LC-MS/MS法测定人血浆中卡格列净浓度的方法

摘要

本发明属于医药检测技术领域，具体公开了一种LC‑MS/MS法测定人血浆中卡格列净浓度的方法，本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中的卡格列净的浓度，灵敏度较高，卡格列净的血浆最低定量限为50ng/mL。本方法卡格列净的血浆标准曲线线性范围为50～8000ng/mL，批内和批间精密度RSD均小于±10％。本发明方法重现性好，准确度高；解决了基质效应，不受基质、高血脂基质和溶血基质的干扰，不同人群的血浆对本发明方法无干扰现象，可用于临床大批量样品分析需求。

说明书

技术领域

本发明涉及医药检测技术领域，具体涉及一种LC-MS/MS法测定人血浆中卡格列净浓度的方法。

背景技术

卡格列净，英文名为Canagliflozin，是由强生原研的强效、可逆的高选择性人体肾脏钠葡萄糖共转运体(SGLT2)抑制剂，通过抑制肾脏对葡萄糖的重吸收作用，促进葡萄糖经尿液排泄，从而降低血糖。2013年3月，获得美国FDA批准上市，该药以商品名

现有的卡格列净有关物质高效液相分析方法有：仪器：API3200；流动相：乙腈-0.1％甲酸水(90:10V/V)；流速0.2ml/min；色谱柱：Quicksorb ODS(2.1mm*150mm，5μm)。处理步骤：取用100μL血浆，加入10μL内标工作液，再加入100μL乙腈沉淀，涡旋15S混匀，加入1mL叔丁基甲基醚，涡旋30S以上，12000rpm离心15min。离心后取上清液转移至干净的离心管中，在60℃条件下氮气吹干，100Μl流动相复溶，涡旋30秒，30μL进样分析。上述方法并不能应用到检测人血浆中卡格列净血药浓度上来，且样品分析时间较长，具有一定的局限性。

国外期刊杂志有相关报道，其中对于卡格列净血药浓度检测的方法为：仪器：API3200；流动相：乙腈-0.1％甲酸水(90:10V/V)；流速0.2ml/min；色谱柱：Quicksorb ODS(2.1mm*150mm，5μm)。处理步骤：取用100μL血浆，加入10μL内标工作液，再加入100μL乙腈沉淀，涡旋15S混匀，加入1mL叔丁基甲基醚，涡旋30S以上，12000rpm离心15min。离心后取上清液转移至干净的离心管中，在60℃条件下氮气吹干，100μL流动相复溶，涡旋30秒，30μL进样分析。该方法操作步骤繁杂，需氮吹复溶，且耗用血浆用量大。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种LC-MS/MS法测定人血浆中卡格列净浓度的方法，可检测人血浆中卡格列净，样品分析时间较短且检测时间短，实现在短时间内准确测定出人血浆中卡格列净浓度。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明提供一种LC-MS/MS法测定人血浆中卡格列净浓度的方法，包括如下步骤：提取血浆中的卡格列净，得到提取液；将提取液采用高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行定性定量测定。

进一步地，所述高效液相色谱串联质谱的液相色谱条件包括：

色谱柱：Waters XTERRA MS C18(2.1×50mm，5micron)；

保护柱：Gemini C18(4×3.0mm，Phenomenex，USA)；

流动相A∶10mM乙酸铵水溶液，流动相B∶乙腈；流速0.6mL·min

停止时间7.00min；洗针程序：洗针液冲洗10s；进样量10μL；柱温35℃；

采用梯度洗脱。

进一步地，所述洗针液为甲醇和水的混合溶液，V/V＝90:10。

本发明选择色谱柱：Waters XTERRA MS C18，规格为2.1×50mm，5micron；对血浆中的卡格列净的响应值最高，峰形较好，对称且不拖尾，出峰时间时间不会太靠前，也不会太靠后，刚好合适。

考虑流速对药物出峰时间的影响以及进样量过大导致出峰效果的影响，本发明选择流速为0.6mL/min，采用进样量为10μL，不仅可保证药物出峰效果和响应值，也能使药物完全洗脱赶紧，避免对色谱柱的污染，同时也利于回收率的提升和后续质谱检测的灵敏度的提升。

进一步地，所述梯度洗脱的程序为：

。

本发明采用梯度洗脱的方式对血浆中的卡格列净进行检测，流动相的洗脱比例在不同时间进行变化，综合考虑血浆基质效应等问题，使得药物出峰峰形对称完美，不仅可将药物充分洗脱下来，且回收率也高，干扰性小。

进一步地，所述高效液相色谱串联质谱的质谱条件包括：

采用ESI源，正离子MRM模式检测。

质谱切换阀设置如下：

离子源参数设置如下：

。

通过质谱仪很强的组分鉴别能力，能够有效分离和鉴别血浆中卡格列净，并进行定量检测。

进一步地，所述提取液制备过程如下：取待测全血样本，加入抗凝剂肝素钠，通过离心后制得待测血浆样本，加入内标工作溶液，涡旋，加入提取溶剂，涡旋，离心，取上清液得提取液。

进一步地，所述提取溶剂为乙腈。所述稀释溶液为50％乙腈水溶液。

进一步地，所述内标工作溶液中的内标为卡格列净-d

进一步地，所述内标工作溶液的配制过程如下：称取卡格列净-d

取卡格列净-d

进一步地，所述涡旋离心的条件为：涡旋3min，离心，15700g，4℃，10min。

进一步地，所述定性定量方法为：定性方法为待测药物与药物标准品的保留时间一致，结合质谱参数中的定性和定量离子对确定为目标药物；定量方法：以分析物峰面积与内标峰面积比对标准曲线中分析物的理论浓度进行线性最小二乘法回归计算，以所得回归方程计算样品中分析物的实测浓度。

进一步地，所述标准曲线的制备过程如下：取卡格列净标准工作溶液，稀释到空白血浆中，配制卡格列净标准曲线血浆样品；取标准曲线血浆样品，加入内标工作溶液，涡旋离心，加入乙腈进行蛋白沉淀，涡旋离心，取上清液采用高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)测定，记录每个浓度的卡格列净对应的峰面积，以卡格列净和内标的峰面积比值为纵坐标，以卡格列净浓度为横坐标，制备标准曲线回归方程。

进一步地，所述卡格列净标准工作溶液的配制：称取卡格列净于棕色广口玻璃瓶中，经甲醇溶解配制成1mg·mL

进一步地，所述标准系列的卡格列净工作溶液的浓度范围为1～160μg/mL；优选浓度为1、2、4、10、40、80、136、160μg/mL。

进一步地，所述卡格列净标准曲线血浆样品的配制如下：取标准系列的卡格列净工作溶液稀释至空白血浆中，配制成卡格列净标准曲线血浆样品。

进一步地，所述卡格列净标准曲线血浆样品的浓度范围为50～8000ng/mL，优选为50、100、200、500、2000、4000、6800、8000ng/mL。

进一步地，所述标准曲线回归方程的获取过程如下：取标准曲线血浆样品各50μL，加入内标工作溶液20μL，涡旋1min，加入200μL乙腈沉淀，涡旋3min，离心10min，15700g；10μL进样LC-MS/MS系统，得到色谱图；根据得到的色谱图中卡格列净色谱峰面积与内标峰面积的比值计算卡格列净在血浆中的浓度，制定卡格列净标准曲线回归方程。

进一步地，所述LC-MS/MS系统检测后，卡格列净在1.62min左右出峰，峰形良好，且人血浆中无杂质峰干扰上述化合物的测定，表明该方法具有较强的专属性。

进一步地，所述标准曲线的回归方程如下：

测得的卡格列净在人血浆中的标准曲线回归方程为y＝6.640462×10

本发明方法可获得高回收率且有效降低杂质峰的干扰，避免传统方法由于溶剂效应带来的影响，避免传统方法的繁琐和条件不受控的情况。

本发明采用卡格列净-d

本发明方法具有系统适用性，对不同来源空白血浆无选择性，能够专一性测定卡格列净，分离度好。

本发明方法用量小，每次血浆样品测试仅需50μL，进样量仅需10μL，可准确测定出化合物。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明基于LC-MS-MS法建立人血浆的采集、分离分析方法，并成功的应用于人血浆中卡格列净的浓度检测。采用LC-MS/MS法测定人血浆中卡格列净浓度，解决了血浆基质干扰多的问题，灵敏度高，结果准确可靠，基质效应、高血脂基质效应和溶血基质效应均无干扰，准确度和精密度高，用量小，可用于临床大批量样品分析需求。本发明方法步骤简单，耗用血浆量小，样品处理过程简单，通过改用乙腈蛋白沉淀法，将血浆用量缩减一般，大幅度的节约了项目成本，且采用同位素内标，大大减少了基质效应对分析测试的影响。

本发明提供了一种预处理方法简便的测定人血浆中的卡格列净浓度的方法，采用乙腈进行蛋白沉淀法，适用于常规测定；本发明采用液相色谱-质谱联用法进行检测，能够有效分离和鉴别血浆中卡格列净，并进行定量检测。本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中的卡格列净的浓度，灵敏度较高，卡格列净的血浆最低定量限为50ng/mL。本方法卡格列净的血浆标准曲线线性范围为50～8000ng/mL，批内和批间精密度RSD均小于±10％。本发明方法重现性好，准确度高，不受基质、高血脂基质和溶血基质的干扰，不同人群的血浆对本发明方法无干扰现象。

相比现有液相检测方法，本发明方法的检测下限能满足较小给药量时生物体内的含量测定要求，检测过程中信噪比符合标准要求，无杂质峰的干扰，测定的药物的含量准确度高。

本发明采用的溶剂能保持溶液的稳定性，还能确保检测的结果具有良好的重现性。本发明采用的液相的流动相、梯度以及色谱柱，可以有效分离卡格列净与基质，使分析物在固定位置出峰，提高准确度。

本发明方法能够满足人体药代动力学要求，可应用与临床药代动力学研究。

附图说明

图1 LC-MS/MS法测得的人血浆中卡格列净的标准曲线图；

图2 LC-MS/MS法测得的人血浆中卡格列净和卡格列净-d

图3卡格列净正离子多反应检测扫描质谱图；

图4卡格列净-d

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

1.主要仪器

Agilent 6410B型三重四极杆液质联用仪，配有自动进样器、液相色谱仪、柱温箱、电喷雾电离离子源(ESI)及Agilent MassHunter Workstation Software数据处理系统(Agilent，德国)

METTLER TOLEDO AB135-S型十万分之一天平(METTLER，瑞士)；

Sartorius BS224S型万分之一天平(北京赛多利斯)；

XW-80A涡旋混合器(上海沪西分析仪器厂)；

多管涡旋振荡器(安简(北京)科技有限公司)；

TGL16M/TGL20M型冷冻离心机(长沙英泰仪器有限公司)；

Eco-S15HUVF实验室纯水系统(上海和泰仪器有限公司)。

2.色谱条件

色谱柱：Waters XTERRA MS C18(2.1×50mm，5micron)；

保护柱：Gemini C18(4×3.0mm，Phenomenex，USA)；

流动相A∶10mM乙酸铵水溶液，流动相B∶乙腈；流速0.6mL·min

停止时间7.00min；洗针程序：洗针液冲洗10s；进样量10μL；柱温35℃；流动相比例设置如下：

3.质谱条件

采用ESI源，离子化方式：电喷雾离子化正离子模式(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；

质谱切换阀设置如下：

离子源参数设置如下：

4.抗凝剂：肝素钠

5.内标：卡格列净-d

6.数据处理

色谱保留时间及色谱峰面积由Agilent MassHunter Workstation Software(version B.08.02)采集处理与定量分析，采用Agilent ECM网络系统。以分析物峰面积与内标峰面积比对标准曲线中分析物的理论浓度进行线性最小二乘法回归计算，以所得回归方程计算样品中分析物的实测浓度。样品中分析物的实测浓度由仪器采用以下回归方程计算：

y＝ax+b

其中，y＝分析物/内标峰面积比

a＝标准曲线之斜率

x＝分析物浓度(单位ng·mL

b＝标准曲线之截距

(权重因子为1/x

7.样品进行检测前的预处理方法：

取全血，加入抗凝剂肝素钠，通过蛋白沉淀法进行处处理后制得空白血浆，冷藏用于进行样品稀释或配制，使用前解冻。

50μL标准曲线血浆样品使用前加入内标工作溶液20μL，涡旋1min，加入200μL乙腈，涡旋3min，离心，15700g，4℃，10min，转移200μL上清液至96孔板中，待进样。

50μL SST使用前加入内标工作溶液20μL，涡旋1min，加入200μL乙腈，涡旋3min，离心，15700g，4℃，10min，转移200μL上清液至96孔板中，待进样。

50μL质控血浆样品使用前加入内标工作溶液20μL，涡旋1min，加入200μL乙腈，涡旋3min，离心，15700g，4℃，10min，转移200μL上清液至96孔板中，待进样。

50μL空白血浆使用前加入甲醇20μL，涡旋1min，加入200μL乙腈，涡旋3min，离心，15700g，4℃，10min，转移200μL上清液至96孔板中，待进样，记作：Double blank或Carryover样品。

或者50μL空白血浆使用前加入内标工作溶液20μL，涡旋1min，加入200μL乙腈，涡旋3min，离心，15700g，4℃，10min，转移200μL上清液至96孔板中，待进样，记作：Blank样品。

50μL超纯水使用前加入甲醇20μL，涡旋1min，加入200μL乙腈，涡旋3min，离心，15700g，4℃，10min，转移200μL上清液至96孔板中，待进样，记作：Reagent and Materialsblank样品。

备注：Double blank为双空白样品、carryover为残留考察用双空白样品、blank为只加内标的单空白样品、Reagent and Materials blank为试剂耗材验收空白样品。

实施例1

1.溶液配制

流动相A(10mM乙酸铵水溶液)

称取约0.7708g乙酸铵溶解于1L超纯水中，混匀待用。

流动相B(乙腈)

量取乙腈(Merck)2L于2L的溶剂瓶中，待用

洗针溶液(甲醇：水，90:10，V/V)

分取900mL甲醇和100mL的超纯水转移至适当的溶剂瓶中，混匀，待用。

工作液稀释剂的配制(50％乙腈水溶液)

分取250ml的超纯水和250ml的乙腈至适当的溶剂瓶中，混匀即得。

沉淀剂(乙腈)

量取500mL乙腈至适当溶剂瓶中，待用。

2.标准溶液配制：

标准对照品储备液的配制

称取卡格列净对照品稍多于10mg置于自制杯状铝箔纸中，将铝箔纸置于20mL棕色广口玻璃瓶中，用10mL移液管吸取10mL的甲醇加入玻璃瓶中，根据实际称量值及卡格列净含量(101.1％)计算浓度达到1mg·mL

标准系列工作溶液的配制：

标准曲线血浆样品的配制

SST样品：配制同STD1。

内标标准溶液配制

内标储备溶液配制

直接加入971μL的甲醇溶解规格为1mg的卡格列净-d

内标工作溶液配制

用移液管吸取20mL的甲醇置于20mL棕色广口玻璃瓶中，用移液器移去100μL的甲醇，加入卡格列净-d4内标储备溶液100μL，摇匀，即得浓度为5μg·mL

质控标准溶液配制

质控对照品储备液的配制：

称取卡格列净对照品略多于10mg，置于自制杯状铝箔纸中，将铝箔纸置于20mL棕色广口玻璃瓶中，用10mL移液管吸取10mL甲醇加入玻璃瓶中，摇匀，根据实际称量值及卡格列净含量(101.1％)计算浓度达到1mg·mL

质控工作溶液的配制：取质控对照品储备液，稀释到50％乙腈水中，配制成的卡格列净质控工作液；

质控血浆样品的配制：取质控工作溶液，稀释到空白血浆中，配制成的卡格列净质控血浆样品液；

3.方法学验证

5.1线性范围和定量下限

取标准系列工作溶液各10μL，稀释到空白血浆中使得总体积为0.2mL，配制的标准曲线血浆样品中卡格列净浓度值为：50～8000ng/mL。

取标准曲线血浆样品、空白血浆Double blank样品、Blank样品；10μL进样到色谱系统分析。

结论：所得标准曲线样品的线性曲线图如1所示，其中LC-MS/MS法测得的卡格列净在人血浆中的标准曲线方程为y＝6.640462E-004x-0.004140，R

5.2精密度与准确度

取四个不同浓度的质控血浆样品，卡格列净质控血浆样品液的浓度为6000ng/mL、1500ng/mL、120ng/mL、50ng/mL；分别对应为HOQ QC、MOQ QC、LOQ QC、LLOQ浓度，并将其进行检测。作为批内及批间准确度和精密度的考察。每一个浓度平行制备6份，至少测试三次。采用平均值来评估批间准确度和精密度。结果如下表：

表1：LC-MS/MS法测定血浆中卡格列净批内、批间的精密度和准确度

结果表明：卡格列净的血浆样品批内、批间精密度、准确度偏差均小于15％。低、中、高浓度水平标准血浆样品测得值应为标示值的85％～115％范围内，批内与批间精密度(RSD)小于15％。说明本发明方法对血浆中的卡格列净的检测具有良好的精密度和准确度。

5.3系统适用性：

取经预处理过的卡格列净血浆样品，浓度为50ng/mL；每批次进样前进样检测，重复分析5次；

分别记录待测物与内标的色谱峰面积值及保留时间，并计算待测物与内标的色谱峰面积比值及色谱峰保留时间的变异系数。具体结果如下表2所示：

表2：卡格列净系统适用性

结论：待测物信噪比(S/N不小于5)，5次重复分析所得待测物与内标色谱峰面积比值的变异系数应小于5.0％；5次重复分析所得待测物与内标色谱峰保留时间的变异系数应小于3.0％。待测物卡格列净保留时间变异系数0.0～0.2％、内标保留时间变异系数0.0％、面积比的变异系数2.2～4.5％；说明本发明方法对血浆中药物的检测方法适用测定人血浆中卡格列净的浓度。

5.4选择性

选择性是指色谱方法测定分析物时，区分生物基质中干扰的能力。方法验证之前，需要至少筛选6个不同批次的空白基质用于方法验证。

取6个中国人群不同来源的空白血浆50μL，经预处理为Carryover样品后，10μL进样到色谱系统分析。

取50μL 6份来自不同来源的空白血浆，配制成的卡格列净质控血浆样品液的浓度为50ng/mL，经预处理后，10μL进样到色谱系统分析；

取50μL 6份来自不同来源的空白血浆，经预处理为Blank样品后，10μL进样到色谱系统分析；

分别记录各份空白样品及定量下限浓度水平的标准血浆样品的结果如下表。

表3：六个不同来源空白健康人体血浆对分析物、内标的选择性考察对比表

结论：至少6份不同来源空白基质样品中的分析物保留时间处色谱峰峰面积低于相对应的不同来源空白基质LLOQ浓度待测物峰面积的20.0％，且内标保留时间处内标峰面积低于相对应的不同来源空白基质LLOQ浓度内标峰面积的5.0％。6份不同来源空白基质配制的LLOQ浓度测得值在理论值的80.0％～120.0％范围内。本发明方法针对不同来源空白基质样品中的分析物的干扰范围为4.0～6.4％，内标干扰响应值为0～0.1％。可见，不同人体的空白血浆对卡格列净的检测结果没有造成干扰，该方法可以用于检测不同人体血浆中卡格列净，不同人群的血浆对本发明检测方法无影响。

5.5回收率

5.5.1分析物的提取回收率

分析物回收样品

提取回收率样品由待测物(KGLJ)三个浓度水平(120ng·mL-1、1500ng·mL-1、6000ng·mL-1)的基质样品分别平行制备6份，不加入内标溶液，沉淀后，取合适体积的上清溶液，加入合适的内标溶液。

回收率参比样品：

提取过程与提取回收率样品的提取操作相同，但是分析物和内标溶液均在沉淀后加入。

5.5.2内标物的提取回收率

内标的提取回收率样品

由空白血浆样品平行制备6份，加入内标工作溶液，沉淀后，取合适体积的上清溶液，加入与MOQ QC质控样品浓度相当的标准品溶液。

内标的回收率参比样品：

提取过程与内标的提取回收率样品的提取操作相同，但是MOQ QC质控样品和内标溶液均在沉淀后加入。

表8：内标回收率

结论：1)本发明方法的待测物卡格列净在高、中、低三个浓度范围内的提取回收率分别为84.3％、85.3％、84.9％，对应的变异系数CV值为5.5％、3.2％、4.2％；总回收率为84.8％，总体回收率变异CV值为4.1％。

4)本发明方法的内标物卡格列净-d

5.6基质效应

1)基质效应系指生物基质中存在的组分对分析物的离子化所产生的抑制或增强作用。分别取6个不同批次的空白人血浆，每个批次配制一份，经前处理后分别加入与处理后的低浓度和高浓度质控样品浓度相当的标准品溶液及内标溶液进行分析。

无基质存在的与低浓度和高浓度质控样品浓度相当的纯溶液，平行6份，进行分析。

2)溶血基质的配制：取100μL空白全血，将其超声破坏血细胞，取其20μL加入980μL正常空白血浆，混匀，即为2％经超声破坏的溶血血浆，视为严重溶血。

使用模拟的溶血血浆制备待测物两个浓度水平(LOQ QC、HOQ QC)样品各6份，并将其处理后，进样到色谱系统分析。

3)使用高血脂血浆样品制备待测物低、高浓度水平(LOQ QC、HOQ QC)样品各6份，并将其处理后，进样到色谱系统分析。

结论：经内标归一化的基质因子的变异系数CV％：1.2％、1.7％；溶血基质效应的平均准确度偏差范围：1.1％～6.1％；高血脂基质效应的平均准确度偏差范围：2.6％～5.7％；说明本发明方法没有明显的基质效应，也没有明显的溶血和高血脂基质效应。

5.7稳定性

将待测物低、高(LOQ QC、HOQ QC)两个浓度的人血浆质控样品，在如下条件下进行稳定性考察：

-70℃反复冻融3次稳定。

室温放置21h稳定。

-20℃条件下42d稳定。

全血稳定性：分别考察加入含低、高(LOQ QC、HOQ QC)两个浓度水平分析物在全血中冰水浴下放置(0h)、(0.5～2h)峰面积之比的变化，在放置相应考察时间点后，将全血样品离心分离血浆，加入内标按照相应血浆样品处理操作方法处理，每个浓度水平平行6份。

通过稳定性考察后的样品与现配制的样品同时检测，每个浓度对比结果如下：

表4室温放置21h稳定-短期稳定性结果：

表5 -20℃条件下42d稳定-长期稳定性结果：

表6 -70℃反复冻融3次稳定性结果：

表7全血稳定性结果：

本发明的方法检测的血浆中各药物的浓度在上述考察条件下得出的CV值小于5％，提示在上述考察条件下本发明方法对全血和血浆中卡格列净的检测具有较强的稳定性。

5.8人血浆样品检测

于96孔板中精密加入50uL的标准曲线、随行质控血浆样品、人血浆样品，加入20uL的IS Spike，涡旋1min，加入200uL乙腈于96孔板中，涡旋混合3min，于4℃以15700g离心10min，取200uL上清液转移至96孔板中；10uL进样到色谱系统进行LC-MS/MS分析。

结论：经方法学验证，本发明方法具有灵敏度高，适用性强，精密度和准确度良好、稳定性好的优点，药物的提取回收率在可接受范围内，未见明显基质效应，本发明方法还具有快速、通量高的优点。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。