一种快速鉴别不同生长速度类型肉鸡的方法

摘要

本发明属于分子生物学技术领域。一种快速鉴别不同生长速度类型肉鸡的方法，包括以下步骤：(1)待测肉鸡总DNA提取；(2)PCR扩增和测序：利用特异性引物对待测肉鸡总DNA进行PCR扩增反应，反应完毕后，PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳检测，测序；(3)数据处理和分析：测序结果经拼接后，剪去多余片段序列，统计ABCE单倍型数和各种单倍型比例；(4)鉴别：待测肉鸡的单倍型数及其占比中，E单倍型的比例小于40％，判断待测肉鸡为慢速生长型。本发明解决了现有中快速生长型肉鸡冒充慢速生长型肉鸡的技术问题。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速鉴别不同生长速度类型肉鸡的方法。

背景技术

我国市场上肉鸡种类主要包括白羽肉鸡、黄羽肉鸡及肉杂鸡三类，其中黄羽肉鸡是由我国优良的地方品种杂交培育而成，一般分为快速型、中速型和慢速型三种，其与白羽肉鸡相比，具有体重较小、抗病能力较强等特点。快速型黄羽肉鸡上市日龄一般为42～65天，中速型黄羽肉鸡上市日龄一般为45～95天，慢速型黄羽肉鸡上市日龄一般为95天以上。慢速型黄羽肉鸡是在地方鸡种保存、整理和利用的基础上培育出来的优质鸡种，其肉质鲜嫩，味道鲜美，深受消费者喜爱。据中国畜牧业协会最新数据显示，慢速型黄羽肉鸡市场占比不断增加，目前在黄羽肉鸡市场上占有率达40％以上。

随着冷鲜鸡产业的不断发展，一些不法商家为了谋取利益，往往以生长速度快、肉品质较低等级的品种冒充品质较高的慢速型品种，以次充好、以假乱真的现象时有发生，而消费者却对冷鲜鸡的品质和来源难以准确地区分和鉴别。随着大批肉鸡配套系的成功培育，人们对家禽品种的需求也越来越多元化，如何培育出满足不同消费者需求的肉鸡品种是育种工作者的当务之急，而如何帮助消费者快速有效的鉴别出不同品种的来源则是科研工作者的关注焦点。

公开号CN108251418A、公开日为2018年7月6日的中国发明专利说明书公开了一种鉴别生长速度快的肉鸡品系的方法，利用引物对组合，PCR方法对待测鸡INSR基因rs16212279和rs314213038位点的核苷酸进行检测，直接测序法对扩增产物进行等位基因测序，判断基因型，当rs16212279基因型为G，并且rs314213038基因型为A时，且两个位点优势基因型等位基因频率接近100％，说明待测品种为快速型肉鸡。但是采用上述方法，只能判断肉鸡类型是否为快速型肉鸡，不能区分中速型肉鸡、慢速型肉鸡。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速鉴别不同生长速度类型肉鸡的方法，以解决现有快速生长型肉鸡冒充慢速生长型肉鸡的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案，一种快速鉴别不同生长速度类型肉鸡的方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：

(1)待测肉鸡总DNA提取；

(2)PCR扩增和测序：利用特异性引物对待测肉鸡总DNA进行PCR扩增反应，反应完毕后，PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳检测，测序；特异性引物序列为：

上游引物：5'-AAACACCCAAACTCAC TAAC-3'；

下游引物：5'-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3'；

(3)数据处理和分析：测序结果经比对拼接后，剪去多余片段序列，仅留D-loop完整序列，对序列进行单倍型分型，统计最终序列中的A\B\C\E单倍型数及其占比；

(4)鉴别：待测肉鸡的单倍型数及其占比中，E单倍型的比例小于40％，判断待测肉鸡为慢速生长型。

采用上述技术方案，具有以下有益效果：本发明主要是根据线粒体DNA中D-loop区序列的不同单倍型比例，用以区分不同生长速度肉鸡中的慢速型肉鸡。本发明方法快速简便，易于操作且价格便宜，可以快速有效地区分出中快速型黄羽肉鸡和慢速型黄羽肉鸡、地方鸡种和淘汰高产蛋鸡、白羽肉鸡和817肉杂鸡。

优选的，PCR扩增体系：2×PCR反应混合物(Master Mix)25μL，10μmol/L上下游引物各1.5μL，DNA模板2μL，灭菌双蒸水20μL。

优选的，PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min。

优选的，所有序列测序均采用双向测序，确保序列的完整性和准确性。

优选的，所述基因组DNA提取采用常规的酚/氯仿法，质量浓度0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。

优选的，所述PCR产物采用质量浓度1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

优选的，所述测序结果经DNAStar 5.02软件SeqMan程序拼接。

优选的，所述突变位点和单倍型数统计采用DnaSP 5.10软件实现，单倍型分型采用鸡线粒体DNA单倍型分类通用标准实现，以及不同单倍型的比例分布在鉴别不同生长速度肉鸡中的应用。

附图说明

图1是实施例1的21个鸡种D-Loop区全序列单倍型分布情况图；

图2是实施例1的不同生长速度类型肉鸡D-Loop区全序列单倍型特征图。

具体实施方式

实施例1

1材料与方法

1.1实验材料

以不同生长速度类型肉鸡品种(配套系)为实验素材，包括白羽肉鸡品种3个、中快速型黄羽肉鸡配套系7个、慢速型黄羽肉鸡配套系5个、地方品种2个、引进品种2个以及其他鸡种2个共计21个品种(配套系)。每个鸡种随机选择60个个体，公母各半，翅静脉采血，ACD抗凝。各鸡种相关信息见表1。

表1 21个品种(配套系)基本信息

1.2实验方法

1.2.1总DNA提取

基因组DNA提取采用常规的酚/氯仿法，质量浓度0.8％琼脂糖(Promega，美国)凝胶电泳检测DNA提取效果。

1.2.2引物合成

根据GenBank数据库中公布的红色原鸡线粒体控制区全序列(序列号:NC_007235)，利用Primer Premier 5.0软件设计筛选特异性引物1对，PF：5'-AAACACCCAAACTCAC TAAC-3'；PR：5'-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3'，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增和测序

50μL扩增体系：2×PCR Master Mix(大连宝生物公司)25μL，10μmol/L上下游引物(上海生工生物工程公司)各1.5μL，DNA模板2μL，灭菌双蒸水20μL。

PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min。

反应完毕后，PCR产物采用质量浓度1.0％琼脂糖(Promega，美国)凝胶电泳检测，测序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，所有序列均采用双向测序。

1.3数据处理和分析

测序结果经DNAStar 5.02软件SeqMan程序拼接后，剪去多余片段序列。利用DnaSP5.10软件统计突变位点和单倍型数，利用鸡线粒体DNA单倍型分类通用标准对所有单倍型进行分型，并计算各类型单倍型占比。上述分类通用标准参照以下文章：Liu Y P,Wu G S,Yao Y G,et al.Multiple maternal origins of chickens:out of the Asian jungles[J].Molecul ar Phylogenetics and Evolution,2006,38(1):12-19。

2结果与分析

2.1 21个鸡种单倍型结果分析

对21个品种(配套系)1260个个体线粒体D-loop区全序列进行测序，具体结果分析见表2和图1。

3个白羽肉鸡品种、2个引进鸡种以及817肉杂鸡和淘汰高产蛋鸡优势单倍型均为E单倍型，其中3个白羽肉鸡品种E单倍型占比分别为100％(60/60)、86.67％(52/60)和51.67％(31/60)；2个引进鸡种E单倍型占比分别为50.00％和90.00％；817肉杂鸡和淘汰高产蛋鸡E单倍型比例均为100％。

中快速型黄羽肉鸡品种(配套系)E单倍型为优势单倍型，占比较高，均在50％以上。中快速型黄羽肉鸡-3E单倍型比例最高，为100％；其次为中快速型黄羽肉鸡-5和中快速型黄羽肉鸡-1，E单倍型占比分别为86.67％(52/60)和80.00％(48/60)；然后是中快速型黄羽肉鸡-2、中快速型黄羽肉鸡-7和中快速型黄羽肉鸡-4，E单倍型占比分别为78.33％(47/60)、70.00％(42/60)和66.67％(40/60)；最后为中快速型黄羽肉鸡-6，E单倍型占比为51.67％(31/60)。慢速型黄羽肉鸡品种(配套系)E单倍型占比相对较低，均未超过40.00％的比例。其中慢速型黄羽肉鸡-3和慢速型黄羽肉鸡-4优势单倍型均为B单倍型，占比分别为76.67％(46/60)和66.67％(40/60)；慢速型黄羽肉鸡-2优势单倍型为A单倍型，占比50.00％(30/60)；慢速型黄羽肉鸡-5优势单倍型为C单倍型，占比41.67％(25/60)；慢速型黄羽肉鸡-1各单倍型比例相对较为均衡，未发现超过40％的单倍型。

2个地方鸡种120个个体中未发现E单倍型，地方鸡种-1主要为A和C单倍型，占比分别为53.33％和46.67％；地方鸡种-2主要为A和B单倍型，占比分别为35.00％和65.00％。

可见，慢速型黄羽肉鸡和地方鸡种E单倍型比例显著低于其他类型鸡种，而慢速型黄羽肉鸡和地方鸡种A单倍型或者B单倍型显著高于其他类型鸡种。

表2 21个鸡种D-Loop区全序列单倍型汇总

2.2不同生长速度类型鸡种单倍型结果分析

对不同生长速度类型鸡种单倍型特征进行统计分析，结果见表3和图2。

表3不同生长速度类型鸡种D-Loop区全序列单倍型特征

注：表中同列不同字母之间表示差异显著(P<0.05)，相同字母之间表示差异不显著(P>0.05)。

由表3可见，A单倍型比例最高的为地方鸡种，显著高于其他鸡种(P<0.05)；其次为慢速型黄羽肉鸡，显著高于中快速型黄羽肉鸡、817肉杂鸡和淘汰高产蛋鸡(P<0.05)。B单倍型比例最高的为慢速型黄羽肉鸡，其次为地方鸡种，这两种类型鸡种B单倍型比例显著高于其他类型鸡种(P<0.05)。可见A、B单倍型为地方鸡种和慢速型黄羽肉鸡的优势单倍型。

E单倍型比例最高的为淘汰高产蛋鸡和817肉杂鸡，其次为白羽肉鸡、中快速型黄羽肉鸡以及引进鸡种，而慢速型黄羽肉鸡E单倍型比例仅为18.00％，本发明中两个地方鸡种E单倍型比例为0，差异分析显示，慢速型黄羽肉鸡和地方鸡种E单倍型占比显著低于其他类型鸡种(P<0.05)。

3结论

本实施例中淘汰高产蛋鸡和817肉杂鸡均仅有E单倍型，这两个鸡种在培育过程中可能存在类似的育种模式。

白羽肉鸡、中快速型黄羽肉鸡以及引进鸡种E单倍型占比相近，且均以E单倍型为优势单倍型。

慢速型黄羽肉鸡和地方鸡种以B和A单倍型为主，E单倍型含量相对较低，不超过40％。

本说明方法快速简便，易于操作且价格便宜，可以快速有效地区分出中快速型黄羽肉鸡和慢速型黄羽肉鸡、地方鸡种和淘汰高产蛋鸡、白羽肉鸡和817肉杂鸡。

综上所述，以E单倍型占比的不同，作为判断鉴别不同生长速度类型肉鸡的依据。

实施例2

一种快速鉴别不同生长速度类型肉鸡的方法，包括以下步骤：

(1)待测肉鸡样品一：群体总数不少于40只；

(2)总DNA提取：基因组DNA提取采用常规的酚/氯仿法，质量浓度0.8％琼脂糖凝胶电泳检测；

(3)PCR扩增和测序：利用特异性引物对待测肉鸡总DNA进行PCR扩增反应，反应完毕后，PCR产物采用质量浓度1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，测序；特异性引物序列为：

上游引物：5'-AAACACCCAAACTCAC TAAC-3'；

下游引物：5'-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3'；

PCR扩增体系：2×PCR Master Mix25μL，10μmol/L上下游引物各1.5μL，DNA模板2μL，灭菌双蒸水20μL；

PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min。

(4)数据处理和分析：测序结果经DNAStar 5.02软件SeqMan程序拼接后，剪去多余片段序列，与GenBank中红色原鸡参考序列逐碱基比对；采用DnaSP 5.10软件统计突变位点和单倍型数；采用鸡线粒体DNA单倍型分类通用标准对所有单倍型进行分型，并计算A\B\C\E各类型单倍型占比；

(5)鉴别：待测肉鸡的单倍型数中，E单倍型的比例为18.0％，判断待测肉鸡为慢速生长型。

实施例3

一种快速鉴别不同生长速度类型肉鸡的方法，包括以下步骤：

(1)待测肉鸡样品二：群体总数不少于40只；

(2)总DNA提取：基因组DNA提取采用常规的酚/氯仿法，质量浓度0.8％琼脂糖凝胶电泳检测；

(3)PCR扩增和测序：利用特异性引物对待测肉鸡总DNA进行PCR扩增反应，反应完毕后，PCR产物采用质量浓度1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，测序；特异性引物序列为：

上游引物：5'-AAACACCCAAACTCAC TAAC-3'；

下游引物：5'-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3'；

PCR扩增体系：2×PCR Master Mix25μL，10μmol/L上下游引物各1.5μL，DNA模板2μL，灭菌双蒸水20μL；

PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min。

(4)数据处理和分析：测序结果经DNAStar 5.02软件SeqMan程序拼接后，剪去多余片段序列，与GenBank中红色原鸡参考序列逐碱基比对；采用DnaSP 5.10软件统计突变位点和单倍型数；采用鸡线粒体DNA单倍型分类通用标准对所有单倍型进行分型，并计算A\B\C\E各类型单倍型占比；

(5)鉴别：待测肉鸡的单倍型数中，E单倍型的比例为79％，判断待测肉鸡为非慢速生长型，可能为中速生长型或快速生长型。