一种研究HSD17B13 rs72613567基因变异和肾功能损伤之间关系的方法

摘要

本发明公开了一种研究HSD17B13 rs72613567基因变异和肾功能损伤之间关系的方法，属于医学技术领域。本发明选择经活检证实为NAFLD的患者作为实验人群，检测患者的HSD17B13基因型，测量患者的肾小球滤过率(eGFR)、尿/血清NGAL和尿白蛋白与肌酐的比值(u‑ACR)，最后利用多变量回归分析的方法确定HSD17B13 rs72613567基因型与基因变异和肾功能损伤之间的关系。结果表明，HSD17B13 rs72613567 A/‑或A/A基因型与较低的蛋白尿风险显著相关，但与u‑NGAL浓度或eGFR水平无关，为早期肾损伤提供新颖的见解。

说明书

技术领域

本发明涉及一种研究HSD17B13 rs72613567基因变异和肾功能损伤之间关系的方法，属于医学技术领域。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是由肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、晚期纤维化和肝硬化相关的一系列肝脏性疾病组成的综合征。NAFLD与慢性肾脏病(CKD)发病的共同危险因素包括：胰岛素抵抗、血脂异常、慢性炎症和氧化应激增强。无论是通过影像学还是通过肝脏活检证实的NAFLD都会增加微量白蛋白尿、大量蛋白尿以及CKD的患病率。越来越多的证据表明，一些易感的遗传基因变异会导致NAFLD/NASH更容易发生肾脏病，这些遗传变异已经在不同的人群中被认识，例如patatin样磷脂酶域含蛋白-3(PNPLA3)和trans-膜6超家族成员2基因(TM6SF2)。我们前期研究发现，携带PNPLA3 rs738409G等位基因的NAFLD患者早期发生肾小球和肾小管损伤的风险较高。

最近，17-羟甾体脱氢酶13(HSD17B13)被鉴定为肝脏特异性脂滴相关蛋白，在NAFLD研究领域日益受到关注。HSD17B13被Liu等人2007年从第一只克隆人类肝cDNA图文中发现，并发现位于肝脏脂滴表面的差异会导致脂质积累和脂滴扩张，从而在NAFLD发病机制中发挥重要作用。此外，功能缺失的HSD17B13rs72613567变异可能是降低NAFLD进展的治疗靶点。最近，Sessa等研究者发现，在肥胖儿童中，携带HSD17B13 A等位基因的人群eGFR水平高于纯合子人群。然而，rs72613567变异的功能是否影响成人肾功能/损伤尚不清楚。蛋白尿是肾脏损害的尿液生物标志物，常被认为是反映肾脏疾病发生发展的早期标志。众所周知，脂质也可以积聚在肾脏导致蛋白尿和肾功能损伤，就是我们常说的脂质肾损伤；本研究旨在探讨HSD17B13 rs72613567基因变异和肾功能损伤在中国经肝活检证实的NAFLD患者人群中的意义。

发明内容

为了实现上述目的，本发明提供了一种研究HSD17B13 rs72613567基因变异和肾功能损伤之间关系的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)选择经活检证实为NAFLD的患者作为实验人群；

(2)检测患者的HSD17B13基因型；

(3)测量患者的肾小球滤过率(eGFR)、尿/血清NGAL和尿白蛋白与肌酐的比值(u-ACR)；

(4)利用多变量回归分析的方法确定HSD17B13rs72613567基因型与基因变异和肾功能损伤之间的关系。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中活检证实为NAFLD的患者的过程中，NAFLD的组织学特征根据NASH CRN分型和Brunt标准来定义。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，检测基因型时，DNA采用QIAGEN试剂盒进行提取，同时保存于-20℃用于分析，HSD17B13 rs72613567基因分析使用TaqMan检测平台检测，其中，正向引物序列为CAGATTATGGCCTGTATTGGAGAC；反向引物序列为GCTCTATTGGTGTTAGTATTTGGGT；探针报告基因1序列为CTACAGAAGTAAGTACAGCAC；探针报告基因2序列为ACTACAGAAGTTAAGTACAGCA。

在本发明的一种实施方式中，所述尿/血清NGAL为用于衡量肾小管损伤的指标。

本发明还提供了上述方法在医学研究中的应用。

本发明的优点：

本发明结果表明，与携带HSD17B13rs72613567-/-相比，携带HSD17B13rs72613567A/-或A/A基因型患者发生尿蛋白的风险明显减低，但与u-NGAL浓度或eGFR水平无关。当矫正已知肾脏危险因素、NASH和肝纤维化的组织学分型后，rs72613567A/-或A/A基因型患者与蛋白尿之间仍然显著相关。这个发现可能为携带HSD17B13 rs72613567基因型患者发生早期肾损伤提供新颖的见解，从而有利于进一步研究有关早期肾损伤的治疗方法。

附图说明

图1根据HSD17B13 rs72613567基因型分组后不同u-ACR、u-NGAL的受试者比例(A)；肝脏组织学特点(B)。

图2在合并糖尿病(A)或高血压(B)的NAFLD患者中不同HSD17B13 rs72613567基因型对数转化后白蛋白尿(ln u-ACR)的水平，*p<0.05。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)人群筛选

在横断面研究中，我们纳入了215名成年NAFLD患者，这些患者于2016年12月至2019年2月连续在温州医科大学第一附属医院就诊。所有参与者均经肝活检确诊为NAFLD。该研究获得了当地伦理委员会的批准。在分析前，我们会从参与者那里获得书面的知情同意，并删除个人信息和记录。

(2)肝脏组织学活检

所有的肝脏活检标本由经验丰富的肝脏病理学家分析，其对参与者的临床资料不知情。NAFLD的组织学特征根据NASH CRN分型和Brunt标准来定义。

(3)遗传分析

首先采集所有患者的血样，从每个血样中提取约20ng的基因组DNA进行遗传分析。DNA采用QIAGEN试剂盒进行提取，同时保存于-20℃用于分析。HSD17B13 rs72613567基因分型使用TaqMan检测平台，按照厂家方案进行。正向引物序列为CAGA TTATGGCCTGTATTGGAGAC；反向引物序列为GCTCTATTGGTGTTAGTATTTGGGT；探针报告基因1序列为CTACAGAAGTAAGTACAGCAC；探针报告基因2序列为ACTACAGAAGTTAAGTACAGCA。

(4)临床和实验室参数

所有参与者在进行肝活检前都记录了人口统计学数据、人体测量以及临床参数。体重指数(BMI)的计算方法是体重除以身高的平方，BMI≥25kg/m

(5)肾功能参数、CKD和肾小球滤过率(eGFR)的评估

以尿蛋白/肌酐比值(ACR)≥30mg/g被定义为蛋白尿。

根据北京Hotgen的使用说明书，使用上转换发光技术测定尿液和血清NGAL水平。接着，从25名中国健康志愿者(n＝25)样本中测到的尿/血清NGAL的平均值作为参考值，平均u-NGAL水平为31.18±12.77ng/mL，血清NGAL水平为31.47±11.29ng/mL。

CKD定义为eGFR<60ml/min/1.73m

高血压定义为血压≥130/85mmHg或既往使用过任何降压药。

糖尿病的定义为：空腹血糖≥7.0mmol/L或糖化血红蛋白(HbA1c)≥6.5％或服用降糖药者。

高尿酸血症定义为:男性血尿酸>420mol/L，女性血尿酸>360mol/L，或使用降尿酸药物的人群。

血脂异常被定义为以下任一标准:总胆固醇>5.17mmol/L；甘油三酸酯>1.70mmol/L；女性为高密度脂蛋白胆固醇<1.0mmol/L，男性为<1.3mmol/L，低密度脂蛋白胆固醇≥3.4mmol/L，或使用任何降脂药物。

(6)统计

分类变量用数字(百分比)表示，连续正态分布变量用平均数±标准差表示，非正态分布变量用中位数(四分位区间)表示。此外，HSD17B13rs72613567A/-和A/A基因型分别纳入或合并为单个类别(使用-/-基因型作为参考类别)进行分析。以HSD17B13rs72613567基因型分层的研究人群为基线特征，采用单因素方差分析或正态分布和非正态分布连续变量的Kruskal-Wallis检验，以及对分类变量采用Pearson检验和Fisher精确检验进行比较。采用单变量和多变量回归模型检验HSD17B13 rs72613567基因型与u-ACR的相关性。

在分析之前，我们将u-ACR和u-NGAL水平转换为自然对数，使其分布正态化。在多变量回归模型中，Model 2校正了年龄、性别、BMI、HOMA-IR评分、高尿酸血症、高血压和糖尿病；Model 3进一步矫正了eGFR、NASH(定义为NAFLD活性评分≥4)和肝纤维化的组织学分期。统计学检验均为双侧检验，p值<0.05(双尾)认为有统计学意义。所有的统计分析使用SPSS22.0版本(SPSS，芝加哥)进行。

(7)结果分析

(i)人群基本特点

通过上述临床和实验室参数以及基因检测，可知，本发明统计的NAFLD患者人群平均年龄为41±13岁，BMI为26.8±4.7kg/m

三组HSD17B13基因型患者基本信息比较列于表1，可见，三组患者BMI、肝酶、血浆脂质和HOMA-IR的平均水平无显著差异。然而，-/-基因型患者蛋白尿的患病率明显高于A/-基因型患者(19.3％vs.6.3％)，及A/-+A/A基因型患者(19.3％vs.4.9％)。相反，与HSD17B13rs72613567:A/-+A/A基因型相比，-/-基因型携带者在年龄、性别、BMI、合并症(包括高血压和糖尿病)、血清或尿液NGAL、BUN和eGFR值等方面都没有显著差异。另外，携带HSD17B13rs72613567A/-或A/A基因型的患者比携带-/-基因型的患者发生蛋白尿的风险更低，但是NGAL水平无明显差异(图1A)。此外，HSD17B13 rs72613567基因型之间的NASH患病率(定义为NAS≥4)(表1)和NAFLD的个体组织学特征没有显著差异(图1B)。

表1活检证实的NAFLD患者在HSD17B13 rs72613567基因型分层后的基线特征。

(ii)HSD17B13 rs72613567基因型与蛋白尿相关

如图2所示，可见，HSD17B13 rs72613567:A等位基因携带者的ln(u-ACR)(u-ACR的自然对数)平均水平明显低于-/-基因型携带者(p<0.05)。因此，为了进一步了解蛋白尿与rs72613567基因型的关系，我们进行了logistic和线性回归分析，结果见表2。

表2结果显示携带HSD17B13 rs72613567A/-或A/A基因型与蛋白尿呈显著负相关。在矫正年龄、性别、BMI、HOMA-IR、高血压、糖尿病和高尿酸血症(Model 2)以及再进一步矫正eGFR、NASH和纤维化组织学分期(Model 3:矫正后的OR＝0.16,95％CI:0.05-0.49,p＝0.001)后，两者仍然有显著的相关性。此外，矫正了相同协变量的线性回归模型后提示，A/-或A/A基因型携带者的ln(u-ACR)水平低于野生型组(矫正后的β系数＝-0.41,95％CI[-0.76，-0.06],p＝0.022)。不同HSD17B13基因型携带者间u-NGAL水平无差异(表3)。

表2.HSD17B13 rs72613567基因型与经活检证实的NAFLD患者尿白蛋白/肌酐比值(u-ACR)的相关性。

样本量n＝215.表中的数据是根据单因素、多因素logistic回归分析方式计算出的比值比(OR)和95％CI可信区间。

Ref.＝reference category(参考类别).

Model 1：未矫正的单因素回归分析。.

Model 2：矫正年龄、性别、体重指数、胰岛素抵抗的稳态模型评估、高血压、糖尿病和高尿酸血症。

Model 3：矫正Model 2的变量同时加上肾小球滤过率、NASH的存在以及肝纤维化组织学分期。

表3HSD17B13 rs72613567基因型与尿白蛋白/肌酐比值[ln(u-ACR)，mg/g]、尿中性粒细胞明胶酶相关脂钙蛋白[ln(u-NGAL)，ng/mL]自然对数转换的相关性。

(iii)进一步亚分层评估HSD17B13基因型与蛋白尿的关系

由于年龄、性别和肥胖是CKD的常见危险因素，因此，本发明探讨了此相关危险因素分层后rs72613567和蛋白尿之间的关系(表4)。在矫正所有的危险因素后(Model 3)，在超重或者肥胖人群(BMI≥25kg/m

表中的数据是根据单因素、多因素logistic回归分析方式计算出的比值比(OR)和95％CI可信区间。在logistic回归分析中，我们使用HSD17B13 rs72613567A/-组，或者HSD17B13 rs72613567A/-和A/A两组基因型与对照组HSD17B13rs72613567-/-基因组进行比较。*p<0.05.

Model 1：单因素回归分析。

Model 2：矫正的因素包括年龄、性别、体重指数、胰岛素抵抗稳态评估、高尿酸血症、高血压以及糖尿病，除了亚组分层里特有的参数。

Model 3：矫正了相同的Model 2里相同的协变量以及包括肾小球滤过率、NASH和肝脏纤维化组织学分期。

本发明的研究结果表明，经活检证实的携带HSD17B13 rs72613567A/-或A/A基因型的NAFLD患者发生蛋白尿的风险较低(特别是男性、超重/肥胖或年龄小于50岁的年轻人)，这是首个研究HSD17B13rs72613567变异与经活检证实的NAFLD成人肾功能/损伤标志物之间关系的研究。

在本发明中，研究发现rs72613567:A/-或者A/A基因携带者与rs72613567-/-基因型携带者相比，蛋白尿的风险降低，但与u-NGAL浓度或eGFR水平无关。由于HSD17B13在肾脏固有细胞中表达，故推测其参与了脂质介导的肾损伤的发病机制。因此，可以推测，HSD17B13rs72613567-/-基因型可能是NAFLD患者发生蛋白尿的遗传危险因素，由于其主要参与脂质代谢的调节作用，因此其功能缺失可能对早期肾功能不全有保护作用。

本发明可能为HSD17B13rs72613567基因型在早期肾损伤中的病理生理学提供新的见解。有关HSD13B17影响蛋白尿风险的潜在机制有待进一步研究。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。