一种判断罕见遗传性疾病的评估方法

摘要

本发明公开了一种判断罕见遗传性疾病的评估方法，它包括深度表型分析、全外显子组测序、基因突变的鉴定和过滤、结合遗传模式和疾病表型的突变优化结合全外显子组测序和人类表型本体，可以帮助临床医生及时判断和评估罕见遗传性疾病的致病因素，提高罕见遗传性疾病的可评估率，为确定合适的治疗措施和临床管理策略提供依据，为家庭提供遗传咨询和产前评估，减少类似患儿的出生，减轻家庭和社会的经济负担。因此该方法对于判断高度表型异质性和低发病率的遗传性疾病具有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明属于遗传性疾病判断评估以及致病基因领域，具体涉及判断未明原因罕见遗传性疾病的评估方法。

背景技术

目前，在世界医学上约有4600种疑难罕见病的致病和遗传机制相对明确，但仍有>50％的罕见遗传性疾病患者未得以明确判断。与常见疾病相比，罕见疑难病的相关研究水平明显滞后。由于对疑难罕见病的发病机制认识有限，诊疗手段均显不足。传统上，针对不明原因的罕见遗传性疾病的临床实验室判断评估技术包括神经影像学，代谢筛查，基因检测(例如，核型分析(karyotype),染色体微阵列分析(chromosomal microarrayanalysis),临床外显子组测序(medical exome sequencing,MES),与靶向疾病基因panel)，以及侵入性检测等。随着下一代测序技术的不断完善和生物信息学技术的高速发展，使得基因组数据以及新基因突变的发现呈现爆炸式增长。但是，若不能有效建立基因组学信息与临床表型的相关，就不能很好地解释复杂的基因变异以及生物学医学相关问题。

在基因检测开展之前，大部分遗传性疾病仅仅依靠表型信息是无法判断的。表型数据包括定量数据(体重，身高)、定性数据(行为)，照片，临床特征描述，病史，体格检查以及生化检查。表型信息的检测项目包括侵入性检测(如：血检，组织检测)和非侵入性检测(如：测心率，进行X光检测)。临床医生决策是否需要做这些检测时需要结合相应的临床指标加以判断。在罕见疾病的判断过程中应包括患者父母的表型信息。在基因检测前后，表型信息对临床判断策略的决策至关重要。基因检测之前，表型信息可以辅助锁定要研究的区域，帮助筛选检验项目；而在基因检测之后，表型信息可以与基因信息关联起来对疾病进行解释。例如，一位病人患有主动脉病；而多个基因的变异都有主动脉病的发病有关，主动脉病不同亚型的临床表现之间也有重叠。Loeys-Dietz综合征和Marfan综合征的表型非常相近，但前者是TGF-beta受体基因(TGFBR1,TGFBR2)发生了突变，而后者是FBN1基因发生了突变。相反，Ectopia Lentis综合征和Marfan综合征都是FBN1基因发生的突变，但是表型却有所不同。因此，将表型信息和基因型信息结合起来，即建立基因型-表型明确相关,对疾病的判断评估至关重要。

人类表型本体论(HPO,human phenotype ontology)是一个与7000多种疾病相关的表型异常的标准化词汇库，被全世界成千上万的研究人员、临床医生、信息学家和电子健康记录系统所使用。其对临床异常的详细描述和可计算的疾病定义，使人类表型本体成为罕见病领域深表型的事实标准。已有研究人员结合先天性肌无力综合症患者的全外显子测序数据和人类表型本体编码的表型，得出基于人类表型本体的表型分析有助于发现该疾病患者的致病性变异。

不同的临床基因检测各有优劣。靶向疾病基因panel的检测对临床有特异表型但遗传异质性较强，对需要进行分辨判断的病种较为合适，比如耳聋、心肌病等；但基因panel的临床功效在很大程度上除了取决于临床医生对病种的临床判断的把握，也取决于已知致病基因能解释这类疾病的比例。此外，由于新的致病基因不断被发现，因此基因panel也需不断被更新。临床外显子组测序(MES)策略包含所有已知的致病基因。但是，由于新致病基因的发现速度很快，同时以往我们认为的致病基因事实上不是或还没有足够的证据支持是确凿的致病基因，因此该策略也具有相应的缺陷。全基因组测序(WGS)已经开始常规性地用到拷贝数变异(CNV)的分析上，而且成本不超过目前一般的染色体芯片；但是，由于成本的缘故(序列变异的检测要求覆盖度需>30X)，目前全基因组测序尚未常规性地用于测序变异的临床检测。全外显子组测序(WES)包含绝大部分编码的区域，虽然实际内容因公司产品设计有部分差别，再加上在测序过程中难免会有一些区域的覆盖度不够，但这些局限不足以影响全外显子测序的广泛应用。此外，全外显子组测序除了能检测已知遗传病的序列变异外，新近发现的致病基因也会得以检测，同时也有机会发现新的候选致病基因。因此，全外显子组测序能够以相对更低的检测成本创造更高的临床价值，在有条件时，对临床表型复杂、临床表型不特异、临床判断不明或因为病人的临床表型还没有表现的病例，全外显子组测序是理想的基因检测手段，也是发现新致病基因的有效策略。

当前阶段，遗传性疾病的判断周期长、可判断评估概率较低，加上我们对疾病基因致病机理的了解还不够充分，同一基因会以不同的变异方式导致不同的疾病，共享人群数据库中缺乏足够的中国人群参照数据，这些都给我们分析变异的临床意义增加了难度。因此，本发明结合人类表型本体标准化的异常表型及全外显子组测序数据，利用临床相关性和跨物种表型比较来确定外显子组序列的优先级，以及用于变异频率、预测致病性和系谱分析的大量其他计算过滤系统，筛选候选变异，用于发现新的疾病基因或孟德尔疾病的鉴别判断评估，在临床上有着重要的意义。

发明内容

为客户上述技术的不足，本发明提供了一种结合人类表型本体和全外显子组测序用于判断罕见遗传性疾病的评估方法。结合了表型和基因型数据，通过详细的分析得到统计学证据，根据疾病分层为每位患者提供精准判断评估。

本发明采用的技术方案是：一种判断罕见遗传性疾病的评估方法，它包括以下步骤：

步骤一，深度表型分析，采集所有家系成员表型信息，排除利用传统基因检测或代谢筛查可以判断的患者，留下未明原因的核心家系，基于人类表型本体系统进行表型标准化，先从临床病史中得到中文的表型描述，再利用中文HPO数据库进行查询和匹配，得到HPO编号，再从HPO数据库里得到该表型本体对应的名称和所属系统；

步骤二：全外显子组测序，对核心家系成员进行外周血全外显子组测序，并根据基因组分析工具的最佳指南，得到以核心家系为单位的突变文件VCF(variant callingfile)；

步骤三：基因突变的鉴定和过滤，以家系为单位，将家系表型信息,PED文件，以及突变的VCF文件一起用于基于表型匹配计算，结合表型和全外显子测序数据对符合遗传模式的候选基因变异进行优先排序用于判断评估，最终得以精准的遗传学判断和评估。

优化的，所述的步骤一中的表型标准化，是指从医院电子化电子病历中收集了各种临床记录，包括病史，实验室检查，以及放射学报告，经由临床医生对每个先证者提取符合症状的表型信息。

优化的，所述的步骤二中的全外显子组测序，是采集核心家系成员的外周血，使用QIAamp DNA Blood Mini试剂盒(Qiagen，德国)从外周血淋巴细胞中提取基因组DNA，然后通过超声仪(Covaris，Woburn MA)将其片段化为250-300bp，使用安捷伦SureSelect HumanAll Exon V6试剂盒构建测序文库，全外显子组测序选择北京基因组学中心的illuminaHiSeqXten测序平台，从核心家系获得配对末端长度为150bp的测序数据，平均测序深度约为30×。

优化的，所述的步骤三中的基因突变的鉴定和过滤，是使用比对工具BWA将全外显子组测序读数比对到参考基因组hg19，应用GATK(v.4.1)最佳指南流程进行单核苷酸变异(SNV)和小的插入和缺失(indels)鉴定，并使用GATK的标准过滤流程进行初步过滤，在突变鉴定之后，按照ACMG/AMP指南利用InterVar将突变注释并分为五类，包括致病性，可能致病性，不确定性(VUS，variant of unknown significance)，可能良性和良性，同时，获得突变在1000基因组计划(1000G)或基因组聚集数据库(gnomAD，v.2.0.2)中的次要等位基因频率(minor allele frequency，MAF)；在ClinVar，OMIM(omim.org)和HGMD等数据库来鉴定与神经发育障碍有关的已知致病变异。

进一步的，所述的评估方法还包括符合遗传模式和疾病表型的突变优化，为了确定潜在的致病突变，从而进行遗传判断，通过整合已知人类疾病和小鼠模型之间的表型相似性计算来对突变进行优先排序(即，跨物种比较)，并根据突变致病性，MAF(<0.1％)和遗传模式评估突变，从而将基因型和表型信息进行充分结合，运用于未知原因的遗传性疾病判断评估。

本发明的有益效果在于：本发明结合全外显子组测序和人类表型本体，可以帮助临床医生及时判断和评估罕见遗传性疾病的致病因素，提高罕见遗传性疾病的可评估率，为确定合适的治疗措施和临床管理策略提供依据，为家庭提供遗传咨询和产前评估，减少类似患儿的出生，减轻家庭和社会的经济负担。因此该方法对于判断高度表型异质性和低发病率的遗传性疾病具有重要的意义。

对于已有明确治疗方法的遗传病，明确的遗传判断结果有助于早期判断和治疗，可有效降低伤残率和病死率；对于缺乏有效治疗措施的遗传病，也有利于判断预后，试验新疗法，帮助患儿父母做出合理的医疗决策。

附图说明

图1为本发明的评估方法流程图。

图2为本发明中表型本体在已判断和未判断的家系中的分布情况图。NS代表不显著，*代表显著性为p值小于0.05.

图3为本发明的实施例中神经发育障碍的核心家系遗传学判断评估结果图，其中(A)22个家谱的判断及其遗传模式；(B)突变模式和新发突变的分布统计。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的说明。

如图1所示，一种判断罕见遗传性疾病的评估方法，它包括以下步骤：

步骤一，深度表型分析，采集所有家系成员表型信息，排除利用传统基因检测或代谢筛查可以判断的患者，留下未明原因的核心家系，基于人类表型本体系统进行表型标准化，从医院电子化电子病历中收集了各种临床记录，包括病史，实验室检查，以及放射学报告，经由临床医生对每个先证者提取符合症状的表型信息，先从临床病史中得到中文的表型描述，再利用中文HPO数据库进行查询和匹配，得到HPO编号，再从HPO数据库里得到该表型本体对应的名称和所属系统；

步骤二：全外显子组测序，对核心家系成员进行外周血全外显子组测序，并根据基因组分析工具的最佳指南，得到以核心家系为单位的突变文件VCF(variant callingfile)；采集核心家系成员的外周血，使用QIAamp DNA Blood Mini试剂盒(Qiagen，德国)从外周血淋巴细胞中提取基因组DNA，然后通过超声仪(Covaris，Woburn MA)将其片段化为250-300bp，使用安捷伦SureSelect Human All Exon V6试剂盒构建测序文库，全外显子组测序选择北京基因组学中心的illuminaHiSeqXten测序平台，从核心家系获得配对末端长度为150bp的测序数据，平均测序深度约为30×。

步骤三：基因突变的鉴定和过滤，以家系为单位，将家系表型信息,PED文件，以及突变的VCF文件一起用于基于表型匹配计算，结合表型和全外显子测序数据对符合遗传模式的候选基因变异进行优先排序用于判断评估，最终得以精准的遗传学判断和评估。使用比对工具BWA将全外显子组测序读数比对到参考基因组hg19，应用GATK(v.4.1)最佳指南流程进行单核苷酸变异(SNV)和小的插入和缺失(indels)鉴定，并使用GATK的标准过滤流程进行初步过滤，在突变鉴定之后，按照ACMG/AMP指南利用InterVar将突变注释并分为五类，包括致病性，可能致病性，不确定性(VUS，variant of unknown significance)，可能良性和良性，同时，获得突变在1000基因组计划(1000G)或基因组聚集数据库(gnomAD，v.2.0.2)中的次要等位基因频率(minor allele frequency，MAF)；在ClinVar，OMIM(omim.org)和HGMD等数据库来鉴定与神经发育障碍有关的已知致病变异。

符合遗传模式和疾病表型的突变优化，为了确定潜在的致病突变，从而进行遗传判断，通过整合已知人类疾病和小鼠模型之间的表型相似性计算来对突变进行优先排序(即，跨物种比较)，并根据突变致病性，MAF(<0.1％)和遗传模式评估突变，从而将基因型和表型信息进行充分结合，运用于未知原因的遗传性疾病判断评估。

实施例

在本实施例中，一共收集了45个传统检测方法未能判断的神经发育障碍核心家系(以家系为单位的PED(pedigree)文件如表1)。

表1数据采集表

对45个未明原因的神经发育障碍核心家系的深度表型标准化。先从临床病史中得到中文的表型描述，再利用中文HPO数据库(http://www.chinahpo.org/)进行查询和匹配，得到HPO编号，再从HPO数据库里得到该表型本体对应的名称和所属系统。我们自主将其进行缩写，以便于后续分析。采集所有家系成员表型信息，基于人类表型本体系统进行表型标准化，结果如表2所示。

表2表型标准化统计表

我们对核心家系成员进行外周血全外显子组测序，并根据基因组分析工具的最佳指南，得到以核心家系为单位的45个突变文件VCF(variant calling file).随后，以家系为单位，我们将家系表型信息,PED文件，以及突变的VCF文件一起用于基于表型匹配计算，目的在于结合表型和全外显子测序数据对符合遗传模式的候选基因变异进行优先排序用于判断评估。最终，22个家系得以精准的遗传学判断和评估，如图3所示。

另外，我们做了相应的一代测序(Sanger sequencing)验证部分得以精准判断评估的家系示例，值得注意的是，如图2所示，在得以判断的家系中，所涉及的非神经系统相关的表型数量(n＝22)明显高于未判断出的家系(n＝23)(Wilcoxon检验，p＝9×10^-4)，进步一说明了表型的重要性；同时也说明了针对具有综合征特征的家系，这样的方法更加有效。