伏杀磷农药的荧光比率检测法

摘要

本发明公开了一种氮掺杂型荧光碳量子点，以天然高分子糖类为碳源，加入氮源，并采用一步水热法合成。由于本发明的氮掺杂型荧光碳量子点双激发‑单发射的荧光特性，以单一的氮掺杂型荧光碳量子点为荧光团，无需外加荧光团，可实现双输出信号，建立荧光比率传感器。据此，建立了伏杀磷农药的荧光比率检测法。随着伏杀磷的加入，氮掺杂型荧光碳量子点能在1min内作出反应，具体表现为235nm处的激发峰将不断发生猝灭，而327nm处的荧光峰则基本保持不变，并以之建立标准曲线；以该标准曲线为依据，实现对样品中伏杀磷的检测。总之，本发明不需昂贵的大型仪器，操作简单，绿色环保，响应迅速，在伏杀磷的实时检测中具有潜在的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于农药分析检测技术领域，尤其涉及一种伏杀磷农药的荧光比率检测法。

背景技术

有机磷农药是指含有磷酸酯或者硫代磷酸酯类农药的一类的有机化合物农药，主要用以防治植物病、虫害。由于其相对较快的环境降解速度、高效性、对植物安全和价格低廉等优点，已经广泛地替代了有机氯农药，并且从20世纪五六十年代开始向全世界广泛推用。伏杀磷是一种广谱高效的有机磷杀虫剂和除螨剂，广泛应用于粮食，果树，蔬菜及棉花中的病虫害防治。伏杀磷一旦进入体内可以结合并因此抑制乙酰胆碱酯酶活性，阻碍硫代乙酰胆碱催化水解，引起神经毒性。因此，它是一种高毒性的神经毒素，即使在较低的浓度下也会对人体机能造成损害，可以使人进入中毒状态，例如呕吐、出冷汗、精神异常，严重的情况下能够造成呼吸麻痹甚至死亡。伏杀磷在作物和环境中的残留也对哺乳动物和环境造成了显著危害：它会通过污染水体，经过食物链，由消化道、呼吸道进入而危害到人体。

目前，色谱法仍是伏杀磷检测的主流方法，包括高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用技术、液相色谱-质谱联用技术、超高效液相色谱-质谱/质谱联用技术等。色谱或/及其联用技术虽然可实现伏杀磷及其他有机磷农药的高通量检测，但是其设备比较昂贵，操作复杂，分析时间长且对操作人员的要求高，不利于紧急事件的实时检测。因此，开发出简单、快速、廉价的技术应用于伏杀磷的检测具有重要的意义。

荧光检测技术能够迅速、高灵敏地对目标检测物作出响应，且操作简单，价格低廉，已经受到了越来越多学者的关注。然而，常见的分析检测技术大都集中于单个信号的检测，容易受到背景信号、仪器噪音及周围环境的干扰，降低其准确度。为了克服这些缺点，比率型荧光传感器应运而生，它以两个荧光信号的比值作为输出信号，相当于为传感器引入了内标，能有效消除系统误差，提高准确度。为了获得多个荧光信号，常用的策略是引入不同的荧光团，但是外加荧光团不但增加了操作步骤和检测成本，外加的荧光团还可能会对目标检测物产生干扰或者排斥。因此，具有多个荧光信号的荧光团在比率型传感器的构建中将更具优势。尽管基于单一具有双发射性质的荧光团构建比率传感器也有报道，但已报道的荧光传感器几乎都集中在发射光谱上，基于激发光谱的荧光传感器很少报道，更不用说基于激发光谱的比率式荧光传感器了。对于这类有创新性的科学研究，将会对以后生活当中的物质检测技术提供更迅捷、更广阔的渠道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种廉价、迅捷、绿色的伏杀磷农药的荧光比率检测法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

氮掺杂型荧光碳量子点，以天然高分子糖类为碳源，加入氮源，并采用一步水热法合成；氮掺杂型荧光碳量子点具有双激发-单发射的荧光特性，当固定发射波长为400～440nm时，氮掺杂型荧光碳量子点在235nm和327nm左右各有一个激发峰。

天然高分子糖类为纤维素、木糖、纤维素二糖中的一种或多种；氮源为尿素、碳酸氢铵、二氰二胺、乙二胺、氨水中的一种或多种。

上述氮掺杂型荧光碳量子点的制备方法，以天然高分子糖类为碳源，加入氮源，在水热反应釜中加入去离子水，在高温环境下进行水热反应，冷却得到氮掺杂型荧光碳量子点粗产品；粗产品经滤膜过滤，透析袋透析得到氮掺杂型荧光碳量子点提纯产品。

天然高分子糖类为0.05～0.5g、氮源为0.2～2.0g、去离子水为10～50mL，水热反应在140～210℃下进行1～15h，透析采用500～1000Da的透析袋透析12～36h。

天然高分子糖类为0.2g纤维素二糖、氮源为0.75g尿素、去离子水为20mL，水热反应在180℃下进行4h，透析采用1000Da的透析袋透析24h，透析后的溶液定容至50mL。

上述氮掺杂型荧光碳量子点用于伏杀磷的可视化检测及其比率型荧光传感器制备。

伏杀磷农药的荧光比率检测法，以上述的氮掺杂型荧光碳量子点和伏杀磷标准品制备梯度浓度的伏杀磷溶液，将发射波长固定在400～440nm，通过荧光分光光度计扫描荧光激发光谱，并记录激发峰235nm(I

发射波长固定在420～430nm。

梯度浓度的伏杀磷溶液采用甲醇与水的混合溶液作为溶剂，甲醇与水的混合溶液中甲醇与水的比例为1～4:4～1。

甲醇与水的混合溶液中甲醇与水的比例为1:4、2:3、3:2或4:1。

针对目前伏杀磷缺乏有效针对性检测措施的问题，发明人研制了一种氮掺杂型荧光碳量子点，以天然高分子糖类为碳源，加入氮源，并采用一步水热法合成；氮掺杂型荧光碳量子点具有双激发-单发射的荧光特性，当固定发射波长为400～440nm时，氮掺杂型荧光碳量子点在235nm和327nm各有一个激发峰。由于本发明的氮掺杂型荧光碳量子点双激发-单发射的荧光特性，以单一的氮掺杂型荧光碳量子点为荧光团，无需外加荧光团，可实现双输出信号，建立荧光比率传感器。据此，发明人建立了伏杀磷农药的荧光比率检测法。随着伏杀磷的加入，氮掺杂型荧光碳量子点能在1min内作出反应，具体表现为235nm处的激发峰将不断发生猝灭，而327nm处的荧光峰则基本保持不变，并以之建立标准曲线；以该标准曲线为依据，实现对样品中伏杀磷的检测。总之，本发明方法不需昂贵的大型仪器，操作简单，绿色环保，响应迅速，在伏杀磷的实时检测中具有潜在的应用价值。

与现有技术相比，本发明至少具有如下优势：

(1)本发明的氮掺杂型荧光碳量子点以天然高分子糖类为碳源，来源广泛、廉价易得。

(2)本发明氮掺杂型荧光碳量子点具有双激发-单发射的荧光特性，无需外加其他荧光团便可提供两个荧光信号；现有大部分的荧光传感器都是基于发射光谱进行，而本发明创新性地利用利用激发光谱构建伏杀磷的比率型荧光传感器，基于荧光激发光谱对伏杀磷的响应而进行识别，为比率型荧光传感器地构建提供了新的思路，绿色环保，价格低廉。

(3)本发明采用比率型荧光传感器进行伏杀磷检测，具有准确度高，灵敏度好，响应快速等特点。

(4)本发明在分析检测领域具有良好的应用前景及应用价值，可应用于环境水样品及农产品中伏杀磷的检测。

附图说明

图1是荧光碳量子点的透射电子显微镜图(TEM)。

图2是荧光碳量子点的激发及发射光谱图。

图3是不同浓度伏杀磷对荧光碳量子点的235nm和327nm处荧光激发光谱对不同浓度伏杀磷的荧光响应图。

图4是检测伏杀磷的标准曲线图。

图5是不同浓度伏杀磷存在下，氮掺杂型荧光碳量子点在254nm紫外光照射下的荧光图，图中：1-11分别对应伏杀磷浓度0.00,0.16,0.24,0.40,0.60,0.80,1.00,2.00,4.00,6.00,10.00μg/mL。

图6是氮掺杂型荧光碳量子点对伏杀磷及其他干扰物质的荧光比率响应图。

具体实施方式

实施例1氮掺杂型荧光碳量子点的制备

将0.2g纤维素二糖，0.75g尿素，20mL去离子水加入到水热反应釜中，于180℃条件下反应4h，冷却至室温，得到氮掺杂型荧光碳量子点粗产品；粗产品过0.22μm滤膜除去大颗粒物质，然后于1000Da的透析袋透析24h除去未反应的原料和小颗粒物质。透析后的溶液定容至50mL，得到氮掺杂型荧光碳量子点溶液，避光保存，备用。

如图1所示，本发明的氮掺杂型荧光碳量子点呈现出良好的单分散性和球形，其尺寸分布范围为1.2～4.6nm，通过统计100个颗粒的平均粒径计算得其粒径为2.7nm。运用高分辨透射电子显微镜可以清楚地观察到CQDs的晶格条纹，其晶格间距为0.23nm，这归因于(100)石墨面，证实了类石墨碳的存在。

如图2所示，本发明的氮掺杂型荧光碳量子点在235nm和327nm左右各出现一个荧光激发峰，分别对应于sp

实施例2伏杀磷的比率型荧光传感器的构建

将200μL实施例1所制得的荧光碳量子点分别与伏杀磷标准品(100μg/mL)溶液4μL，8μL，10μL，12μL，20μL，30μL，40μL，60μL，100μL，140μL，200μL，300μL，400μL，600μL，700μL加入到一系列比色管中，用2:3的甲醇-水溶液(pH 11)定容至5mL，摇匀。将发射波长固定在400～440nm，通过LS55型荧光分光光度计扫描荧光激发光谱，并记录激发峰235nm(I

如图3所示，随着伏杀磷的不断加入，氮掺杂型荧光碳量子点能在1min内对它作出响应(可稳定1h以上)，具体表现为235nm处的荧光激发峰不断猝灭，伴随着激发波长从235nm到220nm的蓝移，而327nm处的激发峰几乎不变。因此，可将在235nm(I

如图4所示，激发信号的比值I

如图5所示，随着伏杀磷的不断加入，在254nm紫外灯下可以观察到碳量子点不断猝灭，说明本发明构建的比率型荧光传感器在伏杀磷的可视化检测中具有潜在的应用价值。

实施例3伏杀磷的比率型荧光传感器的选择性考察

选择性是评价传感器性能的一个重要指标。通过检测共存物质和其它农药的比率信号，研究了基于激发光谱的比率传感器的选择性。

在一系列5mL的比色管中，分别加入200μL实施例1所得氮掺杂型荧光碳量子点和4.00μg/mL的伏杀磷、乙草胺、甲草胺、甲基毒虫畏、哒螨灵、噻虫胺、二溴磷、内吸磷、六氯苯、辛硫磷、氯氰菊酯、NO

如图6所示，在4.00μg/mL伏杀磷存在时，荧光变化差值(I

实施例4湖水中伏杀磷含量的检测

湖水取自广西大学校园，并静置过夜，沉淀大型悬浮物，然后过0.22滤膜。取200μL实施例1所得的氮掺杂型荧光碳量子点和200μL上述湖水样品，用2:3的甲醇-水溶液定容至刻度，摇匀。将发射波长固定在420nm，通过LS55型荧光分光光度计扫描荧光激发光谱，并记录激发峰235nm左右(I

结果显示，在广西大学校园的湖水中未检测出伏杀磷，三个加标水平的回收率分别为90.64％，110.17％，104.78％，对应的RSD分别为5.33％，7.93％，4.02％。可见，本发明伏杀磷荧光比率传感器在湖水样品检测中具有良好的准确度和精确度。

实施例5河水中伏杀磷含量的检测

河水取自南宁市心圩江，并静置过夜，沉淀大型悬浮物，然后过0.22滤膜。参照实施例4检测。

结果显示，在南宁市心圩江的河水中未检测出伏杀磷，三个加标水平的回收率分别为98.51％，101.08％，95.73％，对应的RSD分别为5.07％，5.87％，7.22％。可见，本发明伏杀磷荧光比率传感器在河水样品检测中具有良好的准确度和精确度。

实施例6草莓中伏杀磷含量的检测

草莓样品从当地的市场获得，先进行均质处理，然后取0.5～2g样品于10mL的离心管中加入4mL甲醇-水溶液(2:3)，在摇床中水浴提取30min，离心，取上清液，过0.22μm滤膜，待测。参照实施例4检测。

结果显示，在草莓样品中未检测出伏杀磷，加标回收实验结果显示三个加标水平的回收率分别为112.74％，111.98％，98.22％，对应的RSD分别为5.30％，13.21％，9.10％。可见，本发明伏杀磷荧光比率传感器在草莓样品检测中具有良好的准确度和精确度。

此外，发明人还以纤维素、木糖为碳源，以NH