用于生产VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒颗粒的LDLR阴性包装细胞系

摘要

本发明提供了包装细胞系在生产VSV‑G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒中的用途，其中所述包装细胞系是低密度脂蛋白受体(LDLR)阴性，任选地所述包装细胞系稳定表达VSV‑G。公开了一种制备所述VSV‑G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的方法，以及通过所述方法获得的所述颗粒。

说明书

技术领域

本发明涉及用于生产逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的包装细胞系的领域，特别是在其表面上不表达低密度脂蛋白(LDLR)的包装细胞系，其用于生产VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其载体样颗粒(VLP)。

背景技术

在T细胞和干细胞基因疗法的领域，逆转录病毒载体如慢病毒载体(LV)被认为是将治疗性核酸分子递送至靶细胞并诱导长期表达的高效工具。通常，逆转录病毒载体在逆转录病毒膜内含有来自外源病毒物种的异源性包膜蛋白。交换病毒载体包膜蛋白的过程称为“假型化”。最常用于假型化的包膜蛋白是水泡性口炎病毒(Vesicular StomatitisVirus)的G蛋白(VSV-G)。其转导广泛的靶细胞，包括与治疗相关的细胞类型，如干细胞和T细胞。三聚体VSV-G蛋白与其受体的结合诱导从融合前状态到融合后状态的多种构象变化，以催化疏水性融合蛋白插入靶细胞膜以及随后病毒与靶细胞膜的融合。该过程是pH依赖性的，这意味着病毒膜和细胞膜的融合主要发生在内体(endosome)中。

在2013年之前，鉴定VSV-G受体的尝试尚无定论。例如，已提出该受体是磷脂而不是蛋白。然后，Finkelshtein等、Amirache等和Nikolic等已证实LDLR是VSV-G的主要受体。此外，LDLR的相关家族成员(即，LRP1、LRPlb、LRP2、LRP4、LRP5和LRP6、VLDLR、LRP8)也有助于VSV介导的结合和感染。LDLR是1型跨膜糖蛋白，负责调控哺乳动物体内的胆固醇稳态。LDLR基因的功能丧失突变与富含胆固醇的LDL从血液向细胞的传递受损有关，这可能导致人类家族性高胆固醇血症。LDL在中性pH下是结合的，随后受体-配体内化，其最终导致在酸性条件下在内体中配体的释放。之后，受体被循环回到细胞表面。Otahal等已证实LDLR的配体结合结构域在VSV-G相互作用中起关键作用。Nikolic等更具体地鉴定了两个不同的富含半胱氨酸的结构域(CR2和CR3)，其也负责与VSV-G的结合。在VLDLR、LRP1、LRP1B、LRP2、LRP3、LRP4中也发现了相关的CR结构域(Nikolic等)。对于包膜的病毒颗粒(如慢病毒载体)，充分供应包装细胞膜的脂质和脂质组合物是病毒颗粒的感染力和收率的关键参数(Guyader等)。

VSV-G假型逆转录病毒载体的最新方案基于包装细胞，如HEK293细胞及其衍生物。这些包装细胞主要在贴壁培养容器(如滚瓶或细胞工厂)中培养，但悬浮细胞培养物对于解决可扩展性的限制非常重要。

目前尚无法获得用于VSV-G假型逆转录病毒载体连续表达一些或全部组分的稳定包装细胞。这归因于VSV-G的众所周知的毒性(Rodrigues、Alves和Coroadinha)；因此，已经在本领域中建立了基于用编码所有组分的3-5个质粒转染包装细胞的瞬时方案(Merten等)。通过简单地交换所需质粒，这种方法可实现高度的灵活性。然而，由于转染效率的变化，使得批次之间收率的可重现性相当低。

为了避免转染程序，但实现高水平的可重现性，本领域已经建立了可诱导的系统，以将有毒VSV-G蛋白的表达限制为仅在收获期。这些系统需要复杂的转录控制表达盒和能特异性诱导或关闭所选基因转录的物质。大多数系统使用Tet-On/Tet-Off系统，但是基于例如激素的替代系统也有报道。这些系统不能解决细胞毒性的问题，但是避免了瞬时转染的需要，并且将VSV-G毒性的负担限制为仅在收获期。然而，可能需要进行其他纯化用于治疗性应用，以耗竭来自病毒收获物中的物质。此外，可诱导的或稳定的生产系统通常需要进行大规模的筛选活动，以鉴定以最佳比率表达所有组分的包装细胞克隆，以收获高收率的逆转录病毒载体。

因从，本领域中需要一种改进的或替代的包装细胞系，其用于生产VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，以及需要通过所述包装细胞系生产的VSV-G假型逆转录病毒颗粒或其病毒样颗粒。

发明内容

令人吃惊的是，发明人发现，当所述包装细胞系天然地或基因工程化地不表达LDLR(即，包装细胞系是LDLR阴性的)时，与表达LDLR的包装细胞系(LDLR阳性包装细胞系；例如，HEK 293T WT)相比，用于生产VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的包装细胞系导致VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的更高收率。所述VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒可以是VSV-G假型慢病毒载体颗粒或病毒样颗粒和/或VSV-G假型γ逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒。

出乎意料的是，使用由所述包装细胞系产生的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒对LDLR阴性HEK 293T细胞(HEK293T LDLR neg)的自转导比当使用HEK 293T野生型(WT)作为包装细胞系时的自转导低多达45％。结果，当使用LDLR阴性包装细胞系代替LDLR阳性包装细胞系时，可收获的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的量增加。

可以证明，来自HEK 293T WT或HEK 293T LDLR阴性包装细胞的相同逆转录病毒载体剂量的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒在HEK 293T WT细胞和在原代人T细胞上具有相等的转导率。而相反的是，添加相同逆转录病毒载体剂量的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒可导致与HEK 293T WT相比，来自HEK 293T LDLR阴性包装细胞的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒对HEK 293T LDLR阴性细胞的转导率更低(见实施例5和图7)。

因此，与表达LDLR的包装细胞系相比，天然的或基因工程化的在其细胞表面上不表达LDLR的包装细胞系更适合于生产VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒。

示例性地，用在其表面上正常表达LDLR但是对其基因工程化以阻止其表达的包装细胞系HEK 293T证明了令人吃惊的效果。令人吃惊的是，与表达LDLR的包装细胞相比，包含来源于LDLR阴性包装细胞的VSV-G假型逆转录病毒载体或其病毒样颗粒的多个颗粒的聚集物的数量和尺寸更小(见图6)。这是避免在纯化和/或浓缩过程中(例如，当使用具有有限孔径的膜的过滤步骤时)逆转录病毒载体或VLP的损失的优点。此外，当存在相同数量的逆转录病毒载体颗粒或VLP时，可提取的逆转录病毒载体或VLP的收率较高，但作为包含多个颗粒的聚集物的程度较低。此外，聚集的逆转录病毒载体颗粒或VLP可能以诱导剂量效应的水平诱导过高的VLP摄取或转导率。例如，如果应用颗粒的聚集物，与优选地不以聚集物的形式存在的逆转录病毒载体颗粒相比，每个宿主细胞基因组的逆转录病毒载体基因组整合的数量更高。

此外，令人吃惊的是，与LDLR阳性包装细胞系(如HEK 293T WT)相比，对于瞬时和稳定VSV-G表达，VSV-G在LDLR阴性包装细胞系(如HEK 293T LDLR neg)上的毒性活性较不明显或者甚至不存在。因此，一旦表达VSV-G，LDLR阴性包装细胞系(如HEK 293T LDLR neg)的活力就比LDLR阳性包装细胞系(如HEK 293T WT)更高。表达VSV-G的LDLR阴性包装细胞系(如HEK 293T LDLR-neg包装细胞系)的活力与不表达VSV-G的包装细胞相当(见图5、图9A)。

因此，本发明包括用于更有效地生产VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的LDLR阴性包装细胞系，稳定表达VSV-G的LDLR阴性包装细胞系，一种用于生产VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的方法，以及由所述方法获得的和/或由所述LDLR阴性包装细胞系生产的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒。

附图说明

图1：在VSV-G假型LV生产期间减少自转导的原理。A)HEK293T WT细胞包装LV并将其释放到细胞培养上清液中，但可收获LV的剂量受到包装细胞转导导致LV丢失的限制。B)而相比之下，在包装细胞上不存在LDLR降低转导率并增加可收获的LV的剂量。

图2：LDLR缺陷HEK 293T的产生

对HEK 293T WT细胞进行基因修饰以产生HEK 293T LDLR neg。通过基于流式细胞术的细胞分选测得初始效率从25％提高到90％。随后进行单细胞克隆，以获得均质的100％纯HEK 293T LDLR neg克隆(克隆1A1)，其显示出提高的LV生产率。

图3：与HEK 293T WT相比，使用HEK 293T LDLR neg包装细胞(混合物和克隆1A1)降低了自转导率。

A)通过瞬时转染HEK 293T WT、HEK 293T LDLR neg(混合物和克隆1A1)以生成编码GFP的LV后，通过流式细胞术将自转导定量为稳定且增加的荧光强度水平(MFI)的平均值。与HEK 293T WT相比，HEK 293T LDLR neg上的自转导率降低了。

B)通过对整合至宿主细胞基因组的LV基因组拷贝数进行定量确认了自转导。LV产生10天后，对从瞬时转染的HEK 293T、HEK293T LDLR neg(混合物和克隆1A1)分离的基因组DNA进行qPCR分析，以产生LV。与HEK 293T WT相比，HEK 293T LDLR neg上整合的LV基因组拷贝数减少了。将转染的包装细胞再培养10天，以通过稀释残留质粒DNA排除假阳性信号。

图4：与HEK 293T WT包装细胞相比，通过使用HEK 293T LDLR neg(混合物和克隆1A1)的生产率更高。用编码VSV-G、gag/pol、rev和编码治疗活性CD20-CAR构建体(A)或GFP标记基因(B)的LV转移载体基因组的质粒瞬时转染各个包装细胞系。通过确定转染后所示时间和所有时间点累积的LV滴度对生产率进行定量。

图5：与HEK 293T WT相比，瞬时表达的VSV-G在HEK 293T LDLR neg(混合物和克隆1A1)中的毒性降低。使用CD20特异性CAR编码质粒作为对照。以48h间隔测量活力(％)持续288h。

图6：与HEK 293T WT相比，在HEK 293T LDLR neg(混合物和克隆1A1)中产生的LV的LV聚集物形成减少。通过使用Viewsizer2000(Manta Instruments)测量颗粒数量[计数/mL/nm]和相应粒径[nm]，确定存在于各个包装细胞系上清液中的LV聚集物形成。

图7：示意图：要转导的细胞系的LDLR表达水平(但在很小的程度上，LV来源的LV包装细胞系的LDLR表达水平也)决定生产过程中的转导效率水平。A)在HEK 293T WT上，LV包装细胞系的LDLR表达水平不影响转导效率水平。B)而相反的是，与HEK 293T WT靶细胞相比，HEK 293T LDLR neg靶细胞的转导效率水平大大降低，并且也取决于LV包装细胞系。

图8：A)实验结果表明，要转导的细胞系的LDLR表达水平(但在很小的程度上，LV来源的LV包装细胞系的LDLR表达水平也)决定生产过程中的绝对转导效率(TDX)水平。B)将TDX水平归一化为使用的包装细胞系HEK293T WT的水平。实验重复进行三次。显示了三次中的一次代表性实验。统计分析基于非配对Student t检验(Prism,GraphPad)。>0.05(n.s.)，<0.05(*)，<0.01(**)，<0.001(***)，<0.0001(****)。

图9：用于产生稳定表达VSV-G的LV包装细胞系的新方法分别不含转录控制或可诱导系统。A)用编码VSV-G和抗生素(嘌呤霉素)抗性基因的质粒转染HEK 293T WT和HEK293TLDLR neg细胞(HEK 293T LDLR阴性混合物或HEK 293T 1A1)，以选择稳定转染的细胞。在存在抗生素的条件下培养34天后，仅获得了稳定转染的HEK 293T LDLR neg包装细胞的活细胞克隆。B)用稳定转染了VSV-G的HEK 293T LDLR neg克隆1A1(HEK 293T 1A1)进行进一步的实验(活力[V]：89％)。应用流式细胞术细胞分选以获得稳定表达高水平VSV-G的包装细胞(HEK 293T 1A1 VSV-G混合物)。最后，通过单细胞克隆获得高产细胞克隆。

图10：有活力和扩增的HEK 293T 1A1 VSV-G混合物和HEK293T 1A1 7G的长期VSV-G表达以及功能性LV的产生。A)未转染的HEK 293T WT和用VSV-G编码质粒瞬时转染的HEK293T WT的VSV-G表达水平。对于稳定表达VSV-G的包装细胞，显示了转染后168天HEK 293T1A1 VSV-G混合物和单细胞克隆HEK 293T 1A1 7G的表达水平。B)稳定表达VSV-G的包装细胞产生功能性LV。用产生LV所需的所有组分(完整的LV质粒系统；VSV-G、gag/pol、rev、GFP编码转移构建体)转染HEK 293T WT。作为比较，用所有组分(无包膜质粒VSV-G)转染稳定表达VSV-G的包装细胞系HEK 293T1A1 VSV-G混合物和HEK 293T 1A1 7G。通过测量转导单位/mL(t.u./mL)确定生产率。

具体实施方式

在第一个方面中，本发明提供了一种用于生产VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的包装细胞系，其中所述包装细胞系是LDLR阴性。

所述包装细胞系用于生产VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中所述包装细胞系是LDLR阴性，从而与LDLR阳性的包装细胞系的自转导相比，由具有所述包装细胞系生产的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的所述包装细胞系的自转导降低至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。

所述包装细胞系可以是例如以其野生型形式在其细胞表面上原始或天然不表达LDLR的细胞系。

所述包装细胞系可以是例如以其野生型形式在其细胞表面上原始或天然表达LDLR，但是已分离出LDLR阴性的天然存在的变体(例如，单细胞克隆)的细胞系。

所述包装细胞系可以是例如以其野生型形式在其细胞表面上原始或天然表达LDLR，但是向细胞培养基中添加了已知可阻止LDLR的表达或活性或降低其稳定性的化学化合物的细胞系。

所述包装细胞系可以是例如以其野生型形式在其细胞表面上原始或天然表达LDLR，但是可以被基因工程化(修饰)以阻止LDLR在其细胞表面上表达(即，其被修饰为LDLR阴性)的细胞系。

因此，所述包装细胞系可以是一种包装细胞系，其中所述包装细胞系已被基因工程化以阻止在其细胞表面上表达LDLR。

可以在基因组水平上实现所述基因修饰，例如，通过部分或完全修饰LDLR基因的转录控制元件或蛋白编码区。此类修饰所需的方法是本领域众所周知的，并且包括例如CrispR/Cas、TALEn、ZFN、同源重组的技术。

所述包装细胞系可以是例如以其野生型形式在其细胞表面上原始或天然表达LDLR，但是通过使用例如RNAi或表观遗传沉默在转录水平上抑制LDLR表达的细胞系。

所述包装细胞系可以是用于生产VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的细胞系，其中所述包装细胞系是LDLR阴性，从而与来源于表达LDLR的包装细胞系的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的平均聚集物尺寸相比，所述VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的平均聚集物尺寸更小。

在用于沉默或降低基因LDLR表达水平的方法的上下文中，术语“LDLR阴性”或“LDLR neg”等在本文中也指通过所述方法实现的包装细胞系中基因LDLR表达的充分强烈降低，以使得与非降低状态的所述包装细胞系相比，本文公开的对于LDLR阴性的包装细胞系的作用也出现并发生在LDLR表达水平降低的包装细胞中。

所述包装细胞系优选地可以是人包装细胞系。

所述包装细胞系可以是HEK 293细胞或其衍生物，或者CEVEC羊膜细胞生产(CAP)细胞或其衍生物，或者细胞系AGE1.HN或细胞系PER.C6。所述包装细胞系可以选自以下：HEK293、HEK 293T、HEK EBNA、HEK 293F、HEK 293FT、HEK 293-S、CEVEC羊膜生产(CAP)细胞(CAP)、CAP-T细胞、CAP-GT细胞和CAP-Go细胞。

所述包装细胞系可以选自以下：HEK 293、HEK 293T、HEK EBNA、HEK 293F、HEK293FT和HEK 293-S。

所述VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒可以是VSV-G假型慢病毒载体颗粒或病毒样颗粒和/或VSV-G假型γ逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒。

所述包装细胞系，其中所述包装细胞系瞬时表达基因VSV-G。

所述包装细胞系，其中所述包装细胞系稳定表达基因VSV-G。

所述包装细胞系，其中所述包装细胞系稳定表达选自以下的至少一种另外的基因：gag、pol、rev和编码转基因的psi阳性逆转录病毒表达载体。

所述包装细胞系，其中所述包装细胞系稳定表达选自以下的所有基因：gag、pol、rev和编码转基因的psi阳性逆转录病毒表达载体。

所述包装细胞系，其中所述包装细胞系稳定表达选自以下的所有基因：gag、pol和编码转基因的psi阳性γ逆转录病毒表达载体。

所述包装细胞系可以是使用以下稳定转染的生产细胞系

a)编码gag/pol基因的psi阴性逆转录病毒表达载体，编码rev基因的psi阴性逆转录病毒表达载体(如果逆转录病毒表达载体是慢病毒表达载体)，编码转基因的psi阳性逆转录病毒表达载体和编码VSV-G的psi阴性表达载体，或

b)编码gag/pol的psi阴性逆转录病毒表达载体，编码rev的psi阴性逆转录病毒表达载体(如果逆转录病毒表达载体是慢病毒表达载体)，编码转基因的psi阳性逆转录病毒表达载体和编码VSV-G的psi阴性表达载体。

所述生产细胞系还可以包含可以在所述表达载体之一上的编码抗生素抗性基因(如新霉素、潮霉素B、博来霉素、嘌呤霉素抗性基因)的核酸。

所述包装细胞系，其中所述细胞系针对选自以下的VSV-G的至少一种另外的受体是阴性的：LRP1、LRPlb、LRP2、LRP4、LRP5、LPR6、VLDLR和LRP8。

所述包装细胞系可以是天然地针对VSV-G的至少一种另外的受体是阴性的细胞系。

所述包装细胞系可以是例如以其野生型形式在其细胞表面上原始表达所述VSV-G的至少一种另外的受体，但是可以对其基因工程化(修饰)以阻止所述VSV-G的至少一种另外的受体在其细胞表面上表达(即，其被修饰为所述VSV-G的至少一种另外的受体是阴性)的细胞系，因此所述包装细胞系可以是一种包装细胞系，其中所述包装细胞系已被基因工程化(例如，通过本文所述的方法)以阻止所述VSV-G的至少一种另外的受体在其细胞表面上表达。

所述包装细胞系，其中与LDLR不是阴性的包装细胞系的自转导相比，所述自转导降低至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。

所述包装细胞系，其中所述VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒包含转基因。

所述转基因可以是应当引入靶细胞的任何基因，所述靶细胞旨在通过如本文所公开的所生产的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒进行转导。然后，通过所述靶细胞可以表达所述转基因。所述转基因可以是编码标志物基因，治疗性蛋白(例如，嵌合抗原受体(CAR)，其在靶细胞中或靶细胞上表达，例如免疫细胞，如T细胞或NK细胞)，或者单基因疾病(如β地中海贫血、SCID-X1、Wiskott-Aldrich综合征)未突变的等位基因从而将有缺陷的干细胞校正为无缺陷的细胞的基因。

在另一个方面中，本发明提供了如本文所公开的包装细胞系用于生产VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的用途，其中所述包装细胞系是LDLR阴性。

在一个方面中，本发明提供了如本文所公开的包装细胞系用于生产VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的用途，其中所述包装细胞系稳定表达VSV-G。

在一个进一步的方面中，本发明提供了一种生产VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的体外方法，所述方法包括a)提供包装细胞系，其中如本文所公开的所述包装细胞系是LDLR阴性；

b)至少将编码gag/pol的psi阴性核酸，编码rev的psi阴性核酸(如果逆转录表达载体是慢病毒表达载体)，以及编码VSV-G的psi阴性核酸和编码转基因的psi阳性核酸引入所述细胞，从而生产所述VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒。

与LDLR阳性的包装细胞系的自转导相比，所述生产的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒使具有所述VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒对所述包装细胞系的自转导降低至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。所述VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒可以是VSV-G假型慢病毒载体颗粒或病毒样颗粒和/或VSV-G假型γ逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒。

所述方法，其中所述包装细胞系是在细胞培养基中。

所述方法，其中所述方法另外地包括

c)分离包含所述VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的细胞培养基。

所述分离包含所述VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的细胞培养基可以通过除去含有所述VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的至少一部分培养基(上清液)进行，其中所述包装细胞系仍在所述培养基中。

所述方法，其中所述引入所述核酸是通过以下进行：

i)用编码gag/pol的psi阴性逆转录病毒表达载体，编码rev的psi阴性逆转录病毒表达载体(如果所述逆转录病毒表达载体是慢病毒表达载体)，编码转基因的psi阳性逆转录病毒表达载体和编码VSV-G的psi阴性表达载体共转染所述包装细胞系，或者

ii)用编码gag/pol/rev的psi阴性逆转录病毒表达载体，编码转基因的psi阳性逆转录病毒表达载体和编码VSV-G的psi阴性表达载体共转染所述包装细胞系。

另外，可以在所述共转染过程中引入编码抗生素抗性基因的核酸，其中所述抗性基因是在表达载体之一上，从而允许产生稳定的包装细胞系。适于细胞选择的编码抗生素抗性的基因是本领域中众所周知的，并且包括，例如，新霉素、潮霉素B、博来霉素、嘌呤霉素抗性基因。

可以使用本领域熟知的其他方法和技术将所述核酸引入所述包装细胞系。所使用的另一种技术可以是CRISPR/Cas9技术。因此，可以使用所述方法，其中另外地可以引入抗性基因，并且其中可以通过使用CRISPR/Cas9技术通过将所述核酸定向整合至所述细胞的基因组中来进行所述核酸的所述引入，从而使得能够产生稳定的包装细胞系。

在另一个方面中，本发明提供了一种生产VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的体外方法，所述方法包括a)提供如本文所公开的稳定表达基因VSV-G的包装细胞系，b)将编码gag/pol的psi阴性核酸，编码rev的psi阴性逆转录病毒表达载体(如果所述逆转录病毒表达载体是慢病毒表达载体)和编码转基因的psi阳性核酸引入所述细胞，从而生产所述VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒。

所述方法，其中所述包装细胞系是在细胞培养基中。

所述方法，其中所述方法另外地包括

c)分离包含所述VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的细胞培养基。

在一个进一步的方面中，本发明提供了一种生产VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的体外方法，所述方法包括a)提供稳定表达基因VSV-G的包装细胞系，其中所述包装细胞系稳定表达选自以下的如本文所公开的至少一个另外的基因：gag/pol、rev和转基因；

b)将编码gag/pol的一种或多种psi阴性核酸，编码rev的psi阴性逆转录病毒表达载体(如果逆转录表达载体是慢病毒表达载体)，以及编码转基因的psi阳性核酸(以上不是由所述包装细胞系稳定表达)引入所述细胞，从而生产所述VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒。

所述方法，其中所述包装细胞系是在细胞培养基中。

所述方法，其中所述包装细胞系是在无血清细胞培养基中，所述方法，其中所述包装细胞系是悬浮培养的。

所述方法，其中所述方法另外地包括

c)分离包含所述VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的细胞培养基。

所述方法，其中所述包装细胞系(生产细胞系)稳定表达选自以下的至少一种另外的基因的全部：gag/pol、rev和转基因。

在一个进一步的方面中，本发明提供了通过如本文所公开的方法获得的和/或通过如本文所述的包装细胞系生产的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒。

所述VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒可以是VSV-G假型慢病毒载体颗粒或病毒样颗粒和/或VSV-G假型γ逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒。

通过如本文所公开的方法获得的和/或通过如本文所述的包装细胞系生产的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒以比由表达LDLR的包装细胞系获得VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒更低的效率转导LDLR阴性的包装细胞系。

通过如本文所公开的方法获得的和/或通过如本文所述的包装细胞系生产的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的平均聚集物尺寸与来源于表达LDLR的包装细胞系的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒的平均聚集物尺寸相比小至少5％、10％或15％。

通过如本文所公开的方法获得的和/或通过如本文所述的包装细胞系生产的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，与来源于表达LDLR的包装细胞系的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒的平均聚集物尺寸相比，具有降低的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的聚集物形成水平。减少的聚集物形成的作用导致如本文所公开的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒的上文所述的更小的聚集物尺寸。

使用通过如本文所公开的方法获得的和/或通过如本文所述的包装细胞系生产的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒使得a)避免在纯化和/或浓缩过程中(例如，当使用具有有限孔径的膜的过滤步骤时)逆转录病毒载体颗粒或其VLP损失，b)当存在相同数量的逆转录病毒载体颗粒或其VLP时，可提取的逆转录病毒载体颗粒或其VLP的收率增加，但聚集物的程度降低，和c)阻止了剂量效应，如由聚集的逆转录病毒载体颗粒或其VLP诱导的每个宿主细胞基因组大量逆转录病毒载体基因组整合。

在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含如本文所公开的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，任选地还包含药学上可接受的载体。

与已在LDLR阳性细胞系中生产的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒相比，使用如本文所公开的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒作为药物组合物由于聚集趋势降低导致逆转录病毒载体基因组整合减少。

在一个进一步的方面中，本发明提供了如本文所公开的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒用于制备药物的用途。

在另一个方面中，本发明提供了用于生产假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的包装细胞系，其中所述包装细胞系是低密度脂蛋白受体(LDLR)阴性，并且其中用VSV-G以外的包膜蛋白对所述假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒进行假型。例如，所述包装细胞系可以用于生产使用替代的包膜蛋白(如RD114、GALV env、麻疹病毒H/F、尼帕病毒G/F、Baboon env、Cocal env)假型的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒。

关于生产本发明的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒的包装细胞系，本文所定义的所有定义和实施方式在本发明其他方面的情况下，也可以作必要修改后适用：例如，包装细胞系用于生产VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的用途，一种用于生产VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的方法，可通过如本文所公开的方法获得的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，一种包含如本文所公开的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒的药物组合物和如本文所公开的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒用于制备药物的用途。

在本发明的一个实施方式中，已通过本领域众所周知的方法敲除了HEK 293T包装细胞系的LDLR基因，从而产生了LDLR阴性的HEK 293T包装细胞系(HEK 293T K.O.)。该HEK293T K.O.包装细胞系是用编码gag/pol基因的psi阴性慢病毒表达载体，编码rev基因的psi阴性慢病毒表达载体，编码转基因的psi阳性慢病毒表达载体和编码VSV-G的psi阴性表达载体共转染，所述转基因可以编码例如嵌合抗原受体。HEK 293T K.O.包装细胞系生产高速率的VSV-G假型慢病毒载体颗粒，其携带转基因(例如，嵌合抗原受体)的遗传信息。这些颗粒可用于转导旨在表达转基因(例如，嵌合抗原受体)的干细胞或免疫细胞，如T细胞或NK细胞。

在本发明的另一个实施方式中，用于生产VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒(例如，慢病毒载体颗粒)或其病毒样颗粒的方法包括a)用编码gag/pol基因的psi阴性慢病毒表达载体，编码rev基因的psi阴性慢病毒表达载体，编码转基因的psi阳性慢病毒表达载体和编码VSV-G的psi阴性表达载体共转染如本文所公开的包装细胞系，或b)用编码gag/pol/rev基因的psi阴性慢病毒表达载体，编码转基因的psi阳性慢病毒表达载体和编码VSV-G的psi阴性表达载体共转染如本文所公开的包装细胞系，从而降低由所述包装细胞系生产的VSV-G假型慢病毒载体颗粒或其病毒样颗粒对所述包装细胞系的自转导。

可以从其中培养所述包装细胞系的细胞培养基的上清液中收获由所述包装细胞系生产的VSV-G假型慢病毒载体颗粒或其病毒样颗粒。

在本发明的一个实施方式中，可以对收获的上清液进行过滤，所述上清液含有由所述包装细胞系生产的VSV-G假型慢病毒载体颗粒或其病毒样颗粒。

在本发明的另一个实施方式中，所述包装细胞系是无血清和/或悬浮培养的。

包装细胞系可以是瞬时表达的细胞系或稳定表达的细胞系，即生产细胞系。

为建立稳定表达的包装细胞系，还共转染了编码在所述载体之一上的抗生素抗性基因的核酸。该抗性基因的共表达使得能够选择稳定表达如本文所公开的VSV-G假型慢病毒载体颗粒或病毒样颗粒的细胞。

除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

逆转录病毒科是具有单链、二倍体、正义RNA基因组的病毒科，该RNA基因组被反转录成DNA中间体，其然后整合到宿主细胞基因组中。逆转录病毒来源的病毒是直径为80-120nm的包膜颗粒。

(逆转录病毒/慢病毒/γ逆转录病毒)病毒载体是源自相应的病毒科的复制缺陷型病毒颗粒。它们包含Gag和Pol蛋白，单链RNA基因组，且通常用源自其他病毒的异源包膜蛋白进行假型化。所述病毒载体的RNA基因组不包含任何病毒基因以产生病毒后代，而是包含有效包装和DNA逆转录所需要的psi元件和LTR。DNA中间体可以包含在合适的启动子(例如，CMV启动子)控制下的感兴趣的基因，并且当所述DNA整合到宿主细胞的基因组中时感兴趣的基因被表达。进入宿主细胞、递送RNA基因组、整合和表达感兴趣的基因的过程称为转导。基于γ逆转录病毒或慢病毒的病毒载体的最低要求已在本领域中详细描述。

另外，已经开发出不能整合逆转录病毒载体基因组到宿主细胞基因组中的整合酶缺陷的逆转录病毒载体(ID-RV)。ID-RV源自常规的逆转录病毒载体，但不包含逆转录病毒整合酶或包含突变形式的逆转录病毒整合酶。进入宿主细胞中后，逆转录病毒载体基因组在细胞质中逆转录，递送到细胞核中，但不稳定整合到宿主细胞基因组中。ID-RV是瞬时表达感兴趣的基因的有用工具。逆转录病毒载体和转导的定义也扩大了整合缺陷的逆转录病毒载体及其应用。

慢病毒是逆转录病毒科的一个属，其在人类和其他哺乳动物物种中引起以长潜伏期为特征的慢性和致命性疾病。最著名的慢病毒是可有效感染非分裂细胞的人类免疫缺陷病毒HIV，因此慢病毒衍生的逆转录病毒载体是最有效的基因递送方法之一。

γ逆转录病毒是逆转录病毒科的一个属。代表性的物种是鼠白血病病毒和猫白血病病毒。

本文使用和公开的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒可以是VSV-G假型慢病毒载体颗粒或病毒样颗粒和/或VSV-G假型γ逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒。

病毒样颗粒(VLP)与病毒颗粒相似，但不是感染或转导的，因为它们不包含编码病毒样颗粒的蛋白质的病毒遗传物质。特别地，在逆转录病毒载体的情况下，VLP不包含psi阳性核酸分子。一些病毒样颗粒可含有与其基因组不同的核酸。病毒结构蛋白(例如，包膜或衣壳)的表达可导致病毒样颗粒(VLP)的组装。像逆转录病毒载体一样，VLP也可以使用与对于逆转录病毒载体相同的包膜构建体假型化。VLP可用于将蛋白质但也将核酸递送至靶细胞的细胞质。特别地，VLP可用作疫苗。

如本文所用，术语“假型化”或“假型的”是指带有源自具有包膜的其他病毒的包膜糖蛋白的载体颗粒。因此，可以根据糖蛋白使用的细胞表面受体的类型来扩展或改变本发明的慢病毒载体或载体颗粒的宿主范围。

为产生逆转录病毒载体，通过包装细胞系(例如，HEK 293T)反式提供组装载体颗粒所需的gag/pol和env蛋白。这通常通过用一种或多种含有gag/pol和env基因的质粒转染包装细胞系来完成。为产生假型载体，将最初与gag和pol基因以及RNA分子或表达载体来源于同一逆转录病毒的env基因交换为不同包膜病毒的一种或多种包膜蛋白。例如，VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒指已将水泡性口炎病毒的G蛋白(VSV-G)整合入膜中的逆转录病毒载体或病毒样颗粒。

因此，基于HIV-1逆转录病毒的示例性假型载体颗粒包含(1)HIV-l Gag和Pol蛋白，(2)来自HIV-1基因组的RNA分子，其可以用于基于HIV-1基因组产生逆转录病毒载体颗粒，所述HIV-1基因组缺乏gag、env、pol、tat、vif、vpr、vpu和nef基因，但仍包含LTR、psi元件和CMV启动子，然后是要转导的基因，例如GFP蛋白的基因，和(3)使用水泡性口炎病毒的G蛋白(VSV-G)。

水泡性口炎病毒(VSV)是单核病毒目中的弹状病毒科中的水泡病毒属中的一个种。VSV的基因组编码G蛋白，G蛋白负责病毒的结合和进入靶细胞。其是一种同源三聚体，一旦受体已经结合在细胞表面上，其在内体中诱导网格蛋白介导的内吞作用。在内体中，pH的变化会诱导同源三聚体的构象变化，从而导致病毒和细胞膜的不可逆融合。

如本申请中所使用的，术语“psi阳性”和“psi阴性”分别指其中存在和不存在逆转录病毒psi元件的核酸分子。psi元件是位于逆转录病毒基因组5’端附近的顺式作用信号，并指定包装信号，该信号在病毒组装过程中是重要的并导致病毒RNA掺入病毒核心中。因此，psi阴性RNA不包含逆转录病毒psi元件，且因此不被组装到本发明的载体颗粒中；相反，确实包含所述psi元件的psi阳性RNA被有效地组装到载体颗粒中。

术语“滴度”或“转导效率”用作表征和比较载体颗粒关于转导其靶细胞的能力的手段。因此，具有“增加的滴度”或“增加的转导效率”的载体颗粒能够在给定的载体颗粒体积下比具有相同体积的其他载体颗粒转导更多数量的细胞。

如本文所用，术语“包装细胞系”指能够产生逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的细胞系，如HEK 293。根据细胞系的制备种类，包装细胞系可以瞬时或稳定地生产所述逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒。优选地，包装细胞系可以是人包装细胞系。

如果包装细胞系稳定生产(产生)所述逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，则也可以将其称为“生产细胞系”。

在包装细胞系的上下文中，术语“LDLR阴性”或“LDLR neg”等意思是指，在所述包装细胞系的表面上不表达基因LDLR，或者通过本领域众所周知的方法通过沉默或降低蛋白表达水平的方法至少使LDLR的表达水平足够强地降低。如本文所公开的，在不表达LDLR的包装细胞系上观察到的作用也出现并发生在具有足够强的LDLR表达降低的包装细胞系上。术语“LDLR阴性”或“LDLR neg”还可以包括具有突变形式的LDLR的包装细胞系，其对VSV-G的亲和性降低或丧失，如GM01915成纤维细胞。所述包装细胞系可以是LDLR天然阴性的细胞系，但是所述包装细胞系也可以是在其细胞表面上最初表达LDLR(即，以其野生型形式)，但可以被基因工程化(修饰)以阻止在其细胞表面上表达LDLR(即，其被修饰为LDLR阴性)的细胞系。

所述基因修饰可以例如通过重组敲除LDLR，通过缺失LDLR或通过使用例如RNAi沉默LDLR表达来实现。

所述包装细胞系可以选自以下：HEK 293、HEK 293T、HEK EBNA、HEK 293F、HEK293FT和HEK 293-S，其中所述细胞系是LDLR阴性的。

术语“针对LDLR是阴性的”和“LDLR阴性”和“LDLR neg”和“LDLR

在包装细胞的背景下，术语“针对LDLR是阳性的”和“LDLR阳性”和“LDLR pos”和“LDLR

低密度脂蛋白(LDL)受体(LDLR-R或LDLR)是一种839个氨基酸的镶嵌蛋白(除去21个氨基酸的信号肽后)，介导富含胆固醇的LDLR的内吞作用。其是一种细胞表面受体，可识别脱辅基蛋白B 100，该蛋白嵌入LDL颗粒的外部磷脂层中。该受体还识别存在于乳糜微粒残留物和VLDL残留物(IDL)中的apoE蛋白。在人类中，LDL受体蛋白由染色体19上的LDLR基因编码。其属于低密度脂蛋白受体基因家族。LDLR是VSV-G的推定主要受体。

如本文所用，术语“自转导”指包装细胞系的转导，所述包装细胞系产生转导所述包装细胞系的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒。通过包装细胞系表达假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的受体来诱导自转导。

如本文所用，术语“自转导减少”指与LDLR阳性的包装细胞系相比，LDLR阴性的包装细胞系的自转导减少。如本文所公开的包装细胞系的自转导减少可以是与LDLR不是阴性(即，LDLR是阳性的)的包装细胞系的自转导相比至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。

如本文所用，术语“聚集物”指含有至少两个颗粒的累积的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒的物理结构。例如，与表达LDLR的包装细胞相比，包含来源于LDLR阴性包装细胞的VSV-G假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的多个颗粒的聚集物的数量和尺寸更低。

本文所用的术语“表达”定义为细胞中由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

如本文所用，术语“(基因)工程化的细胞”和“(基因)修饰的细胞”可以互换使用。该术语指含有和/或表达外来基因或核酸序列，其反过来修饰细胞或其后代的基因型或表型。术语“转基因”描述了DNA区段，所述DNA区段含有已从一种生物体中分离出并引入到另一生物体中的基因序列。这一非天然的DNA区段可以保留在转基因生物体中产生RNA或蛋白的能力，或改变转基因生物体遗传密码的正常功能。

人胚胎肾细胞293，通常也称为HEK 293、HEK-293、293细胞或更粗略地称为HEK细胞，是最初来源于组织培养中生长的人胚胎肾细胞的特定细胞系。HEK 293细胞因其可靠的生长和转染倾向而被广泛用于细胞生物学研究多年。其还被生物技术产业用来生产用于基因治疗的治疗性蛋白和病毒。

这种细胞系的重要变体是293T细胞系。其包含SV40大T抗原，可进行包含SV40复制起点的转染质粒的游离型复制。这使得能够扩增转染的质粒并在时间上延长所需基因产物的表达。HEK 293，尤其是HEK 293T细胞通常用于生产各种逆转录病毒载体。各种逆转录病毒包装细胞系也是基于这些细胞。

概括而言，HEK 293(原始细胞系)的衍生物是例如HEK 293T(用猴病毒40(SV40)大T抗原转化的HEK 293)、HEK EBNA(用爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)的核抗原1转化的HEK 293细胞系)、HEK 293F和HEK 293FT(来源于HEK 293细胞)、HEK 293-S(无血清适应性HEK 293细胞)。HEK 293或所述衍生物可以用在本发明中，其中这些细胞系已被基因修饰以阻止在其细胞表面上表达LDLR。

CEVEC羊膜细胞生产细胞(CAP)，例如，CAP细胞、CAP-T细胞、CAP-GT细胞或CAP-Go细胞最初来源于通过常规羊膜穿刺术获得的原代人羊水细胞。通过转染携带人腺病毒血清型5(Ad5)的AV E1/pIX功能的质粒使其永生化。CAP细胞非常适合生产具有人类相同翻译后修饰的治疗性蛋白，也适合生产病毒载体。概括而言，CEVEC羊膜细胞生产(CAP)细胞(原始细胞系)的衍生物是例如CAP-T细胞、CAP-GT细胞和CAP-Go细胞。CAP细胞或所述衍生物可以用在本发明中，其中这些细胞系已被基因修饰以阻止在其细胞表面上表达LDLR。

PER.C6细胞系是可商购的生产系统，可用于生产各种生物制药产品，包括疫苗、基因疗法产品、抗体和其他治疗性蛋白。PER.C6细胞系来源于人胚胎视网膜细胞，最初来自1985年流产的18周龄胎儿的视网膜组织，然后通过用5型腺病毒的确定的E1区转染，随后选择具有永生表型的转染子，进一步开发和制备为细胞系。AGE1.HN适于工业，符合GMP的基于病毒的疫苗生产，包括无RCA的腺病毒载体，适于具有特定复杂聚糖的重组蛋白，其他特定的翻译后修饰以及适于对蛋白水解不稳定或易感的蛋白。AGE1.HN细胞系来源于人神经元细胞，并被来自人5型腺病毒的EI基因的组合永生化。

如本文所用，术语“细胞培养基”包括提供HEK细胞维持所需的化学条件的液体。可以支持HEK细胞扩增的化学条件的实例包括但不限于通常在细胞培养基中提供(或者可以手工提供)的溶液、缓冲剂、血清、血清组分、营养物、维生素、细胞因子和其他生长因子。如本领域所公知的，适合用于培养HEK细胞的培养基包括TexMACS(Miltenyi)、CD FortiCHO

术语“将核酸引入细胞”指通过本领域熟知的方法将核酸如DNA和/或RNA引入细胞，以允许细胞摄取核酸。此类细胞例如是转染、转导、磁转染和电穿孔。

术语“转染”指使用化合物(例如，通过使用磷酸钙、高度支化有机化合物、阳离子聚合物、脂质体或纳米克隆)引入核酸。

可以使用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂以任何常规方式配制基于本发明的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的药物组合物。常用的赋形剂的实例包括但不限于：盐水、缓冲盐水、右旋糖、注射用水、甘油、乙醇及其组合，稳定剂、增溶剂和表面活性剂，缓冲剂和防腐剂，张度剂，填充剂和润滑剂。

因此，可以将本发明的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒配制成用于通过例如注射、吸入或隔离(通过口或鼻)，或通过口服、经颊、胃肠外或直肠施用的形式。

此类药物组合物可以用于转导特异性靶细胞，所述靶细胞尤其可以包括免疫细胞、癌细胞或干细胞，以及所需蛋白的基因产物，所述所需蛋白如果在靶细胞中表达，则导致预防或治疗特定疾病。

实施例

通过瞬时转染HEK 293T细胞产生VSV-G假型慢病毒载体。在转染当天，以1.0E06个细胞/mL将HEK 293T细胞接种在125mL Shakerflask(185rpm)中的25mL无血清细胞培养基中，并使用编码VSV-G、gag/pol、rev的质粒和编码GFP(完整的质粒系统)或治疗相关的CD20-CAR的psi-阳性转移载体质粒进行转染。转染后24h，加入10mM丁酸钠(Sigma-Aldrich，目录号：3034 10-5004)。转染后48h，通过200x g离心以除去细胞碎片收获慢病毒上清液、分装并在-80℃下保存以供后续使用。

为了转染稳定表达VSV-G的细胞系，将HEK 293T细胞在转染前一天接种在24孔板中的DMEM/10％FCS/0.8μg/mL嘌呤霉素(Biowest，目录号12362；Biochrom，目录号S0415；Gibco，目录号A11138-03)中。在转染当天，仅使用4种质粒系统中的3种质粒：编码gag/pol、rev的质粒，以及编码GFP的psi阳性转移载体质粒。以下程序类似于用4种质粒转染。

为滴定慢病毒载体，在转导前一天，将在DMEM/10％FCS中培养的HT1080细胞以1.1E05个细胞/孔接种在24孔板中。在转导当天，确定细胞数，使用DMEM洗涤细胞，并使用在含有

为分离LDLR阴性或稳定表达VSV-G的细胞，使用

为了进行实际分选，使用10mL注射器和连接到输入室的预分离过滤器(20μm)将以4xl0

用编码VSV-G、gag/pol、rev的质粒和编码GFP的psi-阳性转移载体质粒转染HEK293T WT和HEK 293T LDLR neg混合细胞。作为对照，将HEK 293T WT细胞与自转导抑制剂雷特格韦[1μM](Sigma-Aldrich，目录号：CDS023737)和3’-叠氮基-3’-脱氧胸腺嘧啶(AZT)[10μM](Sigma-Aldrich，目录号：A2l69-25mg)一起孵育。转染24h后，加入10mM丁酸钠。在24h间隔内，通过流式细胞术确定96h的以平均荧光强度(MFI)表示的表达水平。由于生成的LV编码GFP，与自转导水平较低的细胞相比，自转导水平较高的细胞产生随时间推移MFI(FITC通道)增加的可检测到的累积的转移蛋白量。

如实施例1和实施例2中所述，通过HEK 293T WT、HEK 239T LDLR neg混合物和HEK293T克隆1A1的转染产生慢病毒载体，并在HT1080上滴定。将LV剂量调整为感染复数(MOI)为0.1，并转导5.0E05个HEK 293T WT、HEK 293T LDLR neg混合物或HEK 293T1A1。转导后三天，通过流式细胞术确定转导效率(％)。HEK 293T LDLR neg混合物和HEK 293T 1A1上产生的慢病毒载体的相对转导率是通过归一化为HEK 293T WT细胞包装的LV诱导的转导率来计算的。通过使用相同LV剂量，与HEK 293T WT相比，LDLR缺陷型细胞对自身产生的LV的自转导具有更高抗性。

如实施例1中所述，转染HEK 293T WT、HEK 293T LDLR neg混合物和HEK 293TLDLR neg克隆1A1细胞。将每种培养物培养12天，以通过稀释降低残留质粒的假阳性信号。为了量化通过自转导整合到宿主细胞基因组中的LV基因组的数量，使用DNeasy Blood和Tissue Kit(50)(Qiagen，目录号：69504)从每个样品中分离基因组DNA。

为了对整合的前病毒进行定量，设计特异性扩增5’LTR和内部启动子之间的99bp片段的引物和探针。类似地定量细胞参照基因。构建同时包含病毒和细胞靶序列的质粒，并用作标准品。计算病毒与细胞拷贝的比率。还考虑了转导效率，以确定仅转导细胞的VCN。

为获得单克隆亚群，将亲本细胞混合物(HEK 293T LDLR neg混合物或HEK 293T1A1 VSV-G混合物)在DMEM/10％FCS中稀释至在200μL的总体积中统计上活细胞浓度为0.5个细胞/96孔。基于缺乏LDLR表达、低自转导率和高LV生产力的水平筛选LDLR阴性细胞克隆。基于高VSV-G表达水平和高LV生产率筛选稳定表达VSV-G的单细胞克隆。将有希望的单细胞克隆扩增到T-75烧瓶中，并产生冻存原种(stock)。

以1.0E06个细胞/mL，在25mL无血清培养基中，将HEK 293T WT、HEK 293T LDLRneg混合物和HEK 293T LDLR neg克隆1A1接种在125mL摇瓶(185rpm)中。接种后3h，用编码VSV-G的表达质粒和真核抗生素抗性表达盒转染细胞培养物，以使得能够对稳定转染的细胞进行基于抗生素选择(嘌呤霉素，Gibco，目录号：A11138-03)。转染后两天，在含有0.8μg/mL嘌呤霉素的无血清培养基中进行选择。以48h间隔确定活力。转染后9天，将悬浮培养物转移到含有DMEM/10％FCS/0.8μg/mL嘌呤霉素的T75烧瓶中，以达到足够数量的活细胞。针对稳定转染的HEK 293T LDLR neg细胞(混合物和克隆1A1)，仅存在嘌呤霉素抗性细胞。将这些扩增到T175烧瓶中，以获得HEK 293T 1A1 VSV-G细胞。在高VSV-G表达水平的细胞上，用

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