一种长鳍真鲨年龄鉴定用素材的制备方法

摘要

本发明公开了一种长鳍真鲨年龄鉴定用素材的制备方法，先选取脊椎骨素材，然后包括如下步骤：(1)提取：自第一背鳍处取约3‑5节脊椎骨，冷冻保存；(2)清洗：切除脊椎骨上肌肉及结缔组织，并用蒸馏水冲洗，然后将脊椎骨置于沸水中煮5‑10min，除去难以清除的结缔组织，若仍有结缔组织附着，将其置于30％H2O2溶液中浸泡约1h‑2h，后用蒸馏水浸泡反复冲洗干净并烘干；(3)粗磨：在金相研磨机上使用120grits防水耐磨砂纸进行粗磨，将两面分别打磨至接近中心位置，约成3‑5mm厚的脊椎骨薄片。本发明对长鳍真鲨脊椎骨的纵截面进行打磨，用力均匀，打磨抛光的的脊椎骨切片用封片剂封片，保证轮纹能保持较长的时间。

说明书

技术领域

本发明涉及一种海洋生物年龄鉴定用素材的制备方法，特别涉及一种长鳍真鲨年龄鉴定用素材的制备方法。

背景技术

长鳍真鲨(Carcharhinus longimanus)隶属于真鲨目(Carcharhiniformes)真鲨科(Carcharhinidae)，是一种大型中上层鲨鱼，位于食物链顶端，曾是热带海域资源量最丰富的物种之一，也是常见的金枪鱼延绳钓兼捕鱼种之一。然而，随着近些年来过度捕捞的加剧以及海洋环境的恶化，长鳍真鲨资源量出现严重衰退，现已被国际自然保护联盟(IUCN)列为濒危物种。

鱼类年龄信息是进行渔业资源评估的基础，在种群动力学研究中，精确的年龄与生长信息有助于预测鱼类资源变动。脊椎骨具有稳定储存生长信息的特点，是研究鲨鱼类年龄和生长最有效的材料；脊椎骨呈双凹型，脊椎骨上轮纹特征为宽阔的不透明轮纹和狭窄的半透明轮纹交替排列，呈同心圆状。不透明轮纹形成于较为温暖的生长较快春夏季，半透明轮纹形成于温度较低生长缓慢的秋冬季，当年的不透明轮纹和翌年的半透明轮纹交界处即为年轮。

长鳍真鲨具有生长缓慢、性成熟期晚、繁殖周期长、寿命长等特征，使得其对捕捞压力承受能力极低，故加强长鳍真鲨年龄与生长的研究有助于评估其资源状况变动。其脊椎骨作为一种生长信息载体，它能稳定的储存机体输入的生长信息，揭示其生长发育过程。但随着鱼类年龄增长,脊椎骨半径的增大,靠近外缘的轮纹逐渐密集,甚至重叠，因此，选择何种年龄鉴定方法至关重要。

发明内容

本发明提供了一种长鳍真鲨年龄鉴定用素材的制备方法，其目的在于，通过染色法使完整脊椎骨上轮纹更加清晰，解决了较小脊椎骨切片不易研磨、研磨过程中易受损、研磨后轮纹清晰度不高等问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种长鳍真鲨年龄鉴定用素材的制备方法，先选取脊椎骨素材，然后包括如下步骤：

(1)提取：自第一背鳍处取约3-5节脊椎骨，冷冻保存；

(2)清洗：切除脊椎骨上肌肉及结缔组织，并用蒸馏水冲洗，然后将脊椎骨置于沸水中煮5-10min，除去难以清除的结缔组织，若仍有结缔组织附着，将其置于30％H

(3)粗磨：在金相研磨机上使用120grits防水耐磨砂纸进行粗磨，将两面分别打磨至接近中心位置，约成3-5mm厚的脊椎骨薄片；

优选地，不同的尺寸脊椎骨使用不同的素材，所述步骤(1)提取的是较大脊椎骨素材。

优选地，在所述步骤(3)粗磨后，增加如下两个步骤：

固定：用强力速粘胶将纵切片粘在载玻片上，椎体中心面朝下；

磨片：先后分别使用600grits、1200grits的防水耐磨砂纸打磨切片，并随时在透射光解剖镜下观察其研磨程度，直至轮纹较为清晰，切片研磨厚度约为1mm时为最佳，将样品放至样品盒中待年龄鉴定。

优选地，所述脊椎骨素材选用研磨轮纹不清晰的脊椎骨及脊椎骨较小难以直接研磨的素材，

优选地，所述研磨轮纹不清晰的脊椎骨及脊椎骨较小难以直接研磨的素材制备方法包含如下步骤：

(1)提取：自第一背鳍处取约3-5节脊椎骨，冷冻保存；

(2)清洗：切除脊椎骨上肌肉及结缔组织，并用蒸馏水冲洗，然后将脊椎骨置于沸水中煮5-10min，除去难以清除的结缔组织，若仍有结缔组织附着，将其置于30％H

(3)染色：将干燥的完整脊椎骨置于蒸馏水中浸泡12h，用酒精漂洗2次后用蒸馏水冲洗干净，每隔16h使用4％KOH漂洗3次，最后置于1％KOH作为母液、质量浓度为0.01％的茜素红溶液中12h，取出后，使用1％KOH溶液浸泡1h，最终晾干。

优选地，较大脊椎骨素材的直径≥10mm的个体，

优选地，所述脊椎骨较小难以直接研磨的素材的直径＜10mm的个体。

本发明的有益效果是：

本发明方法是对较大脊椎骨样本(直径≥10mm)和较小脊椎骨样本(直径<10mm)及轮纹不清晰样本的长鳍真鲨年龄鉴定用素材进行制备，根据实验发现多数直径小于10mm较小脊椎骨的长鳍真鲨样本及研磨后轮纹不清晰的脊椎骨样本适宜利用完整脊椎骨染色法进行素材制备，通过试验确定茜素红染色为最佳；而直径大于等于10mm的脊椎骨较大，轮纹在边缘会出现重叠，选择进行切片观察，由于脊椎骨材质中具部分软骨，纵切片制备素材效果会更佳。

长鳍真鲨脊椎骨的制片是一个复杂而精细的过程，制片效果的好坏直接关系到年龄鉴定的准确性及可靠性；染色剂处理可以加深年轮的清晰度，对鉴定的精确性尤为重要。本发明通过染色法使完整脊椎骨上轮纹更加清晰，解决了较小脊椎骨切片不易研磨、研磨过程中易受损、研磨后轮纹清晰度不高等问题，提供一种能够快速准确适用不同大小长鳍真鲨脊椎骨年龄鉴定用素材的制备方法，制备出的素材极大的缩短了鉴定时间，保证了较高的鉴定成功率，同时使研磨后的脊椎骨轮纹能保持较长的时间。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明直径≥10mm的长鳍真鲨脊椎骨形态示意图；

图2为本发明直径≥10mm的长鳍真鲨脊椎骨形态纵切片示意图；

图3为本发明直径＜10mm的长鳍真鲨脊椎骨染色图；

图中各符号代表：

1、椎体；2、椎体中心；3、椎体中心面；4、生长轮纹。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

本发明公开了一种长鳍真鲨年龄鉴定用素材的制备方法，不同的尺寸脊椎骨使用不同的素材；

参见图1、图2所示，较大脊椎骨(直径≥10mm)素材制备方法包括如下步骤：

(1)提取：自第一背鳍处取约3-5节脊椎骨，冷冻保存；

(2)清洗：切除脊椎骨上肌肉及结缔组织，并用蒸馏水冲洗，然后将脊椎骨置于沸水中煮5-10min，除去难以清除的结缔组织，若仍有结缔组织附着，将其置于30％H

(3)粗磨：在金相研磨机上使用120grits防水耐磨砂纸进行粗磨，将两面分别打磨至接近中心位置，约成3-5mm厚的脊椎骨薄片，制成椎体中心面3；

固定：用强力速粘胶将纵切片粘在载玻片上，椎体中心面朝下；

磨片：先后分别使用600grits、1200grits的防水耐磨砂纸打磨切片，并随时在透射光解剖镜下观察其研磨程度，直至轮纹较为清晰，生长轮纹4，切片研磨厚度约为1mm时为最佳，将样品放至样品盒中待年龄鉴定。

参见图3所示，较小脊椎骨(直径＜10mm)及研磨轮纹不清晰脊椎骨素材的制备方法包含如下步骤：

(1)提取：自第一背鳍处取约3-5节脊椎骨，冷冻保存；

(2)清洗：切除脊椎骨上肌肉及结缔组织，并用蒸馏水冲洗，然后将脊椎骨置于沸水中煮5-10min，除去难以清除的结缔组织，若仍有结缔组织附着，将其置于30％H

(3)染色：将干燥的完整脊椎骨置于蒸馏水中浸泡12h，用酒精漂洗2次后用蒸馏水冲洗干净，每隔16h使用4％KOH漂洗3次，最后置于1％KOH作为母液、质量浓度为0.01％的茜素红溶液中12h，取出后，使用1％KOH溶液浸泡1h，最终晾干，生长轮纹4清晰可见。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。