一种基于染料GelRed免标记核酸适配体传感器检测链霉素的方法和应用

摘要

本发明公开了一种基于染料GelRed免标记核酸适配体传感器检测链霉素的方法和应用，利用染料GelRed在游离状态或与单链DNA共存时发出微弱荧光，而与双链DNA共存时与之特异性结合使得荧光信号显著增强的特性，构建了免标记核酸适配体传感器检测链霉素的方法。当有链霉素存在时，核酸适配体与链霉素结合，导致荧光信号显著降低，从而检测出链霉素。GelRed是一种集高灵敏、低毒性和超稳定与一身的核酸凝胶荧光染料，原料易得、成本低，易于规模化，与核酸适配体结合具有高亲和力和特异性，可用于链霉素快速检测，具有经济、快速、灵敏、准确等优点，对控制食品安全、保护人体健康具有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明属于药物分析、食品安全领域，具体涉及一种基于染料GelRed免标记核酸适配体传感器检测链霉素的方法和应用。

背景技术

链霉素是一种氨基糖苷类抗生素，对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌以及分枝杆菌有抗菌活性，被广泛用于治疗尿道感染，皮肤感染，呼吸道感染和乳腺炎等疾病。随着链霉素在畜牧业中的广泛应用，动物性食品中不可避免的会有抗生素残留，而这些残留的存在应引起人们的高度重视，因为其潜在的致癌特性，可能会使人产生抗生素抗性和过敏反应。近年来，不少检测方法迅猛发展，如高效液相色谱法、液质联用法以及酶联免疫法等，这些方法往往存在操作复杂，仪器昂贵或检测受环境干扰较大等缺点。随着时代的发展，寻求一种高效、低成本和精确的检测方法来满足更加严格的检测要求，对控制食品安全、保护人体健康具有重要的意义。

核酸适配体是在体外从DNA或RNA分子的随机寡核苷酸库中通过称为“指数富集配体的系统进化”(SELEX)的方法选择的。适体具有热稳定性、化学稳定性、大规模的化学生产、可控的体外选择、低免疫原性和靶向多功能性等关键优势，它们能以高度的亲和力和特异性与靶分子结合，这些特性使适体成为生物传感器发展中理想的识别元件。基于适配体的生物传感器的显著发展，诸如荧光传感器、电化学传感器、化学发光传感器等。其中，基于荧光的适配体传感器是目前最为常用的检测方法，主要是因为该方法操作简单，灵敏度高，成本低。然而，这些已有的方法都需要适配体用荧光团和淬灭剂进行标记，或是荧光能量供体和能量受体，这样的标记工作成本较高，耗时较长。因此，研究免标记的核酸适配体荧光传感器检测技术显得尤为必要。

利用适配体与目标物质结合后空间构象的改变进而引起染料的荧光强度变化的原理所建立的免标记适配体荧光传感器已有很多报道，但是具有此特性的染料不多，而且不是任何一种适配体与目标物质结合后都能形成与荧光染料特异性结合的构象，所以适用范围比较局限。而EB、SYBR Green等染料具有游离或是与单链DNA共存的情况下，只发出微弱的荧光，而与双链DNA共存时，荧光强度显著增强的特性，基于此类染料构建的适配体免标记检测技术，无需特殊的荧光染料，也无需特殊的空间构象，因而应用范围十分广泛。但是，上述两种染料分别存在毒性大和价格昂贵等缺点，因而不适合大批量和日常的检测。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种基于染料GelRed免标记核酸适配体传感器检测链霉素的方法和应用，能够经济、快速、准确、灵敏地检测链霉素，可以有效解决现有链霉素检测操作复杂，或仪器昂贵或检测受环境干扰较大的缺点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于染料GelRed免标记核酸适配体传感器检测链霉素的方法，包括以下步骤：

步骤1)将链霉素适配体分别与待测样品混合，于室温下混匀孵育10～20min；

所述链霉素适配体的序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤2)向步骤1)得到的混合物中加入链霉素适配体互补链，于常温下杂交反应10～20min；

所述链霉素适配体互补链的序列如SEQ ID NO.2所示；

步骤3)向步骤2)得到的混合物中加入1×GelRed染料，混匀反应5～10min，上机检测荧光强度；

步骤4)当样品中不存在链霉素时，链霉素适配体与其互补链形成双链结构，与GelRed染料结合，此时得到的荧光强度最大；当样品中的链霉素浓度增加时，在加入GelRed染料后引起的荧光强度会随链霉素浓度的增加而减小，最终通过荧光强度的强弱变化来检测链霉素的浓度。

优选地，所述链霉素适配体和所述链霉素适配体互补链的浓度均为4μmol/L。

优选地，所述链霉素的检测线性范围为6～100μmol/L。

优选地，所述链霉素的最低检测限为1.2μmol/L。

一种基于染料GelRed免标记核酸适配体传感器检测链霉素的方法在检测食品中的链霉素浓度的应用。

一种基于染料GelRed免标记核酸适配体传感器检测链霉素的方法在检测抗生素类、毒素类、小分子类物质中的应用。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明的检测方法简单地基于链霉素结合适配体，且染料亦可竞争性结合适配体DNA的特性，具有操作简单、耗时短、成本较低的优点，避免了免疫检测法和液相检测成本高的问题。

(2)在本发明的检测方法中，标记的适体、昂贵的酶是不必要的，这使得本发明的检测方法真正不需要标记(免标记)并且行之有效。

(3)“混合检测”方法操作简单、快速，可以实现对链霉素的实时监测。此外，GelRed首次用于适配体传感器中，且成功实现了牛奶中链霉素的检测。

(4)本发明的检测方法是一种共性的检测方法，不仅可广泛应用于其他抗生素的检测，还可应用于毒素类，小分子类物质的检测。

附图说明

图1为基于适配体识别免标记荧光分析检测链霉素的原理图；

图2为检测不同浓度的链霉素与荧光变化的线性图；

图3为检测不同浓度的链霉素引起的荧光光谱图；

图4为实施例2中检测其他抗生素(卡那霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、头孢氨苄、青霉素)的荧光响应图；

图5为实施例3中检测其他可能干扰物质(色氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸)的荧光响应图；

图6为实施例3中检测其他可能干扰物质(葡萄糖、离子类物质)的荧光响应图。

具体实施方式

以下结合附图与具体实施例对本发明做进一步详细说明，但下面的实施例仅作为本发明的操作方法，不能作为对本发明的限定。

本发明利用一种在游离状态、或与单链DNA存在时只发出微弱荧光的染料GelRed，该染料毒性较低，与双链DNA共存时会与之发生结合使得荧光信号显著增强，利用GelRed染料构建了免标记适配体传感器检测链霉素的方法。该检测方法的检测原理为：适配体与链霉素在室温下孵育一段时间后形成适配体-链霉素复合物，之后将与适配体互补DNA和GelRed染料依次加入到该复合物中，这样为能与链霉素结合的游离适配体则会与互补DNA杂交形成双链DNA，GelRed染料能够插入到双链DNA中，从而引起荧光信号的显著增强。链霉素的浓度越高，体系中未能与链霉素结合的游离适配体越少，能够与互补DNA形成的双链DNA也就越少，使得插入到双链DNA中的GelRed染料也越少，从而导致荧光信号变弱。根据此原理进行定量分析，检测原理如图1所示。

实施例1

一种基于染料GelRed免标记核酸适配体传感器检测链霉素的方法，具体步骤如下：

(1)将4μmol/L链霉素适配体与待测样品(含不同浓度的链霉素)混合，于室温下混匀孵育16min。

所述链霉素适配体，具有如SEQ ID NO.1所示的序列，具体为：

5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’。

(2)接着加入4μmol/L链霉素适配体互补链，于常温下杂交反应11min。

所述链霉素适配体互补链，具有如SEQ ID NO.2所示的序列，具体为：

5’-CGGCGCATGCGTCGACCTGCAGACGACCCGACAGAACAAAGCAGAACACCAGACCCCGGATCCGTCGACGAATTCCCTA-3’。

(3)最后加入1×GelRed染料，混匀反应6min，上机检测荧光强度。

(4)当样品中不存在链霉素时，链霉素适配体与其互补链形成双链结构，与GelRed染料结合，此时得到的荧光强度最大(F

在最优的实验条件下，如图2、图3所示，链霉素在6～100μmol/L浓度范围内与荧光强度(F)呈线性相关，最低检出限为1.2μmol/L。

实施例2检测其他抗生素的应用

选取牛奶中常见的抗生素如卡那霉素(Kana)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(Amx)、头孢氨苄(Cel)、青霉素(Pen)，按照实施例1的检测方法对这些样品进行测定，观察荧光信号的变化。结果如图4所示，由目标物质链霉素(Str)引起的荧光信号的改变非常显著，而其他抗生素的荧光信号的变化很小，近似可以忽略。该结果证明基于适配体免标记荧光分析检测链霉素的方法具有高度特异性和专一性。

实施例3检测其他可能干扰物质的应用

选取牛奶中可能的干扰物质如氨基酸(色氨酸Try、赖氨酸Lys、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe、谷胱甘肽Gsh、半胱氨酸Cys)、葡萄糖(Glu)和离子类物质(Na

实施例4检测牛奶中加标链霉素的应用

称取10mL牛奶于50mL离心管中，加入5mL 5％的三氯乙酸，涡旋混匀3min后，水浴超声15min，于10000r/min下离心30min，上层清液移至另一50mL离心管中，上清液用0.22μm滤膜过滤后，调节pH为7左右作为待测牛奶样品。按照实施例1的检测方法对待测牛奶样品进行测定，观察荧光信号的变化。结果如下表1所示，采用该方法对含有不同浓度链霉素(8、10、20μmol/L)的牛奶样品进行分析，链霉素的平均回收率在95.5％～110.2％之间。该结果证明所提出的荧光分析法具有良好的重现性和准确性，可用于实际样品中链霉素的筛选。

表1牛奶中链霉素浓度检测及其加标回收测定

本发明利用一种新型的荧光染料GelRed，它不但具有在游离状态，或与单链DNA共存时只发出微弱的荧光。与双链DNA共存时会与之发生结合使得荧光信号显著增强的特性，而且低毒性，价格低廉，结合适配体的高亲和力和高特异性识别，构建了免标记适配体传感器检测链霉素的方法。实验结果表明，该检测方法特异性高，耗时短，灵敏度高。值得关注的是该检测方法的原理仅基于DNA的杂交，因此可广泛应用于检测各类抗生素，为保障食品安全提供了新思路、新方法。

序列表

<110> 南京师范大学

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<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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<210> 2

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