秦巴硒菇提取物对慢性髓系白血病的实验研究方法

摘要

本发明公开一种秦巴硒菇提取物对慢性髓系白血病的实验研究方法，选取秦巴硒菇提取物酸性RNA蛋白复合物FA‑2‑b‑β作用于慢性髓系白血病K562细胞株、慢性髓系原代白血病细胞，通过Wnt/β‑catenin、Caspase信号通路研究其对慢性髓系白血病凋亡的影响机制，为秦巴硒菇的临床应用提供实验依据。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及秦巴硒菇提取物对慢性髓系白血病的实验研究方法。

背景技术

慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一种起源于骨髓多能造血干细胞的双向多能造血干细胞衍生而来的骨髓恶性克隆增殖性肿瘤。其特征为费城染色体(Ph)(9：22)(q34：q11)相互移位形成BCR-ABL致癌基因，是一种组成型激活的酪氨酸正玄激酶，通过下游效应分子磷酸化驱动CML的发生。大部分CML患者表达酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，该蛋白是一种组成型激活的酪氨酸正弦激酶，BCR-ABL酪氨酸激酶通过下游效应分子磷酸化驱动引起细胞增殖不受控，髓样细胞异常增长，进而引起CML的发生。CML的治疗以BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂IM为第一代治疗CML患者的临床一线药物，该药抑制白血病细胞增殖的机制可能是通过靶向抑制BCR-ABL酪氨酸蛋白激酶活性。IM在21世纪批准为临床治疗患者后，其临床治疗疗效好，明显改善了CML患者的预后和生存期。然而，随着治疗时间的延长，仍有部分患者在治疗后并未达到细胞遗传学和分子生物学的缓解。人们试图从传统中药中寻找价格低廉、多靶点、毒副作用小的天然中药为CML治疗提供给新的方案。

秦巴硒菇又名姬松茸、粱金菇，属于担子菌纲。巴西、日本、秘鲁、我国福建、湖北、贵州、陕西、云南等多地种植，营养和药用价值丰富，是一种药食兼用的珍稀真菌类。随着国内外学者对秦巴硒菇研究的不断深入，从秦巴硒菇子实体多糖中分离得到结构为β-1,6-葡聚糖，能够抑制肿瘤细胞增殖，调节肿瘤细胞的生长及衰老，且能提高机体免疫力，其机制可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥良好的抗肿瘤效应。

发明内容

本发明选取秦巴硒菇提取物酸性RNA蛋白复合物FA-2-b-β作用于慢性髓系白血病K562细胞株、慢性髓系原代白血病细胞，通过Wnt/β-catenin、Caspase信号通路研究其对慢性髓系白血病凋亡的影响机制，为秦巴硒菇的临床应用提供实验依据。

本发明采用的技术方案：

秦巴硒菇提取物对慢性髓系白血病的实验研究方法，该方法包括以下步骤：

步骤S1：秦巴硒菇提取物对体外白血病细胞的实验研究

S101：测定秦巴硒菇提取物对白血病细胞的敏感性

S102：检测细胞凋亡率

S103：检测细胞周期

步骤S2：秦巴硒菇提取物对慢性髓系白血病动物的实验研究

S201：慢性髓系白血病动物模型的建立

选择4-5周龄，体重为18-20g的雄性NOD/SCID小鼠，于SPF环境中，温度为22±1℃，自由进食水喂养一周后，小鼠状态良好；取对数生长期的原代细胞，用0.9％的生理盐水将细胞密度调整至1×10

S202：模型小鼠外周血细胞数、体重检测；

步骤S3:RT-qPCR法检测K562、原代细胞，模型小鼠脾脏组织相关凋亡基因表达

步骤S4:Western-blot法检测K562、原代细胞，模型小鼠脾脏组织相关凋亡蛋白表达；

步骤S5：模型小鼠HE、免疫荧光、免疫组化检测；

步骤S6：统计软件使用PRISM7，数据表示为X±SD，各组数据采用单因素方差分析，2组数据比较，采用独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

优选的，上述步骤S101的具体过程如下：

(1)骨髓单个细胞核提取；

(2)细胞复苏、冻存

(3)CCK8法检测细胞增殖抑制率实验

CCK8法评估K562细胞、原代细胞活力，收集生长对数期K562细胞、原代细胞重悬于RPMI-1640培养基中，分别将这两种细胞以密度为1×10

优选的，骨髓单个细胞核提取过程为：

收集骨髓液按照1:1加入等体积的无菌PBS溶液进行稀释，充分混匀，在新的无菌15mL离心管中加入4mL Ficoll淋巴细胞分离液，用吸管将上述稀释后的骨髓液沿离心管管壁缓慢加入到Ficoll淋巴细胞分离液上层，使骨髓稀释液与Focll淋巴细胞分离液形成分界面；然后2000rpm离心15min，离心结束后取出离心管，可见液体分离4层，骨髓上清层-单个核细胞层-Ficoll分离液层-红细胞层；吸管小心吸取中间呈白色雾状的单个核细胞层，转移至15mL离心管中，在细胞悬液中加入无菌PBS洗涤后的细胞，1500rpm离心5min，弃掉上清，重悬细胞进行二次洗涤离心收集细胞沉淀，加入细胞冻存液放入细胞冻存管中，-80℃冰箱保存。

优选的，在上述步骤S102中，检测细胞凋亡率的具体过程如下：

取对数生长期的K562细胞、原代细胞，将10×10

优选的，在上述步骤S103中，检测细胞周期的具体过程如下：

取对数生长期的K562细胞、原代细胞，将10×10

优选的，上述步骤S4的具体过程如下：

S401：蛋白提取

S402：蛋白定量

S402：SDS-PAGE蛋白电泳

S403：转膜、免疫反应

S404：DAB显色、凝胶电泳图像分析

显色剂ECL充分混匀滴至蛋白条带上，采用Image J软件分析条带所曝光的数值，计算蛋白相对含量＝目的蛋白吸光度/Actin蛋白吸光度。

优选的，在上述步骤S401中，蛋白提取的具体过程如下：

取对数生长期细胞，将10×10

与现有技术相比，本发明的有益效果是：体外实验研究结果显示与空白对照组相比，CCK8法检测结果发现，不同浓度的FA-2-b-β作用于K562细胞、原代细胞24、48、72h后，细胞增殖抑制率增加，且呈浓度时间依赖性，其r值为：rK562-24h＝-0.9111、rK562-48h＝-0.9067、rK562-72h＝-0.9213、r原-24h＝-9082、r原-48h＝-9442、r原-72h＝-9546；流式细胞术检测结果发现不同浓度的FA-2-b-β(1.2,1.8and 2.4mg/mL)作用于K562细胞、原代细胞24、48h后，K562细胞的调亡率依次为1.18/0.11％、9.91/25.21％、79.49/71.83％、93.4/95.74％；原代细胞凋亡率依次为3.94/10.7％、17.8/30.4％、49.21/52.89％、81.13/79.81％；不同浓度FA-2-b-β(1.2,1.8and 2.4mg/mL)作用于K562细胞、原代细胞24、48h后，K562细胞周期变化为加药组G1百分比随着药物浓度的增加而上升，依次为33.73％/37.18％、34.94％/37.01％、37.36％/43.09％和41.53％/60.64％，原代细胞GI期百分比依次为33.73％/37.65％、37.01％/45.07％、56.95％/53.11％和58.99％/60.66％；S期细胞百分比随着药物浓度的增加而降低。

附图说明

图1为CCK8法测定FA-2-b-β抑制K562、原代细胞的增殖抑制率；不同的时间点，K562细胞(A)，原代细胞(B)活力受到抑制；

图2为FA-2-b-β对K562(A，B，E，F)、原代细胞(C，D，G，H)凋亡的影响；

图3为FA-2-b-β对K562细胞(A，C，E，F)、原代细胞(B，D，G，H)周期的影响；

图4为K562(A)、原代细胞(B)中相关凋亡蛋白的表达；(*P<0.05，**P<0.001)

图5为K562、原代细胞中相关凋亡蛋白的表达(K562(A，C)，原代细胞(B，D)*P<0.05，**P<0.001)；

图6为小鼠生存分析；

图7为模型小鼠治疗前后血细胞计数，体重变化(*P<0.05,**P<0.001)白细胞：109/L(0.8-6.8)，红细胞:1012/L(6.36-9.42)，血红蛋白:g/L(110-143)，血小板:109/L(450-1590)；

图8为慢性髓系白血病模型小鼠脾脏HE染色；

图9为慢性髓系白血病模型小鼠脾脏组织相关凋亡蛋白CytochromeC，BcL-2，caspase3，Bax，A，C治疗前.B，D治疗后(dyeing of DAPI,DAB PI 400×)；

图10为脾脏组织中相关凋亡基因的表达(*P<0.05，**P<0.001)；

图11为脾脏组织中相关凋亡蛋白的表达(*P<0.05，**P<0.001)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明具体提供了提供了一种秦巴硒菇提取物对慢性髓系白血病的实验研究方法，下面结合实验具体分析下该研究方法。

英汉缩略语名词对照表

仪器与试剂

1.主要试剂和耗材

(1)秦巴硒菇由陕西紫阳有限公司提供，其提取物酸性RNA蛋白复合物(FA-2-b-β)由中国科学院兰州物理化学研究所天然产物研究室分离提取并鉴定,500g国产秦巴硒菇分离纯化可得到4.86g酸性RNA蛋白复合物FA-2-b-β。PBS溶液配成所需浓度，灭菌，4℃冰箱保存，备用。

(2)K562细胞株(Lot：CL-0130)，为人来源慢性髓系白血病细胞株，细胞株从中国科学院细胞库(ATCC)获得。原代白血病细胞由甘肃省人民医院门诊获取初诊慢性髓系白血病患者，获得患者知情权，签署知情同意书后，并通过甘肃省人民医院伦理委员会审批。抽取患者骨髓，无菌分离原代细胞，并在RPMI1640培养基中培养,辅以10％热灭活胎牛血清，在5％CO2湿润孵化器培养箱中培养，恒温37°。

(3)溶液配制①PBS(磷酸盐缓冲液)8g NaCL，1.44g NaHPO4，0.2gKCL，O.24gKH2PO4，超纯水定容至1L，高压灭菌，4℃保存；

②4×上样缓冲液(Loading Buffer):500mmol/L LDTT、0.5％溴酚蓝、pH：6.8Tris盐酸10％SD、50％甘油；

③蛋白定量工作液(Bradford法)：0.035g考马斯蓝、25mL 95％乙醇、52mL85％磷酸、超纯水定容至500mL，除菌，4℃保存；

④蛋白标准液BSA蛋白溶液(1ug/uL)、0.9％NaCL、-20℃保存；

⑤TBST：1×TBS中，1000：1Tween20，室温保存；

⑥1.0mol/L Tris-Hcl溶液(pH 6.8)：6gTris碱，0.5mol/L的HCl调整pH值至6.8超纯水定容至100mL，4℃保存；

⑦10×甘氨酸电泳缓冲液(10×Tris-Glycine)：甘氨酸144g，SDS 10g，Tris碱30g溶于超纯水定容至1L，充分溶解后，4℃保存。

(4)重度免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)缺乏B细胞，T细胞，NK细胞，缺乏补体活性，树突状细胞，巨噬细胞等，对植入的各种肿瘤细胞有较少的排异反应，具有成模效率高，成模稳定等特点而被用于临床评价药物疗效，通过向NOD/SCID小鼠尾静脉注射慢性髓系白血病原代细胞建立CML模型小鼠。本研究选取NOD/SCID小鼠42只，雄性，4-5周龄，20-25g，购自江苏集萃药康实验动物有限公司，动物质量合格证号：SCXK(苏)2018-0008，于甘肃中医药大学无特定病原体的(SPF级)条件下饲养，实验动物饲养设施合格证号：SYX(甘)2015-0005。实验方案经甘肃省人民医院动物实验委员会批准(批准号为：2019-156)根据道德伦理委员会提供的指南进行动物和细胞实验。

2.无菌操作技术

实验前期准备，处理细胞前一天，高压锅高压蒸汽灭菌进行细胞实验用到的空瓶、培养皿、枪头、PBS等。细胞间应该每日紫外线进行消毒。实验前一小时，细胞室内进行紫外线消毒，超净工作台内放入培养皿、孔板、枪头、移液枪等进行紫外灯照射消毒，并且检查血清、培养基、胰酶消化液及各种抗体有无浑浊、液体絮状沉淀现象、检查各试剂生产日期并进行认真核对，然后放入超净工作台紫外线照射30min中方可使用，紫外线照射消毒细胞超净台及培养皿30min，抽风系统开启10min后，操作者方可进入细胞间，必须佩戴口罩、帽子、手套、穿无菌衣，操作者必须严格遵守无菌原则。

3.实验操作方法如下：

步骤S1：秦巴硒菇提取物对体外白血病细胞的实验研究

S101：测定秦巴硒菇提取物对白血病细胞的敏感性

(1)骨髓单个细胞核提取

收集骨髓液按照1:1加入等体积的无菌PBS溶液进行稀释，充分混匀，在新的无菌15mL离心管中加入4mL Ficoll淋巴细胞分离液，用吸管将上述稀释后的骨髓液沿离心管管壁缓慢加入到Ficoll淋巴细胞分离液上层，使骨髓稀释液与Focll淋巴细胞分离液形成分界面；然后2000rpm离心15min，离心结束后取出离心管，可见液体分离4层，骨髓上清层-单个核细胞层-Ficoll分离液层-红细胞层；吸管小心吸取中间呈白色雾状的单个核细胞层，转移至15mL离心管中，在细胞悬液中加入无菌PBS洗涤后的细胞，1500rpm离心5min，弃掉上清，重悬细胞进行二次洗涤离心收集细胞沉淀，加入细胞冻存液放入细胞冻存管中，-80℃冰箱保存；

(2)细胞复苏、冻存

将水浴温度设置为37℃，-80℃冰箱取出K562细胞、原代细胞，迅速移至水浴箱中，左右摇晃冻存管，使其迅速全部溶解，转移至超净工作台中加入9mLRPMI-1640培养基细胞培养皿中培养，次日更换培养液；选择生长对数期的细胞，将细胞悬液转移至离心管内，进行离心，加入细胞冻存液，重悬细胞，充分混匀，移液枪转移至细胞冻存管，做好标记，-80℃冰箱冻存；

(3)CCK8法检测细胞增殖抑制率实验

CCK8法评估K562细胞、原代细胞活力，收集生长对数期K562细胞、原代细胞重悬于RPMI-1640培养基中，分别将这两种细胞以密度为1×10

S102：检测细胞凋亡率

取对数生长期的K562细胞、原代细胞，将10×10

S103：检测细胞周期

取对数生长期的K562细胞、原代细胞，将10×10

步骤S2：秦巴硒菇提取物对慢性髓系白血病动物的实验研究

S201：慢性髓系白血病动物模型的建立

选择4-5周龄，体重为18-20g的雄性NOD/SCID小鼠，于SPF环境中，温度为22±1℃，自由进食水喂养一周后，小鼠状态良好；取对数生长期的原代细胞，用0.9％的生理盐水将细胞密度调整至1×10

S202：模型小鼠外周血细胞数、体重检测；

小鼠治疗前后经内眦取血行外周血细胞数检测，助手一手固定模型小鼠头部，一手下压颈部阻碍静脉回流，使眼球外凸；操作者持含EDTA的抗凝毛细玻璃管沿内眦滑向眼球正下方进行穿刺，深度约为2-3mm，全部血液负压收集EP管中，4℃保温箱送检。每天测量模型小鼠体重并记录，实验期间意外死去的小鼠进行称重，分离脾脏、肝脏、肾脏组织，-20℃保存，直至实验结束。

步骤S3:RT-qPCR法检测K562、原代细胞，模型小鼠脾脏组织相关凋亡基因表达

S301：提取总RNA

(1)取对数生长期细胞、组织，将10×10

(2)向上述细胞悬液、组织悬液加有Trizol reagent的EP管中加入300μL氯仿，剧烈震荡，室温静置10min；

(3)4℃离心5min，转速为1000转/min，将无色水相RNA转移至EP管中，加入等体积70％的乙醇，轻轻吹打混匀，静置2min；

(4)4℃离心1min，转速为12000转/min，弃上清，加入500μLclean buffer，继续离心1min；

(5)4℃离心2min，转速为15000转/min，弃上清，加入500μL clean buffer，继续离心2min，彻底去除残留的乙醇；

(6)将离心柱放入RNase-free Tube中，加入100μLRNase-free Water在离心柱中，室温静置2min，离心1min，洗脱RNA。

S302：逆转录

(1)除去基因组DNA

(2)使用PrimeScript RT Master Mix逆转录酶cDNA合成试剂盒进行逆转录；

S303：反转录反应

(1)配置10uL反应体系

(2)RT-qPCR引物序列

①细胞引物序列

②动物组织引物序列

(3)反应条件

将步骤(1)中配置好的反应体系加入96孔板中，每个样品按照浓度梯度FA-2-b-β(1.2mg/mL，1.8mg/mL，2.4mg/mL)设3个重复目的基因和内参基因Actin组，整个体系在MxProM3005P荧光定量PCR仪上进行基因扩增，定量；

(4)通过Applied Biosystems

步骤S4:Western-blot法检测K562、原代细胞，模型小鼠脾脏组织相关凋亡蛋白表达

S401：蛋白提取

取对数生长期细胞，将10×10

S402蛋白定量

(1)稀释蛋白标准品，按标准体积将稀释好的标准品溶液按0、1、2、4、8、12、16、20加入96孔板中，然后用PBS将每孔补齐至20μL；

(2)每孔加入BCA工作液至200μL；其中，BCA工作液由试剂A：试剂B＝50:1充分混匀形成；其中，试剂A：1％BCA二钠盐。2％无水碳酸钠，0.16％酒石酸钠，0.4％氢氧化钠、0.95碳酸氢钠，将上述溶液混合后调ph至11.25；试剂B：4％硫酸铜

(3)然后37℃水浴30min；

(4)利用酶标仪测定560nm处吸光度，计算样品蛋白定量标准曲线。

S402：SDS-PAGE蛋白电泳

(1)无水乙醇清洗玻璃板，晾干，固定装置；

(2)配胶，灌胶，避免配胶过程中产生气泡；

(3)蛋白上样，电泳槽加入配备好的电泳缓冲液，根据所测蛋白浓度，加入蛋白样品和蛋白Maker；

(4)蛋白电泳60v恒压跑至分离胶与浓缩胶之间，120v恒压跑出胶面停止。

S403：转膜、免疫反应

(1)电泳结束前，根据蛋白分子量大小准备PVDF膜，与滤纸一同浸入甲醇2min；

(2)电泳结束后，从玻璃板中小心取出凝胶，根据Marker边界代表的分子量，切去所需蛋白，将分离胶置于转膜液中，制作“夹心饼”依据“黑胶白膜”标准，黑板质底，依次海绵垫-滤纸-PVDF，膜-滤纸-海绵的顺序安装，最上层为白板，“夹心饼”内各层物品标准对齐，保证未出现气泡，将“夹心饼”置于转膜槽中，0℃恒温，横流180mA进行转膜；

(3)关闭电源，取出PVDF膜，丽春红染色10min，之后ddH2O清洗，TBST清晰3次，置于脱脂牛奶封闭1h，封闭结束后，TBST洗膜10min，重复3次；

(4)将蛋白条带膜放入3％BSA稀释至一定浓度二抗，4℃孵育过夜；

(5)室温下脱色摇床上振荡蛋白条带，TBST清洗3次，每10min；

(6)将蛋白条带膜放入HRP标记的二抗稀释液中，室温下孵育2h，TBST清洗，每次10min。

S404：DAB显色、凝胶电泳图像分析

显色剂ECL充分混匀滴至蛋白条带上，采用Image J软件分析条带所曝光的数值，计算蛋白相对含量＝目的蛋白吸光度/Actin蛋白吸光度；

步骤S5：模型小鼠HE、免疫荧光、免疫组化检测；

S401：模型小鼠HE

先把固定好的脾脏标本块进行处理，自来水流水不断地进行冲洗，逐步加入70％乙醇2h，80％乙醇过夜，90％乙醇2h，100％乙醇1h，然后将脾脏标本放入二甲苯中，直至脾脏标本变透明为止，将脾脏标本转移至二甲苯+白蜡中，60℃温箱孵育2h，白蜡全部浸过脾脏标本，将脾脏标本放入溶解白蜡的金属框中央，冷却后，切成5μm薄片，然后将其放于温水中待展开后转到载玻片上烘干，60℃，4h；

(1)取出切片，65℃烤箱烤片恒温60min，依次放入二甲苯I，II，各静置10min后，一次加入乙醇I，II，静置5min；

(2)二甲苯浸洗，每次10min；

(3)100％乙醇、95％乙醇、80％乙醇各浸洗一次，每次5min，自来水清洗一次；

(4)苏木素染色10min，1％盐酸乙醇水化，1％氨水返蓝，蒸馏水清洗；

(5)0.5％伊红染色3min，清洗，80％乙醇分化，镜下观察；

(6)二甲苯浸洗，中性树胶封片；

S402：模型小鼠免疫组化

先把固定好的脾脏标本块进行处理，自来水流水不断地进行冲洗，逐步加入70％乙醇2h，80％乙醇过夜，90％乙醇2h，100％乙醇1h，然后将脾脏标本放入二甲苯中，直至脾脏标本变透明为止，将脾脏标本转移至二甲苯+白蜡中，60℃温箱孵育2h，白蜡全部浸过脾脏标本，将脾脏标本放入溶解白蜡的金属框中央，冷却后，切成5μm薄片，然后将其放于温水中待展开后转到载玻片上烘干，60℃，4h；

(1)抗原修复；

(2)灭活内源酶活性；

(3)封闭非特异性抗体，向切片滴加山羊血清封闭液，37℃孵育30min；

(4)除去血清，滴加一抗，4℃孵育过夜；

(5)向切片滴加二抗，37℃，恒温30min，PBS清洗2-3次；

(6)DAB进行显色，苏木素复染，中性树胶封片；

(7)结果分析，DAB染色阳性结果为棕黄色；

S403：模型小鼠免疫荧光

(1)先把固定好的脾脏标本块进行处理，自来水流水不断地进行冲洗，逐步加入70％乙醇2h，80％乙醇过夜，90％乙醇2h，100％乙醇1h，然后将脾脏标本放入二甲苯中，直至脾脏标本变透明为止，将脾脏标本转移至二甲苯+白蜡中，60℃温箱孵育2h，白蜡全部浸过脾脏标本，将脾脏标本放入溶解白蜡的金属框中央，冷却后，切成5μm薄片，然后将其放于温水中待展开后转到载玻片上烘干，60℃，4h；

(2)抗原修复；

(3)灭活内源酶活性；

(4)封闭非特异性抗体，向切片滴加山羊血清封闭液，37℃孵育30min；

(5)除去血清，滴加一抗，4℃孵育过夜；

(6)向切片滴加二抗，37℃，恒温30min，PBS清洗2-3次；

(7)孵育二抗，取出爬片，1×PBST清洗三遍，二抗(罗丹明标记)室温避光孵育1h，PBST清洗三遍，DAPI工作液染色5min；

(8)1×PBST漂洗DAPI工作液后，用滤纸轻轻吸去多余水分，滴甘油一滴用以封片，盖好盖玻片后荧光显微镜观察拍照；

(4)结果分析，DAPI染出来细胞核为蓝色，阳性标记为红色或绿色。

步骤S6：统计软件使用PRISM7，数据表示为X±SD，各组数据采用单因素方差分析，2组数据比较，采用独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

4.实验结果

4.1体外实验

4.1.1FA-2-b-β对K562、原代细胞增殖抑制率的影响

首先，为了更深入研究秦巴硒菇提取物酸性RNA蛋白复合物FA-2-b-β在CML中的作用机制，探讨了FA-2-b-β对K562细胞、原代细胞增殖、活力的影响，如图1所示，不同浓度的FA-2-b-β作用于K562细胞、原代细胞24、48、72h后，CCK8细胞增殖/毒性检测试剂盒分析K562细胞、原代细胞存活率，实验结果显示：三个时间段对K562细胞、原代细胞均具有较好的增殖抑制作用。与对照组相比(未加任何药物处理的肿瘤细胞)，随着药物浓度的增加，细胞活性减弱，细胞增殖受到抑制，且呈浓度时间依赖性(rK562-24h＝-0.9111、rK562-48h＝-0.9067、rK562-72h＝-0.9213，r原24h＝-9082、r原-48h＝-9442、r原-72h＝-9546)如图(1,K562细胞(A)；原代细胞(B))，在较高药物浓度(2.4mg/mL)作用下，细胞活性发生变化，细胞基本死亡。细胞增殖抑制率＝(实验组-空白对照组)/(阳性对照组-空白对照组)×100％，数值表示为均值±标准差(n＝5，P<0.05)。

4.1.2FA-2-b-β诱导K562、原代细胞凋亡

细胞凋亡的特征在于染色质凝聚和核碎裂。课题组通过膜联蛋白V/PI双染流式细胞术法检测FA-2-b-β诱导K562细胞、原代细胞凋亡进行实验分析，根据CCK8法敏感实验选取药物浓度为：0、1.2、1.8、2.4mg/mL进行细胞凋亡检测。总细胞凋亡率包括明显的早期凋亡率(右下象限)和晚期凋亡(右上象限)如图2(A,B,C,D),流式细胞术检测结果表明，不同浓度的FA-2-b-β处理细胞24、48h后，K562细胞的调亡率依次为1.18/0.11％，9.91/25.21％，79.49/71.83％，93.4/95.74％，如图(A,B,E,F)，原代细胞凋亡率依次是为：3.94/10.7％，17.8/30.4％，49.21/52.89％，81.13/79.81％，如图(C,D,G,H)，该结果提示：FA-2-b-β处理白血病细胞后，引起细胞凋亡率显著增加，且以早期凋亡为主，差异具有统计学意义。数值显示为平均值±标准差，独立样本t检验。(n＝3，*P<0.05)。

4.1.3FA-2-b-β对K562、原代细胞周期的影响

细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的整个过程，可分为DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2/M期)。细胞分裂期：前期、中期、后期、末期。由上述结果可知，不同浓度的FA-2-b-β可以诱导K562细胞、原代细胞凋亡，其机制是否是通过阻滞细胞周期来实现的？因此，课题组对FA-2-b-β诱导K562细胞、原代细胞进行细胞周期实验分析，如图3所示，将K562细胞、原代细胞与不同浓度的FA-2-b-β置于1640培养基孵育24、48h，与阳性对照组(未加任何药物处理的肿瘤的细胞)相比，伴随着细胞凋亡率的发生，加药组G1百分比增加，K562细胞周期变化为加药组G1百分比随着药物浓度的增加而上升，依次为33.73％/37.18％、34.94％/37.01％、37.36％/43.09％和41.53％/60.64％，原代细胞GI期百分比依次为33.73％/37.65％、37.01％/45.07％、56.95％/53.11％和58.99％/60.66％；S期细胞百分比随着药物浓度的增加而降低K562细胞S期百分比依次为46/46％、54/49％、58/27％和46/46％，原代细胞S期细胞百分比依次为：46/46％、49/40％、27/29％和26/31％。如图3(24h：A,C,E,F；48h：B,D,G,H)所示，该结果进一步阐明FA-2-b-β诱导人慢性髓系白血病细胞发生凋亡，是将细胞周期阻滞在G1期，DNA合成期来实现的。数值表示为平均值±标准差，独立样本t检验(n＝3，P<0.05)。

4.1.4RT-qPCR检测K562、原代细胞Wnt/β-catenin信号通路中相关凋亡基因的表达

由上述实验结果可以得到FA-2-b-β诱导慢性髓系白血病细胞发生凋亡，将细胞周期阻滞在G1期，为了更深入探讨其机制，将从分子生物学基础上进一步进行分析，为此我们提出了FA-2-b-β可能通过Wnt/β-catenin信号通路对慢性髓系白血病细胞发挥调控的假设，不同浓度(0、1.2、1.8、2.4mg/mL)的FA-2-b-β作用于K562细胞、原代细胞48h，行RT-qPCR定量分析β-catenin、BCL-2、BAX基因的表达水平，使用2

4.1.5Western-blot检测K562、原代细胞Wnt/β-catenin信号通路中相关凋亡蛋白的表达

基于上述结果，进一步检测了FA-2-b-β作用于K562细胞、原代细胞对Wnt/β-catenin信号通路中凋亡蛋白表达的影响，不同浓度的(0、1.2、1.8、2.4mg/mL)FA-2-b-β孵育K562细胞、原代细胞48h，以Actin作为内参蛋白进行均一校正，以K562细胞、原代细胞中的表达量为参照，结果发现与空白对照组(未加任何药物干预)相比，细胞周期蛋白CyclinD1以剂量依赖性方式降低，使得FA-2-b-β降低了CyclinD1与Wnt信号通路上游启动子结合，降低了β-catenin与Lef/Tcf-4核定位，从而影响细胞核DNA的表达和转录，引起Wnt蛋白信号通路中相关凋亡蛋白c-myc、CJun、CD44表达降低，从而使K562细胞、原代细胞发生凋亡(图5:A,C K562细胞；B,D原代细胞)，基于此结果，因此课题组通过体内实验进行进一步验证FA-2-b-β体内抗肿瘤效果，为FA-2-b-β临床应用提供实验依据。

4.2体外实验

4.2.1FA-2-b-β对慢性髓系白血病模型小鼠生存期影响

通过体外实验发现FA-2-b-β可以抑制K562细胞、原代细胞增殖，且呈浓度时间依赖性，可使K562细胞、原代细胞发生早期凋亡，将细胞周期阻滞在G1期，DNA合成期，RT-qPCR，Western blot检测结果提示FA-2-b-β诱导细胞凋亡其机制可能是通过Wnt/β-catenin信号通路对慢性髓系白血病细胞发挥调控的假设成立。由于多信号通路构成了庞大复杂的基因信号网络，共同调控着CML的发生、发展及演变，因此，课题组通过Caspase信号通路体内实验进一步探讨FA-2-b-β体内抗肿瘤的效果及作用机制。建立慢性髓系白血病小鼠模型，将生长对数期的原代细胞悬液200μL(1×105/mL)经尾静脉注射7-15d后，模型小鼠逐渐出现精神萎靡，毛色暗淡无光，随之，进行随机抽取模型小鼠进行内眦取血，验证造模是否成功，随后，不同剂量的FA-2-b-β50mg/kg/d(根据动物给药指南计算所得)逐渐递增至100mg/kg/d，观察模型小鼠生长状况，实验期间模型小鼠均未表现出任何的生物毒性反应。设定实验观察终点为120天，期间每天观察模型小鼠精神状态，体毛改变及活动活跃等情况，记录模型小鼠死亡时间并绘制小鼠生存曲线。实验期间意外死亡的小鼠进行称重，取材脾脏组织，-20℃冰箱保存，实验后期模型小鼠出现步态不稳、暗淡无华、脊背弓起，第120天处死小鼠(图6)。

4.2.2模型小鼠血细胞数、体重的检测

慢性髓系白血病模型小鼠建立后，出现疾病征象后加强检测，模型小鼠经内眦取血行血细胞计数检测发现，治疗前白细胞数明显升高，红细胞数、血小板数、血红蛋白量降低；治疗后红细胞数、血红蛋白量、血小板数基本恢复正常，白细胞数仍然较高(如图7，A，B，C，D)。每天测量模型小鼠的体重,记录小鼠体重值，治疗后模型小鼠体重基本恢复正常(图7，E)。

4.2.3HE染色、免疫荧光、免疫组化检测相关凋亡蛋白的表达

苏木精和伊红(haematoxylin and eosin,HE)染色结果显示：空白对照组脾脏组织细胞大小不等、排列紊乱，高倍数显微镜下可观察到肿瘤细胞中主要以圆形和椭圆形为主，细胞核大且深染，核仁大而明显，核分裂相增多，FA-2-b-β实验组及IM阳性对照组模型组和空白对照组小鼠脾脏组织相比，高倍镜下观察到细胞。如图8和9所示。

4.2.4RT-qPCR检测慢性髓系白血病模型小鼠相关凋亡基因的表达

如图10所示，检测未治疗模型小鼠BCR-ABL基因过表达后，实验组，阳性对照组与空白组相比(未给予任何干预的小鼠相比)脾脏组织相关凋亡基因,BCL-2表达降低，促凋亡基因Bax表达上调，进而引起CytochromeC基因表达，活化caspase8，caspase9，作用于胞内多种蛋白质和酶类，产生多种凋亡信号，如促凋亡基因Bax表达增加，凋亡的最终执行者caspase3基因表达也升高，BCR-ABL基因表达下降，如图所示(图10)，促使细胞发生凋亡，白血病细胞减少。

4.2.5Western-blot检测慢性髓系白血病模型小鼠相关凋亡蛋白的表达

通过蛋白印迹法我们发现，空白组(未给予任何干预的模型小鼠)过表达BCR-ABL融合蛋白，实验组，阳性对照组与空白组相比，脾脏组织相关凋亡蛋白BCL-2表达降低，促凋亡蛋白BAX表达上调，引起CytochromeC蛋白表达，活化caspase8，caspase9，作用于胞内多种蛋白质和酶类，产生多种凋亡信号，如促凋亡蛋白BAX表达上调，凋亡的最终执行者caspase3蛋白表达升高，BCR-ABL融合蛋白在药物作用后，表达下降，如图所示(图11)，进而使细胞发生凋亡。通过体内实验验证结果正如我们所料，FA-2-b-β治疗慢性髓系白血病小鼠一段疗程(14-21d)后，具有和IM相似的治疗效果，可以使模型小鼠血细胞计数、体重基本恢复正常，尽管治疗后白细胞数仍高，可使BCR/ABL融合蛋白表达下调，抑制细胞凋亡蛋白表达降低，促进细胞凋亡蛋白表达增加。由此我们可以得出FA-2-b-β参与诱导慢性髓系白血病细胞凋亡的机制可能是降低BCR/ABL表达进而引起Caspase信号通路途径得变化来实现的，数值为3次独立实验，平均值±标准差(*P<0.05，**P<0.001)，差异具有统计学意义。

FA-2-b-β作用于白血病细胞，通过体内外实验验证FA-2-b-β对白血病细胞中Wnt/β-catenin、Caspase信号通路的影响机制进行阐述，Wnt/β-catenin、Caspase信号通路多条信号通路相互交汇参与了CML的演变过程。上述研究为传统中药秦巴硒菇提取物临床治疗CML提供实验依据。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。