一种确定动物脑桥被盖背外侧下核（SLD）解剖功能学边界的实验方法

摘要

本发明涉及动物SLD核团的定位方法。本发明提供一种确定受试对象脑桥被盖背外侧下核(SLD)解剖功能学边界的方法，所述方法包括：1)向SLD下游核团‑腹侧巨细胞网状核(GiV)‑立体定向注射逆向转运病毒载体，在神经元选择性启动子作用下，该逆向转运病毒载体可特异性地在上游传出神经元中表达第一标记，2)对受试者进行REM睡眠剥夺与反弹实验，并通过第二标记确定‑功能活性神经元，其中第二标记与第一标记不同，和3)根据第一标记和第二标记共标融合范围确定SLD核团的解剖功能学边界。通过对神经纤维投射和睡眠生理学研究方法的巧妙联合运用，本发明可以更为直观、准确地确定SLD核团的解剖功能学边界。

说明书

技术领域

本发明涉及医学和生物技术领域。具体而言，本发明涉及确定动物脑桥被盖背外侧下核(SLD)解剖功能学边界的实验方法。

背景技术

人的一生中有三分之一的时间是在睡眠中度过的，对睡眠生理与病理的研究也一直都是医学研究的前沿和热点领域。在诸多睡眠阶段与时相中，快动眼睡眠(rapid eyemovement sleep，REM)在记忆的存储、整理、学习能力的整合和睡眠维持方面发挥着重要作用。脑桥被盖背外侧下核(sublaterodorsal tegmental nucleus，SLD)是快动眼睡眠期(REM)启动、维持和其间肌张力松弛(muscle atonia)调控的关键核团，确定其准确的解剖功能学边界(anatomo-functional delimitation)对于阐明REM睡眠相关疾病的病因、病理生理、发病机制、相关动物模型制备及药物研发方面无疑具有至关重要的意义。

20世纪50年代法国INSERM科学家Michel Jouvet首次发现了REM睡眠(异相睡眠，paradoxical sleep)并通过一系列实验证实机械毁损脑桥被盖区可诱导实验动物出现REM睡眠期梦境演绎行为(dream-enactment behavior)[1，2]。在此研究基础上，MichelJouvet做出推测：完整的脑桥被盖(intact pontine tegmentum)是REM睡眠发生和其间肌张力松弛状态维持的前提条件[2]。此后，数代睡眠科学家围绕动物脑桥被盖区开展了深入的研究：在这些研究中几乎无一例外地都采用了机械破坏或电凝毁损脑桥被盖不同区域的方法(图1)，然后根据睡眠记录和行为观测结果确定脑桥被盖不同区域在REM睡眠发生及维持中的调控作用。相应地，在不同的历史时期，吻侧脑桥网状核(nucleus reticularispontis oralis，RPO)[3]、脑桥抑制区(pontine inhibitory area，PIA)[4]、α外周核(peri-α nucleus，peri-α)[5，6]等不同的称谓被提出用来指代脑桥被盖区域中调控REM发生和肌张力松弛状态维持的功能核团。但是，这种单纯机械毁损的方法仅能说明破坏的“因”导致了行为的“果”，难以准确界定脑桥被盖不同调控区域的解剖学范围大小，更不能体现其确切的上下游纤维联结和功能调控关系，因此存在较大的局限性。

小鼠作为医学科学和生命科学研究中的重要工具和载体，准确绘制的小鼠脑核团解剖位置和坐标图谱无异于神经科学研究中的“导航图”。然而，对于小鼠SLD核团的定界，目前通用的由Keith B.J.Franklin和George Paxinos所著的小鼠脑图谱(The MouseBrain in Stereotaxic Coordinates)[11]在圈注该核团时仍然参照人体解剖学图谱标注，由于人类和动物的解剖学差异，该标注方法至今未能被睡眠医学研究学界学者所普遍认可。

参考文献

1.Jouvet M.Paradoxical sleep-a study of its nature and mechanisms[M]//Progress in brain research.Elsevier，1965，18：20-62.

2.Roussel B，Pujol J F，Jouvet M.Effets des lésions du tegmentumpontique sur les états de sommeil chez le rat[J]Arch.ital.Biol.，1976，114：188-209.

3.Carli G，Zanchetti A.A study of pontine lesions suppressing deepsleep in the cat[J].Archives italiennes de biologie，1965.

4.Hendricks J C，Morrison A R，Mann G L.Different behaviors duringparadoxical sleep without atonia depend on pontine lesion site[J].Brainresearch，1982，239(1)：81-105.

5.Sakai K，Luppi P H，Salvert D，et al.Localization of cholinergicneurons in the cat lower brain stem[J].Comptes rendus de l′Academie dessciences.Serie III，Sciences de la vie，1986，303(8)：317-324.

6.Ledoux L，Sastre JP，Buda C，et a1.Alterations in c-fos expressionafter different experimental procedures of sleep deprivation in the cat[J].Brain research，1996，735(1)：108-118.

7.Boissard R，Gervasoni D，Schmidt M H，et al.The rat ponto-medullarynetwork responsible for paradoxical sleep onset and maintenance：a combinedmicroinjection and functional neuroanatomical study[J].European Journal ofNeuroscience，2002，16(10)：1959-1973.

8.Fort P，Bassetti C L，Luppi P H.Alternating vigilance states：newinsights regarding neuronal networks and mechanisms[J].European Journal ofNeuroscience，2009，29(9)：1741-1753.

9.Clément O，Sapin E，Bérod A，et al.Evidence that neurons of thesublaterodorsal tegmental nucleus triggering paradoxical(REM)sleep areglutamatergic[J].Sleep，2011，34(4)：419-423.

10.Valencia Garcia S，Libourel P A，Lazarus M，et al.Geneticinactivation of glutamate neurons in the rat sublaterodorsal tegmentalnucleus recapitulates REM sleep behaviour disorder[J].Brain，2016，140(2)：414-428.

11.Franklin K B J，Paxinos G.The mouse brain in stereotaxiccoordinates[M].New York：：Academic press，2008.

发明内容

鉴于SLD核团的功能主要体现在启动、维持和调控REM睡眠期骨骼肌张力松弛方面，本发明考虑结合上下游核团投射和SLD核团所发挥的生物学功能对SLD进行定界，即确定其解剖功能学边界(anatomo-functional delimitation)。

在一些实施方案中，本发明考虑采用下游核团逆向示踪结合特定行为学干预的手段分别从解剖学纤维示踪和生物学功能操控两个路径确定SLD的解剖功能学边界。

在一些实施方案中，本发明涵盖下述各项所述的技术方案。

1.一种确定受试对象脑桥被盖背外侧下核(SLD)解剖功能学边界的方法，所述方法包括：

1)向SLD下游核团-腹侧巨细胞网状核(GiV)-定向注射逆向转运病毒载体，其中所述逆向转运载体包含神经元选择性启动子，在神经元选择性启动子作用下，该逆向转运载体可特异性地在上游传出神经元中表达第一标记，

2)对受试对象进行REM睡眠剥夺与反弹实验，并通过第二标记确定功能活性神经元，其中第二标记与第一标记不同，和

3)根据第一标记和第二标记共标融合范围确定SLD核团的解剖功能学边界。

2.项目1所述的方法，其中所述逆向转运载体包括病毒载体，例如腺相关病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体，例如腺相关病毒(AAV)载体，例如重组腺相关病毒(rAAV)载体，例如AAV2-retro，rAAV2-retro。

3.项目1或2所述的方法，其中所述神经元选择性启动子包括hSyn、CaMKIIa、GAD1、GAD2、Slc32a1、TH、vGLUT1/2、ChAT、DAT、SERT、ePet等神经元特异性启动子。

4.项目1-3任一项所述的方法，其中所述第一标记和/或第二标记包括酶标记，例如荧光素酶，荧光素，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，荧光标记，例如荧光蛋白，例如深蓝色荧光蛋白如Sirius、蓝色荧光蛋白如EBFP、Azurite、EBFP2、TagBFP、青色荧光蛋白如ECFP、Cerulean、CyPet、mTurquoise、mTFP1(Teal)、Midoriishi-Cyan、绿色荧光蛋白如GFP、UKG、EGFP、Emerald、Superfolder、黄色荧光蛋白如YFP、sfYFP、EYFP、Venus、Citrine、YPet、PhiYFP、橙色荧光蛋白如mHoneydew、mBanana、mKO、mKOκ、mOrange、mOrange2、红色荧光蛋白如TagRFP、TagRFP 158T、mRuby、mCherry、深红色荧光蛋白如Katushka、mKate、mKate2、mPlum、E2-Crimson、mNeptune、Tag657、eqFP650、eqFP670、近红外荧光蛋白如mIFP，细菌光敏色素蛋白如BphP、藻胆蛋白如藻红蛋白CPE、藻红蓝蛋白PEC、藻蓝蛋白CPC、变藻蓝蛋白APC，生物素/抗生物素蛋白，离子指示剂。

5.项目1-4任一项所述的方法，其中所述第二标记用于标记活动的神经元，例如应激诱导的活动神经元，例如活动神经元特异性表达的基因和/或蛋白，例如应激诱导表达的基因和/或蛋白，例如即刻早期基因和/或蛋白，例如c-fos、zenk、c-jun等。

6.项目1-5任一项所述的方法，其中所述受试者包括非人哺乳动物，例如非人灵长类动物，例如啮齿动物，例如猴、马、牛、犬、猫、小鼠、大鼠和猪等。

7.项目1-5任一项定义的逆向转运载体和第二标记的组合试剂，和/或所述组合试剂用于确定受试者脑桥被盖背外侧下核(SLD)解剖功能学边界的用途。

8.一种用于确定受试者脑桥被盖背外侧下核(SLD)解剖功能学边界的试剂盒，其包括项目1-6中任一项定义的逆向转运载体和第二标记。

9.项目8所述的试剂盒，其还包括：1)注射工具和/或试剂，和/或2)睡眠剥夺实验工具，例如水平台、REM睡眠剥夺笼和/或反弹笼。

在一些实施方案中，本发明提供本文描述的逆向转运载体和第二标记在用于确定受试者脑桥被盖背外侧下核(SLD)解剖功能学边界的试剂盒中的用途。

在一些实施方案中，本发明可以另外使用适当的标记，神经元特异性标记，神经胶质细胞特异性标记，用于辅助脑核团边界的确定。

在一些实施方案中，本发明提供一种试剂盒(tool kit)，其可用于用于确定受试者脑桥被盖背外侧下核(SLD)解剖功能学边界。在一些实施方案中，所述试剂盒包括容器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书。在一些实施方案中，适合的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等。所述容器可以由各种材料如玻璃或塑料制成。容器装有组合物，所述组合物是单独地或与可有效确定核团的另一种试剂或组合物结合。组合物中至少一种试剂是本文的载体和/或标记。此外，所述试剂盒可以包含：(a)其中包含组合物的第一容器，其中所述组合物包含本文的载体；和(b)其中包含组合物的第二容器，其中所述组合物包含第二标记和/或其它相关试剂。在一些实施方案中，本发明的标记可以与适当的抗体偶联，例如活动神经元特异性表达的蛋白的特异性抗体，用于鉴别活动神经元。本发明的试剂盒还可以包括包装说明书，所述包装说明书指明所述组合物可以用于确定核团边界。所述试剂盒还可以包括第二或第三容器，所述第二或第三容器包含缓冲剂，如注射用水，磷酸盐缓冲盐水，葡萄糖溶液，还可以包括其他材料，如其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。

在一些实施方案中，本发明设计具有神经元选择性的可逆向转运的能表达荧光蛋白的病毒载体。在一些实施方案中，本发明重新规划适合小鼠的脑内定向注射和睡眠剥夺-反弹方案。在一些实施方案中，本发明可以包括对脑电频谱、睡眠时程和/或睡眠结构进行分析和/或量化的步骤。

在一些实施方案中，本发明包括下述步骤：1.SLD下游核团(GiV)定向注射病毒逆向示踪(解剖标记)：可以通过向双侧SLD下游核团-腹侧巨细胞网状核(GiV)-定向注射神经元选择性可表达荧光蛋白的逆向转运病毒载体从而逆向标记出SLD核团中与下游核团GiV有纤维联结关系的神经元(如绿色荧光标记)的分布范围。本发明方案中在解剖标记部分可以采用对SLD下游核团(GiV)定向注射神经元选择性(例如hSyn-突触素做启动子)可表达荧光蛋白的逆向转运病毒的策略来做逆向纤维示踪。相较于传统的逆向转运小分子(如CTb)，该方法中采用的病毒载体可选择性侵染SLD投射到下游核团的神经纤维末梢并在其中扩增、复制并表达标记例如绿色荧光蛋白(GFP)，从而直观、便捷地标记出SLD核团中与下游核团GiV有纤维联结关系的神经元。

在一些实施方案中，本发明包括下述步骤：2.REM睡眠剥夺(RSD)与反弹(RSR)实验(功能标记)：借助REM睡眠剥夺法，实验动物接受REM睡眠剥夺，睡眠剥夺实验结束后转移至饲养笼，给予充足睡眠，在此期间缺失的REM睡眠将集中并大量反弹(REM sleep rebound)，脑桥被盖区域调控REM睡眠发生、维持的神经元活化，大量表达神经元活动标记物；睡眠反弹实验结束后处死动物，借助免疫荧光技术，可标记出调控REM睡眠发生及维持的SLD核团神经元(如红色荧光标记)的分布范围。

在一些实施方案中，水平台REM睡眠剥夺法(flower-pot technique)实验设备技术参数示例如下：a.水平台包括上部的螺纹塑料垫和下部的不锈钢柱，REM睡眠剥夺笼是在反弹笼基础上加装水平台并盛水，水量在笼中需达到一定高度，具体各部件构造及尺寸参数可以参见图4。

本发明方案中根据小鼠的体长特点设计了针对小鼠的睡眠剥夺水平台，并使之与透明有机玻璃材质的REM睡眠剥夺笼相匹配，睡眠剥夺与反弹过程中持续不间断进行多导睡眠记录(PSG)，经睡眠结构分析可证实实验期间能有效剥夺去小鼠的REM睡眠而不影响其它时相睡眠的进行。相较于传统方法，最大程度保证了实验的标准化、规范化和定量化。

在一些实施方案中，本发明包括下述步骤：3.解剖标记与功能标记融合定界(共标定界)：根据以上解剖标记(绿色荧光标记)和功能标记(红色荧光标记)神经元共标融合范围确定SLD核团的解剖功能学边界(例如参见图5)。

相较于传统方法，本发明方案中对逆向示踪标记出的神经元(例如绿色荧光标记)和睡眠剥夺反弹实验标记出的功能活化神经元(例如红色荧光标记)采用多色荧光标记手段，可更为直观、明确地观察到双标神经元的分布范围，从而使共标定界更为直观且便捷易行。

附图说明

图1：机械毁损脑桥被盖不同区域研究其对REM睡眠的调控作用：a电凝破坏猫脑桥被盖区域诱导其REM睡眠期出现RBD样行为(pontine cat model，M.Jouvet，1950s)；b机械破坏动物脑桥被盖及基底区域图示(改编自法国国家健康与医学研究院网站)。

图2：逆向示踪定标纤维联结神经元示意图：向GiV立体定向注射逆向转运荧光病毒载体标记与之有纤维联结关系的神经元在脑桥被盖区域的分布(注：scp-小脑上脚；MoV-三叉神经运动核；LPGi-巨细胞网状旁核，py-锥体束，下同)。

图3：REM睡眠剥夺与反弹实验示意图通过REM睡眠剥夺与反弹实验确定调控REM睡眠发生及维持神经元在脑桥被盖区域的分布(注：PSG-多导睡眠记录)。

图4：水平台、REM睡眠剥夺笼、反弹笼部件构造及尺寸示意图(Φ-直径，P-螺距，h-高度)。

图5：解剖标记和功能标记神经元共标融合确定SLD核团边界示意图。

图6：SLD解剖功能边界定界示例流程图。

图7：GiV核团病毒原始注射位点(a，AP-6.72mm)、脑桥被盖病毒逆向示踪标记区(b，AP-5.20mm)及相应示意图(c，AP-5.20mm)。

图8：REM睡眠剥夺(RSD)与反弹(RSR)实验中EEG频谱图和睡眠时相图(其中RSD仅显示最后24h)小鼠进入RSR阶段后，REM睡眠(R)集中密集出现。

图9：REM睡眠剥夺(RSD)与反弹(RSR)实验中三种睡眠-觉醒时相(Wake/SWS/REM)统计a-b.Wake/SWS/REM在RSD和RSR状态下的时长累积百分比统计图。

图10：脑桥被盖区域(AP：-5.34/-5.20/-5.02mm)SLD核团解剖标记(GFP)、功能标记(c-fos)及共标融合荧光图示。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明，所描述的各个具体实施方式不是限制性的，并且可以相互组合。

本发明采用下游核团逆向示踪结合特定行为学干预的手段分别从解剖学纤维示踪和生物学功能操控两个路径确定SLD的解剖功能学边界，具体的技术方案如下：

1.SLD下游核团(GiV)定向注射病毒逆向示踪(解剖标记)：通过向双侧SLD下游核团-腹侧巨细胞网状核(GiV)-定向注射神经元选择性可表达荧光蛋白的逆向转运病毒载体从而逆向标记出SLD核团中与下游核团GiV有纤维联结关系的神经元(绿色荧光标记)的分布范围(见图2)。

本发明方案中在解剖标记部分采用了对SLD下游核团(GiV)定向注射神经元选择性(hSyn-突触素做启动子)可表达荧光蛋白的逆向转运病毒的策略来做逆向纤维示踪。相较于传统的逆向转运小分子(如CTb)，该方法中采用的病毒载体可选择性侵染SLD投射到下游核团的神经纤维末梢并在其中扩增、复制并表达绿色荧光蛋白(GFP)从而直观、便捷地标记出SLD核团中与下游核团GiV有纤维联结关系的神经元的分布范围(见图2)。

2.REM睡眠剥夺与反弹实验(RSD&RSR，功能标记)：病毒注射14天后，借助水平台REM睡眠剥夺法，实验动物接受连续3天的REM睡眠剥夺，至第3天中午12:00睡眠剥夺实验结束后转移至饲养笼给予3小时的充足睡眠，在此期间缺失的REM睡眠将大量反弹(REM sleeprebound)，脑桥被盖调控REM睡眠发生、维持的神经元活化，大量表达神经元活动标记物c-fos。睡眠反弹实验结束后，使用免疫荧光技术即可标记出调控REM睡眠发生及维持的SLD核团神经元(红色荧光标记)的分布范围(见图3)。

水平台REM睡眠剥夺法(flower-pot technique)实验设备技术参数：

a.水平台由上部的螺纹塑料垫和下部的不锈钢柱组成，REM睡眠剥夺笼是在反弹笼基础上加装水平台并盛水，水深需达到塑料垫与钢柱交界水平，具体各部件构造及尺寸参数如下(见图4)。

本发明方案中根据小鼠的体长特点设计了针对小鼠的睡眠剥夺水平台并使之与透明有机玻璃材质的REM睡眠剥夺笼相匹配，睡眠剥夺与反弹过程中持续不间断进行多导睡眠记录(PSG)，经睡眠结构参数分析可证实实验期间能有效剥夺去小鼠的REM睡眠而不影响其它时相睡眠的进行。相较于传统方法，最大程度保证了实验的标准化、规范化和定量化。

3.解剖标记与功能标记融合定界(共标定界)：根据以上解剖标记(绿色荧光标记)和功能标记(红色荧光标记)神经元共标融合范围确定SLD核团的解剖功能学边界(见图5)。

相较于传统方法，本发明方案中对逆向示踪标记出的神经元(绿色荧光标记)和睡眠剥夺反弹实验标记出的功能活化神经元(红色荧光标记)采用双色荧光标记手段，可更为直观、明确地观察到双标神经元的分布范围，从而使共标定界更为直观且便捷易行。

根据以上规划的技术方案，本发明从SLD下游核团-GiV-逆向纤维示踪、REM睡眠剥夺与反弹及脑桥被盖区域共标融合定界三个方面确定SLD的解剖功能学边界(见图6)，现结合具体的实验实例分述如下：

实验1.SLD下游核团逆向示踪(解剖标记)

1.实验材料及主要试剂

C57BL/6J小鼠购自中国科学院实验动物资源平台；逆向转运病毒载体AAV2/retro-hSyn-eGFP购自上海泰儿图生物(货号：S0237)

2.实验方法

选取8-10周龄C57BL/6J小鼠(体重18-22g)，以1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(80ml/Kg)后头部备皮固定于立体定位注射仪(RWD，瑞沃德)上，调整前后囟高度一致后使用微量注射气泵(WPI，世界精密仪器)分别向双侧GiV核团(坐标-AP：-6.72mm，ML：±0.25mm，DV：-5.60mm)缓慢泵入可表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的逆向转运病毒载体(AAV2/retro-hSyn-eGFP)30nl，注射完毕停针10min后缓慢退针，生物胶封闭颅骨钻孔、缝皮后送回恢复笼，注意术后保温促进苏醒。

3.实验结果

下位延髓(AP：-6.72mm)层面荧光切片可见GiV核团区域密集绿色荧光点，是为逆向荧光病毒感染的轴突截面(见图7a)；脑桥被盖层面(AP：-5.20mm)小脑上脚(scp)腹内下侧区域可见团聚性绿色荧光聚集区，是为逆向荧光病毒标记的与下游GiV核团存在纤维联结的SLD核团神经元聚集部位(见图7b)；图7c为对应的示意图。

实验2.REM睡眠剥夺与反弹(RSD&RSR，功能标记)

1.实验材料及主要设备

骨科胶水、牙科水泥购自上海玉研仪器；排针、排线等电极制备原材料购自铭泰鑫电子；数据采集软件Spike 2购自英国CED公司；睡眠数据解析软件SleepSign购自日本Kissei Comtec公司

2.实验方法

立体定向注射术后14天，1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(80ml/Kg)后固定于立体定向注射仪(RWD，瑞沃德)上，备皮、切开、分离后分别在右侧额叶(AP/ML：+1.50/-0.80mm)和顶叶皮层(AP/ML：+1.50/-1.00mm)钻孔后埋置EEG记录电极螺丝，深度以紧贴硬脑膜表面为宜，EMG记录电极则插入颈下斜方肌，然后以牙科水泥固定电极于颅骨表面，缝皮后送回恢复笼，电极埋置术后恢复7天。7天后中午12:00将动物转入REM睡眠剥夺笼内并连接睡眠记录仪开始睡眠剥夺实验，实验过程中保证12h光照-12h黑暗的昼夜节律和充足的水和食物供应；至第3天中午12:00结束睡眠剥夺实验，将小鼠转移至REM睡眠反弹笼给予3小时充足睡眠(换笼过程中睡眠持续记录)，下午15:00解除睡眠记录设备后导出数据，使用SleepSign软件解析小鼠在实验期间的脑电频谱、睡眠时相变化及其在清醒(wake，W)、慢波睡眠(slow wave sleep，SWS)及快动眼睡眠(REM，R)三种睡眠-觉醒时相中的时长百分比。

3.实验结果

对REM睡眠剥夺(RSD)与反弹(RSR)期间睡眠数据解析可知：RSD期间REM睡眠分布稀疏且持续时间极短，在总的睡眠-觉醒时长中占比仅0.07％；进入RSR阶段后REM睡眠大量反弹，密集出现，跃升至10.93％(见图8&9)。由此可推测，RSR期间调控REM发生及维持的核团神经元(SLD)将大量活化，表达神经元活动标记物c-fos。

实验3.脑桥被盖区解剖标记与功能标记共标融合定界

1.实验材料及主要试剂

PBS缓冲液(1×)购自上海生工(货号：E607008)；多聚甲醛粉剂购自Sigma-Aldrich(货号：158127)；c-fos一抗购自Millipore公司(货号：ABE457)；山羊抗兔红色荧光二抗(Alexa Fluro 568)购自Invitrogen公司(货号：A-11011)；DAPI细胞核荧光染料购自Sigma-Aldrich公司(货号：160166)2.实验方法

REM睡眠剥夺与反弹实验结束后麻醉小鼠，经心脏灌流固定后取脑，蔗糖梯度脱水后OCT胶包埋速冻，冰冻切片机(Leica)连续切片。挑选脑桥被盖层面切片，经c-fos一抗(1∶10000稀释)及相应二抗(1∶1000稀释)分别孵育48h和2h后DAPI复染胞核，封片镜检。选取脑桥被盖三个典型层面(AP：-5.34/-5.20/-5.02mm)切片，共聚焦荧光显微镜(Olympus)扫描拍照，观察绿色荧光和红色荧光阳性标记神经元的在脑桥被盖区域的分布范围，圈注共标阳性神经元(黄色荧光标记)的分布范围即为SLD核团的解剖功能学边界。

3.实验结果

在脑桥被盖三个典型层面(AP：-5.34/-5.20/-5.02mm)上小脑上脚(scp)腹内下侧可见一绿色荧光(GFP)和红色荧光(c-fos)共标融合聚集区(黄色荧光标记)，圈注该共标融合区域即为SLD的解剖功能学边界(见图10)。