两种不同营养素来源的高脂高蛋白饲料配方及其应用

摘要

本发明属于动物实验模型领域，公开了两种不同营养素来源的高脂高蛋白饲料配方及其在诱导大鼠产生恶臭气体代谢物及炎症模型中的应用。所述的高脂高蛋白饲料包括植物性来源和动物性来源两种，健康雄性5周龄SD大鼠经8周的高脂高蛋白干预饲养后出现了肝脏损伤，盲肠内容物中吲哚含量升高，皮下脂肪组织中有更多的粪臭素积累，同时在血清和盲肠组织中检测到了更高的炎症表达，成功建立了大鼠恶臭气体代谢物及炎症产生模型。该饲料配方充分模拟了特殊环境人员单一且不均衡的饮食模式，构建起的大鼠模型耗时短，建立简单，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本研究涉及动物实验模型技术领域，具体涉及两种不同营养素来源的高脂高蛋白饲料，及其在构建大鼠产生恶臭气体代谢物及炎症模型中的应用，该动物模型可用于饮食所诱导的有毒有害气体代谢物产生及炎症的发病机制的研究及防治措施的评价。

背景技术

为满足我国军事发展的需求，越来越多的人员工作在特殊受控密闭环境下。因此，人员的生存存在较多的局限性。其中，饮食的限制导致人员膳食摄入呈现高脂肪、高蛋白、低碳水的状态，且通常营养素来源单一。不合理的膳食摄入会影响机体的正常代谢，产生威胁健康的有害代谢物。

气体的产生和排放是人身体消化过程的重要组成部分，不均衡的饮食往往可能会造成气体代谢异常，甚至可能会诱发炎症或疾病，影响机体健康，以气体排放异常为特征的肠易激综合征和以肠道炎症为诱因的结直肠癌屡见报道。高脂饮食会加重肝脏负担进而损伤肝脏，高蛋白饮食富含色氨酸，其厌氧发酵会产生有毒有害的恶臭气体代谢物，受损的肝脏不及时地将其排出体外将会导致其在肠道积累引发炎症。

然而，目前有关恶臭气体代谢物产生的研究仍集中在畜牧业中，而忽视了其对人体的危害，且对于相关炎症产生的治疗多集中在靶向用药方面，缺乏饮食对肠道炎症预防调控研究的报道，高脂高蛋白饮食所产生的恶臭气体代谢物对机体健康也鲜有报道。从源头上弄清诱导产生恶臭气体代谢物的饮食成分并为今后控制该类食物成分的摄入提供膳食指导意见值得研究，首先应开展动物模型试验，但目前尚没有能产生恶臭气体代谢物的高脂高蛋白动物饲料配方的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，充分模拟特殊环境人员单一且不均衡的饮食模式，更好地研究高脂高蛋白饮食下人员新陈代谢产生的有毒有害气体对机体健康的影响而构建的一种理想动物实验模型。本发明提供了两种用于大鼠恶臭气体代谢物及炎症产生研究的不同营养素来源的高脂高蛋白饲料配方及应用，基于该饮食配方能模拟人员特殊饮食及可能造成的机体疾病，模型建立简单，耗时短，应用前景广。

本发明通过下述方案实现：

两种不同营养素来源的高脂高蛋白饲料，分别为植物性来源的高脂高蛋白饲料和动物性来源的高脂高蛋白饲料，植物性来源的高脂高蛋白饲料中蛋白质均来自大豆分离蛋白，供能35％-45％，脂肪均来自大豆油，供能35％-45％，每100g饲料包括38-54g大豆分离蛋白、17-23g大豆油、10-30g碳水化合物和12-14g营养素；动物性来源的高脂高蛋白饲料中蛋白质均来自猪肉冻干粉，供能35％-45％，脂肪均来自猪油，供能35％-45％，每100g饲料包括43-63g猪肉冻干粉、11-15g猪油、10-30g碳水化合物和12-14g营养素。所述的大豆分离蛋白、大豆油、猪油均为市售产品。

所述的猪肉冻干粉由市售猪瘦肉馅经水煮72℃煮熟后冷冻干燥磨成粉末而制得。

所述的碳水化合物包括玉米淀粉、麦芽糖糊精和蔗糖中的一种或多种，营养素包括L-胱氨酸、纤维素、矿物质预混、磷酸二氢钾、碳酸钙、一水柠檬酸钾、维生素预混和重酒石酸胆碱。

所述的两种不同营养素来源的高脂高蛋白饲料配方可应用于诱导大鼠产生恶臭气体代谢物及炎症模型中，大鼠模型的构建包括以下步骤：

步骤1，配制两种不同营养素来源的高脂高蛋白饲料；

步骤2，选用雄性成年大鼠，分别饲以上述两种高脂高蛋白饲料，保持自由进食与饮水；

步骤3，经上述高脂高蛋白饲料喂养8周后，检测大鼠肝重、肝指数、恶臭气体代谢物水平及细胞因子表达水平，相比于对照组大鼠出现了显著性差异即代表该饲料成功诱导了大鼠恶臭气体代谢物的产生及炎症。

所述大鼠为雄性5周龄SD大鼠，体重为140-160g。

所述方法进一步是随机选取同批次SD大鼠，自由采食市售基础饲料的为对照动物，自由采食市售常规高脂高蛋白饲料的为常规模型动物。

所述恶臭气体代谢物指标，包括但不限于吲哚和粪臭素浓度水平；细胞因子指标，包括但不限于白介素1、白介素6、白介素10和肿瘤坏死因子水平。

本发明所述诱导大鼠产生恶臭气体代谢物及炎症的高脂高蛋白饲料配方的原理：高蛋白饮食含有较多L-色氨酸，高度特异性的细菌在后肠发酵L-色氨酸可直接降解为吲哚，或转化为吲哚-3-乙酸再代谢成粪臭素，吲哚和粪臭素被认为是肛门排放的臭味气体主要来源。高脂饮食会导致过量的脂肪在肝脏沉积，进而引起肝脏脂肪代谢紊乱和炎症反应，同时，吲哚和粪臭素在肠道的沉积也会对肠道健康造成损害。因此本实验模型完全契合生产实践，有助于从恶臭气体代谢物角度揭示高脂高蛋白对机体损害的发生和发展机制以及需求有效的防治措施。

本发明具有以下优点和积极效果：

1.本发明所述的高脂高蛋白饲料配方充分模拟特殊环境下人员单一且不均衡的饮食搭配，有良好的应用前景。

2.本发明所述的高脂高蛋白饲料配方简单，原料易得，构建的动物模型成功率高且造模时间短。

3.本发明所构建的动物模型可用于研究饮食在恶臭气体代谢物产生及炎症中的作用，对于从源头起通过调控饮食来预防各种微量有害气体的排放、维持和改善肠道稳态与健康，调整受控密闭环境人员膳食水平具有重要指导意义。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

(一)高脂高蛋白饲料的制备

购买市售猪瘦肉馅，经水煮72℃煮熟后冷冻干燥磨成粉末，经营养素检测得每100g猪肉冻干粉含蛋白质80.5g，脂肪13.2g。选取蛋白质和脂肪均供能40％配置饲料。每100g大豆蛋白大豆油饲料组分为：46.31g大豆分离蛋白、0.35gL-胱氨酸、8.48g玉米淀粉、11.65g麦芽糖糊精、1.14g蔗糖、5.83g纤维素、19.59g大豆油、1.17g矿物质预混、1.51g磷酸二氢钾、0.64g碳酸钙、1.92g一水柠檬酸钾、1.17g维生素预混、0.23g重酒石酸胆碱。每100g猪肉蛋白猪油饲料组分为：53g猪肉冻干粉、0.35gL-胱氨酸、8.48g玉米淀粉、11.65g麦芽糖糊精、1.66g蔗糖、5.83g纤维素、12.39g猪油、1.17g矿物质预混、1.51g磷酸二氢钾、0.64g碳酸钙、1.92g一水柠檬酸钾、1.17g维生素预混、0.23g重酒石酸胆碱。

(二)本发明模型的建立

实施例选取健康雄性SD大鼠，适应性饲养一周后，根据饲料的不同随机分为饲喂常规饲料(22％蛋白质+12％脂肪)的对照组、饲喂酪蛋白猪油饲料(40％蛋白质+40％脂肪)的常规模型组、饲喂大豆蛋白大豆油饲料(40％蛋白质+40％脂肪)的植物性来源组及饲喂猪肉蛋白猪油饲料(40％蛋白质+40％脂肪)的动物性来源组。大鼠饲养环境维持12h光暗周期(光照时间8:00-20:00)，温度设置为(22±2)℃，相对湿度设置为(50±20)％。实验过程中所有大鼠均自由进食和饮水，连续饲养8周。

(三)大鼠肝重及肝指数的评价方法及结果

实验结束时解剖大鼠，分离其肝脏称重，并按下式计算肝指数。

结果如表1所示：

表1高脂高蛋白饮食对大鼠肝重及肝指数的影响

注：

由表可知，大鼠经过八周的高脂高蛋白饲养后，肝重和肝指数均显著高于对照组大鼠，表明高脂高蛋白饮食诱导了大鼠肝脏损伤。

(四)大鼠恶臭气体代谢物产生的评价方法及结果

评价方法包括大鼠盲肠内容物及皮下脂肪组织中吲哚和粪臭素的水平。

1.造模8周后，收集大鼠盲肠内容物，精确称取盲肠内容物0.3000g，加入2ml色谱级甲醇，涡旋振荡3min后4℃超声提取1h，恢复至室温，用甲醇定容至3ml。最后4℃10000r/min离心10min，取上清用高效液相色谱检测(250*4.6mm；0.5μm C18色谱柱，柱温25℃，DAD检测器)。检测结果如表2所示：

表2高脂高蛋白饮食对大鼠盲肠内容物中恶臭气体代谢物产生的影响

注：

大鼠在喂食8周的植物性来源的高脂高蛋白饲料后，吲哚含量显著高于对照组大鼠，且粪臭素含量有升高的趋势。

2.造模8周后，收集大鼠皮下脂肪组织，精确称取液氮研磨好的皮下脂肪组织样本0.3000g，加入2ml色谱级甲醇，涡旋振荡3min后4℃超声提取1h，恢复至室温，用甲醇定容至3ml。最后4℃10000r/min离心10min，取上清用高效液相色谱(250*4.6mm；0.5μm C18色谱柱，柱温25℃，DAD检测器)检测。检测结果如表3所示：

表3高脂高蛋白饮食对大鼠皮下脂肪组织中恶臭气体代谢物产生的影响

三组高脂高蛋白饮食组大鼠皮下脂肪组织中的吲哚含量均略低于对照组大鼠，粪臭素浓度均高于对照组大鼠，但无显著性差异，推测吲哚含量的变化可能与代谢为吲哚硫酸酚有关，而粪臭素则是由于色氨酸的缺氧代谢导致高脂高蛋白饮食组含量升高。

(五)大鼠细胞因子水平结果

评价方法包括大鼠血清及盲肠组织中白介素1、白介素6、肿瘤坏死因子和白介素10水平。

1.造模8周后，采集大鼠股动脉血液，3,000rpm离心15min后得到大鼠血清。分别用大鼠白细胞介素1(Rat IL-1)酶联免疫检测试剂盒和大鼠白细胞介素10(Rat IL-10)酶联免疫检测试剂盒测定大鼠血清中白介素1和白介素10水平。酶联免疫检测试剂盒操作如下：

1)使用前先将试剂盒在室温下平衡半小时，预留空白孔后，在酶标包被板上每孔加入标准品或样品50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl。轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育60min。

2)第一次洗涤:小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

3)加入50μl亲和素-HRP到标准品孔和样品孔中，轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育60min。

4)第二次洗涤:小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

5)显色:每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。

6)终止:每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

7)测定:以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后10分钟以内进行。

检测结果如表4所示：

表4高脂高蛋白饮食对大鼠血清中细胞因子水平的影响

注：

动物性来源组大鼠血清中IL-1的水平显著高于对照组(p<0.05)，表明动物性来源组大鼠机体出现了炎症，常规模型组和植物性来源组虽未出现较之对照组显著的差异，但IL-1水平有升高的趋势；三组高脂高蛋白饮食组的IL-10水平均低于对照组，但无统计学差异。

2.造模8周后，收集大鼠盲肠组织，准确称取一定量的组织，按照1:10PBS进行匀浆，4,000rpm离心10min后取上清用于后续检测。分别用大鼠白细胞介素1(Rat IL-1)酶联免疫检测试剂盒、大鼠白细胞介素6(Rat IL-6)酶联免疫检测试剂盒、大鼠白细胞介素10(Rat IL-10)酶联免疫检测试剂盒和大鼠肿瘤坏死因子(Rat TNF-α)酶联免疫检测试剂盒测定大鼠血清中白介素1、白介素6、白介素10和肿瘤坏死因子水平。检测结果如表4所示：

表4高脂高蛋白饮食对大鼠盲肠组织中细胞因子水平的影响

注：

三组高脂高蛋白饮食组大鼠的盲肠组织中三个促炎细胞因子(IL-1、IL-6和TNF-α)均显著升高(p<0.05)，且植物性饮食组大鼠表现出更高的炎症表达，抗炎细胞因子IL-10的水平在四个不同处理组大鼠中没有显著性差异。

以上结果表明，高脂高蛋白饮食诱导了大鼠肝脏损伤、盲肠内容物的吲哚增加并导致了粪臭素在脂肪组织中的积累，进而使机体产生炎症，表现为促炎细胞因子水平在血清和盲肠组织中的显著升高。相比于传统高脂饮食，本发明采用了高蛋白与高脂饮食相结合的搭配方式，以及纯植物性或动物性的蛋白质脂质来源，这种饲料对特殊环境饮食的模拟性更强，模型构建时间短且模型效果更加显著，填补了恶臭气体代谢物产生及炎症的模型空白，具有良好的应用前景。