一种液相质谱固相萃取法检测精神类药物浓度的方法

摘要

本发明涉及一种液相质谱固相萃取法检测精神类药物浓度的方法，包括以下步骤：A、对待检测样品进行前处理；所述前处理具体采用固相萃取的方法进行；B、配制不同浓度的精神类药物的标样，然后进行液相质谱检测，并绘制标准曲线；C、对步骤A处理后得到的待检测样品进行液相质谱检测，即得所述精神类药物浓度。本发明使用的液相色谱串联质谱法，它通过各类药物质核比不同来检测药物浓度，该方法特异性强，灵敏度高。

说明书

技术领域

本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种检测精神类药物浓度的方法，尤其涉及一种液相质谱固相萃取法检测人血清中的精神类药物浓度的方法。

背景技术

现有精神类治疗药物的主要特点有：药物作用机制复杂、副作用多而强、神经类疾病易反复发作，治疗时间一般较长，需长期服药甚至终身用药；药代动力学和药效动力学方面存在显著的个体差异，药物在体内浓度波动较大，有研究表明在药物剂量几乎相同的情况下，不同个体体内稳态药物浓度可相差20倍以上。所以，精神类药物的上述特点需要更为精准的追踪患者用药依从性的手段，而治疗药物监测是较为理想的方法，目前临床上已经有相当数量的精神类药物可以根据其血浆浓度来调整用药剂量。

血药浓度是影响药物疗效和药物毒副作用的一大因素。血药浓度过低，药物疗效不佳，浪费治疗时间与治疗费用；而血药浓度过高，则可能会产生药物不良反应，危害患者健康与生活质量。精神科药物往往治疗窗较窄，如奥氮平治疗浓度(20-80ng/ml)和中毒浓度(100ng/ml)非常的接近，因此监测血药浓度指导临床用药是非常有必要的。

目前已有的精神类药物浓度检测的方法现在主要有三类技术：第一类技术是免疫学技术，它通过抗原抗体结合来检测药物浓度，但由于有些药物难以制备相应的抗原抗体所以能检测的药物并不多，并且由于抗原抗体的非特异性结合会使结果产生偏差；第二类技术是高压液相色谱法，它通过流动相使待测药物进入色谱柱,在柱内各成分被分离后进入检测器进行检测，液相色谱所配备的检测器主要是紫外检测器，但由于有些精神类药物治疗浓度较低，紫外检测器灵敏度无法达到要求。第三类为本发明使用的液相色谱串联质谱法，它通过各类药物质核比不同来检测药物浓度，该方法特异性强，灵敏度高；但现有采用液相色谱串联质谱法对精神类治疗药物浓度进行检测时，采用的前处理方法为液液萃取法，这样的前处理方法存在偏移较大的问题。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种液相质谱固相萃取法检测人血清中的精神类药物浓度的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种液相质谱固相萃取法检测精神类药物浓度的方法，包括以下步骤：

A、对待检测样品进行前处理；所述前处理具体采用固相萃取的方法进行；

B、配制不同浓度的精神类药物的标样，然后进行液相质谱检测，并绘制标准曲线；

C、对步骤A处理后得到的待检测样品进行液相质谱检测，即得所述精神类药物浓度。

优选地，步骤A中，所述待检测样品来自人血清。

优选地，步骤A中，所述待检测样品的制备为：在人血清中加入精神类药物内标，然后采用PBS稀释，混合后静置，即得。

优选地，所述人血清、精神类药物内标和PBS的体积比为10:1:10；所述精神类药物内标的浓度为200ng/ml。

优选地，所述前处理的方法具体为：

A1、对孔固相萃取板进行活化，每孔加入200ul甲醇，下面放置废液板，在正压固相萃取仪上，设置压力值为1psi，用氮气将孔中液体吹至废液板中，使固相萃取板吹干；

A2、固相萃取板吹干后，每孔加入200ul超纯水，正压固相萃取仪设置压力值为1psi，再次使固相萃取板吹干；

A3、将待检测样品全部加入孔固相萃取板中，正压固相萃取仪设置压力值为3psi，继续使固相萃取板吹干；

A4、在孔固相萃取板中加入200ul 95％甲醇-水溶液，正压固相萃取仪设置压力值为1psi；

A5、然后再对孔固相萃取板通过以正压固相萃取仪设置压力值为8-9psi，用氮气吹1min；

A6、对孔固相萃取板的每孔中加入50ul甲醇，孔固相萃取板下方放置用于上样的96孔板，进行洗脱，正压固相萃取仪设置压力值为1psi；

A7、96孔板中确认收集到液体后，再次向固相萃取板中加入50ul甲醇,吹干，96孔板盖上专用的盖子，前处理完成。

所述前处理中，采用的压力和氮吹强度呈正相关，如果压力过大，液体下滴速度过快会导致萃取不彻底，本方法压力值经过前期测试，控制在每秒钟1-2滴均匀下落。

优选地，所述固相萃取板中，采用的吸附剂填料为N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物。

优选地，步骤B和C中，所述进行液相质谱检测时，需运用Ms1 Scan和DaughterScan确定精神类药物的母离子和子离子，并确定调谐文件的各项参数。

优选地，步骤B和C中，所述进行液相质谱检测时，采用的流动相包括流动相A和流动相B；所述流动相A为0.1％甲酸、2mmol/L甲酸铵形成的水溶液；流动相B为甲醇。

优选地，步骤B和C中，所述进行液相质谱检测时，采用的液相方法为：

若不按照此流动相比例和梯度进行时，则会影响待测药物出峰时间，信号强度。且若采用的流动相B为其他溶剂，如使用有机溶剂乙腈作为流动相B时，则导致峰行会出现拖尾现象。

优选地，所述精神类药物包括奥氮平。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明首次采用的固相萃取板是一种水可浸润性的强亲水性聚合物，具有独特的亲水-疏水平衡性。为简化固相萃取操作而设计，特定采用N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物作为吸附剂填料，不仅充分利用了水可浸润性和反相保留特性，而且操作流程更简单，无需对吸附剂进行平衡步骤，可以用更少的操作步骤获得更洁净的样品的方法对待测样品进行前处理，可去除待测样品中基质中的蛋白质、盐、脂肪和磷脂等常见干扰物质，从而优化了处理流程，提高了提取效率。

2、本发明的检测方法通过方法学的双重标准确认，保证了检验结果的可靠性。

3、本发明方法的准确性可达到奥氮平比例系统误差＝5.83％，精密度可达到批内：奥氮平浓度低值CV＝1.91％，奥氮平浓度中值CV＝3.57％，奥氮平浓度高值CV＝3.30％；

批间：奥氮平浓度低值CV＝5.79％，奥氮平浓度中值CV＝4.87％，奥氮平浓度高值CV＝6.04％。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为批间精密度统计分析结果；

图2为最佳拟合曲线和一阶拟合曲线的关系，表明本实验的曲线和一阶拟合曲线的高度相关性。

图3为实测值与一阶拟合值之差的偏差结果，表明该偏差在可接受范围内。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本实施例提供了一种液相质谱固相萃取法检测精神类药物奥氮平浓度的方法，包括以下步骤：

1、在质谱仪中运用Ms1 Scan和Daughter Scan确定奥氮平的母离子和子离子，并确定调谐文件的各项参数；优化后的各项参数如下：

质谱检测采用电喷雾离子源(ESI),正离子MRM扫描模式。

离子源参数：

化合物质谱参数：

2、确定色谱方法中的流动相和液相方法

采用的流动相包括流行相A：0.1％甲酸-2mmol/L甲酸铵-水溶液；流动相B：甲醇。采用的液相方法如表1所示：

表1

3、绘制标准曲线

取180ul空白血清然后加入20ul不同浓度(50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml)的标准品至200ul，然后加入20ul 200ng/ml奥氮平-D3内标，再用200ul PBS进行稀释，混合溶液涡旋后静置，得不同浓度的标准溶液。

采用步骤5的前处理方法对不同浓度的标准溶液进行前处理，然后将前处理后的标准溶液上样到步骤1和2进行确定了运行条件后的质谱仪中进行检测，根据检测结果绘制标准曲线。

4、待检测样品的制备

取收集的人血清200ul，加入20ul 200ng/ml待测目标物内标，再用200ul PBS进行稀释，混合溶液涡旋后静置，即得待检测样品。

5、对待检测样品进行前处理

(1)对孔固相萃取板进行活化，每孔加入200ul甲醇，下面放置废液板，在正压固相萃取仪上，设置压力值为1psi左右，至氮气将孔中液体吹至废液板中(几秒)；

(2)固相萃取板吹干后，每孔加入200ul超纯水，正压固相萃取仪设置压力值为1psi左右，再次吹干(几秒)；

(3)将待检测样品用吸管全部加入孔板中，正压固相萃取仪设置压力值为3psi左右，继续吹干(几秒)；

(4)加入200ul 95％甲醇-水溶液,去除杂质，正压固相萃取仪设置压力值为1psi左右(几秒)；

(5)正压固相萃取仪设置压力值为8-9psi，1min；

(6)每孔加入50ul甲醇，固相萃取板下方放置用于上样的96孔板，进行洗脱，正压固相萃取仪设置压力值为1psi左右(几秒)；

(7)接收板中确认收集到液体后，再次向过滤板中加入50ul甲醇,吹干，接收板盖上专用的盖子，前处理完成。

6、对前处理后的标本进行检测

将前处理后的标本上样到步骤1和2确定了运行条件后的质谱仪中进行检测，即得检测结果。

对比例1

本对比例与实施例1的方法基本相同，不同之处仅在于：本对比例不进行步骤5的前处理，而是采用常规的液液萃取法进行前处理。

以奥氮平为例：分别使用实施例1和对比例1的前处理方法对低、中、高三个浓度的标本进行检测，对检测结果和理论浓度进行偏移评估。结果如表2所示，表明：固相萃取和液液萃取虽都在可接受范围内(小于±15％)，但固相萃取法的偏移要小于液液萃取法，表明固相萃取法前处理标本效果更好。

对比例2

本对比例与实施例1的方法基本相同，不同之处仅在于：本对比例进行前处理的步骤中，步骤(1)-(7)设置的压力值均为实施例1的各压力值的2倍。

以奥氮平为例：分别采用实施例1的压力值和对比例2的压力值对低、中、高三个浓度的标本进行检测，对检测结果和理论浓度进行偏移评估。结果如表2所示，表明：高于实施例1的压力值的低值样本已超过可接受范围(小于±15％)，表明对比例1采用的压力值不适用。

表2

效果验证1:正确度验证

目的：评价仪器测试结果与接受参考值之间的一致程度。

方法：定量检测方法的回收实验是评估准确度的方法之一，用于评估定量检测方法准确测定待测分析物的能力，结果用回收率表示。

实验样本的基本要求和制备方法：

(1)选择合适浓度的常规检测样本，分为体积相同的3份。

(2)在其中2份样本中加入不同浓度相同体积的待测物标准液制备待回收分析样本，加入体积小于原体积的10％，制成2个不同加入浓度的待回收分析样本，计算加入的待测物的浓度。

(3)在另一份样本中加入同样体积的无待测物的溶剂，制成基础样本。

结果判断：

计算项目平均回收率的差值需小于±10％；

计算样本检测均值需小于理论浓度±15％；

计算系统比例误差需小于1/2TEA。

采用实施例1方法获得的检测结果为:奥氮平4个样本回收率与平均回收率的差值分别为-7.04％、-9.57％、7.99％、8.61％<±10％；奥氮平的4个样本检测均值的理论浓度<±15％；奥氮平比例系统误差＝5.83％<1/2TEA12.5％，故奥氮平的回收实验(准确度)可接受。

效果验证2:精密度验证

1、重复精密度

目的：考察仪器检测方法的随机误差

方法：制备3个浓度标本各20份进行：连续重复测定20次，计算SD，CV，得到批内精密度。

结果判断：高、中、低三个浓度需小于1/4TEA。

采用实施例1方法所得结果如表3所示，结果显示：

奥氮平浓度低值CV＝1.91％＜1/4TEA6.25％，奥氮平浓度中值CV＝3.57％＜1/4TEA6.25％，奥氮平浓度高值CV＝3.30％＜1/4TEA6.25％，故奥氮平批内精密度符合要求。

表3.重复性精密度验证试验数据记录表

2、批间精密度

目的：考察目前实验室检测方法批间精密度。

方法：制备3个浓度标本，每个批次每个浓度样本分5次进行处理，连续测定3个批次，总样本数为45份，分别评估每个浓度样本的批内精密度和总精密度。

结果判断：高、中、低三个浓度需小于1/3TEA。

采用实施例1方法所得结果(见表4)如下：

奥氮平浓度低值CV＝5.79％<1/3TEA8.33％；奥氮平浓度中值CV＝4.87％<1/3TEA8.33％；奥氮平浓度高值CV＝6.04％<1/3TEA8.33％，故奥氮平批间精密度通过验证。

表4.批间精密度验证试验数据记录表

由图1(图1中各曲线代表正常的批间差异)和表5所示的批间精密度验证统计结果可见，水平1、2、3，(低、中、高水平浓度)的批内重复性验证和室内重复性验证均通过。

表5

效果验证3：可报告范围

目的：在确定项目检测上限的同时检测其上下限是否呈线性关系，从而保证该浓度范围检测结果的准确性。

方法：根据CLIS EP6-A和WS/T 408-2012，制备一份高浓度标本和一份低浓度标本，按照EP6-A中的稀释方案进行稀释，得到11个浓度水平的样本。

结果判断：根据EP6-A的方法对结果进行统计分析，判断线性是否符合临床需求。

采用实施例1方法所得结果如下表6和表7、图2、图3所示：

根据EP6-A的方法对结果进行统计分析，判断线性5-200ng/ml通过验证。

表6.线性范围验证试验数据记录表

表7.线性范围统计分析表

效果验证4：生物参考区间

目的：本实验药物浓度参考区间使用AGNP共识指南-2017版，对所使用的参考区间进行验证评价。

方法：收集20例临床用药有效的患者血清标本及时检测，要求性别均匀分布，对参考范围进行验证，只允许5％的数据超过所验证的参考范围，否则需建立参考范围。

结果判断：R≥95％即合格，认为实验室参考区间验证通过。

采用实施例1方法结果如下表8所示：本实验室所检测的20个标本其检测结果20个均在验证区间内，故本实验室参考区间验证通过。

表8.生物参考区间数据及验证记录表

备注：信息栏代表的是溯源性，可以追溯到具体样本。

效果验证5：携带污染率(残留)

目的：LC-MS是由连续流路组成，这种一体化的检测系统会增加高浓度样本残留风险，通过携带污染率实验来验证本系统不存在明显的携带污染率。

方法：制备一个高浓度标本、一个低浓度标本连续重复进样；进样模式为：低-低-低-高-高-低-高-高-低-低-低-低-高-高-低-高-高-低-高-高-低，统计分析得出的数据。

结果判断：高低值标本转换-低低值标本转换＜低低值转换样本3SD，认为该方法不存在明显的携带污染率。

采用实施例1方法检测的结果如下表9所示：高低值标本转换-低低值标本转换＜低低值转换样本3SD，奥氮平高-低值转换样本＝0.12＜1.34低低值转换样本3SD，故认为该方法不存在明显的携带污染率。

表9.携带污染率数据及验证记录表

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。