一种癌症基因甲基化检测系统和在该系统在中执行的癌症体外检测方法

摘要

本文公开了一种用于检测癌症甲基化的系统，其包括：样品采集模块，其用于采集受试者样品；DNA提取模块，其用于提取纯化所述样品中的DNA；建库模块，其用于针对纯化的DNA样品构建用于测序的DNA文库；转化模块，其用于用重亚硫酸盐转化所述构建的DNA文库；预PCR扩增模块，其用于预PCR扩增所述经重亚硫酸盐转化的DNA文库；杂交捕获模块，其用于利用探针组合物对经预PCR扩增的样品进行杂交捕获；后PCR扩增模块，其用于利用PCR扩增经杂交捕获后的产物；测序模块，其用于对PCR扩增后的经杂交捕获后的产物进行高通量二代测序；数据分析模块，其用于对测序数据进行分析，确定样本的甲基化水平；判读模块，其用于基于所述样本的甲基化水平判读所述患者的患病情况。

说明书

技术领域

本申请涉及一种癌症基因甲基化检测系统，特别涉及一种基于高通量测序(NGS)检测食管癌、胃癌和结直肠癌等3种管腔性器官肿瘤游离DNA甲基化水平变化的系统以及在该系统中执行的癌症体外检测方法。

背景技术

高通量测序(NGS)技术是现代基因组学研究领域革命性的创新，该技术可以同时对几十到几百万条DNA分子进行序列分析，这标志着后基因组时代的到来。通过对测序深度的控制，可实现从头测序和重测序等不同的目标，也可以通过不同的前期处理，分析基因组、转录组和甲基化组的序列。

目前临床基因检测的技术主要是聚合酶链式反应(PCR)、荧光原位杂交(FISH)和基因芯片技术。PCR仪器设备价格低，灵敏性高，操作简单快速，在临床的普及度高，但是受技术限制，只能同时检测少数几个基因。FISH灵敏度高，但操作难度较大。基因芯片通量高于前两者，可以同时检测大量的基因。但局限在于只能检测已知的基因或变异，准确性低，假阳性高。而NGS技术具有通量高(同时检测大量已知和未知的基因及变异)，结果准确(准确率高于基因芯片)，检测速度较快，均摊到每个基因的检测成本低等特点，现在已经逐渐应用到临床疾病检测和监控等领域。随着未来测序费用的进一步降低，NGS必然会逐步取代基因芯片等其他高通量技术。

由于目前常规全基因组测序的总价比较高，如果为了检测稀有变异而增加测序深度，则最终价格让消费者难以承受。因此目标序列捕获测序成为比较主流的选择，该技术是根据检测的需求，针对感兴趣的基因组区域设计捕获探针，通过杂交互补的原理富集目标片段DNA，并在后续进行NGS检测。这种策略可以根据研究或检测的目的进行灵活定制，只选择少量的基因区域，加大测序深度，可以有效的发现目标区域变异的状况，具有很高的灵敏度和准确性。

在癌症的发生和进展过程中，遗传信息会产生一系列的变化，包括DNA的突变、插入/缺失，染色体结构变异，拷贝数变异，以及表观遗传信息的改变。在癌症的演进过程中，DNA序列的变异是随机发生的，仅当变异发生在关键的生长控制基因时，才可以导致恶性肿瘤的产生。而大多数的基因表达异常是源于表观遗传的改变，通常是DNA甲基化水平的改变。研究表明，基因甲基化水平的改变早于基因变异，跟踪检测基因甲基化的变化，可以较早的预测癌症产生。近年来，随着基因组学的发展，现在已经对超过30种癌症的表观基因组进行了研究。结果显示，尽管DNA甲基化并非在每种癌中都占主导地位，但毫无疑问的是，基因甲基化修饰模式的变化会改变细胞的发展倾向以及肿瘤的表型，从而对大多数癌症的发生发展起重要的影响。

2018年初癌症基因组图谱(TCGA)发表了27篇总结性的分析文章，对历时十多年的30多种癌症数据做了迄今为止最全面的泛癌基因组分析。在通过整合染色体变异、DNA甲基化、RNA和蛋白等多种数据进行分析后，发现，解剖学上的33中癌症可以根据分子特征分成28个亚型。在某种分子亚型会包括25种传统意义上的癌症。这个结果说明，来源于不同器官的癌症存在共同的分子特征。与此同时，来源于同一器官的癌症可能有不同的基因组图谱。由此可见，在不远的将来，癌症筛查和诊断标志物的开发必将引入更多泛癌的概念，不仅研究解剖学层次的癌症，更应在分子水平研究癌症，开发出可以覆盖某种分子分型的泛癌标志物。

液体活检是体外诊断的一种方式，采用非侵入性的血液检测，可以监测肿瘤或转移灶释放到血液的循环肿瘤细胞(CTC)或循环肿瘤DNA(ctDNA)，该技术可以有效降低侵入性造成的危害，且能够实现对肿瘤各部分和所有转移灶的采样，克服肿瘤异质性(而目前采用的标准组织活检只能反映肿瘤某一部分的特征)，并实现实时监测，具有更高的灵敏度，甚至有可能通过基因组信息预测发生病变的部位，可以有效延长患者生存期。根据这些优点，液体活检可以用于肿瘤的早诊、辅助分期、预后和复发监测，用药指导等方面。目前最常用于的液体活检的游离DNA。

游离DNA(cfDNA)是存在于循环血中游离与细胞外的部分降解的内源性DNA。研究表明，肿瘤组织在发生发展的过程中，其肿瘤细胞凋亡后，会向血浆中释放DNA，经降解后，形成游离肿瘤DNA(ctDNA)。CtDNA的分子遗传特征(如基因突变，微卫星不稳定性和抑癌基因启动子甲基化等)与肿瘤组织DNA相一致。在多癌的早期筛查和检测中，采集外周血比其它临床检测手段更为简便、易于向基层推广，而且由于其无创的特点，更易于被无症状人群接受。因此通过检测血浆中的ctDNA甲基化水平改变，可以成为多癌早期筛查和诊断的重要手段之一。

利用目标序列捕获技术结合NGS监测cfDNA的变异以及甲基化水平变化，可以实现肿瘤早期筛查、易感基因监测、伴随诊断、个性化用药、预后监测等各方面的应用。目前国内外多个公司都推出了不同规模，针对不同应用场景的癌症检测panel，有部分panel已经获得了FDA或CFDA的批准文号。如Foundation Medicine推出的FoundationOne CDx覆盖324个基因，纪念斯隆·凯特琳癌症研究中心(MSK)推出的IMPACT覆盖468种癌症相关基因，燃石医学推出的“人EGFR/ALK/BRAF/KRAS基因突变联合检测试剂盒”，诺禾致源推出的“人EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1基因突变检测试剂盒”等。鹍远基因也于2018年推出了检测结直肠癌甲基化水平的产品“常乐思”。

发明内容

综上所述，针对目前多癌检测产品的缺乏和技术限制，本申请提供了一种用于检测癌症甲基化的系统和在该系统中执行的癌症体外检测方法，可用于食管癌、胃癌和结直肠癌等3种管腔性器官肿瘤的早期筛查。该系统和在该系统中执行的方法可以：1)以非侵入性的方式用于无症状人群的早期筛查，以及癌症患者的预后检测，降低了侵入性检测造成的危害，2)加大了测序深度，使检测基因的广度优于现有的技术和产品，具有通量高，检测速度较快，均摊到每个基因的检测成本低等特点，3)能够实现对肿瘤各部分和所有转移灶的采样，克服肿瘤异质性，和4)具有更高的灵敏度和准确性，能够实现实时监测，甚至有可能通过基因组信息预测发生病变的部位有效延长患者生存期。

具体地，本申请涉及如下内容：

1.一种系统，该系统用于检测癌症甲基化，其包括：

样品采集模块，其用于采集受试者样品；

DNA提取模块，其用于提取纯化所述样品中的DNA；

建库模块，其用于针对纯化的DNA样品构建用于测序的DNA文库；

转化模块，其用于用重亚硫酸盐转化所述构建的DNA文库；

预PCR扩增模块，其用于预PCR扩增所述经重亚硫酸盐转化的DNA文库；

杂交捕获模块，其用于利用探针组合物对经预PCR扩增的样品进行杂交捕获；

PCR扩增模块，其用于利用PCR扩增经杂交捕获后的产物；

测序模块，其用于对PCR扩增后的经杂交捕获后的产物进行高通量二代测序；

数据分析模块，其用于对测序数据进行分析，确定样本的甲基化水平；

判读模块，其用于基于所述样本的甲基化水平判读所述患者的患病情况。

2.根据第1项所述的系统，所述受试者疑似患有癌症。

3.根据第1或2项所述的系统，采集受试者的样品为血浆样品。

4.根据第1-3项中任一项所述的系统，在所述杂交捕获模块中使用的探针组合物包括：

靶向泛癌特异性区域的2个探针，

靶向癌症特异性区域的n个探针，和

靶向组织特异性区域的m个探针。

5.根据第1-4项中任一项所述的系统，在所述杂交捕获模块中使用的探针组合物包括：

低甲基化探针，其与经重亚硫酸盐转化的不含CG甲基化的所述癌症特异性区域、泛癌特异性区域、以及组织特异性区域杂交，和

高甲基化探针，其与经重亚硫酸盐转化的CG全部甲基化的所述癌症特异性区域、泛癌特异性区域、以及组织特异性区域杂交。

6.根据第1-5项中任一项所述的系统，在所述杂交捕获模块中使用的探针组合物中的每一个探针的长度为40～60bp。

7.根据第1-6项中任一项所述的系统，在所述杂交捕获模块中使用的探针组合物中的每一个探针的长度为45～56bp，优选50～56bp，进一步优选50bp。

8.根据第1-7项中任一项所述的系统，在所述杂交捕获模块中使用的探针组合物中的n个探针靶向癌症特异性区域，

其中，n为选自1-192中的任意的整数；

其中，所述癌症特异性区域选自Seq ID No.：1-62中的任意。

9.根据第1-8项中任一项所述的系统，在所述杂交捕获模块中使用的探针组合物中的m个探针靶向所述组织特异性区域，

其中，m为选自1-44中的任意的整数；

其中，所述组织特异性区域选自Seq ID No.：66-67、79、81-83、87-90、97-102、111、117-118中的任意。

10.根据第5项所述的系统，在所述杂交捕获模块中，所述低甲基化探针包括靶向癌症特异性区域的探针Seq ID No.：119-215中的任意，靶向泛癌特异性区域的探针Seq IDNo.：216-217中的任意，和靶向组织特异性区域的探针Seq ID No.：219-220、233、235-237、241-244、251-257、266-268、275-276中的任意。

11.根据第5项所述的系统，在所述杂交捕获模块中，所述高甲基化探针包括靶向癌症特异性区域的探针Seq ID No.：277-373中的任意，靶向泛癌特异性区域的探针Seq IDNo.：374-375中的任意，和靶向组织特异性区域的探针Seq ID No.：377-378、391、393-395、399-402、409-415、424-426、433-434中的任意。

12.根据第1-11项中任一项所述的系统，所述判读模块包括：

(1)泛癌判读模块，其用于比对泛癌特异性区域数据库，并进行判读以确认受试者是否患有癌症；

(2)癌症判读模块，其用于比对癌症特异性区域数据库，并进行判读以进一步确认受试者患有的癌症为几种疑似癌症中的一种；和

(3)组织特异性判读模块，比对组织特异性区域数据库，并进行判读以确认受试者患癌的部位。

13.根据第12项所述的系统，所述泛癌判读模块包括进行如下判读：判断所述泛癌特异性区域Seq ID No.：63的甲基化水平是否大于等于55％，并且判断所述泛癌特异性区域Seq ID No.：64的甲基化水平是否大于等于60％，如果Seq ID No.：63的甲基化水平大于等于55％且Seq ID No.：64的甲基化水平大于等于60％，则判读所述患者患有癌症。

14.根据第12项所述的系统，所述癌症判读模块包括进行如下判读：如果在靶向所述癌症特异性区域的n个探针中，n1个探针靶向的区域的甲基化水平大于等于各自阈值，且n1/n≥20％，优选n1/n≥30％，则判读患者患有组织特异性癌症中的任意一种。

15.根据第12项所述的系统，所述组织特异性判读模块包括进行如下判读：如果在靶向所述组织特异性区域的m个探针中m1个探针靶向的区域的甲基化水平大于等于各自阈值，则进一步分析大于等于各自阈值的m1个探针所靶向的组织并计数每一个组织大于等于阈值的探针的个数，判读认为患者罹患癌症的组织是甲基化水平大于等于阈值的探针个数最多的组织。

16.一种受试者癌症体外检测方法，包括以下步骤：

采集受试者样品；

提取纯化所述样品中的DNA；

针对纯化的DNA样品构建用于测序的DNA文库；

用重亚硫酸盐转化所述构建的DNA文库；

预PCR扩增所述经重亚硫酸盐转化的DNA文库；

利用探针组合物对经预PCR扩增的样品进行杂交捕获；

利用PCR扩增经杂交捕获后的产物；

对PCR扩增后的经杂交捕获后的产物进行高通量二代测序；

对测序数据进行分析，确定样本的甲基化水平；

基于所述样本的甲基化水平判读所述患者的患病情况。

17.根据第16项所述的方法，所述受试者疑似患有癌症。

18.根据第16或17项所述的方法，采集受试者的样品为血浆样品。

19.根据第16-18项中任一项所述的方法，所述转化为使用重亚硫酸盐处理。

20.根据第16-18项中任一项所所述的方法，所述探针组合物包括：

靶向泛癌特异性区域的2个探针，

靶向癌症特异性区域的n个探针，和

靶向组织特异性区域的m个探针。

21.根据第16-20项中任一项所所述的方法，所述探针组合物包括：

低甲基化探针，其与经重亚硫酸盐转化的不含CG甲基化的所述癌症特异性区域、泛癌特异性区域、以及组织特异性区域杂交，和

高甲基化探针，其与经重亚硫酸盐转化的CG全部甲基化的所述癌症特异性区域、泛癌特异性区域、以及组织特异性区域杂交。

22.根据第16-21项中任一项所所述的方法，所述探针组合物中的每一个探针的长度为40～60bp。

23.根据第16-22项中任一项所所述的方法，所述探针组合物中的每一个探针的长度为45～56bp，优选50～56bp，进一步优选50bp。

24.根据第16-23项中任一项所所述的方法，所述探针组合物中的n个探针靶向癌症特异性区域，

其中，n为选自1-192中的任意的整数；

其中，所述癌症特异性区域选自Seq ID No.：1-62中的任意。

25.根据第16-24项中任一项所所述的方法，所述探针组合物中的m个探针靶向所述组织特异性区域，

其中，m为选自1-44中的任意的整数；

其中，所述组织特异性区域选自Seq ID No.：66-67、79、81-83、87-90、97-102、111、117-118中的任意。

26.根据第21项所述的方法，所述低甲基化探针包括靶向癌症特异性区域的探针Seq ID No.：119-215中的任意，靶向泛癌特异性区域的探针Seq ID No.：216-217中的任意，和靶向组织特异性区域的探针Seq ID No.：219-220、233、235-237、241-244、251-257、266-268、275-276中的任意。

27.根据第21项所述的方法，所述高甲基化探针包括靶向癌症特异性区域的探针Seq ID No.：277-373中的任意，靶向泛癌特异性区域的探针Seq ID No.：374-375中的任意，和靶向组织特异性区域的探针Seq ID No.：377-378、391、393-395、399-402、409-415、424-426、433-434中的任意。

28.根据第16-27项中任一项所所述的方法，所述判读包括以下步骤：

(1)比对泛癌特异性区域数据库，并进行判读以确认受试者是否患有癌症；

(2)比对癌症特异性区域数据库，并进行判读以确认受试者患有的癌症为几种疑似癌症中的一种；

(3)比对组织特异性区域数据库，并进行判读以确认受试者患癌的部位。

29.根据第28项所述的方法，所述步骤(1)包括进行如下判读：判断所述泛癌特异性区域Seq ID No.：63的甲基化水平是否大于等于55％，并且判断所述泛癌特异性区域SeqID No.：64的甲基化水平是否大于等于60％，如果Seq ID No.：63的甲基化水平大于等于55％且Seq ID No.：64的甲基化水平大于等于60％，则判读所述患者患有癌症。

30.根据第28项所述的方法，所述步骤(2)包括进行如下判读：如果在靶向所述癌症特异性区域的n个探针中，n1个探针靶向的区域的甲基化水平大于等于各自阈值，且n1/n≥20％，优选n1/n≥30％，则判读患者患有组织特异性癌症中的任意一种，再根据模式识别判读各癌种的可能性。

31.根据第28项所述的方法，所述步骤(3)包括进行如下判读：如果在靶向所述组织特异性区域的m个探针中m1个探针靶向的区域的甲基化水平大于等于各自阈值，则进一步分析大于等于各自阈值的m1个探针所靶向的组织并计数每一个组织大于等于阈值的探针的个数，判读认为患者罹患癌症的组织是甲基化水平大于等于阈值的探针个数最多的组织。

由于现有癌症检测技术的局限性，因此，需要开发一种具有以下优势的用于检测癌症甲基化的系统和在该系统中执行的癌症体外检测方法：

1液体活检属于无创肿瘤检测，对于无法获取组织样品的无症状人群和病人群体均能适用。

2可以同时检测3种中国常见管腔性器官肿瘤的甲基化水平改变，覆盖超过80％的癌症发病人群。

3为增加检测的准确性，对于每一种癌症，平均测序深度超过5000X。

4对于受检人，一次性可以完成所有高发癌症的筛查，提高了检测效率，每个标志物的平均价格低于市场现有单标志物的检测。

5对于企业，用一个Panel可以完成对主要癌症的筛选，节约了探针合成成本，可以简化实验流程，便于实验员操作。

6原则上也可以用于癌症患者预后的癌症监测。

附图说明

图1为本申请的实施操作流程。

具体实施方式

本申请提供了一种癌症基因甲基化检测的系统和在该系统中执行的癌症体外检测方法。基于高通量测序(NGS)方法检测食管癌、胃癌和结直肠癌等3种管腔性器官肿瘤游离DNA甲基化水平变化。其可以以非侵入的方式同时检测3种常见癌症的甲基化水平改变，灵敏性和准确定高，测序深度深且成本低，适用于无法获取组织样品的无症状人群和病人群体，以及癌症患者预后的癌症监测。

除非在本文的其他地方具体限定，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本申请所属领域的普通技术人员通常理解的含义。

探针为长度在几十到几百甚至上千碱基对的单链或双链DNA，其可利用分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，能与待测样本中互补的非标记单链DNA或RNA以氢键结合(杂交)，形成双链复合物(杂交体)。将未配对结合的探针洗去后，可用放射自显影或酶联反应等检测系统检测杂交反应结果。在本申请中，与探针互补结合或杂交的区域为特异性靶区域。多个探针组合成探针组合物。

癌症特异性区域是指在少部分癌症种类中，与正常的对照组织相比，该区域的甲基化水平存在显著差异。

泛癌特异性区域是指在大部分癌症种类中，与正常的对照组织相比，该区域的甲基化水平存在显著差异。

组织特异性区域是指该区域在特定组织中的甲基化水平与其他组织相比存在显著差异。

DNA甲基化是指发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，作为一种对稳定的修饰状态，在DNA甲基转移酶的作用下，可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA，是一种重要的表观遗传机制，DNA甲基化时，基因启动子区的甲基化可导致抑癌基因转录沉寂，因此它与肿瘤的发生关系密切。异常甲基化包括抑癌基因和DNA修复基因的高甲基化、重复序列DNA的低甲基化、某些基因的印记丢失，其与多种肿瘤的发生有关。

在本文中，Panel是指本文中使用的探针组合物。

以下详细描述本申请的技术方案。

本文涉及一种系统，该系统用于检测癌症甲基化，其包括：样品采集模块，其用于采集受试者样品的；DNA提取模块，其用于提取纯化所述样品中的DNA；建库模块，其用于针对纯化的DNA样品构建用于测序的DNA文库；转化模块，其用于用重亚硫酸盐转化所述构建的DNA文库；预PCR扩增模块，其用于预PCR扩增所述经重亚硫酸盐转化的DNA文库；杂交捕获模块，其用于利用探针组合物对经预PCR扩增的样品进行杂交捕获；后PCR扩增模块，其用于利用PCR扩增经杂交捕获后的产物；测序模块，其用于对PCR扩增后的经杂交捕获后的产物进行高通量二代测序；数据分析模块，其用于对测序数据进行分析，确定样本的甲基化水平；判读模块，其用于基于所述样本的甲基化水平判读所述患者的患病情况。

在上述本文涉及的系统中，样品采集模块是指集成在该系统中用于自动采集待测样品，即受试者的血液或血浆，并装有待测样品的模块；

DNA提取模块是指待测样品进入其中，并在其中用已知的常规方法来提取DNA，例如经过加热裂解释放DNA，再通过过滤除杂进入下一模块进行反应和检测的模块；

建库模块是指将DNA提取模块中提取的目的片段进行末端修复和添加碱基A，并将其与接头相连成为连接产物，再将连接产物进行扩增以及分离纯化后构成DNA测序文库的模块；

转化模块是指将建库模块中所构建的DNA文库用重亚硫酸盐使用已知的转化方法进行转化的模块；

预PCR扩增模块是指用已知的方法将在转化模块中经重亚硫酸盐转化的DNA文库扩增至可以与本文所述的探针组合物进行杂交捕获的量的模块；

杂交捕获模块是指利用传统液相杂交捕获体系，利用本文所述的探针组合物对经预PCR扩增的样品进行杂交捕获的模块；

PCR扩增模块是指使用已知的扩增方法扩增经杂交捕获后的产物的模块；

测序模块是指利用常规的高通量二代测序平台，例如Illumina平台，对PCR扩增后的经杂交捕获后的产物进行测序的模块；

数据分析模块是指根据通过整合公共数据以及已有的测序数据得到的一种多癌甲基化分析数据库对测序数据进行分析，确定样本的甲基化水平的模块；

判读模块是指基于从所述数据分析模块获得的所述样本的甲基化水平数据，利用计算机根据数据库进行模式识别，构建判读整体癌症风险模型，分析检测对象的癌症风险及组织来源，由此判读所述患者的患病情况的模块。

本文还涉及一种系统，该系统用于检测癌症甲基化，其包括：样品采集模块，其用于采集受试者样品的；DNA提取模块，其用于提取纯化所述样品中的DNA；建库模块，其用于针对纯化的DNA样品构建用于测序的DNA文库；转化模块，其用于用重亚硫酸盐转化所述构建的DNA文库；预PCR扩增模块，其用于预PCR扩增所述经重亚硫酸盐转化的DNA文库；杂交捕获模块，其用于利用探针组合物对经预PCR扩增的样品进行杂交捕获；后PCR扩增模块，其用于利用PCR扩增经杂交捕获后的产物；测序模块，其用于对PCR扩增后的经杂交捕获后的产物进行高通量二代测序；数据分析模块，其用于对测序数据进行分析，确定样本的甲基化水平；泛癌判读模块，其用于比对泛癌特异性区域数据库，并判读；癌症判读模块，其用于比对癌症特异性区域数据库，并判读；和组织特异性判读模块，比对组织特异性区域数据库，并判读。

本文还涉及一种系统，该系统用于检测癌症甲基化，其包括：样品采集模块，其用于采集受试者样品的；DNA提取模块，其用于提取纯化所述样品中的DNA；建库模块，其用于针对纯化的DNA样品构建用于测序的DNA文库；转化模块，其用于用重亚硫酸盐转化所述构建的DNA文库；预PCR扩增模块，其用于预PCR扩增所述经重亚硫酸盐转化的DNA文库；杂交捕获模块，其用于利用探针组合物对经预PCR扩增的样品进行杂交捕获；后PCR扩增模块，其用于利用PCR扩增经杂交捕获后的产物；测序模块，其用于对PCR扩增后的经杂交捕获后的产物进行高通量二代测序；数据分析模块，其用于对测序数据进行分析，确定样本的甲基化水平；泛癌判读模块，其通过比对泛癌特异性区域数据库，判断所述泛癌特异性区域Seq IDNo.：63的甲基化水平是否大于等于55％，并且所述泛癌特异性区域Seq ID No.：64的甲基化水平是否大于等于60％，如果Seq ID No.：63的甲基化水平大于等于55％且Seq ID No.：64的甲基化水平大于等于60％，则判读所述患者患有癌症；癌症判读模块，其进行如下判读：如果在靶向所述癌症特异性区域的n个探针中，n1个探针靶向的区域的甲基化水平大于等于各自阈值，且n1/n≥20％，优选n1/n≥30％，则判读患者患有组织特异性癌症中的任意一种；组织特异性判读模块，其进行如下判读：如果在靶向所述组织特异性区域的m个探针中，m1个探针靶向的区域的甲基化水平大于等于各自阈值，则进一步分析大于等于各自阈值的m1个探针所靶向的组织并计数每一个组织大于等于阈值的探针的个数，判读认为患者罹患癌症的组织是甲基化水平大于等于阈值的探针个数最多的组织。

具体来说，例如当m1为6时，进一步判断，其中5个探针是靶向胃部的探针，1个探针是靶向胰腺的探针，则判断患者罹患癌症是胃部。如果当m1为6时，进一步判断，其中3个探针是靶向胃部的探针，3个探针是靶向胰腺的探针，则判断患者罹患癌症是胃部和胰腺。例如当m1为6时，进一步判断，其中2个探针是靶向食管癌的探针、2个探针是靶向胃癌的探针、2个探针是靶向结直肠癌的探针，则判断患者罹患癌症是食管、胃、结直肠。

参见下表1，表1中列出了全部靶区域各自的甲基化阈值。

如表1所示，其中Seq ID No.119、Seq ID No.120和Seq ID No.121均是靶向SeqID No.1所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.277、Seq ID No.278和Seq ID No.279均是靶向Seq ID No.1所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.122和Seq ID No.123均是靶向Seq ID No.2所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.280和Seq ID No.281均是靶向SeqID No.2所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.124和Seq ID No.125均是靶向Seq IDNo.3所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.282和Seq ID No.283均是靶向Seq ID No.3所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.126是靶向Seq ID No.4所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.284是靶向Seq ID No.4所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.127和SeqID No.128均是靶向Seq ID No.5所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.285和Seq IDNo.286均是靶向Seq ID No.3所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.129是靶向Seq IDNo.6所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.287是靶向Seq ID No.6所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.130是靶向Seq ID No.7所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.288是靶向Seq ID No.7所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.131和Seq ID No.132均是靶向Seq ID No.8所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.289和Seq ID No.290均是靶向SeqID No.8所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.133、Seq ID No.134和Seq ID No.135均是靶向Seq ID No.9所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.291、Seq ID No.292和Seq IDNo.293均是靶向Seq ID No.9所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.136是靶向Seq IDNo.10所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.294是靶向Seq ID No.10所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.137是靶向Seq ID No.11所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.295是靶向Seq ID No.11所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.138是靶向Seq IDNo.12所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.296是靶向Seq ID No.12所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.139是靶向Seq ID No.13所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.297是靶向Seq ID No.13所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.140和Seq ID No.141均是靶向Seq ID No.14所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.298和Seq ID No.299均是靶向Seq ID No.14所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.142和Seq ID No.143均是靶向Seq ID No.15所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.300和Seq ID No.301均是靶向SeqID No.15所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.144和Seq ID No.145均是靶向Seq IDNo.16所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.302和Seq ID No.303均是靶向Seq IDNo.16所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.146和Seq ID No.147均是靶向Seq IDNo.17所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.304和Seq ID No.305均是靶向Seq IDNo.17所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.148是靶向Seq ID No.18所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.306是靶向Seq ID No.18所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.149和Seq ID No.150均是靶向Seq ID No.19所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.307和Seq ID No.308均是靶向Seq ID No.19所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.151是靶向Seq ID No.20所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.309是靶向Seq IDNo.20所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.152是靶向Seq ID No.21所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.310是靶向Seq ID No.21所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.153是靶向Seq ID No.22所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.311是靶向Seq IDNo.22所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.154、Seq ID No.155和Seq ID No.156均是靶向Seq ID No.23所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.312、Seq ID No.313和Seq IDNo.314均是靶向Seq ID No.23所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.157和Seq IDNo.158均是靶向Seq ID No.24所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.315和Seq IDNo.316均是靶向Seq ID No.24所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.159和Seq IDNo.160均是靶向Seq ID No.25所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.317和Seq IDNo.318均是靶向Seq ID No.25所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.161和Seq IDNo.162均是靶向Seq ID No.26所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.319和Seq IDNo.320均是靶向Seq ID No.26所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.163是靶向Seq IDNo.27所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.321是靶向Seq ID No.27所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.164和Seq ID No.165均是靶向Seq ID No.28所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.322和Seq ID No.323均是靶向Seq ID No.28所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.166和Seq ID No.167均是靶向Seq ID No.29所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.324和Seq ID No.325均是靶向Seq ID No.29所示靶区域的高甲基化探针。SeqID No.168是靶向Seq ID No.30所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.326是靶向Seq IDNo.30所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.169和Seq ID No.170均是靶向Seq IDNo.31所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.327和Seq ID No.328均是靶向Seq IDNo.31所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.171是靶向Seq ID No.32所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.329是靶向Seq ID No.32所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.172和Seq ID No.173均是靶向Seq ID No.33所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.330和Seq ID No.331均是靶向Seq ID No.33所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.174是靶向Seq ID No.34所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.332是靶向Seq IDNo.34所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.175和Seq ID No.176均是靶向Seq IDNo.35所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.333和Seq ID No.334均是靶向Seq IDNo.35所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.177是靶向Seq ID No.36所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.335是靶向Seq ID No.36所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.178和Seq ID No.179均是靶向Seq ID No.37所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.336和Seq ID No.337均是靶向Seq ID No.37所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.180和Seq ID No.181均是靶向Seq ID No.38所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.338和Seq ID No.339均是靶向Seq ID No.38所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.182是靶向Seq ID No.39所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.340是靶向Seq IDNo.39所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.183和Seq ID No.184均是靶向Seq IDNo.40所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.341和Seq ID No.342均是靶向Seq IDNo.40所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.185是靶向Seq ID No.41所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.343是靶向Seq ID No.41所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.186是靶向Seq ID No.42所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.344是靶向Seq IDNo.42所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.187是靶向Seq ID No.43所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.345是靶向Seq ID No.43所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.188是靶向Seq ID No.44所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.346是靶向Seq IDNo.44所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.189和Seq ID No.190均是靶向Seq IDNo.45所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.347和Seq ID No.348均是靶向Seq IDNo.45所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.191是靶向Seq ID No.46所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.349是靶向Seq ID No.46所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.192是靶向Seq ID No.47所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.350是靶向Seq IDNo.47所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.193是靶向Seq ID No.48所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.351是靶向Seq ID No.48所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.194是靶向Seq ID No.49所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.352是靶向Seq IDNo.49所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.195是靶向Seq ID No.50所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.353是靶向Seq ID No.50所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.196和Seq ID No.197均是靶向Seq ID No.51所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.354和Seq ID No.355均是靶向Seq ID No.51所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.198是靶向Seq ID No.52所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.356是靶向Seq IDNo.52所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.199和Seq ID No.200均是靶向Seq IDNo.53所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.357和Seq ID No.358均是靶向Seq IDNo.53所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.201是靶向Seq ID No.54所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.359是靶向Seq ID No.54所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.202和Seq ID No.203均是靶向Seq ID No.55所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.360和Seq ID No.361均是靶向Seq ID No.55所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.204和Seq ID No.205均是靶向Seq ID No.56所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.362和Seq ID No.363均是靶向Seq ID No.56所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.206和Seq ID No.207均是靶向Seq ID No.57所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.364和Seq ID No.365均是靶向Seq ID No.57所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.208和Seq ID No.209均是靶向Seq ID No.58所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.366和Seq ID No.367均是靶向Seq ID No.58所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.210和Seq ID No.211均是靶向Seq ID No.59所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.368和Seq ID No.369均是靶向Seq ID No.59所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.212是靶向Seq ID No.60所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.370是靶向Seq IDNo.60所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.213和Seq ID No.214均是靶向Seq IDNo.61所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.371和Seq ID No.372均是靶向Seq IDNo.61所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.215是靶向Seq ID No.62所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.373是靶向Seq ID No.62所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.216是靶向Seq ID No.63所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.374是靶向Seq IDNo.63所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.217是靶向Seq ID No.64所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.375是靶向Seq ID No.64所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.219是靶向Seq ID No.66所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.377是靶向Seq IDNo.66所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.220是靶向Seq ID No.67所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.378是靶向Seq ID No.67所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.222是靶向Seq ID No.79所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.391是靶向Seq IDNo.79所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.235是靶向Seq ID No.81所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.393是靶向Seq ID No.81所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.236是靶向Seq ID No.82所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.394是靶向Seq IDNo.82所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.237是靶向Seq ID No.83所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.395是靶向Seq ID No.83所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.241是靶向Seq ID No.87所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.399是靶向Seq IDNo.87所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.242是靶向Seq ID No.88所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.400是靶向Seq ID No.88所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.243是靶向Seq ID No.89所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.401是靶向Seq IDNo.89所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.244是靶向Seq ID No.90所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.402是靶向Seq ID No.90所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.251是靶向Seq ID No.97所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.409是靶向Seq IDNo.97所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.252是靶向Seq ID No.98所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.410是靶向Seq ID No.98所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.253是靶向Seq ID No.99所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.411是靶向Seq IDNo.99所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.254是靶向Seq ID No.100所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.412是靶向Seq ID No.100所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.255是靶向Seq ID No.101所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.413是靶向Seq IDNo.101所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.256和Seq ID No.257均是靶向Seq IDNo.102所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.414和Seq ID No.415均是靶向Seq IDNo.102所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.266和Seq ID No.267均是靶向Seq IDNo.111所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.425和Seq ID No.426均是靶向Seq IDNo.111所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.275是靶向Seq ID No.117所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.433是靶向Seq ID No.117所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.276是靶向Seq ID No.118所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.434是靶向Seq IDNo.118所示靶区域的高甲基化探针。表1中给出了探针所靶向的靶序列。

两个泛癌标志物甲基化水平阈值的确定是指在超过50％的癌症样本中分别均达到或超过这一指标，而在对应的正常对照中则低于此指标。

通过统计癌症特异性区域(标志物)的甲基化水平，并分析大于等于阈值的标志物，当大于等于阈值的标志物数量(n1)≥总体标志物数量(n)的20％，则判定为癌症。实际上任何一个癌特异性标志物甲基化水平的变化，都意味着样本存在或多或少的异常。在多数癌症样本中，甲基化水平差异的标志物占所有标志物比例均超过30％。考虑到多数癌症样本均为病理分级II期或以后的患者，为增加本panel检测的灵敏性，将该比例调整到20％，以提高早期癌症的检出。

通过统计所有组织标志物的甲基化水平，并分析大于等于阈值的组织标志物指向的组织，最后给出可能的组织来源。

在上述本文涉及的系统中，所述泛癌特异性区域Seq ID No.：63的甲基化水平的阈值是55％，因此当检测结果大于等于55％时则认为该泛癌特异性区域的甲基化水平大于等于阈值；所述泛癌特异性区域Seq ID No.：64的甲基化水平的阈值是60％，因此当检测结果大于等于60％时则认为该泛癌特异性区域的甲基化水平大于等于阈值。

在本文中，靶向所述癌症特异性区域的n个探针中，n1个探针靶向的区域的甲基化水平大于等于各自阈值，n1/n≥20％，优选≥30％，则判读患者患有组织特异性癌症中的任意一种。如表1示出了癌症特异性区域各自的阈值，例如如Seq ID No.：48所示的区域，其阈值为0.35，因此，利用靶向该区域的探针进行检测时，如果检测结果大于等于0.35，则该探针检测的该区域的甲基化水平大于等于阈值。其余癌症特异性区域的甲基化阈值均可以参见表1。

在本文中，如果在靶向所述组织特异性区域的m个探针中m1个探针靶向的区域的甲基化水平大于等于各自阈值，则进一步分析大于等于各自阈值的m1个探针所靶向的组织并计数每一个组织大于等于阈值的探针的个数，判读认为患者罹患癌症的组织是甲基化水平大于等于阈值的探针个数最多的组织。如表1示出了组织特异性区域各自的阈值，例如如Seq ID No.：79所示的区域，其阈值为0.29，因此，利用靶向该区域的探针进行检测时，如果检测结果大于等于0.29，则该探针检测的该区域的甲基化水平大于等于阈值。其余组织特异性区域的甲基化阈值均可以参见表1。

在上述本文涉及的系统中，从受试者中采集样品。所述受试者可为，疑似患有癌症的受试者，或已经患有癌症的受试者。所述癌症可为，食管癌、胃癌，或结直肠癌。所述样品可为血液、血浆。在上述本文涉及的系统中，从样品中提取纯化DNA，所述DNA可为gDNA，或cfDNA。

在上述本文涉及的系统中，在预PCR扩增模块中，利用PCR扩增所述经重亚硫酸盐转化的DNA文库，使用PCR扩增可以使经重亚硫酸盐转化的DNA的量增加，达到可进行与探针组合物杂交的量。

在上述本文涉及的系统中，在所述杂交捕获模块中，利用探针组合物对样品进行杂交捕获，所述探针组合物包括，靶向泛癌特异性区域的2个探针，靶向癌症特异性区域的n个探针，和靶向组织特异性区域的m个探针。n可为选自1-192中的任意的整数。n可以是，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，110，……，192。所述癌症特异性区域可以选自Seq ID No.：1-62中的任意。m可为选自1-44中的任意的整数。m可以是，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44。所述组织特异性区域可选自Seq ID No.：66-67、79、81-83、87-90、97-102、111、117-118中的任意。

在上述本文涉及的系统中，在所述杂交捕获模块中，所述探针组合物包括：低甲基化探针，其与经重亚硫酸盐转化的不含CG甲基化的所述癌症特异性区域、泛癌特异性区域、以及组织特异性区域杂交，和高甲基化探针，其与经重亚硫酸盐转化的CG全部甲基化的所述癌症特异性区域、泛癌特异性区域、以及组织特异性区域杂交。所述低甲基化探针包括靶向癌症特异性区域的探针Seq ID No.：119-215中的任意，靶向泛癌特异性区域的探针SeqID No.：216-217中的任意，和靶向组织特异性区域的探针Seq ID No.：219-220、233、235-237、241-244、251-257、266-268、275-276中的任意。所述高甲基化探针包括靶向癌症特异性区域的探针Seq ID No.：277-373中的任意，靶向泛癌特异性区域的探针Seq ID No.：374-375中的任意，和靶向组织特异性区域的探针Seq ID No.：377-378、391、393-395、399-402、409-415、424-426、433-434中的任意。

在上述本文涉及的系统中，在所述杂交捕获模块中，所述探针组合物中的每一个探针的长度为40～60bp。例如，可以为，41～60bp，42～60bp，43～60bp，44～60bp，45～60bp，45～59bp，45～58bp，45～57bp，45～56bp，46～56bp，47～56bp，48～56bp，49～56bp，50～56bp。所述探针组合物中的每一个探针的长度优选为50～56bp，进一步优选50bp。

在上述本文涉及的系统中，在后PCR扩增模块中，利用PCR扩增经杂交捕获后的产物，使用PCR扩增可以使杂交捕获后的产物的量，达到可以上机测序的起始量。如果不使用PCR扩增杂交捕获后的产物，则产物的量无法达到上机测序的要求。

在上述本文涉及的系统中，在所述测序模块中，进行高通量二代测序的平台为Illumina平台。

在上述本文涉及的系统中，在所述判读模块中，所述数据库可以是通过整合公共数据以及已有的测序数据，提供了一种多癌甲基化分析数据库。根据数据库进行模式识别，数据库中包含三种标志物信息，分别为：泛癌标志物、组织特异性标志物和癌症特征性标志物。

在上述本文涉及的系统中执行的方法中，所述检测方法采用杂交捕获的方式富集cfDNA，并用NGS技术检测与癌症高度相关的甲基化位点。覆盖了我国发病率最高的三种管腔性器官恶性肿瘤(食管癌、胃癌和结直肠癌)。最终，根据检测血浆cfDNA中基因甲基化变化水平，为多癌早筛和早诊提供信息。

实施例实施例1：

如图1所示，本申请的实施流程具体如下：

1.1.cfDNA提取纯化

1.1.1.血浆样本制备：

4℃、2000g离心血液样本10min,将血浆转移到一个新的离心管中。4℃、16000g离心血浆样本10min,根据使用的收集管类型，执行下一步,本实验中使用的收集管类型为其他。

表2

1.1.2.裂解和结合

1.1.2.1.按照下表准备结合溶液/珠子混合物，然后彻底混匀。

表3

加入适量体积的血浆样品。

1.1.2.2.彻底混匀血浆样品和结合溶液/珠子混合物。

1.1.2.3.在旋转混匀仪上充分的结合10min，使cfDNA结合到磁珠上。

1.1.2.4.将结合管放在磁力架上5min，直到溶液变得澄清，磁珠完全吸附在磁力架上。

1.1.2.5.用移液管小心的弃去上清，继续保持管子在磁力架上几分钟，用移液管移去残留上清。

1.1.3.洗涤

1.1.3.1.将珠子重悬在1ml洗涤溶液中。

1.1.3.2.将重悬液转移到新的无吸附1.5ml离心管中。保留结合管。

1.1.3.3.将含有珠子重悬液的离心管置于磁力架上，20s。

1.1.3.4.将分离得到的上清，吸出洗涤结合管，将清洗后的残留珠子再次收集到重悬液中，弃掉裂解/结合管。

1.1.3.5.管子置于磁力架上2min，直到溶液变得澄清，珠子聚集在磁力架，用1ml移液器移除上清。

1.1.3.6.管子留在磁力架上，用200μL移液器尽可能移除残留的液体。

1.1.3.7.将管子从磁力架取下来，加入1ml洗涤溶液，涡旋30s。

1.1.3.8.置于磁力架2min，直到溶液澄清，珠子聚集在磁力架上，用1ml移液管移除上清。

1.1.3.9.管子留在磁力架上，用200μL移液器彻底移除残留液体。

1.1.3.10.将管子从磁力架取下，加入1ml 80％乙醇，涡旋30s。

1.1.3.11.置于磁力架上2min，溶液变得澄清，用1ml移液器移去上清。

1.1.3.12.管子留在磁力架上，用200μL移液器移去残留液体。

1.1.3.13.用80％乙醇重复上述1.1.3.10.-1.1.3.12.步骤一次，尽可能除去上清。

1.1.3.14.管子留在磁力架上，空气中干燥珠子3～5分钟。

1.1.4.洗脱cfDNA

1.1.4.1.按照下表加入洗脱液。

表4

1.1.4.2.涡旋5min，置于磁力架上2min，溶液变得澄清，吸取上清液中的cfDNA。

1.1.4.3.纯化的cfDNA立即使用，或者将上清转移至新的离心管中，-20℃保存。

1.2.gDNA打断与纯化：

1.2.1.按照Qubit浓度，取2μg gDNA，加水补至125μl，加入到covaris130μl打断管中，设置程序：50W，20％，200个循环，250s。

1.2.2.打断结束后取1μl样品使用Agilent2100进行片段检测，正常打断后样品检测主峰约在150bp-200bp。

对于cfDNA样品，Agilent2100进行片段检测，直接Qubit用于后续的实验。

1.3.末端修复、3‘端加“A”：

1.3.1.取20ng打断后的gDNA或cfDNA至PCR管中，用无核酸酶水补至50μl，加入以下试剂，涡旋混匀：

表5

1.3.2.设置以下程序在PCR仪上进行反应：热盖温度85℃。

表6

1.4.接头连接及纯化：

1.4.1.参照下表将接头提前稀释成合适的浓度：

表7

1.4.2.按下表配制以下试剂，轻轻吸打混匀，短暂离心：

表8

1.4.3.设置以下程序在PCR仪上进行反应：无热盖。

表9

1.4.4.按照以下体系，加入纯化磁珠进行实验(Agencourt AMPure XP磁珠提前拿至室温震荡混合均匀备用)：

表10

1.4.4.1.轻轻吸打混匀6次。

1.4.4.2.室温静置孵育5-15min，将PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清。

1.4.4.3.移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向PCR管内加入200μl80％乙醇溶液，静置30s。

1.4.4.4.移除上清，再向PCR管内加入200μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)。

1.4.4.5.室温静置3-5min，使残留乙醇彻底挥发。

1.4.4.6.加入22μl的无核酸酶水，把PCR管从磁力架取下，轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min。

1.4.4.7.将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清。

1.4.4.8.用移液器吸取20μl上清液，转移到新的PCR管。

1.5重亚硫酸盐处理及纯化：

1.5.1.预先拿出所需要的试剂，并溶解。根据下表加入各试剂：

表11

1.5.2.DNA保护缓冲液加入液体变成蓝色。轻轻吸打混匀，然后分成两管至于PCR仪上。

1.5.3.设置以下程序，并运行：热盖105℃。

表12

1.5.4.简短离心将两管相同样本合并至同一个干净的1.5ml离心管中。

1.5.5.每个样本中加入310μl缓冲液BL(样本量少于100ng加入1μl的载体RNA(1μg/μl))，涡旋混匀，简短离心。

1.5.6.加入250μl无水乙醇到每个样本中，涡旋混匀15s，简短离心，将混合液加入到准备好的对应的离心柱中。

1.5.7.静置1min，离心1min，将收集管中的液体重新转移到离心柱中，离心1min，弃去离心管的液体。

1.5.8.加入500μl缓冲液BW(注意是否加入无水乙醇)，离心1min，弃去废液。

1.5.9.加入500μl缓冲液BD(注意是否加入无水乙醇)，盖好管盖，室温放置15min。离心1min，弃去离心下的液体。

1.5.10.加入500μl缓冲液BW(注意是否加入无水乙醇)，离心1min，弃去离下来的液体，在重复一次，共2次。

1.5.11.加入250μl无水乙醇，离心1min，将离心柱放置到新的2ml收集管中，弃掉全部剩余液体。

1.5.12.将离心柱放置到干净的1.5ml离心管中，加入20μl无核酸酶水到离心柱膜中心，轻轻盖上管盖，室温放置1min，离心1min。

1.5.13.将收集管中的液体重新转移至离心柱中，室温放置1min，离心1min。

1.6.杂交前预扩增及纯化：

1.6.1.按下列表格配制反应体系，吹打混匀，短暂离心：

表13

1.6.2.设置以下程序并启动PCR程序：热盖105℃

表14

1.6.3.PCR循环数根据投入DNA的量不同进行调整，参考数据如下所示：

表15

1.6.4.向反应结束后的PCR管中加入50μl Agencourt AMPure XP磁珠，用移液器吹打混匀，避免产生气泡(Agencourt AMPure XP提前室温混匀并平衡)。

1.6.5.室温孵育5-15min，把PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清。

1.6.6.移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向PCR管内加入200μl80％乙醇溶液，静置30s。

1.6.7.移除上清，再向PCR管内加入200μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)。

1.6.8.室温静置5min，使残留乙醇彻底挥发。

1.6.9.加入30μl的无核酸酶水，将离心管从磁力架取下，使用移液器，轻轻吸打重悬磁珠。

1.6.10.室温静置2min，将200μl PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清。

1.6.11.用移液器将上清液转移到新的200μl PCR管中(置于冰盒上)，在反应管上标记好样本号，准备下一步反应。

1.6.12.取1μl样品使用Qubit进行文库浓度测定，记录文库浓度。

1.6.13.取1μl样品使用安捷伦2100进行文库片段长度测定，文库长度约在270bp-320bp间。

1.7.样品与探针杂交：

1.7.1.按照以下体系将样品文库与各种Hyb阻断物混匀，标记为B：

表16

1.7.2.将准备好的样品和Hyb阻断物混合物放入真空浓缩离心机，打开PCR管盖，启动离心机，打开真空泵开关，开始浓缩。

1.7.3.将抽干的样品重新溶在约9μl无核酸酶水中,总体积10μl，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上待用，标记为B。

1.7.4.将Hyb缓冲液置于室温融化，融解之后会有沉淀出现，混匀后置于65℃水浴锅内预热，完全溶解后(无沉淀及浑浊物)取20μl Hyb缓冲液置于新的200μl PCR管内，盖好管盖,标记为A,继续置于65℃水浴锅内孵育待用。

1.7.5.通过艾吉泰康生物科技(北京)有限公司合成以下低甲基化探针：

a)靶向癌症特异性区域的探针Seq ID No.：119-215中的任意，b)靶向泛癌特异性区域的探针Seq ID No.：216-217中的任意，和c)靶向组织特异性区域的探针Seq ID No.：218-276中的任意，

并且合成以下高甲基化探针：

d)靶向癌症特异性区域的探针Seq ID No.：277-373中的任意，e)靶向泛癌特异性区域的探针Seq ID No.：374-375中的任意，和f)靶向组织特异性区域的探针Seq ID No.：376-434中的任意。

并且以a:b:c:d:e:f＝1:1:1:1:1:1的比例制成探针组合物。

1.7.6.取5μl RNA酶阻断物与2μl探针组合物置于200μl PCR管内，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上待用，标记为C。

1.7.7.设置PCR仪参数，热盖100℃，95℃，5min；65℃，保持。

1.7.8.将PCR管B置于PCR仪上，运行以上程序。

1.7.9.PCR仪温度降至65℃时，将PCR管A置于PCR仪上孵育，盖上PCR仪热盖。

1.7.10.5min后，将C置于PCR上孵育，盖上PCR仪热盖。

1.7.11.将PCR管C放置入PCR仪2min后，把移液器调至13μl，从PCR管A中吸取13μlHyb缓冲液移至PCR管C中，吸取全部PCR管B中样品移至PCR管C中，轻轻吸打10次，充分混匀，避免产生大量气泡，密封管盖，盖上PCR仪热盖,65℃孵育过夜(16-24h)。

1.8.捕获目标区域DNA文库：

1.8.1.捕获磁珠的准备

1.8.1.1.将磁珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1磁珠)从4℃取出，涡旋震荡重悬。

1.8.1.2.取50μl磁珠置于新的PCR管内，置于磁力架上1min使溶液澄清，移除上清。

1.8.1.3.从磁力架上取下PCR管，加入200μL结合缓冲液轻轻吸打数次混匀，重悬磁珠。

1.8.1.4.置磁力架上1min，移除上清。

1.8.1.5.重复步骤3-4两次，共清洗磁珠3次。

1.8.1.6.从磁力架上取下PCR管，加入200μL结合缓冲液轻轻吸打6次重悬磁珠待用。

1.8.2.捕获目标DNA文库

1.8.2.1.保持杂交产物PCR管C在PCR仪上，将准备好的200μL捕获磁珠加入到杂交后的产物PCR管C中，用移液器吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上室温结合30min(转速最好不要超过10转/min)。

1.8.2.2.将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清，移除上清液。

1.8.2.3.向PCR管C内加入200μL的洗涤缓冲液1，轻轻吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上清洗15min(转速最好不要超过10转/min)，然后短暂离心，将PCR管放于磁力架上2min使溶液澄清，移除上清。

1.8.2.4.加入200μl的65℃预热后的洗涤缓冲液2，轻轻吸打6次混匀，置于混匀仪上65℃孵育10min，转速800转/min进行清洗。

1.8.2.5.短暂离心，将PCR管放于磁力架上2min，移除上清。使用洗涤缓冲液2再重复2次清洗，共计3次。最后一次彻底移除洗涤缓冲液2。

1.8.2.6.PCR管继续置于磁力架上，向PCR管内加入200μl 80％乙醇，静置30s后彻底移除乙醇溶液，室温晾干2min。

1.8.2.7.向PCR管加入30μL无核酸酶水，从磁力架上取下PCR管，轻轻吸打6次重悬磁珠待用。

1.9.捕获后扩增及纯化

1.9.1.根据下表配制反应体系进行捕获文库的富集，轻轻吹打混匀后，短暂离心：

表17

1.9.2.设置以下程序，将样品置于PCR仪中，运行程序：热盖105℃。

表18

1.9.3.PCR结束后向样品加入55μl Agencourt AMPure XP磁珠，用移液器轻轻吸打混匀。

1.9.4.室温孵育5min，把PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清。

1.9.5.移除上清，PCR管继续置于磁力架上，加入200μl 80％无水乙醇，静置30s。

1.9.6.移除上清，再向PCR管内加入200μl 80％无水乙醇，静置30后彻底移除上清。

1.9.7.室温放置5min，使得残留乙醇彻底挥发。

1.9.8.加入25μl无核酸酶水，将PCR管从磁力架拿下，轻轻吹打混匀重悬磁珠，室温放置2min。

1.9.9.将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清。

1.9.10.用移液器吸23μl上清液转移到1.5ml离心管，标记样品信息。

1.9.11.取1μl文库使用Qubit进行定量，记录文库浓度。

1.9.12.取1μl样品使用Agilent2100进行文库片段长度测定。

1.9.13.使用Illumina高通量测序平台进行测序。

1.10.甲基化生信分析流程。大致如下：使用trimmomatic等质控软件查看测序质量，去除低质量的读段，然后采用Bismarker等比对软件将质控后的干净的数据比对到参考基因组上，采用methykit等R包提取相应的甲基化位点。最后，计算出Panel上的每个靶区域的甲基化比率。

实施例2

一例经病理鉴定的胃癌样本，采用本申请的Panel检测，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过Illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，得到甲基化水平，结果如下表19所示(表19显示了检测到的大于等于甲基化阈值的靶区域)。

表19

对检测样本进行模式识别分类鉴定，首先判读出泛癌特异性标志物TBX15和CRYGD基因的甲基化水平大于等于55％和60％，则初步判断该样本为患有癌症的样本；其次，判读出癌症特异性标志物OTX1、SFRP2、CDO1、TRIM15、ALX4、CCNA1的甲基化水平均大于等于表1中所示的各自阈值(如上表19所示)，则进一步判断该样本为患有以下11种癌症(食管癌、胃癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌)中的任意癌症的样本；最后，判读组织特异性标志物，基于表19中大于等于各自阈值的靶区域，可以看出属于胃组织特异性的6个靶区域Seq ID No.81、Seq ID No.82、Seq ID No.97、SeqID No.98、Seq ID No.99和Seq ID No.100大于等于各自的甲基化水平的阈值，没有其他的组织特异性标志物的甲基化大于等于其各自的阈值，因此在大于等于各自甲基化阈值的组织特异性标志物中，胃组织特异性标志物最多，则最终判断该样本为患有胃癌的样本。

该患者术后48小时，再次抽血，采用本申请的Panel检测，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过Illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，通过模式识别的方法，分析所有测序数据，结果显示上表中的基因甲基化水平回归正常水平。

实施例3

一例结直肠癌样本，采用本申请的Panel检测，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过Illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，得到甲基化水平，结果如下表20所示(表20显示了检测到的大于等于甲基化阈值的靶区域)。

表20

对检测样本进行模式识别分类鉴定，首先判读出泛癌特异性标志物TBX15和CRYGD基因的甲基化水平大于等于55％和60％，则初步判断该样本为患有癌症的样本；其次，判读出癌症特异性标志物TRH、CDO1、ELMO1、GFRA1、CCNA1、SALL1的甲基化水平均大于等于表1中所示的各自阈值(如上表20所示)，则进一步判断该样本为患有以下11种癌症(食管癌、胃癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌)中的任意癌症的样本；最后，判读组织特异性标志物，基于表20中大于等于各自阈值的靶区域，可以看出属于结直肠组织特异性的6个靶区域Seq ID No.63、Seq ID No.64、Seq ID No.87、Seq ID No.88、Seq ID No.89、Seq ID No.90大于等于各自的甲基化水平的阈值，没有其他的组织特异性标志物的甲基化大于等于其各自的阈值，因此在大于等于各自甲基化阈值的组织特异性标志物中，结直肠组织特异性标志物最多，则最终判断该样本为患有结直肠癌的样本。

患者术后48小时，再次抽血，采用本申请的Panel检测，按实施例1的方法采集外周血，建库，测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，通过模式识别的方法，分析所有测序数据，结果显示上表中的基因甲基化水平回归正常水平。

实施例4

一例食管癌样本，采用本申请的Panel检测，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过Illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，得到甲基化水平，结果如下表21所示(表21显示了检测到的大于等于甲基化阈值的靶区域)。

表21

对检测样本进行模式识别分类鉴定，首先判读出泛癌特异性标志物TBX15和CRYGD基因的甲基化水平大于等于55％和60％，则初步判断该样本为患有癌症的样本；其次，判读出癌症特异性标志物CPE、TFAP2E、TRH、C11orf21、EDNRB的甲基化水平均大于等于表1中所示的各自阈值(如上表21所示)，则进一步判断该样本为患有以下3种癌症(食管癌、胃癌、结直肠癌)中的任意癌症的样本；最后，判读组织特异性标志物，基于表21中大于等于各自阈值的靶区域，可以看出属于食管组织特异性的4个靶区域Seq ID No.66、Seq ID No.67、SeqID No.79和Seq ID No.80大于等于各自的甲基化水平的阈值，没有其他的组织特异性标志物的甲基化大于等于其各自的阈值，因此在大于等于各自甲基化阈值的组织特异性标志物中，食管组织特异性标志物最多，则最终判断该样本为患有食管癌的样本。

患者术后48小时，再次抽血，采用本申请的Panel检测，按实施例1的方法采集外周血，建库，测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，通过模式识别的方法，分析所有测序数据，结果显示上表中的基因甲基化水平回归正常水平。

对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，作出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形都应该包括在本申请权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 博尔诚（北京）科技有限公司

<120> 一种癌症基因甲基化检测系统和在该系统在中执行的癌症体外检测方法

<130> PC00573

<141> 2020-02-25

<160> 338

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 132

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ctctgctctc ccctcaaaac aagtttcagg atcttgcagg cctcgcggcg tcgttcttcg 60

ttgtggcggc ctgtggctct ttgaaaaaca cgacgaggcc tgcaaaatgc gtttttcttt 120

ttttccttta cg 132

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atccgacggt ggccgcaaga tctcatcatg gatctgaccc ctgctcagcg cgcgccattt 60

cgt 63

<210> 3

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cgctccaggg gcgaaggact ctggactcac cccgaccacc gggagagctg gcccctaccc 60

a 61

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tcactgcggg attcggcgtt gccgccagcc cagtggggag tgaattagcg 50

<210> 5

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

cggcccttcc gacggcacga ggaactcctg tcctgcccca cagaccttcg gcctccgccg 60

ag 62

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

agcttaacag gaatattttc cagcagtgag caggggctgt atgggacgcg 50

<210> 7

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gagcgcctga aatatacttg caaggccgca gcaatatact tgcaaggccg cag 53

<210> 8

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

cgatcttcca gtcctagtgc cctggtcgag acggttctat ccttttgcaa agaagccgga 60

aagagctggg tcccgggggc g 81

<210> 9

<211> 118

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

cgggatgaca gactctgaca atcattaaac cagccgggcc tgatttccca gcactgcctg 60

ctaagatccg ggccaagtgg cactgaatat gcaaatcacc tggggccagg agcccagt 118

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

gggcctctgg tgtcccccat ggtgcagggg gatgacaagg tgtttcgccg 50

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

cgtggccacc aatgacccgc ggcgcccccg cgtgtccccg cagccactcc 50

<210> 12

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

ctggctgggc gcacggcggt gctgagctgg tggggcggcg gcgctgagcg 50

<210> 13

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

agaattctaa tttatttaat tattctaaaa attccaatca caatggcgcg gcg 53

<210> 14

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

cgcagccggg acaatttcga gacaacttcg agacaatttc gaatggacaa attgcg 56

<210> 15

<211> 74

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

ctgaggagag ccgcgcaatg gaaacctggg tgcagggact gtggggcccg aaggcggggc 60

tgggcgcgct ctcg 74

<210> 16

<211> 65

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

cggccagtgc ctccgcgccc cggctccggt ccccaccgtc cccgccccag atttccggag 60

gagca 65

<210> 17

<211> 77

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

cgctgcagac tcctgacctg ccgactgcgg atcccgagtc cccggatccc ggacccatcc 60

tgtggagccc actcctg 77

<210> 18

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

ttgcaggaac tgtatccctg cctgcgacgg gggcgagata gatgattccg 50

<210> 19

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

cgcccccaca gtgagcgagc agggcgcggg ctgcgggagt ggggggcacg cagggcaccc 60

cg 62

<210> 20

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

cgggcttgtt ttgccccagt ccgaagtttc tgctgggttg ccaggcatga 50

<210> 21

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

gttggggggc tgcgtccctg gtagccgcgt gtgccctgtg atggagcccg 50

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

cgaatctcca gccaccgttc agcagcctgt cggtgtgctc cccaatgccg 50

<210> 23

<211> 140

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

tatgcgtgtc aactgccatc aacttccttg cttgctgggg actggggccg cgagggcata 60

cccccgaggg gtacggggct agggctaggc aggctgtgcg gttgggcggg gccctgtgcc 120

ccactgcgga gtgcgggtcg 140

<210> 24

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

gggccccttt taagcgcttg gagtcactag gaatgtacca acggccctcg gagggaggac 60

g 61

<210> 25

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

cggctcacgc gcacatcccc ggcttccccg ggctccgcgc cttcccaaga gccccgttg 59

<210> 26

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

cgggcctaaa atgcattagc tggtttttac tgaatttacg cttagcagag acctacagaa 60

aaatgagatc cagctcgccg 80

<210> 27

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

cgcgaggctg gagtgatttt tttgataatc ctgctagaga cagaatgggt aa 52

<210> 28

<211> 89

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

cggggctcca gccaggcgtc accttccaca gcgaacctgc gaaccacagc gtcccctggg 60

ggtctccgtc cgcgtggccg cttcctctt 89

<210> 29

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

cgcgccccgc ctgctggacc acttcatctg tgagctgccg gcgttgctca agctggc 57

<210> 30

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

cggagacact accgagaacc agatgttcgc cgcccgcgtg gtcatcctgc 50

<210> 31

<211> 68

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

aacttactgc gaggagcacg gcgagaagat ctacttcttc tgcgagaacg atgccgagtt 60

cctctgtg 68

<210> 32

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

cgaggcattc ccagactgaa ggcagatagg gctccacttg gatgtgtggt 50

<210> 33

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

tcggggccag agtttgaagc cgtggatgtg cctgcctggt ggcttgtccg atttgcacgg 60

tgacttgatt 70

<210> 34

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 34

cgaagcgctt tagtgccttc cgtccctaaa ccgccaacag ccagaacggc ttctc 55

<210> 35

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 35

ttccttcctc ctgctggcca gagacacatt ttgcatctgc aaggcatccg gagatcagcc 60

gcg 63

<210> 36

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 36

agaaagcgag gcttggaggg cgcctacacg gggccccatg gcccgctgcg 50

<210> 37

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

agagaagctc ctggagcggc cagatacctg ttggctcctg agcagcatcg cccagtgcag 60

cctccg 66

<210> 38

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 38

cgccaccaaa agtcggtagc tgggagcctt caaagcccgc caaacacact ggaagcatcc 60

aca 63

<210> 39

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 39

cgcactcggt acggcagcat ctctggcctc cagccggggt taaccctgac ctgaac 56

<210> 40

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 40

cggtaatctt cgagagctcg aagggccgag ttgggccagg acgatttccg agcagagccc 60

tcggctcgga tgctcg 76

<210> 41

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 41

cgtgttccga ggccagattt cttctggcca gaggaccctc ggcctgctcc 50

<210> 42

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 42

cgagctacgt ggtgctcttg gcagaccttg actaggttct ttttacagcg 50

<210> 43

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 43

catttcaaag ctacacaatg cgggcggtcc cggcgaggcg ggaggggccg 50

<210> 44

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 44

gagcccgcga tggagctttg tgaagatgca ggcgttgggg ctgctcggcg 50

<210> 45

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 45

cccccttgat gaggtcctga ccaaatgcag gaggagcaat tccagcaccg aggggcg 57

<210> 46

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 46

cggaaaccct gcctgtactg gggccgcagc gctgccccca cccatacgta 50

<210> 47

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 47

cgggaaaaac aaactccaag tcgagtttaa cagccgaaac gctccgtgcc 50

<210> 48

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 48

cggcggacaa gaaggagaca gaacagatcc cttggctccc tcgcagcgat 50

<210> 49

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 49

gcagggggct gtattggaag ccgccgggct ggctgcaggc gccaaagtcg 50

<210> 50

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 50

cgagttgagg gaataatcag aaagagagct ccctctggaa gtcgcagtcc 50

<210> 51

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 51

tgtaaagaca gccttgactc aagcatgcgt tagagcacgt gtcagggccg accgtgctgg 60

cg 62

<210> 52

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 52

agcctggcga gtgaggcgcg aaaccggagg ggtcggcgag gatgcgggcg 50

<210> 53

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 53

tggcttcagc ttcaatccca gaaaagtgga tcaaaacgac aggttccacg aacaaacact 60

gcgccg 66

<210> 54

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 54

cgcctctact ttggagaaaa ggaaaagggc gtgaggtttc ggtcattttt 50

<210> 55

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 55

aaaataaagt tcgattattt cacctggctt gtcagtcacc tatgcaggcg tctgagcccc 60

cg 62

<210> 56

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 56

cgcccggccc ccagcccgga gagctgccac cgaccccctc aacgtcccaa gccccagctc 60

tgtcgc 66

<210> 57

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 57

cggagattcg gaaacccgca gagacttctc aagtcagcag gaacttggaa accgctgttc 60

cctcca 66

<210> 58

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 58

cgtccgtttg caccgtctcc ggaacaactg gcggccagca gcactctcca ccccggccgc 60

aac 63

<210> 59

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 59

tgctgaccgc ctcgcagcgc tggccgggct ccgggaggag ggccccggcg ggtggcg 57

<210> 60

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 60

ggcgggggcg gcgggggtgg tggcggaggc ggcgggggcc cagggtcccg 50

<210> 61

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 61

cgggagggag tcggaggcgc cagcccactg gggaggtggc gctgggcgcg cgggatgcgc 60

ggggagcctt ctctgcagga gccg 84

<210> 62

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 62

cggtctgacg ccccctgctc attcgccagg cagccttgat tggcatgacc 50

<210> 63

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 63

gagcgcctga aatatacttg caaggccgca gcaatatact tgcaaggccg cag 53

<210> 64

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 64

ctggctgggc gcacggcggt gctgagctgg tggggcggcg gcgctgagcg 50

<210> 66

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 66

cacagtcagg gatggtgggc tccagtctgg gccttagggg tggggcgtcg 50

<210> 67

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 67

cgcactgagg ccccgccccc acatggcagg gtgtttttgt ttttgttttt 50

<210> 79

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 79

cgtgatgccg tcttcatttg gaacaagggg gggttcatgc caaaattagg 50

<210> 81

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 81

cgagccagca aataacgcca gcagccctcc cagatccacg ccggcccgtc 50

<210> 82

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 82

gaaggtgagg cgagtagagg ctggtgcgga acttgccgcc cccagcagcg 50

<210> 83

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 83

tgacaagtgc ccctgtggga tacacagccc caggcctcat cggtcactcg 50

<210> 84

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 84

cgcctcagag ccagaagttt atggctccca cctgctcaat ctgacaggaa 50

<210> 85

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 85

cggggtgctt ctggagcctg cctcccaggg agcaggctga ggagctggcg 50

<210> 86

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 86

cggggctgtg gtcacagtaa agcaaggcga tcttcgcaca cagcaagtgc 50

<210> 87

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 87

gatgctgtct tggagcgggc accgccgggg gaaaagtctg gactgcctcg 50

<210> 88

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 88

cggtcaagaa tcctggggaa cccgctccgc cccctggctc cagcgccctc 50

<210> 89

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 89

aggtgtcgga aagcccagcc agtccccggg agtgtagcca atagaaggcg 50

<210> 90

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 90

cgatcctgga gcccagatca agccaagtcc ggccaaagct gtgtcgcaaa 50

<210> 97

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 97

cggggaccac gctgcggtgc accaccttcc gccaccctcc cgcgctgggc 50

<210> 98

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 98

cgcagttggc ggagctgccc agggcgtgcg agcaggctgc gaggatggcg 50

<210> 99

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 99

cggcttaatc tgttggccgc gactcctcag ccagccccga ggaaagtgca 50

<210> 100

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 100

cggcgctggc tgtggaatta gatctgtttt gaacccagtg gagcgcatcg 50

<210> 101

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 101

tgagaggccc ctccgtcctt gaggagcaaa cctggggctg cggagaaccg 50

<210> 102

<211> 67

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 102

cgcccagaaa agcctggaaa tggtgtgggc tattgttggg agaacccgcc tcgcaacaga 60

gctgacg 67

<210> 111

<211> 125

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 111

cgggccctag gtccaggagc tcctaagcca tccccgtcct cagccggtgg cccggtcccc 60

ttagggactg ccttatgagt tgcactcgct gatggaaatc tcgggatgca gtcagaaggc 120

ccccg 125

<210> 117

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 117

cggggacact gcgtaccacc cggcgcacag cccctcccgc gcaaacccga 50

<210> 118

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 118

cgccgtccgg gtgggcctag cagtcgctcc atttatcgct tgagatctcc 50

<210> 119

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 119

cataaaaaaa aaaaaaaaaa acacatttta caaacctcat catatttttc 50

<210> 120

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 120

aaaaaaccac aaaccaccac aacaaaaaac aacaccacaa aacctacaaa 50

<210> 121

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 121

caaaacctac aaaacaaaat cctaaaactt attttaaaaa aaaaacaaaa 50

<210> 122

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 122

acaaaataac acacactaaa caaaaatcaa atccataata aaatcttaca 50

<210> 123

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 123

cactaaacaa aaatcaaatc cataataaaa tcttacaacc accatcaaat 50

<210> 124

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 124

taaataaaaa ccaactctcc caataatcaa aataaatcca aaatccttca 50

<210> 125

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 125

caactctccc aataatcaaa ataaatccaa aatccttcac ccctaaaaca 50

<210> 126

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 126

cactaattca ctccccacta aactaacaac aacaccaaat cccacaataa 50

<210> 127

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 127

ctcaacaaaa accaaaaatc tataaaacaa aacaaaaatt cctcatacca 50

<210> 128

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 128

caaaaatcta taaaacaaaa caaaaattcc tcataccatc aaaaaaacca 50

<210> 129

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 129

cacatcccat acaaccccta ctcactacta aaaaatattc ctattaaact 50

<210> 130

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 130

ctacaacctt acaaatatat tactacaacc ttacaaatat atttcaaaca ctc 53

<210> 131

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 131

cacccccaaa acccaactct ttccaacttc tttacaaaaa aataaaacca 50

<210> 132

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 132

ttacaaaaaa ataaaaccat ctcaaccaaa acactaaaac taaaaaatca 50

<210> 133

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 133

actaaactcc taaccccaaa taatttacat attcaatacc acttaaccca 50

<210> 134

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 134

aatcttaaca aacaatacta aaaaatcaaa cccaactaat ttaataatta 50

<210> 135

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 135

taaaaaatca aacccaacta atttaataat tatcaaaatc tatcatccca 50

<210> 136

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 136

caacaaaaca ccttatcatc cccctacacc ataaaaaaca ccaaaaaccc 50

<210> 137

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 137

aaaataacta caaaaacaca caaaaacacc acaaatcatt aataaccaca 50

<210> 138

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 138

cactcaacac caccacccca ccaactcaac accaccatac acccaaccaa 50

<210> 139

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 139

caccacacca ttataattaa aatttttaaa ataattaaat aaattaaaat tct 53

<210> 140

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 140

cacaatttat ccattcaaaa ttatctcaaa attatctcaa aattatccca 50

<210> 141

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 141

ttatccattc aaaattatct caaaattatc tcaaaattat cccaactaca 50

<210> 142

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 142

caaaaacaca cccaacccca ccttcaaacc ccacaatccc tacacccaaa 50

<210> 143

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 143

caaaccccac aatccctaca cccaaatttc cattacacaa ctctcctcaa 50

<210> 144

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 144

tactcctcca aaaatctaaa acaaaaacaa taaaaaccaa aaccaaaaca 50

<210> 145

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 145

ctaaaacaaa aacaataaaa accaaaacca aaacacaaaa acactaacca 50

<210> 146

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 146

caaaaataaa ctccacaaaa taaatccaaa atccaaaaac tcaaaatcca 50

<210> 147

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 147

aaaatccaaa aactcaaaat ccacaatcaa caaatcaaaa atctacaaca 50

<210> 148

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 148

caaaatcatc tatctcaccc ccatcacaaa caaaaataca attcctacaa 50

<210> 149

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 149

caaaataccc tacatacccc ccactcccac aacccacacc ctactcactc 50

<210> 150

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 150

catacccccc actcccacaa cccacaccct actcactcac tataaaaaca 50

<210> 151

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 151

tcatacctaa caacccaaca aaaacttcaa actaaaacaa aacaaaccca 50

<210> 152

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 152

caaactccat cacaaaacac acacaactac caaaaacaca accccccaac 50

<210> 153

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 153

caacattaaa aaacacacca acaaactact aaacaataac taaaaattca 50

<210> 154

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 154

caacccacac tccacaataa aacacaaaac cccacccaac cacacaacct 50

<210> 155

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 155

acctaaccct aaccccatac ccctcaaaaa tataccctca caaccccaat 50

<210> 156

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 156

caaccccaat ccccaacaaa caaaaaaatt aataacaatt aacacacata 50

<210> 157

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 157

catcctccct ccaaaaacca ttaatacatt cctaataact ccaaacactt 50

<210> 158

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 158

caaaaaccat taatacattc ctaataactc caaacactta aaaaaaaccc 50

<210> 159

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 159

caacaaaact cttaaaaaaa cacaaaaccc aaaaaaacca aaaatataca 50

<210> 160

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 160

tcttaaaaaa acacaaaacc caaaaaaacc aaaaatatac acataaacca 50

<210> 161

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 161

caacaaacta aatctcattt ttctataaat ctctactaaa cataaattca 50

<210> 162

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 162

ctctactaaa cataaattca ataaaaacca actaatacat tttaaaccca 50

<210> 163

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 163

ttacccattc tatctctaac aaaattatca aaaaaatcac tccaacctca ca 52

<210> 164

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 164

aaaaaaaaac aaccacacaa acaaaaaccc ccaaaaaaca ctataattca 50

<210> 165

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 165

actataattc acaaattcac tataaaaaat aacacctaac taaaacccca 50

<210> 166

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 166

accaacttaa acaacaccaa caactcacaa ataaaataat ccaacaaaca 50

<210> 167

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 167

taaacaacac caacaactca caaataaaat aatccaacaa acaaaacaca 50

<210> 168

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 168

acaaaataac cacacaaaca acaaacatct aattctcaat aatatctcca 50

<210> 169

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 169

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<210> 170

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 170

cattctcaca aaaaaaataa atcttctcac catactcctc acaataaatt 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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accacacatc caaataaaac cctatctacc ttcaatctaa aaatacctca 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 172

aatcaaatca ccatacaaat caaacaaacc accaaacaaa cacatccaca 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 174

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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caaatacctt acaaatacaa aatatatctc taaccaacaa aaaaaaaaaa 50

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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cacaacaaac cataaaaccc catataaaca ccctccaaac ctcactttct 50

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<211> 50

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<213> Artificial Sequence

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caaaaactac actaaacaat actactcaaa aaccaacaaa tatctaacca 50

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<211> 50

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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tataaatact tccaatatat ttaacaaact ttaaaaactc ccaactacca 50

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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attcaaatca aaattaaccc caactaaaaa ccaaaaatac taccatacca aataca 56

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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caaaaatcat cctaacccaa ctcaaccctt caaactctca aaaattacca 50

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<211> 50

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<213> Artificial Sequence

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<211> 50

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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caactttaac acctacaacc aacccaacaa cttccaatac aaccccctac 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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caaaaactca aacacctaca taaataacta acaaaccaaa taaaataatc 50

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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ttaaaacatt aaaaaaatca ataacaactc tccaaactaa aaaccaaaca 50

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<213> Artificial Sequence

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taaaaaaaac aacaatttcc aaattcctac taacttaaaa aatctctaca 50

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<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 209

taaaaaatac tactaaccac caattattcc aaaaacaata caaacaaaca 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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caccacccac caaaaccctc ctcccaaaac ccaaccaaca ctacaaaaca 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<211> 50

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<211> 50

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<213> Artificial Sequence

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<211> 50

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<211> 50

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<213> Artificial Sequence

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<211> 50

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<211> 50

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<213> Artificial Sequence

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<211> 50

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<213> Artificial Sequence

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<211> 50

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<213> Artificial Sequence

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<211> 50

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<213> Artificial Sequence

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<211> 50

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<213> Artificial Sequence

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<211> 50

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<211> 50

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<211> 50

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<213> Artificial Sequence

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caaaaacctt ctaactacat cccaaaattt ccatcaacaa atacaactca 50

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<211> 50

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<213> Artificial Sequence

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taaaacaatc cctaaaaaaa ccaaaccacc aactaaaaac aaaaataact 50

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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tcaaatttac acaaaaaaaa ctatacacca aataatacac aatatcccca 50

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<213> Artificial Sequence

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aaaaatctca aacaataaat aaaacaacta ctaaacccac ccaaacaaca 50

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<211> 50

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<213> Artificial Sequence

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cgtaaaaaaa aaaaaaaaaa acgcatttta caaacctcgt cgtatttttc 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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aaaaaaccac aaaccgccac aacgaaaaac gacgccgcga aacctacaaa 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 279

cgccgcgaaa cctacaaaat cctaaaactt attttaaaaa aaaaacaaaa 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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acgaaataac gcgcgctaaa caaaaatcaa atccataata aaatcttacg 50

<210> 281

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 281

cgctaaacaa aaatcaaatc cataataaaa tcttacgacc accgtcgaat 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 282

taaataaaaa ccaactctcc cgataatcga aataaatcca aaatccttcg 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 283

caactctccc gataatcgaa ataaatccaa aatccttcgc ccctaaaacg 50

<210> 284

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 284

cgctaattca ctccccacta aactaacgac aacgccgaat cccgcaataa 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 285

ctcgacgaaa accgaaaatc tataaaacaa aacaaaaatt cctcgtaccg 50

<210> 286

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 286

cgaaaatcta taaaacaaaa caaaaattcc tcgtaccgtc gaaaaaaccg 50

<210> 287

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 287

cgcgtcccat acaaccccta ctcactacta aaaaatattc ctattaaact 50

<210> 288

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 288

ctacgacctt acaaatatat tactacgacc ttacaaatat atttcaaacg ctc 53

<210> 289

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 289

cgcccccgaa acccaactct ttccgacttc tttacaaaaa aataaaaccg 50

<210> 290

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 290

ttacaaaaaa ataaaaccgt ctcgaccaaa acactaaaac taaaaaatcg 50

<210> 291

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 291

actaaactcc taaccccaaa taatttacat attcaatacc acttaacccg 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 292

aatcttaaca aacaatacta aaaaatcaaa cccgactaat ttaataatta 50

<210> 293

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 293

taaaaaatca aacccgacta atttaataat tatcaaaatc tatcatcccg 50

<210> 294

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 294

cgacgaaaca ccttatcatc cccctacacc ataaaaaaca ccaaaaaccc 50

<210> 295

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 295

aaaataacta cgaaaacacg cgaaaacgcc gcgaatcatt aataaccacg 50

<210> 296

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 296

cgctcaacgc cgccgcccca ccaactcaac accgccgtac gcccaaccaa 50

<210> 297

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 297

cgccgcgcca ttataattaa aatttttaaa ataattaaat aaattaaaat tct 53

<210> 298

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 298

cgcaatttat ccattcgaaa ttatctcgaa attatctcga aattatcccg 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 299

ttatccattc gaaattatct cgaaattatc tcgaaattat cccgactacg 50

<210> 300

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 300

cgaaaacgcg cccaaccccg ccttcgaacc ccacaatccc tacacccaaa 50

<210> 301

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 301

cgaaccccac aatccctaca cccaaatttc cattacgcga ctctcctcaa 50

<210> 302

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 302

tactcctccg aaaatctaaa acgaaaacga taaaaaccga aaccgaaacg 50

<210> 303

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 303

ctaaaacgaa aacgataaaa accgaaaccg aaacgcgaaa acactaaccg 50

<210> 304

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 304

caaaaataaa ctccacaaaa taaatccgaa atccgaaaac tcgaaatccg 50

<210> 305

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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gaaatccgaa aactcgaaat ccgcaatcga caaatcaaaa atctacaacg 50

<210> 306

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 306

cgaaatcatc tatctcgccc ccgtcgcaaa caaaaataca attcctacaa 50

<210> 307

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 307

cgaaataccc tacgtacccc ccactcccgc aacccgcgcc ctactcgctc 50

<210> 308

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 308

cgtacccccc actcccgcaa cccgcgccct actcgctcac tataaaaacg 50

<210> 309

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 309

tcatacctaa caacccaaca aaaacttcga actaaaacaa aacaaacccg 50

<210> 310

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 310

cgaactccat cacaaaacac acgcgactac caaaaacgca accccccaac 50

<210> 311

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 311

cgacattaaa aaacacaccg acaaactact aaacgataac taaaaattcg 50

<210> 312

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 312

cgacccgcac tccgcaataa aacacaaaac cccgcccaac cgcacaacct 50

<210> 313

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 313

acctaaccct aaccccgtac ccctcgaaaa tataccctcg cgaccccaat 50

<210> 314

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 314

cgaccccaat ccccaacaaa caaaaaaatt aataacaatt aacacgcata 50

<210> 315

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 315

cgtcctccct ccgaaaaccg ttaatacatt cctaataact ccaaacgctt 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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cgaaaaccgt taatacattc ctaataactc caaacgctta aaaaaaaccc 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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ctctactaaa cgtaaattca ataaaaacca actaatacat tttaaacccg 50

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<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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ttacccattc tatctctaac aaaattatca aaaaaatcac tccaacctcg cg 52

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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aaaaaaaaac gaccacgcga acgaaaaccc ccaaaaaacg ctataattcg 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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gctataattc gcaaattcgc tataaaaaat aacgcctaac taaaaccccg 50

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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accaacttaa acaacgccga caactcacaa ataaaataat ccaacaaacg 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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acaaaataac cacgcgaacg acgaacatct aattctcgat aatatctccg 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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accacacatc caaataaaac cctatctacc ttcaatctaa aaatacctcg 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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aatcaaatca ccgtacaaat cgaacaaacc accaaacaaa cacatccacg 50

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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cgaacaaacc accaaacaaa cacatccacg acttcaaact ctaaccccga 50

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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aaaaaaccgt tctaactatt aacgatttaa aaacgaaaaa cactaaaacg cttcg 55

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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cgaatacctt acaaatacaa aatatatctc taaccaacaa aaaaaaaaaa 50

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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cgaaaactac actaaacgat actactcaaa aaccaacaaa tatctaaccg 50

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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cgatactact caaaaaccaa caaatatcta accgctccaa aaacttctct 50

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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tacgtataaa taaaaacaac gctacgaccc caatacaaac aaaatttccg 50

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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