包括以下步骤：

（1）配制胶体几丁质底物

胶体几丁质用纯水配成浓度为5% (m/v)的底物，用1mol/L的盐酸调pH至5.0左右。

（2）添加几丁质酶

往胶体几丁质底物中加入几丁质酶，其底物与酶用量对应关系为1g:12U。

（3）酶解反应

反应体系于水浴中磁力搅拌酶解，温度为40℃，反应时间6h。反应后，体系中初始浑浊的胶体几丁质转化为清澈溶液，说明几丁质酶解彻底，都转化为水溶性的几丁寡糖，浓度为46 mg/mL。

（4）几丁寡糖收集

将前面发酵产酶过程中得到的几丁寡糖与酶解得到的几丁寡糖合并一起，经过真空蒸发（60℃、-0.08MPa）浓缩，得到20%浓度的液态几丁寡糖。

实施例3：

1.胶体几丁质制备，包括以下步骤：

（1）取1份质量的结晶态几丁质粉末，粒径为80目-200目，缓慢加入3-5倍体积的浓盐酸质量分数为37%，这里加入的为5倍，加入时同时缓慢搅拌，然后于4℃冰箱搅拌过夜14小时。

（2）从冰箱取出后，加入40%（m/v）的氢氧化钠，调节pH至中性。

（3）于8000rpm离心20min，去除上清，收集沉淀，即为胶体几丁质，其含水量为42%。

2. 草酸青霉产孢子培养，包括以下步骤：

（1）配制产孢子培养基

按以下质量分数配置产孢子培养基：胶体几丁质2%、胰蛋白胨4%、FeSO

（2）培养基121℃灭菌30min后，冷却，倒平板；

（3）挑取草酸青霉K10斜面菌种一环，于10mL无菌水中，摇匀分散，得孢子悬浮液；

（4）吸取200ul孢子悬浮液，均匀涂布于平板培养基表面；

（5）平板于28℃，倒置培养3d，至平板上长满孢子为止。

3. 发酵产几丁质酶及酶的分离，包括以下步骤：

（1）配制产几丁质酶培养基（1000mL的三角瓶装液量100mL）；

按以下质量分数配置产几丁质酶培养基：胶体几丁质6%、胰蛋白胨8%、FeSO

（2）121℃灭菌30min后，冷却；

（3）制取种子液：

往草酸青霉长满孢子的平板中加入8mL无菌水，将孢子全部洗到无菌水中；

（4）接种

吸取5mL的种子液，接入产几丁质酶培养基中；

（5）发酵产酶

接种后的三角瓶于25℃、250rpm，发酵5d；

（6）酶的分离

发酵结束后，抽滤进行固液分离，收集滤液，其中含几丁质酶与几丁寡糖。往滤液中加入终质量分数为50%的硫酸铵，于4℃缓慢搅拌过夜13小时，将几丁质酶盐析沉淀。过夜后，10000 rpm 4℃离心15min，分别收集上清与沉淀物，上清中含几丁寡糖，沉淀物用pH6的磷酸缓冲液50mL重悬，得含几丁质酶的粗酶液，其酶活性为 54 U/mL。

4.几丁寡糖的制备，包括以下步骤：

（1）配制胶体几丁质底物

胶体几丁质用纯水配成浓度为8% (m/v)的底物，用1mol/L的盐酸调pH至5.0左右。

（2）添加几丁质酶

往胶体几丁质底物中加入几丁质酶，其底物与酶用量对应关系为1g:15U。

（3）酶解反应

反应体系于水浴中磁力搅拌酶解，温度为50℃，反应时间8h。反应后，体系中初始浑浊的胶体几丁质转化为清澈溶液，说明几丁质酶解彻底，都转化为水溶性的几丁寡糖，浓度为75 mg/mL。

（4）几丁寡糖收集

将前面发酵产酶过程中得到的几丁寡糖与酶解得到的几丁寡糖合并一起，经过真空蒸发（60℃、-0.08MPa）浓缩，得到30%浓度的液态几丁寡糖，再经喷雾干燥（140℃）得到几丁寡糖粉末。

实施例4：

1.胶体几丁质制备，包括以下步骤：

（1）取1份质量的结晶态几丁质粉末，粒径为80目-200目，缓慢加入3.5倍体积的浓盐酸质量分数为37%，加入时同时缓慢搅拌，然后于4℃冰箱搅拌过夜13小时。

（2）从冰箱取出后，加入35%（m/v）的氢氧化钠，调节pH至中性。

（3）于8000rpm离心20min，去除上清，收集沉淀，即为胶体几丁质，其含水量为37%。

2. 草酸青霉产孢子培养，包括以下步骤：

（1）配制产孢子培养基

按以下质量分数配置产孢子培养基：胶体几丁质1.8%、胰蛋白胨2.9%、FeSO

（2）培养基121℃灭菌30min后，冷却，倒平板；

（3）挑取草酸青霉K10斜面菌种一环，于10mL无菌水中，摇匀分散，得孢子悬浮液；

（4）吸取200ul孢子悬浮液，均匀涂布于平板培养基表面；

（5）平板于26℃，倒置培养7d，至平板上长满孢子为止。

3. 发酵产几丁质酶及酶的分离，包括以下步骤：

（1）配制产几丁质酶培养基（1000mL的三角瓶装液量100mL）；

按以下质量分数配置产几丁质酶培养基：胶体几丁质2%、胰蛋白胨6%、FeSO

（2）121℃灭菌30min后，冷却；

（3）制取种子液：

往草酸青霉长满孢子的平板中加入8mL无菌水，将孢子全部洗到无菌水中；

（4）接种

吸取2mL的种子液，接入产几丁质酶培养基中；

（5）发酵产酶

接种后的三角瓶于32℃、230rpm，发酵3d；

（6）酶的分离

发酵结束后，抽滤进行固液分离，收集滤液，其中含几丁质酶与几丁寡糖。往滤液中加入终质量分数为42%的硫酸铵，于4℃缓慢搅拌过夜12小时，将几丁质酶盐析沉淀。过夜后，10000 rpm 4℃离心15min，分别收集上清与沉淀物，上清中含几丁寡糖，沉淀物用pH6的磷酸缓冲液45mL重悬，得含几丁质酶的粗酶液，其酶活性为 43 U/mL。

4.几丁寡糖的制备，包括以下步骤：

（1）配制胶体几丁质底物

胶体几丁质用纯水配成浓度为6% (m/v)的底物，用1mol/L的盐酸调pH至5.0。

（2）添加几丁质酶

往胶体几丁质底物中加入几丁质酶，其底物与酶用量对应关系为1g:11U。

（3）酶解反应

反应体系于水浴中磁力搅拌酶解，温度为45℃，反应时间4h。反应后，体系中初始浑浊的胶体几丁质转化为清澈溶液，说明几丁质酶解彻底，都转化为水溶性的几丁寡糖，浓度为62mg/mL。

（4）几丁寡糖收集

将前面发酵产酶过程中得到的几丁寡糖与酶解得到的几丁寡糖合并一起，经过真空蒸发（60℃、-0.08MPa）浓缩，得到15%浓度的液态几丁寡糖。

实施例5：

1.胶体几丁质制备，包括以下步骤：

（1）取1份质量的结晶态几丁质粉末，粒径为80目-200目，缓慢加入4.5倍体积的浓盐酸质量分数为37%，加入时同时缓慢搅拌，然后于4℃冰箱搅拌过夜12小时。

（2）从冰箱取出后，加入45%（m/v）的氢氧化钠，调节pH至中性。

（3）于8000rpm离心20min，去除上清，收集沉淀，即为胶体几丁质，其含水量为40%。

2. 草酸青霉产孢子培养，包括以下步骤：

（1）配制产孢子培养基

按以下质量分数配置产孢子培养基：胶体几丁质1.2%、胰蛋白胨2.5%、FeSO

（2）培养基121℃灭菌30min后，冷却，倒平板；

（3）挑取草酸青霉K10斜面菌种一环，于7mL无菌水中，摇匀分散，得孢子悬浮液；

（4）吸取200ul孢子悬浮液，均匀涂布于平板培养基表面；

（5）平板于30℃，倒置培养4d，至平板上长满孢子为止。

3. 发酵产几丁质酶及酶的分离，包括以下步骤：

（1）配制产几丁质酶培养基（1000mL的三角瓶装液量100mL）；

按以下质量分数配置产几丁质酶培养基：胶体几丁质4.5%、胰蛋白胨4.5%、FeSO

（2）121℃灭菌30min后，冷却；

（3）制取种子液：

往草酸青霉长满孢子的平板中加入8mL无菌水，将孢子全部洗到无菌水中；

（4）接种

吸取4mL的种子液，接入产几丁质酶培养基中；

（5）发酵产酶

接种后的三角瓶于26℃、210rpm，发酵5d；

（6）酶的分离

发酵结束后，抽滤进行固液分离，收集滤液，其中含几丁质酶与几丁寡糖。往滤液中加入终质量分数为40%的硫酸铵，于4℃缓慢搅拌过夜12小时，将几丁质酶盐析沉淀。过夜后，10000 rpm 4℃离心15min，分别收集上清与沉淀物，上清中含几丁寡糖，沉淀物用pH6的磷酸缓冲液50mL重悬，得含几丁质酶的粗酶液，其酶活性为 38 U/mL。

4.几丁寡糖的制备，包括以下步骤：

（1）配制胶体几丁质底物

胶体几丁质用纯水配成浓度为4% (m/v)的底物，用1mol/L的盐酸调pH至5.0左右。

（2）添加几丁质酶

往胶体几丁质底物中加入几丁质酶，其底物与酶用量对应关系为1g:13U。

（3）酶解反应

反应体系于水浴中磁力搅拌酶解，温度为45℃，反应时间6h。反应后，体系中初始浑浊的胶体几丁质转化为清澈溶液，说明几丁质酶解彻底，都转化为水溶性的几丁寡糖，浓度为41 mg/mL。

（4）几丁寡糖收集

将前面发酵产酶过程中得到的几丁寡糖与酶解得到的几丁寡糖合并一起，经过真空蒸发（60℃、-0.08MPa）浓缩，得到25%浓度的液态几丁寡糖，再经120℃喷雾干燥得到几丁寡糖粉末。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，应当指出，对于本领域的及任何熟悉本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，及作出的若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。