一种对联三苯类化合物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种对联三苯类化合物及其制备方法和应用；该化合物是以真菌发酵获得的对联三苯类化合物通过合环反应、脱甲基反应和氧化反应制得；本发明所公开的化合物同时具有较强的抗氧化及α‑葡萄糖苷酶抑制活性，可应用到治疗糖尿病的药物中。

说明书

技术领域

本发明属于药物领域，具体涉及一对联三苯类化合物及其制备方法以及应用。

背景技术

糖尿病是一种以高血糖为特征的慢性代谢性疾病，长期的高血糖会导致血管受损并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛等多种器官，严重影响患者的生活质量。据国际糖尿病联盟(IDF)2017年发布的第8版糖尿病地图显示，全球20-79岁成人2型糖尿病患者有4.25亿，平均每11个人中就有1位患该病，我国有1.144亿名糖尿病患者位居首位，糖尿病的预防和治疗是一项艰巨的任务。有研究表明氧化应激可能是引起糖尿病及其并发症的重要原因之一，机体活性氧簇产生过多时，会使胰岛β细胞成熟障碍和凋亡增加，导致胰岛素合成与分泌减少；糖尿病患者的高血糖和高血脂状态可促使活性氧化物产生增多，造成氧化应激现象，而氧化应激和高血糖二者相互促进，从而导致恶性循环。(Karunakaran U,ParkKG.Asystematic review of oxidative stress and safety of antioxidants indiabetes:Focus on islets and their defense.Diabetes Metab J,2013,37(2):106-112)。

α-葡萄糖苷酶抑制剂是通过抑制淀粉等多糖的降解，延迟小肠对葡萄糖的吸收起到降糖作用，这类药物既能有效降低餐后高血糖又不会引起低血糖症状，其对以碳水化合物为主要热量来源的中国患者具有较好的治疗效果，因此α-葡萄糖苷酶抑制剂被列为三种可以单药治疗2型糖尿病的药物之一(中国2型糖尿病防治指南2017年版)。糖尿病的病因较为复杂，多种诱因可导致糖尿病的产生，所以在糖尿病的治疗上多靶点的药物可能会比单靶点药物具有更好的效果，比如，同时具有α-葡萄糖苷酶抑制和降低氧化应急水平的药物，可能会在糖尿病发病初期产生降低血糖与保护胰岛细胞的双重作用，从而起到延缓糖尿病发病进程甚至使初期患者得到治愈。

申请人前期开展了天然来源的具有α-葡萄糖苷酶活性及抗氧化活性分子的筛选，发现对联三苯类化合物具有较强的生物活性。本发明以真菌可大量代谢产生的对联三苯类化合物为骨架，合成了微生物发酵产物中含量较低以及新的对联三苯类化合物，此类化合物同时具有较强的α-葡萄糖苷酶活性及抗氧化活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种对联三苯类化合物及其制备方法，以及该化合物用于制备预防或治疗糖尿病的药物中的应用。

本发明的目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：一种对联三苯类化合物，该类化合物以真菌发酵获得的对联三苯类化合物(Ⅰ)式为基础制得的(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)式：

其中，R为：-H或-OH；

该化合物制备步骤包括：分子内合环反应、脱甲基反应和氧化反应，具体为：

式(Ⅱ)化合物的制备方法为：将式(Ⅰ)化合物溶于甲醇，然后加入硅胶催化合环获得式(Ⅱ)化合物；式(Ⅲ)化合物的制备方法为：将式(Ⅰ)化合物溶于二氯甲烷，然后加入三溴化硼脱甲基获得式(Ⅲ)化合物；式(Ⅳ)化合物的制备方法为：将式(Ⅰ)化合物溶于二氯甲烷，然后加入三溴化硼脱甲基，再在甲醇溶液中加入硅胶氧化获得式(Ⅳ)化合物。

其中所述R选自-H、OH。

所述的对联三苯类化合物在制备预防或治疗糖尿病的药物中的应用。所述的化合物用作药物时，可以直接使用或者以药物组合物的形式使用，该药物组合物含有0.1–99％的所述化合物，其余为药用载体或赋形剂。

本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果。由以上技术方案可知，本发明化合物同时具有较强的α-葡萄糖苷酶活性及抗氧化活性；可被开发为高效的预防和治疗糖尿病的药物。

附图说明

图1是对联三苯类化合物的结构图示。

图2是化合物1-6的结构式

具体实施方式

实施例1化合物1：R＝H，式(Ⅱ)化合物的制备：

在25mL两口反应瓶中，加入化合物Ⅰa(30mg,0.085mmol)，用10mL甲醇溶解,室温下加入4克200-300硅胶，25℃反应24小时。反应液浓缩后采用硅胶柱色谱分离、二氯甲烷:乙酸乙酯＝5:1(v/v)洗脱得到化合物126mg,收率87％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.38(s,3H,OH),7.42(d,J＝8.6Hz,2H,ArH),7.38(s,1H,ArH),7.08(s,1H,ArH),6.86(d,J＝8.6Hz,2H,ArH),6.71(s,1H,ArH),3.98(s,3H,OMe),3.75(s,3H,OMe)；13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ156.7,149.4,149.4,148.5,145.9,142.6,136.0,130.6,130.4(2×C),128.7,115.1(2×C),114.1,113.7,107.1,105.6,98.5,60.6,55.9；ESIMSm/z351.0[M-H]-。

实施例2化合物2：R＝OH，式(Ⅱ)化合物的制备：

在25mL两口反应瓶中，加入化合物Ⅰb(30mg,0.081mmol)，用10mL甲醇溶解,室温下加入4克200-300硅胶，25℃反应24小时。反应液浓缩后采用硅胶柱色谱分离、二氯甲烷:乙酸乙酯＝3:1(v/v)洗脱得到化合物224mg,收率81％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.36(s,1H,OH),9.01(s,3H,OH),7.37(s,1H,ArH),7.08(s,1H,ArH),7.03(d,J＝2.1Hz,1H,ArH),6.87(dd,J＝8.1,2.1Hz,1H,ArH),6.82(d,J＝8.1Hz,1H,ArH),6.69(s,1H,ArH),3.97(s,3H,OMe),3.75(s,3H,OMe)；13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ149.4,149.3,148.5,145.9,144.9,144.8,142.6,136.0,130.9,129.2,120.4,116.8,115.5,114.0,113.7,107.1,105.6,98.5,60.6,55.9；ESIMSm/z367.1[M-H]-。

实施例3化合物3：R＝H，式(Ⅲ)化合物的制备：

氩气保护下，在25mL两口反应瓶中，加入化合物Ⅰa(30mg,0.085mmol)，用5mL二氯甲烷溶解，-20℃下加入0.76mL三溴化硼溶液(0.51mmol,17％保存于二氯甲烷中)，升至25℃反应24小时。0℃下加入20mL水终止反应,乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后浓缩，半制备HPLC分离、MeOH:H2O(含有0.15％三氟乙酸)＝3:7(v/v)洗脱得到化合物325mg，收率92％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.39(s,1H,OH),8.72(s,1H,OH),8.69(s,1H,OH),8.40(s,1H,OH),7.83(s,1H,OH),7.52(s,1H,OH),7.35(d,J＝8.5Hz,2H,ArH),6.79(d,J＝8.5Hz,2H,ArH),6.75(d,J＝2.0Hz,1H,ArH),6.71(d,J＝8.0Hz,1H,ArH),6.60(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H,ArH),6.26(s,1H,ArH)；13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ156.2,148.2,145.0,144.3,143.8,134.4,130.0(2×C),129.6,128.2,125.7,122.0,118.6,116.0,114.9(2×C),114.8,106.5；HR-ESIMSm/z325.0716[M-H]-(calcd for C18H13O6,325.0707)。

实施例4化合物4：R＝OH，式(Ⅲ)化合物的制备：

氩气保护下，在25mL两口反应瓶中，加入化合物Ⅰb(30mg,0.081mmol)，用5mL二氯甲烷溶解，-20℃下加入0.72mL三溴化硼溶液(0.48mmol,17％保存于二氯甲烷中)，升至25℃反应24小时。0℃下加入20mL水终止反应,乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后浓缩，半制备HPLC分离、MeOH:H2O(含有0.15％三氟乙酸)＝1:3(v/v)洗脱得到化合物425mg,收率90％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.88(s,1H,OH),8.84(s,1H,OH)8.72(s,1H,OH),8.69(s,1H,OH),8.38(s,1H,OH),7.80(s,1H,OH),7.50(s,1H,OH),6.97(d,J＝2.0Hz,1H,ArH),6.79(dd,J＝8.1,2.1Hz,1H,ArH),6.74-6.77(m,2H,ArH),6.71(d,J＝8.0Hz,1H,ArH),6.59(dd,J＝8.0,1.9Hz,1H,ArH),6.24(s,1H,ArH).13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ148.1,144.9,144.7,144.2,144.2,143.7,134.4,130.1,128.2,125.7,122.0,119.9,118.6,116.6,115.8,115.3,114.8,106.5；HR-ESIMSm/z343.0808[M+H]+(calcd for C18H15O7,343.0812)。

实施例5化合物5：R＝H，式(Ⅳ)化合物的制备：

氩气保护下，在250mL两口反应瓶中，加入化合物Ⅰa(500mg,1.4mmol)，用50mL二氯甲烷溶解，-20℃下加入12.7mL三溴化硼溶液(8.4mmol,17％保存于二氯甲烷中)，升至25℃反应24小时。0℃下加入40mL水终止反应,乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后浓缩。将反应物用30mL甲醇溶解，加入12克200-300目硅胶，25℃反应24小时，浓缩后硅胶柱层析、二氯甲烷:乙酸乙酯＝1:2(v/v)洗脱得到化合物5389mg,收率85％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.50(s,1H,OH),9.94(s,1H,OH),9.02(s,1H,OH),8.90(s,1H,OH),7.46(d,J＝8.5Hz,2H,ArH),6.85(d,J＝8.5Hz,2H,ArH),6.82-6.81(m,1H,ArH),6.74(d,J＝8.2Hz,1H,ArH),6.72(s,1H,ArH),6.66(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H,ArH)；13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ187.0,183.4,159.1,152.2,145.1,144.2,141.6,131.2,130.8(2×C),123.1,122.4,121.6,119.0,118.4,115.3(2×C),114.7.；HR-ESIMSm/z325.0704[M+H]+(calcd for C18H13O6,325.0707)。

实施例6化合物6：R＝OH，式(Ⅳ)化合物的制备：

氩气保护下，在50mL两口反应瓶中，加入化合物Ⅰb(100mg,0.27mmol)，用10mL二氯甲烷溶解，-20℃下加入2.4mL三溴化硼溶液(1.6mmol,17％保存于二氯甲烷中)，升至25℃反应24小时。0℃下加入20mL水终止反应,乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后浓缩。将反应物用15mL甲醇溶解，加入6克200-300目硅胶，25℃反应24小时，浓缩后硅胶柱层析、二氯甲烷:乙酸乙酯＝1:4(v/v)洗脱得到化合物658mg,收率63％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.47(s,1H,OH),9.44(s,1H,OH),9.17(s,1H,OH),9.01(s,1H,OH),8.89(s,1H,OH),7.04(d,J＝2.2Hz,1H,ArH),6.94(dd,J＝8.2,2.2Hz,1H,ArH),6.83-6.78(m,2H,ArH),6.73(d,J＝8.2Hz,1H,ArH),6.68-6.63(m,2H,ArH)；13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ186.9,183.3,152.2,147.5,145.1,145.0,144.2,141.6,131.2,123.5,122.4,121.6,120.9,118.9,118.4,116.6,115.5,114.7；HR-ESIMSm/z341.0649[M+H]+(calcd for C18H13O7,341.0656)。

为了进一步验证本发明合成的化合物的有益效果，通过对实施例1-6方案中合成的化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制和抗氧化性测试，具体实验如下：

被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1～6中合成的化合物1～6。准确称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供活性测试。

1、ORAC抗氧化实验方法

本实验主要用到的溶液有0.153mol/L的2,2’-偶氮二异丁基脒盐酸盐溶液(AAPH)，81.6nmol/L的荧光素溶液(FL)、5系列浓度阳性对照药Trolox(浓度50、25、12.5、6.25、3.125μmol/L)和待测样品，溶剂均用75mmol/LPH为7.4磷酸盐缓冲液溶解(PBS缓冲液)，试验方法为在96孔板中，实验设置阴性对照组、空白对照组、阳性对照组和待测样品组，每组3个平行样，各组先对应加入25μL的PBS缓冲液、Trolox和待测样品，然后每孔加入150μL的FL，将加样后的96孔板放入孵育器中37℃，孵育10min，取出，在阴性对照组中加入25μL的PBS缓冲液，其余组中均加入25μL的AAPH，立即放入多功能酶标仪中检测荧光，仪器设置激发波长为485nm，发射波长为530nm，每分钟检测1次，检测时间约为1h。相对荧光强度f等于时测荧光值与初始荧光值之比，以相对荧光强度采用近似积分法计算荧光衰退曲线下面积(AUC)。其公式为：AUC＝0.5+f1+...fi+...+f59+0.5*f60，其中fi表示时间i分钟时，测得的相对荧光强度。净面积netAUC为样品AUC与空白AUC的差值。以Trolox荧光测定的时间t对netAUC做回归方程，Y(netAUC)＝aX(μM)+b。最终的ORAC值使用Trolox浓度和净AUC之间的回归方程计算，并以每微摩尔样品的Trolox当量表示，单位为μMTE/μM。公式如下：

相对ORAC值＝[(AUC样品-AUC空白)/(AUCTrolox-AUC空白)]*(Trolox摩尔浓度μmol/L)/(样品摩尔浓度μmol/L)

2、酶水平的α-葡萄糖苷酶抑制活性测试

利用PNPG法对化合物的α-糖苷酶抑制活性进行评价。设置背景对照：20μL待测样品溶液+80μLPBS溶液(A0)，空白对照：20μL10％DMSO-PBS溶液+80μLPBS溶液(B0)，实验组：20μL待测样品溶液+60μLPBS溶液+20μL0.5U/mLα-糖苷酶溶液(A)，阴性对照20μL10％DMSO-PBS溶液+60μLPBS溶液+20μL0.5U/mLα-糖苷酶溶液(B)。每组设置3个平行，加样后37℃放置15分钟，之后加入2.5mmol/L的PNPG溶液20μL；37℃放置30分钟后，加入0.2mol/L的Na2CO3终止液80μL，于酶标仪405nm波长下测量OD值，阳性对照为阿卡波糖。

3、细胞水平的α-葡萄糖苷酶抑制活性测试

细胞系及细胞的继代培养：活性测试采用人Caco-2细胞，用含10％FBS的DMEM培养基，在37℃通入5％二氧化碳的培养箱中继代培养。

取对数生长期的Caco-2细胞接种于6孔板，接种密度为4000个/cm2，于37℃、含5％的CO2培养箱中培养。使用DMEM培养液(含10％胎牛血清，1％非必需氨基酸，1％青霉素/链霉素，1％的L-谷氨酰胺，0.25mg支原体抗生素plasmocin)培养细胞，隔天换液，培养至24天。Caco-2细胞弃去旧的培养液，用37℃预热的PBS缓冲溶液清洗细胞表面3次。对照孔加入0.5mL蔗糖/麦芽糖溶液(28mmol/L，PBS溶解)，空白孔加入1mLPBS，实验组加入含不同浓度不同化合物的蔗糖/麦芽糖溶液，37℃孵育60min，冰浴10min终止反应，根据葡萄糖测定试剂盒方法检测产物葡萄糖含量。

阿卡波糖为阳性对照组。

2、实验结果

实验结果如表1所示。

表1.对联三苯类化合物1～6的α-葡萄糖苷酶抑制和抗氧化性

“-”未测试

由表1可知，

(1)化合物1～6具有较强的抗氧化活性，其抗氧化能力分别是维生素E的2.1，2.0，3.7，2.6，3.9和2.8倍。

(2)化合物1～6在酶水平和细胞水平上均具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，尤其是测试的化合物1，2和5在细胞水平的活性较强。

3、实验结论

通过上述实验可知，本发明合成的对联三苯类化合物具有较强的α-葡萄糖苷酶活性及抗氧化活性；可被开发为高效的预防和治疗糖尿病的药物。

上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。