用于调节花柄脱落的番茄水通道蛋白SlTIP1;1

摘要

本发明涉及用于调节花柄脱落的番茄水通道蛋白SlTIP1;1，所述水通道蛋白SlTIP1;1的氨基酸序列为见SEQ ID NO：1；所述水通道蛋白SlTIP1;1过表达具有加速番茄花柄脱落的作用，所述水通道蛋白SlTIP1;1不表达或不完全表达具有延缓番茄花柄脱落的作用；所述番茄水通道蛋白SlTIP1;1通过敲除技术使其不表达；所述水通道蛋白SlTIP1;1通过脱落相关基因SlERF52调控表达，即通过遗传转化手段，将SlTIP1;1基因在番茄中过量或抑制表达，从而调节番茄花柄脱落，进而用于番茄品种的选育。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程和信号传递领域，尤其是涉及一种用于调节花柄脱落的番茄水通道蛋白SlTIP1；1。

背景技术

植物器官脱落发生在营养生长和生殖生长过程中，是由发育信号和环境刺激触发的，发生在被称为离区(AZs)的特殊区域。植物激素生长素的极性运输从远端器官到AZ，阻止了离区对乙烯的敏感性。随着AZ中生长素信号的减少，AZ 细胞对乙烯变得敏感，触发并加速脱落。在番茄花柄中，1-氨基环丙基丙烯酸-1- 羧酸酯合成酶1A(ACS1A)、ACS2和ACS6与ACC氧化酶1(ACO1)和ACO5在脱落过程中表达上调。乙烯被其受体感知，并通过乙烯反应因子52(ERF52)传递信号，以加速脱离。虽然很多研究都支持生长素和乙烯在介导脱落过程中发挥核心作用，但对从生长素敏感期到乙烯敏感期的相关因素知之甚少。活性氧(ROS)可能介导植物生长素在多个水平上的反应。首先，氧化应激诱导的过氧化物酶的上调可能影响生长素的稳态。其次，H

水通道蛋白(AQPs)与自身或其他AQP单体发生物理作用，组装成同源和异源四聚体。在所有活细胞中，这些细胞充当水、尿素、甘油、H

H

发明内容

为了弥补上述现有技术的不足，本发明的目的是提出一种用于调节花柄脱落的番茄水通道蛋白SlTIP1；1，通过遗传转化手段，将SlTIP1；1基因在番茄中过量或抑制表达，从而调节番茄花柄脱落，进而用于番茄品种的选育。

本发明提出一种用于调节花柄脱落的番茄水通道蛋白SlTIP1；1，其技术要点是：所述水通道蛋白SlTIP1；1的氨基酸序列为见SEQ ID NO：1；所述水通道蛋白SlTIP1；1过表达具有加速番茄花柄脱落的作用，所述水通道蛋白SlTIP1；1不表达或不完全表达具有延缓番茄花柄脱落的作用。

本发明还提出所述水通道蛋白SlTIP1；1过表达的方法，其技术要点是：包括以下步骤：

(1)扩增SlTIP1；1CDS编码序列：所述SlTIP1；1CDS核苷酸序列见SEQ ID NO：2；提取番茄幼苗总RNA，利用高保真酶KOD-plus-Neo从叶片的cDNA模板中扩增SlTIP1；1CDS序列；所述扩增引物核苷酸序列见SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；

(2)使用BP clonase克隆全长SlTIP1；1到pENTR/D-TOPO载体，再用LR clonase克隆到二进制载体pB7YWG2；对入门载体pENTRTM

本发明还提出所述番茄水通道蛋白SlTIP1；1通过敲除技术使其不表达方法，其技术要点是：包括以下步骤：

构建番茄SlTIP1；1敲除载体：SlTIP1；1的原CDS序列(SEQ ID NO：2)结合正向引物CR-SlTIP1；1sgRNA1和反向引物CR-SlTIP1；1sgRNA2；

所述CR-SlTIP1；1sgRNA1的核苷酸序列为SEQ ID NO：6；

所述CR-SlTIP1；1sgRNA2的核苷酸序列为SEQ ID NO：7；

PCR后，通过EcoRV酶切位点(GATATC)插入pCas9/sgRNA载体；通过 DNA重组技术构建CRsltip1；1载体；将CRsltip1；1载体导入农杆菌LB4404，对番茄进行转化，获得敲除植株。

本发明还提出所述水通道蛋白SlTIP1；1通过脱落相关基因SlERF52调控表达的方法，其技术要点是：所述脱落相关基因SlERF52通过与SlTIP1；1启动子结合以调控其调控表达，具体方法如下：

脱落相关基因SlERF52的核苷酸序列见SEQ ID NO：3；

将SlERF52全长序列连接到pGADT7载体中生成AD-SlERF52；并将 SlTIP1；1启动子片段连接到pAbAi载体中，生成诱饵载体；通过酵母转化方法将 SlERF52和SlTIP1；1启动子连接；

所述将SlERF52全长序列连接到pGADT7载体中引物见SEQ ID NO：8和 SEQ ID NO：9；

所述将SlTIP1；1启动子片段连接到pAbAi载体中引物见SEQ ID NO：10和 SEQ IDNO：11。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)明确了SlTIP1；1蛋白基因在番茄中过量或抑制表达与花柄脱落相关，即SlTIP1；1是H

(2)明确了水通道蛋白SlTIP1；1不表达或降低表达的方法，为延缓番茄花柄脱落提供理论依据，有助于高产量番茄品种选育。

附图说明

图1为乙烯和AQPs是渗透胁迫诱导的脱落所必需的。其中，(A)为不同渗透胁迫(双蒸馏水、1/4AXS、1/2AXS和AXS溶液)对花梗脱落的影响；(B)和(C) 为不同浓度(0.02μM和0.03μM)水通道蛋白(AQP)抑制剂HgCl2和不同浓度(5mM 和10mM)韧皮素对花柄脱落的影响；(D)为1-MCP预处理对渗透胁迫诱导脱落的影响。方差分析利用±SDs表示，三次生物学统计，每次重复50个样本。不同小写字母表示有显著差异，用T检验P<0.05。

图2脱落期间花梗脱落区(AZ)的水通道蛋白(AQP)积累。质谱分析确定了在0、16和32h的25-32kD AZ蛋白成分中番茄AQP同源物的绝对值。方差利用±SDs表示三次生物学统计。

图3为SlTIP1；1脱落相关表达的qRT-PCR、原位杂交和Western blot分析。 (A)为定量RT-PCR分析SlTIP1；1在脱落过程中的表达。以NAZ和1-mcp处理 AZs为非脱落对照，进一步分析了这些SlTIP1；1在蒂梗脱落过程中的表达模式； (B)为SlTIP1；1在脱落过程中的原位杂交，显示SlTIP1；1优先表达于脱落区。使用SlTIP1；1传感探头作为阴性对照，标尺＝1毫米；(C)和(D)为对不同脱落期离区样本的SlTIP1；1进行了Western blot分析和定量分析。方差分析利用±SDs表示，三次生物学统计。

图4为拟南芥叶肉原生质体和番茄花柄离区细胞中SlTIP1；1的亚细胞定位。 (A)为GFP信号与FM4-64共定位，标记了植物的质膜和液泡膜；(B)为用抗sltip1；1 抗血清检测其在AZ细胞中的亚细胞位置。N，核；CH，叶绿体；V，液泡；LV，溶泡；CW，细胞壁。标尺＝10英尺。

图5为野生型，35S:SlTIP1；1和CR-sltip1；1花柄脱落试验。(A)、(B)、(C) 和(D)分别为水中对照、活性氧清除剂DPI、0.5mMH2O2和20μl·L

图6为SlTIP1；1在脱落过程中对细胞质中H

图7为SlTIP1；1介导H

图8为野生型AZ原生质体在0或3mM H

图9为野生型和CR-sltip1；1在正常、H

图10为SlTIP1；1在脱落过程中乙烯的产生的影响。(A)为在去花后0h和16 h的野生型(WT)、35S:SlTIP1；1和CRsltip1；1离区细胞的乙烯产量；(B)为ROS 清除剂DPI对野生型(WT)，35S:SlTIP1；1，CRsltip1；1乙烯产生的影响；(C)为 H

图11为SlERF52正调控SlTIP1；1转录。(A)为SlTIP1；1在TRV-SlERF52中的表达；(B)为酵母单杂交(Y1H)实验显示SlERF52直接结合含有DRE元素的 SlTIP1；1启动子片段。以酵母菌株中共转化的AD-Rec-p53和p53-启动子片段作为阳性对照。空载体和SlTIP1；1启动子片段作为阴性对照。(C)为电泳迁移迁移实验(EMSA)结果，显示SlERF52与SlTIP1；1启动子的乙烯反应元件结合。纯化his标记的SlERF52，用于分析。探针为生物素标记的水通道蛋白(AQP)启动子片段，内含乙烯反应元件。显示了SlTIP1；1的探测序列，红色的字母表示DRE。探针中的突变碱基用红色字母表示。wt，完整DRE元件；mt，突变DRE元件探针。未标记的探针以1000倍的倍数加入作为竞争蛋白，带和自由探针用带注释的箭头标注。(D)β-葡萄糖苷酶(GUS)活性分析。含有SlTIP1；1启动子或突变体的报告子载体与SlERF52效应子载体一起在烟草叶中共表达，并检查了GUS 活性。进行了三个独立的实验。*表示通过使用学生t检验计算出的多重比较中的显着差异(**P<0.01)。

图12为野生型和CR-sltip1；1系在正常、H

具体实施方式

实施例1:番茄水通道蛋白SlTIP1；1的调节花柄脱落作用研究

1.水通道蛋白SlTIP1；1的氨基酸序列为(SEQ ID NO：1) MetProIleAsnGlnIleThrIleGlySerHisGluGluLeuArgHisProGlyAlaLeuLysAlaAlaLeu AlaGluPheIleSerThrLeuIlePheValPheAlaGlyGlnGlySerGlyMetAlaPheAsnLysLeuThr AspGlyValAlaThrProAlaGlyLeuIleSerAlaSerIleAlaHisAlaPheGlyLeuPheValAlaValS erValGlyAlaAsnIleSerGlyGlyHisValAsnProAlaValThrPheGlyAlaPheValGlyGlyAsnIl eThrLeuPheArgGlyIleLeuTyrIleIleAlaGlnLeuLeuGlySerThrAlaAlaCysAlaLeuLeuGl uPheAlaThrGlyGlyMetSerThrGlySerPheAlaLeuSerAlaGlyValSerValTrpAsnAlaPheV alPheGluIleValMetThrPheGlyLeuValTyrThrValTyrAlaThrAlaValAspProLysLysGlyA spLeuGlyValIleAlaProIleAlaIleGlyPheIleValGlyAlaAsnIleLeuAlaGlyGlyAlaPheThr GlyAlaSerMetAsnProAlaValSerPheGlyProSerLeuValSerTrpThrTrpThrHisGlnTrpVal TyrTrpAlaGlyProLeuIleGlyGlyGlyLeuAlaGlyPheIleTyrGluPheIlePheIleSerHisThrHi sGluGlnIleProSerGlyAspPhe

所述水通道蛋白SlTIP1；1过表达具有加速番茄花柄脱落的作用，所述水通道蛋白SlTIP1；1不表达或不完全表达具有延缓番茄花柄脱落的作用。

2.水通道蛋白SlTIP1；1过表达的方法，包括以下步骤：

过量表达载体构建

①SlTIP1；1CDS编码序列的扩增

所述SlTIP1；1CDS核苷酸序列(SEQ ID NO：2)如下：

aatgccgatcaaccaaattactattggaagccatgaggaactccgccatcccggggcgct taaagcggccttggcggagttcatcagtaccctgatcttcgtattcgcaggtcagggttc tggtatggctttcaataagcttaccgatggcgtcgctactcccgctggccttatttccgc ctccatagcacacgccttcgggttgttcgtcgccgtctccgtcggtgctaacatctccgg cggccacgtcaaccctgctgttaccttcggtgcttttgttggtggaaacatcactttgtt ccgtggaattttgtacatcattgcacagttgcttggatccactgctgcttgcgctctcct tgaattcgccaccggtggcatgagcacgggatcatttgcattgtcagccggtgtatcagt atggaacgcgttcgtattcgagattgtgatgactttcggtctcgtttacactgtttacgc aaccgcagttgacccaaagaagggagatttgggtgtgattgcaccaattgcaattggttt cattgttggtgccaacattcttgctggtggtgcctttactggagcttcaatgaacccagc tgtgtcatttggcccatctttggttagctggacctggactcaccaatgggtttactgggc tggaccacttattggtggtgggcttgctggattcatctatgaattcatcttcattagcca cactcatgagcaaatcccaagtggagatttttaa

②利用Trizol试剂从番茄‘Micro-Tom’(番茄‘Micro-Tom’市场购买)4片真叶的幼苗中提取总RNA；再利用高保真酶KOD-plus-Neo(TOYOBO公司) 从叶片的cDNA模板中扩增SlTIP1；1基因序列(方法见说明书KOD-plus-Neo使用说明书)；

由于需要表达pB7YWG2.0-YFP载体的绿色荧光蛋白，SlTIP1；1的CDS片段在扩增时需要将终止密码子替换掉，利用TOPO异构酶连接入门载体 pENTR

SlTIP1；1FW cacctcgttaaaaatgccgatcaacca(SEQ ID NO：4)；

SlTIP1；1RVtctccacttgggatttgctca(SEQ ID NO：5)。

③PCR扩增程序参照KOD-plus-Neo(TOYOBO公司)说明书；使用BP clonase(Invitrogen)克隆全长SlTIP1；1到pENTR/D-TOPO载体(Invitrogen)，利用LR ClonaseTMEnzyme Mix试剂盒，参考说明书再用LR clonase(Invitrogen)克隆到二进制载体pB7YWG2；对入门载体pENTRTM

3.所述番茄水通道蛋白SlTIP1；1通过敲除技术使其不表达方法

(1)番茄SlTIP1；1敲除载体的构建

从SlTIP1；1的原CDS序列(SEQ ID NO：2)中选取两个19-bp的片段(153-171 和374-392bp)作为SlTIP1；1基因组编辑的靶序列，以pHSE401载体(爱迪基因公司)为模板，结合含有gRNA的正向引物和反向引物分别为 CR-SlTIP1；1sgRNA1和CR-SlTIP1；1sgRNA2，

所述CR-SlTIP1；1sgRNA1的核苷酸序列为：

atatatggtctcgtttggaggaactccgccatcccggttttagagctagaaatagc(SEQ ID NO：6)；

所述CR-SlTIP1；1sgRNA2的核苷酸序列为：

attattggtctcgaaacgagcaccgaaggtaacagcccaaactacactgttagattc(SEQ ID NO：7)；

两个sgRNA(向导RNA)经PCR90°40min，70°10min，55°10min，40°10min， 25°10min退火后，通过EcoRV酶切位点(GATATC)插入pCas9/sgRNA载体(百格公司)；通过DNA重组技术构建CRsltip1；1载体；将CRsltip1；1载体导入农杆菌LB4404(参考Wang etal文献)，对番茄(S.lycopersicum)cv Ailsa Craig(AC) 进行转化(转化方法参考Wang etal.(2018))；通过PCR和DNA测序鉴定其过表达和突变，筛选并鉴定了敲除植株。

4.脱落相关基因SlERF52调控表达水通道蛋白SlTIP1；1

所述水通道蛋白SlTIP1；1通过脱落相关基因SlERF52调控表达，脱落相关基因SlERF52的核苷酸序列见SEQ ID NO：3：

ggtgaaagccaaaagagtcgcttacaaaagcccctgaaaacctttaaccttcttcccctgcatctcttatgctaatcacttcc cttgcttttataacctctaaatttccccatgtctcgaccacaacaaaaatatcgaggtgttcgccagcgccattggggatcttg ggtttccgaaattcgtcatccttcattgaaaacacggatatggctgggaacctatgagacatcagaggatgctgcgagggc atatgatgaagcagcgagactcatgtgtggttcaacagcacgcactaatttcccatacaatgcaacagaatcttcaaggttt ctgtcttctgctttgatagctaaacttcaaagatgcaacatgtcatctctcactgctacgtcaagaagacctggaaagacaag attggaagataaaaaagagaacgagatatccacgcttgttagagacacgggagatggagaagaaaggcagagtgaga gtgcatcacaacaatacatgaaggcacttgaagatgaacatatagaacagatgattgaggaattgcttgattatggatctatt gagatgtgttctgttcgcaatgaataagacataaatgcaataattagcttcaaaaaaaaaa

所述脱落相关基因SlERF52通过与SlTIP1；1启动子结合以调控其调控表达，具体方法如下：

将SlERF52全长序列连接到pGADT7载体(TAKARA公司)中生成 AD-SlERF52；步骤如下：摇菌16h(pGADT7载体)；提质粒(TAKARA公司)；设计的SlERF52引物PCR：KOD酶(TAKARA公司)0.5μL，Buffer2.5μL， dNTP2.5μL，Mg

SlERF52-pRi101-Kpnl FWggtaccgtcatccttcattgaaaacacgg(SEQ ID NO：8)；

SlERF52-pRi101-Kpnl RV ggatccttattcattgcgaacagaacaca(SEQ ID NO：9)；

酶切(提出的质粒)37℃(金属浴)；Buffer(10X)5μL，EcoRⅠ(酶Ⅰ) (TAKARA公司)1μL，PsT(酶Ⅱ)(TAKARA公司)1μL，质粒1μg，H

将SlTIP1；1启动子片段(-2500-0bp)连接到pAbAi载体(TAKARA公司) 中，生成诱饵载体，方法包括：摇菌16h(pAbAi载体)；提质粒(TAKARA 公司)；设计的SlTIP1；1启动子片段PCR：KOD酶(TAKARA公司)0.5μL， Buffer2.5μL，dNTP2.5μL，Mg

SlTIP1；1-pPR3-N FWccatcgatatgccgatcaaccaaatta(SEQ ID NO：10)；

SlTIP1；1-pPR3-N RV gcgtcgacttaaaaatctccacttggg(SEQ ID NO：11)；

酶切(提出的质粒)37℃(金属浴)；Buffer(10X)5μL，EcoRⅠ(酶Ⅰ) (TAKARA公司)1μL，PsT(酶Ⅱ)(TAKARA公司)1μL，质粒1μg，H

酵母单杂检测使用金酵母单杂交文库筛选系统试剂盒(Clontech,USA)根据说明书进行；SlERF52会与SlTIP1；1启动子结合，具体方法如下：

进行酵母转化(材料均购于TAKARA公司)：

(1)酵母转化所需溶液

X TE/LiAc溶液

先配置母液：10X TE buffer和1M LiAc(10X)，转化前再配置工作液，现配现用。混合1.1mL 10X TE buffer和1.1mL 1M LiAc(10X)，再加入8.8mL 灭过菌的超纯水，定容至10mL，混合均匀；

PEG/LiAc溶液(聚乙二醇3350/醋酸锂溶液)先配置母液：50％PEG 3350、 10X TEBuffer和1M LiAc(10X)，转化前再配置工作液，现配现用；

表1 X TE/LiAc溶液配制表

0.9％(w/v)NaCl溶液：称取0.9g NaCl，溶解于80mL超纯水中，用容量瓶定容至100mL，过滤灭菌。

表2主要试剂明细

(2)实验步骤

①诱饵载体菌株构建

使用BstBI或BbsI限制性内切酶将2μg pBait+AbAi重组质粒线性化，按以下酶切体系：

表3酶切体系

将1μg线性化pBait+AbAi质粒整合到Y1HGold菌株中，涂布SD/-Ura平板，培养3-5天；

挑选4-5个SD/-Ura板上的单克隆，用

②筛选条件选择

从SD/-Ura平板上挑取Y1HGold(pBait-AbAi)单菌落(即上述诱饵载体菌株构建中鉴定条带正确的克隆)，用0.9％NaCl重悬，使得OD600＝0.002；

涂布100μL重悬菌液于以下培养基：SD/-Ura；SD/-Ura with AbA(100ng/ml)；SD/-Ura with AbA(150ng/ml)SD/-Ura with AbA(200ng/ml)；据生长情况，选择最终筛选浓度用于后续实验(AbA浓度最高可调整到1000ng/mL)。

③酵母转化方法

酵母感受态细胞的制备和转化酵母感受态细胞：

挑酵母菌株(Y1HGold)在YPDA固体培养基上划板，30℃倒置培养，待菌生长至适宜大小(约3天)。至克隆大小直径2–3mm；

挑单菌落接种于有3ml YPDA液体培养基的三角瓶(规格：15mL)中。在30℃摇床中，以250rpm摇8–12小时。(温馨提示：同时挑4个单菌落，接种到4个三角瓶中，最后挑生长速度最快的菌落继续实验)；

转大瓶：吸取5uL菌液转入有50mL YPDA液体培养基的三角瓶(规格： 250mL)中。在30℃摇床中，以250rpm继续摇16–20小时，期间测OD，待 OD600达到0.15–0.3时停止摇菌；

室温下，700g离心5min收集菌体，弃上清，用滤纸吸干残余液体，加入 100mL YPDA液体重悬菌体；在30℃摇床中，以250rpm继续摇3–5小时至 OD600达到0.4–0.5；室温下，700g离心5min收集菌体，弃上清，用60mL无菌去离子水重悬酵母；室温下700g离心5min收集菌体。弃上清，用滤纸吸干残余液体，2个离心管中各加入1.5mL 1.1xTE/LiAc重悬菌体，同时将Carrier DNA预变性两次；

高速离心15s，收集菌体，加入600μL 1.1x TE/LiAc重悬菌体；(酵母感受态细胞已制备好)；加入10μg酵母文库质粒，50μL预变性Carrier DNA，轻轻混匀；加入2.5mL 1x PEG/LiAc，混匀；30℃水浴45min，每15min摇匀一次；加入160μL DMSO，轻轻混匀；42℃水浴热激20min，每10min上下颠倒混匀一次；700g离心5min，收集菌体；加入3ml YPD Plus，30℃振荡培养90min； 700g离心5min，收集菌体；加入0.9NaCl悬浮菌体，至终体积6ml左右，取 100μl1/10、1/100稀释液涂布100mm SD/-Leu平板，用于计算转化效率(如果是用10倍稀释液或100倍稀释液涂板，还要乘以相应的倍数)。

④阳性克隆酵母质粒抽提

挑取PCR鉴定阳性的克隆，接种于2mL液体培养基SD/-Leu中，在30℃摇床振荡培养2天，用酵母质粒小抽试剂盒抽提酵母质粒；

取1-5mL酵母培养物，12000rpm离心1min，尽量吸除上清；

向菌体中加入300μL山梨醇buffer，加入50U Lyticase，充分混匀，并在30℃摇床200rpm振荡处理1h，4000rpm离心10min，弃去上清，收集沉淀，加入 250μL溶液YP1；

向管中加入250μL溶液YP2,温和的上下翻转6-8次使菌体充分混匀，室温放置5-10min(注意：温柔混匀，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA；此时菌液应变的清亮粘稠)；

向管中加入350μL溶液YP3,立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀；12000rpm离心20min；YP3加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀；如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清；

小心的将上清加入到吸附柱CP2中，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱放回到收集管中；

向吸附柱中加入500μL缓冲液PD,12000rpm离心1min；

向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉废液，将

吸附柱放回到收集管中；重复上述步骤；

将吸附柱放入到收集管中，12000rpm空离2min，目的是去除吸附柱中残余的漂洗液；

将吸附柱CP2置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100 μL的缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中；得到的质粒预备扩增。

⑤酵母质粒的扩增

取5μL酵母质粒化学转至DH5α感受态细胞中；涂布到含氨苄青霉素的LB 板；37℃培养箱倒置培养过夜，约16h；转化得到的菌落筛选板(Ampr抗性)；挑取单菌落接到含氨苄青霉素的LB培养基；在37℃摇床260rpm振荡培养；培养20h后抽提质粒。

⑥Prey质粒与Bait质粒一对一互作验证

将Y1HGold(pBait-AbAi)菌株在SD/-Ura固体培养基上划线，30℃倒置培养2-3天；挑取直径2-3mm的单克隆于有3ml YPDA培养液中，在30℃摇床中，以 250rpm摇8小时；吸取2-5uL至50mL YPDA液体培养基的三角瓶(规格： 250mL)中。在30℃摇床中，以250rpm继续摇16–20小时，期间测OD，待 OD600达到0.15–0.3时停止摇菌；室温下，700g离心5min收集菌体，弃上清，用滤纸吸干残余液体，加入100mL YPDA液体重悬菌体；在30℃摇床中，以250rpm继续摇3–5小时至OD600达到0.4–0.5；室温下，700g离心5min 收集菌体，弃上清，用60mL无菌去离子水重悬酵母；室温下700g离心5min 收集菌体；弃上清，用滤纸吸干残余液体，2个离心管中各加入1.5mL 1.1xTE/LiAc重悬菌体，同时将Carrier DNA预变性两次；高速离心15s，收集菌体，加入600μL 1.1x TE/LiAc溶液吹打混匀，备用；取酵母重悬液50μL,在菌液中加入10μL预变性的Carrier DNA和200ng Prey质粒；加入300μL 1x PEG/LiAc，混匀；30℃水浴30min，每10min摇匀一次；每管中加入20μL DMSO, 轻轻混匀；42℃水浴热激15min，每5min上下颠倒混匀一次；高速离心15s，弃上清，加入1ml YPD Plus重悬菌体，在30℃摇床250rpm振荡复苏1h；高速离心15s，弃上清；100μl 0.9NaCl重悬菌体，涂布于SD/-Leu/AbA*平板上；30℃培养箱培养3-5天，有阳性克隆长出。

实施例2

本发明从离区中纯化了这种大小的蛋白质，基于SDS-PAGE，并进行了质谱分析。从所有部分的分析得到的质谱与番茄AQP数据库中的序列进行比较，并根据基于强度的绝对定量(iBAQ)方法鉴定肽。光谱计数和统计分析的质谱结果表明，总共八个AQP蛋白质被确定在0，16和32h。其中SlTIP1；1在AZ中积累最高，并且在脱落过程中具有AZ特异性表达模式。本发明将SlTIP1；1在番茄中敲除和过量表达，通过表型观察和一系列实验发现，敲除SlTIP1；1可延缓脱落，同时过表达植株与野生型相比脱落速率加快；此外还发现与脱落相关的SlERF52 转录可直接与SlTIP1；1启动子结合，调控其表达以响应脱落。

(1)AQPs在番茄花梗脱落中的作用

从新开的番茄花中获得花梗外植体，在双蒸馏水中培养作为对照，或在人工木质部液中培养(AXS；1mM KH2PO4，1mM K2HPO4，1mM CaCl2，0.1mM MgSO4，3mM KNO3和0.1mMMnSO4用1M HCl或KOH缓冲233至pH 5.8)。在1-mcp处理中，植物在25℃、100L的密封室中暴露于1-mcp(0.5μL·L

(2)SlTIP1；1在番茄花柄离区中的表达

以番茄品种“中蔬六号”(种子市场购买)的离区的cDNA为模板，检测SlTIP1；1在番茄离体花柄离区不同时间的时空表达，如图2离区中SlTIP1；1的表达量最高；对不同脱落期AZ标本进行了Western blot分析。本研究观察到 SlTIP1；1蛋白浓度在脱落过程中显著升高，在16h达到峰值，在24h下降，SlTIP1；1 的增加具有高度的离区特异性，可被1-mcp处理所抑制(图3)。

(3)SlTIP1；1基因的启动子分析

使用SlTIP1；1的启动子序列(起始ATG上游4,04bp)生成报告基因构建。利用快速定点突变试剂盒(Transgen Biotech，中国)将突变引入SlTIP1；1启动子的 DRE元件中。对于效应子的构建，使用限制性内切酶NcoI和BamHI将SlERF52 全长序列导入pRI101载体。Liaoet al.(2016)研究了报告基因和效应基因在烟叶中的侵染和GUS标记。

为了检测SlTIP1；1蛋白潜在的齐聚反应，本研究使用上述特异性抗体对提取的AZ膜进行了非还原SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot分析。结果显示，该免疫反应蛋白的分子量与四聚体单体(>100kDa)相对应，并经LC-MS/MS验证。值得注意的是，强信号只在AZ中检测到，而在NAZ中没有检测到(图4)。

(4)番茄SlTIP1；1过量和干涉表达番茄植株的获得

a.SlTIP1；1过量表达番茄植株的获得

过量表达载体构建：SlTIP1；1CDS序列的扩增：利用Trizol试剂从番茄‘Micro-Tom’4片真叶的幼苗中提取总RNA,再利用高保真酶KOD-plus-Neo从叶片的cDNA模板中扩增SlTIP1；1基因序列，由于需要表达pB7YWG2.0-YFP载体的绿色荧光蛋白，SlTIP1；1的CDS片段在扩增时需要将终止密码子替换掉，利用TOPO异构酶连接入门载体时扩增目标片段的上游引物5’端应加‘C ACC’四个碱基。扩增SlTIP1；1上游引物:

SlTIP1；1FW CACCTCGTTAAAAATGCCGATCAACCA

SlTIP1；1RV TCTCCACTTGGGATTTGCTCA

PCR扩增程序参照KOD-plus-Neo说明书。使用BP clonase(Invitrogen)克隆全长SlTIP1；1到pENTR/D-TOPO载体(Invitrogen)，利用LR ClonaseTM Enzyme Mix 试剂盒，参考说明书再用LR clonase(Invitrogen)克隆到二进制载体pB7YWG2。

b.番茄SlTIP1；1amiRNA干涉载体的构建

从SlTIP1；1CDS中选取两个19-bp的片段(153-171和374-392bp)作为SlTIP11 基因组编辑的靶序列。以pHSE401载体为模板，结合含有gRNA的正向引物和反向引物，

CR-SlTIP1；1sgRNA1 atatatggtctcgtttggaggaactccgccatcccggttttagagctagaaatagc

CR-SlTIP1；1sgRNA2attattggtctcgaaacgagcaccgaaggtaacagcccaaactacactgttagattc 采用PCR方法获得靶导RNA(gRNA)序列。将U6-26-SlTIP1；1-gRNA片段克隆到CRISPR/Cas9二进制载体pCBC-DT1T2_tomatoU6中，分别生成 pCBC-DT1T2_tomatoU6-sltip1；1。根据Wang etal.(2018)的研究，将质粒导入A. tumefaciens菌株LB4404，对番茄(S.lycopersicum)cv Ailsa Craig(AC)进行转化。通过PCR和DNA测序鉴定其过表达和突变。筛选并鉴定了携带突变体的无cas9 T2植株。

(5)SlTIP1；1基因对番茄花柄脱落的调控

创建了SlTIP1；1过表达株系，利用CRISPR/Cas9技术获得了SlTIP1；1敲除株系(KO)。35S:SlTIP1；1在24h显著加速脱落达到100％，CR-sltip1；1KO植株在 32h显著降低脱落46％(图5A)。使用ROS清除剂DPI可以显著抑制野生型，35S: SlTIP1；1和CR-SlTIP1；1系脱落，24h前野生型35S:SlTIP1；1和CR-SlTIP1；1 无显著性差异(图5B)。进一步测定了不同转基因株系对H

(6)SlTIP1；1对番茄花柄离区的H

在AZH2O2检测中，切除不同阶段的不同AZs，立即在50mM pH 7.4磷酸盐缓冲液中孵育10分钟，以去除伤口诱导的ROS。然后将样品在Amplex Red(AR) 或Amplex Ultra Red(AUR)溶液中孵育0.5h，在585-610nm的条件下，使用Leica SP8共聚焦显微镜，525nm激发，测量AR和AUR阳性信号。利用Image J软件对体细胞和细胞质信号进行定量分析。AZ原生质体ROS信号的研究遵循先前报道的协议(Wang et al.，2009)。首先将AZ原生质体置于H2DCFDA溶液中孵育30分钟，然后用H

(7)SlTIP1；1在脱落过程中连接生长素和乙烯信号

敲除sltip1；1系明显延迟了乙烯诱导的脱落。由于前人研究表明，乙烯诱导的离断需要生长素信号的下调，本研究还通过分析野生型和CR-sltip1；1系在正常、H

(8)SlERF52与SlTIP1；1启动子结合

在去花后SlTIP1；1表达增加，并在16h达到高峰，这与AZ细胞对乙烯信号的敏感性增加一致。此外，1-MCP处理完全抑制了这种表达的增加，表明它受到乙烯的调控。在脱落过程中，表达最高的乙烯应答因子是SlERF52，已知其在花梗 AZ转录调控中发挥关键作用。有报道称，下调SlERF52可导致细胞扩张抑制和延迟脱落，但其下游的直接靶基因尚不清楚(Nakano et al.，2014)。pTRVSlERF52 也显著抑制了这三种SlTIP1；1的表达(图11)。接下来，本研究通过酵母杂交(Y1H) 试验研究了SlERF52与SlTIP1；1启动子的结合。进一步分析不同启动子片段发现，SlERF52结合含有DRE基序的片段(SlTIP1；1:-296～-292bp，从TG开始)。为了确认相互作用，本研究对SlERF52蛋白和标记了含有DRE motif的SlTIP1；1 启动子的生物素片段进行了电泳迁移率转移分析(EMSA)。当使用突变DRE元素的未标记探针作为竞争对手时，SlERF52与SlTIP1；1启动子片段的结合没有改变，说明SlERF52确实与SlTIP1；1启动子结合。本研究进一步通过SlERF52检测了烟叶中SlTIP1；1启动子的调控。We共转化35S:SlERF52和ProSlTIP1；SlERF52 显著提高了SlTIP1；1启动子的活性，而突变体SlTIP1；1启动子的活性没有变化。这些结果表明，乙烯诱导SlERF52激活SlTIP1；1的表达，SlTIP1；1在乙烯信号的下游起作用，加速脱落。

综上，通过遗传转化手段将番茄基因组中的SlTIP1；1基因进行过量表达，番茄花柄脱落加速；将番茄基因组中的SlTIP1；1基因进行抑制表达，番茄花柄脱落延缓。进一步测定了不同转基因株系对H

参考文献

1.Wang Y,Zou W,Xiao Y,Cheng L,Liu Y,Gao S,Shi Z,Jiang Y,Qi M,XuTJJoeb(2018)

MicroRNA1917 targets CTR4 splice variants to regulate ethyleneresponses in tomato. 69:1011-1025；

2.Liao W,Wang G,Li Y,Wang B,Zhang P,Peng M(2016)Reactive oxygenspecies regulate leaf pulvinus abscission zone cell separation in response towater-deficit stress in cassava.entific Reports 6:21542；

3.Wang Y,Liu R,Chen L,Wang Y,Liang Y,Wu X,Li B,Wu J,Liang Y,WangXJJocs (2009)Nicotiana tabacum TTG1 contributes to ParA1-induced signallingand cell death in leaf trichomes.122:2673-2685。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> 用于调节花柄脱落的番茄水通道蛋白SlTIP1;1

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 250

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 1

Met Pro Ile Ala Gly Ile Thr Ile Gly Ser His Gly Gly Leu Ala His

1 5 10 15

Pro Gly Ala Leu Leu Ala Ala Leu Ala Gly Pro Ile Ser Thr Leu Ile

20 25 30

Pro Val Pro Ala Gly Gly Gly Ser Gly Met Ala Pro Ala Leu Leu Thr

35 40 45

Ala Gly Val Ala Thr Pro Ala Gly Leu Ile Ser Ala Ser Ile Ala His

50 55 60

Ala Pro Gly Leu Pro Val Ala Val Ser Val Gly Ala Ala Ile Ser Gly

65 70 75 80

Gly His Val Ala Pro Ala Val Thr Pro Gly Ala Pro Val Gly Gly Ala

85 90 95

Ile Thr Leu Pro Ala Gly Ile Leu Thr Ile Ile Ala Gly Leu Leu Gly

100 105 110

Ser Thr Ala Ala Cys Ala Leu Leu Gly Pro Ala Thr Gly Gly Met Ser

115 120 125

Thr Gly Ser Pro Ala Leu Ser Ala Gly Val Ser Val Thr Ala Ala Pro

130 135 140

Val Pro Gly Ile Val Met Thr Pro Gly Leu Val Thr Thr Val Thr Ala

145 150 155 160

Thr Ala Val Ala Pro Leu Leu Gly Ala Leu Gly Val Ile Ala Pro Ile

165 170 175

Ala Ile Gly Pro Ile Val Gly Ala Ala Ile Leu Ala Gly Gly Ala Pro

180 185 190

Thr Gly Ala Ser Met Ala Pro Ala Val Ser Pro Gly Pro Ser Leu Val

195 200 205

Ser Thr Thr Thr Thr His Gly Thr Val Thr Thr Ala Gly Pro Leu Ile

210 215 220

Gly Gly Gly Leu Ala Gly Pro Ile Thr Gly Pro Ile Pro Ile Ser His

225 230 235 240

Thr His Gly Gly Ile Pro Ser Gly Ala Pro

245 250

<210> 2

<211> 754

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 2

aatgccgatc aaccaaatta ctattggaag ccatgaggaa ctccgccatc ccggggcgct 60

taaagcggcc ttggcggagt tcatcagtac cctgatcttc gtattcgcag gtcagggttc 120

tggtatggct ttcaataagc ttaccgatgg cgtcgctact cccgctggcc ttatttccgc 180

ctccatagca cacgccttcg ggttgttcgt cgccgtctcc gtcggtgcta acatctccgg 240

cggccacgtc aaccctgctg ttaccttcgg tgcttttgtt ggtggaaaca tcactttgtt 300

ccgtggaatt ttgtacatca ttgcacagtt gcttggatcc actgctgctt gcgctctcct 360

tgaattcgcc accggtggca tgagcacggg atcatttgca ttgtcagccg gtgtatcagt 420

atggaacgcg ttcgtattcg agattgtgat gactttcggt ctcgtttaca ctgtttacgc 480

aaccgcagtt gacccaaaga agggagattt gggtgtgatt gcaccaattg caattggttt 540

cattgttggt gccaacattc ttgctggtgg tgcctttact ggagcttcaa tgaacccagc 600

tgtgtcattt ggcccatctt tggttagctg gacctggact caccaatggg tttactgggc 660

tggaccactt attggtggtg ggcttgctgg attcatctat gaattcatct tcattagcca 720

cactcatgag caaatcccaa gtggagattt ttaa 754

<210> 3

<211> 634

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 3

ggtgaaagcc aaaagagtcg cttacaaaag cccctgaaaa cctttaacct tcttcccctg 60

catctcttat gctaatcact tcccttgctt ttataacctc taaatttccc catgtctcga 120

ccacaacaaa aatatcgagg tgttcgccag cgccattggg gatcttgggt ttccgaaatt 180

cgtcatcctt cattgaaaac acggatatgg ctgggaacct atgagacatc agaggatgct 240

gcgagggcat atgatgaagc agcgagactc atgtgtggtt caacagcacg cactaatttc 300

ccatacaatg caacagaatc ttcaaggttt ctgtcttctg ctttgatagc taaacttcaa 360

agatgcaaca tgtcatctct cactgctacg tcaagaagac ctggaaagac aagattggaa 420

gataaaaaag agaacgagat atccacgctt gttagagaca cgggagatgg agaagaaagg 480

cagagtgaga gtgcatcaca acaatacatg aaggcacttg aagatgaaca tatagaacag 540

atgattgagg aattgcttga ttatggatct attgagatgt gttctgttcg caatgaataa 600

gacataaatg caataattag cttcaaaaaa aaaa 634

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Forward primer)

<400> 4

cacctcgtta aaaatgccga tcaacca 27

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Forward primer)

<400> 5

tctccacttg ggatttgctc a 21

<210> 6

<211> 56

<212> DNA

<213> 引物(Forward primer)

<400> 6

atatatggtc tcgtttggag gaactccgcc atcccggttt tagagctaga aatagc 56

<210> 7

<211> 57

<212> DNA

<213> 引物(Forward primer)

<400> 7

attattggtc tcgaaacgag caccgaaggt aacagcccaa actacactgt tagattc 57

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物(Forward primer)

<400> 8

ggtaccgtca tccttcattg aaaacacgg 29

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物(Forward primer)

<400> 9

ggatccttat tcattgcgaa cagaacaca 29

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Forward primer)

<400> 10

ccatcgatat gccgatcaac caaatta 27

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Forward primer)

<400> 11

gcgtcgactt aaaaatctcc acttggg 27