用于标识选择性剪接事件的方法和装置

摘要

用于标识选择性剪接事件的方法和装置。该方法包括接收针对多个生物样本中的每个生物样本的剪接百分比(PSI)值的数据集，其中多个生物样本包括具有第一特性的第一样本群体和具有与第一特性不同的第二特性的第二样本群体。将概率模型拟合到数据集，以标识数据集中的样本的多个簇，计算针对多个簇中的每个簇的簇特性，至少部分地基于簇特性来过滤多个簇以标识簇的子集，簇的子集中的每一个与选择性剪接事件相关联，并且在至少一个存储设备上存储与所标识的选择性剪接事件相关联的信息。

说明书

背景技术

尽管在开发有效的靶向疗法方面取得了进展，并且对许多患有癌症等疾病的患者的治疗效果有所改善，但是患有某些疾病或患有抗药性疾病的患者仍然有未满足的医疗需求。

发明内容

在一些方面，本文提供了一种分子谱分析平台，其可以被用来例如标识对两个患者群体进行区分的选择性剪接事件。选择性剪接是提高蛋白质多样性的生物学现象。在选择性剪接中，一部分遗传密码被包含在从基因产生的信使RNA(mRNA)中或从中被排除。因此，从选择性剪接的mRNA翻译的蛋白质将在其氨基酸序列中包含差异，通常导致生物学功能的差异。因此，选择性剪接事件可以产生不同的转录物异构体(isoform)。用于估算生物样本中的选择性剪接事件的程度的常用度量是剪接百分比(PSI或ψ)，它表示样本中的剪接事件的相对丰度。

在一些方面，本公开提供了方法，该方法将针对两个样本群体(例如正常和癌组织样本)所确定的分析(例如PSI值)进行组合并使用概率模型来分析所组合的输入以标识总体群体内可以被进一步分析的样本子群体，以评估两个样本群体中的特定的选择性剪接事件是否被差异表达——即使剪接事件发生在感兴趣条件的子群体中也是如此。样本可以包括从中可以检测到所表达的选择性剪接事件的任何生物样本。例如，生物学样本可以包括但不限于新鲜的冷冻组织、癌组织、乳腺组织、血液样本、尿液样本和脑脊髓液(CSF)样本。

可以使用本文所描述的技术来分析其中一个或多个剪接事件被差异表达的任何两个样本群体。例如，第一样本群体可以与患有特定疾病的患者(例如，被诊断患有乳腺癌的患者)相关联，而第二样本群体可以与未患有特定疾病的患者(例如，尚未被诊断出患有乳腺癌的患者)相关联。在另一个示例中，两个群体都可以与患有特定疾病的患者相关联，而只有一个群体与患有该疾病的特定一个或多个症状的患者相关联。在又一个示例中，第一群体可以包括与患有某种疾病的患者相关联的样本(例如，患有一种或多种癌症的患者)，而第二群体可以包括与尚未被标识为患有某种疾病的患者相关联的样本。可替代地，可以使用本文所描述的技术来分析其他样本群体，并且实施例在这方面不受限制。

一些实施例涉及一种用于标识选择性剪接事件的计算机系统。该计算机系统包括至少一个计算机处理器和在其上存储有多个计算机可读指令的至少一个存储设备，该多个计算机可读指令在由至少一个计算机处理器执行时执行一种方法。该方法包括：接收针对多个生物样本中的每个生物样本的PSI值的数据集，其中多个生物样本包括具有第一特性的第一样本群体和具有与第一特性不同的第二特性的第二样本群体，将概率模型拟合到数据集以标识数据集中的样本的多个簇，计算针对多个簇中的每个簇的簇特性。至少部分地基于簇特性来过滤多个簇以标识簇的子集，簇的子集中的每一个与选择性剪接事件相关联，并在至少一个存储设备上存储与所标识的选择性剪接事件相关联的信息。

一些实施例涉及用于标识特定于癌症的选择性剪接事件的方法。该方法包括：接收针对多个生物样本中的每个生物样本的PSI值的数据集，其中多个生物样本包括具有第一特性的第一样本群体和具有与第一特性不同的第二特性的第二样本群体，通过至少一个计算机处理器将概率模型拟合到数据集，以标识数据集中的样本的多个簇，计算针对多个簇中的每个簇的簇特性，至少部分地基于簇特性来对多个簇进行过滤以标识簇的子集，簇的子集中的每一个与选择性剪接事件相关联，并且在至少一个存储设备上存储与所标识的选择性剪接事件相关联的信息。

一些实施例涉及一种编码有多个指令的非瞬态计算机可读介质，该指令在由至少一个计算机处理器执行时执行一种方法。该方法包括：接收针对多个生物样本中的每个生物样本的PSI值的数据集，其中多个生物样本包括具有第一特性的第一样本群体和具有与第一特性不同的第二特性的第二样本群体，将概率模型拟合到数据集，以标识数据集中的样本的多个簇，计算针对多个簇中的每个簇的簇特性，至少部分地基于簇特性来对多个簇进行过滤以标识簇的子集，簇的子集中的每一个与选择性剪接事件相关联的信息，并在至少一个存储设备上存储与所标识的选择性剪接事件相关联的信息。

一些实施例涉及治疗患者的方法。该方法包括：接收来自患者的样本；对该样本进行测定以确定该样本是否包括包含在选择性剪接事件小组中的多个选择性剪接事件中的一个或多个；以及基于该样本是否包括包含在小组中的一个或多个选择性剪接事件来为患者提供治疗，其中包含在小组中的多个选择性剪接事件由以下方式来确定：将概率模型拟合到多个生物样本中的每个样本的PSI值的数据集中，以标识数据集中的样本的多个簇，其中多个生物样本包括具有第一特性的第一样本群体和具有与第一特性不同的第二特性的第二样本群体，计算针对多个簇中的每个簇的簇特性，至少部分地基于簇特性来对多个簇进行过滤以标识簇的子集，簇的子集中的每一个都与选择性剪接事件小组中的选择性剪接事件相关联。

应当意识到，前述概念和下面更详细讨论的附加概念的所有组合(假设这样的概念并不相互矛盾)被认为是本文所公开的发明主题的一部分。

附图说明

将参考以下附图描述本技术的各种非限制性实施例。应当意识到，附图不一定按比例绘制。

图1例示出了根据一些实施例的用于标识选择性剪接事件的过程；

图2例示出了根据一些实施例的用于分析数据簇的过程；

图3示意性地例示出了根据一些实施例的将概率模型拟合到PSI数据以标识簇；

图4例示出了根据一些实施例的为所标识的簇确定的簇特性的图；

图5例示出了根据一些实施例的为所标识的簇确定的簇特性的另一个图；

图6例示出了根据一些实施例的示出为所标识的簇确定的簇特性的散点图；

图7例示出了根据一些实施例的与正常数据相比的、针对所标识的特定簇的簇特性的图；

图8例示出了根据一些实施例的概率建模分析中所包括的(具有或不具有癌症的)样本的数目的图；

图9例示出了根据一些实施例的针对所标识的特定簇的存活分析图；和

图10示意性地例示出了可以在其上实现一些实施例的基于计算机的系统的组件。

具体实施方式

在一些方面，本文中提供了用于通过分析针对多个生物样本而确定的PSI级别的数据集来标识选择性剪接事件的技术，该多个生物样本包括来自具有不同特性的两个群体的样本。例如，第一群体可以包括从患有癌症的患者获得的样本，第二群体可以包括从尚未被标识为患有癌症的患者获得的样本。用于分析癌组织样本的一些常规技术分析一组正常样本(非癌性样本)和一组癌症样本(已知为癌性的样本)以生成两个分布(正常和癌症)。在这种技术中，假设每个分布内的样本具有相似的生物学性质，并且跨分布的样本具有不同的生物学性质，因此可以分析两个分布的非重叠部分以评估两组样本之间的差异。发明人已经认识到，常规的“两分布”方法不适用于标识选择性剪接事件，至少因为此类事件可能是由于患有癌症之外的原因而发生的(例如，对于非癌性的(正常)健康患者，选择性剪接事件可能会自然地发生)。

为此，一些实施例涉及一种技术，该技术通过将概率模型拟合到数据集来考虑生物学数据中的选择性剪接事件的异质性，该数据集包括针对来自具有不同特性的两个群体的样本(例如，与患有或未患有癌症的患者相关联的样本，或针对患有癌症的患者的一组样本内的样本亚群体)的数据。并非对两组样本进行假设，本文所述的技术采用统计方法来发现样本(其可以包括从正常组织和癌性组织获得的样本)的簇，样本的簇特定于被分析的样本的两个群体之间的(多个)差异特性。

图1例示出了根据一些实施例的用于标识选择性剪接事件的过程100。在动作110中，生成“癌症转录物组”。如上所指出，在本文描述的技术的应用中，其中使用除了具有癌症的样本之外的生物样本群体，在动作110中可以生成除了癌症转录物组之外的转录物组。在一种实施方案中，使用

过程100然后前进到动作112，其中使用动作110中生成的癌症转录物组作为背景来量化数据集中的选择性剪接事件。已经发现了若干类型的选择性剪接事件，包括但不限于选择性5'剪接外显子、选择性3'剪接外显子、外显子跳跃、内含子保留和互斥外显子。除了这些基本类型之外，还可以使用更复杂的选择性剪接模式。本文所述的示例涉及量化和分析外显子被包括在由基因所产生的mRNA中的程度，而不是经由被称为“外显子跳跃”的选择性剪接事件从转录物中被剪接出来的程度。但是，应当意识到，本文所述的技术可以附加地或可替代地被用来标识和表征在两个样本群体中差异表达的任何选择性剪接事件。

在一些实施方案中，分析RNA测序(RNA-seq)数据以确定支持数据中的不同剪接事件的读取计数。如上面简短讨论的那样，RNA-seq数据中的剪接事件的相对丰度可以通过被称为“剪接百分比”(PSI)的度量来进行量化。PSI值的范围为0到1(比例)或0％到100％(百分比)。针对经历选择性剪接的外显子(诸如由于选择性3'和5'边界所引起的修改的外显子或跳过的外显子)计算PSI值。也可以针对内含子计算PSI，以便评估内含子保留。用于PSI的公式可以由下式给出：

其中I是支持包含选择性剪接的外显子/内含子的读取计数的数目，S是支持跳过选择性剪接的外显子/内含子的读取计数的数目，l

在一种实施方案中，从癌症基因组图谱(TCGA)数据集来量化外显子跳跃事件，该数据集是19种不同类型癌症的基因组变化的公开可用数据集。应当意识到，在动作112中可以使用除了TCGA数据集之外的数据集。可以通过针对在剪接结处经历了选择性剪接的遗传密码的部分(例如，外显子、内含子等)计算PSI值来执行对动作112中的选择性剪接事件进行量化。

在一种实施方案中，使用rMATS对外显子跳跃事件进行量化(参见例如，Shen等人的Proceedings of the National Academy of Sciences2014；111(51)：E5593-601)。如上文结合动作110所述，提供癌症患者的RNA-Seq数据和使用SMRT Pacbio测序的癌症转录物组作为对rMATS的输入。在癌症转录物组中标识67,255个外显子跳跃事件，并且跨所有样本(n＝9,366)针对那些外显子中的每个外显子计算PSI值。每个样本分别用rMATS进行处理，并将结果组合到所谓的PSI级别的“PSI矩阵”中，该矩阵由67,255行和9,366列组成，每行对应于所标识的外显子跳跃事件之一，并且每列对应于一个所分析的样本。如上所述，PSI矩阵中的每个值都是介于0和1之间的值，其表示针对特定样本(列)和特定剪接事件(行)的PSI。应当意识到，PSI矩阵可以具有任何合适数目的行和列，并且实施例在这方面不受限制。另外，在一些实施例中，PSI矩阵可以包括与多种不同类型的选择性剪接事件相对应的数据。

当外显子跳跃是考虑的选择性剪接事件时，可以将外显子e

过程100然后继续到动作114，其中将概率模型(例如，高斯混合模型(GMM))拟合到PSI矩阵中的数据。在一些实施例中，将多个GMM拟合到PSI矩阵的一个或多个行中的数据，其中每个GMM包括被用来解释数据的不同数目的高斯分布。GMM中可以使用任何合适数目的高斯分布。作为示例，在一种实施方案中，将范围从一到四个高斯分布的四个GMM拟合到PSI矩阵的每一行，并且根据一个或多个准则(例如，贝叶斯信息准则)针对矩阵的该行选择被最佳拟合到数据的GMM。

图3例示出了使用本文所描述的技术的、被拟合到PSI矩阵的一行中的数据的具有三个高斯分布的GMM的示例。如图所示，GMM中的三个高斯分布中的每一个都定义了PSI矩阵的行内的样本子群体(簇)。沿着图3中的图的PSI轴表示的是高斯分布被拟合到的PSI矩阵的行内的个体样本310。

因此，以这种方式将具有不同数目的高斯分布的多个GMM拟合到PSI矩阵的行使得能够确定准确描述每一行内的PSI级别的异质性的高斯分布的最佳数目。在一个实施方案中，使用利用R计算机语言所编程的多个计算机可读指令来执行GMM的拟合。特别地，Rpackage mclust(参见Scurcca等人的The R Journal 2016；8(1)：289-317)被用来执行高斯拟合和簇分析，下面将对其进行详细描述。应当意识到，可以可替代地使用其他计算机语言、软件包或技术。在一些实施例中，使用并行函数执行GMM到PSI矩阵的行的拟合以允许对PSI矩阵的多线程分析。

尽管上述示例使GMM拟合到PSI矩阵的单行，但在一些实施例中，概率模型(例如GMM)可以被拟合到PSI矩阵的多于一行中的数据，以生成例如多维(例如二维)分布。在多行上拟合GMM可能会发现与由矩阵的不同行所表示的不同剪接事件之间的相互作用相对应的样本子群体。

过程100然后前进到动作116，其中样本被指派给针对一行(或多行)的簇中的每个簇。如图3中所示，对于一些样本310，将样本指派给特定簇是简单的。例如，区域320中的样本被指派给簇1，区域330中的样本被指派给簇2，区域340中的样本被指派给簇3。但是，一些样本位于多个分布(对应于不同簇(在区域350的情况下的簇1和簇2))的重叠区域内(例如区域350)。基于其沿PSI轴的位置和重叠分布，样本中的每个样本可以与该样本属于多个重叠簇中的每个的概率相关联。例如，样本A可以具有它属于簇1的概率0.6，以及属于簇2的概率0.4。为确保每个样本仅被指派给一个簇，可以基于哪个簇与最高概率相关联来指派样本(例如，在以上示例中，样本A将被指派给簇1)。附加地或可替代地，可以使用其他度量用于将重叠区域中的样本指派给簇。

过程100然后前进到动作118，其中从GMM已拟合到的PSI矩阵中的数据的数据集中提取簇。如上所讨论，在一些实施例中，具有不同数目的高斯分布的多个GMM被拟合到PSI矩阵中的数据的每一行，并且对该行中的数据提供最佳拟合的多个GMM之一被选择来表示该行中的数据。针对行的所选择的GMM中的每个高斯分布限定了针对该行的样本的簇(矩阵的每一列表示一个不同的样本)，并且样本被指派给该簇，如上面所讨论的。在样本被指派给每个簇之后，在动作118中计算簇的一个或多个特性，并且簇特性被用来确定哪些簇应被包括在针对选择性剪接事件的生物标记物的小组(panel)中，其表征被研究的两个样本群体之间的差异。下面结合图2描述根据一些实施例的用于计算簇特性的例示性技术。过程100然后前进到动作120，其中基于所提取的簇来标识选择性剪接事件的小组。

图2例示出了用于对从如上所讨论的与GMM拟合的数据集提取的簇执行过滤以确定选择性剪接事件的小组(例如外显子包含(inclusion)事件)的过程200，选择性剪接事件表示针对两个样本群体(例如癌性组织和非癌性组织)之间的特定差异特性或疾病的生物标记物。在动作210中，针对形成PSI矩阵中的数据的子群体的簇中的每个簇，计算至少一个簇特性。例如，如果特定行包括三个簇，则可以针对三个簇中的每一个计算至少一个簇特性。可以计算任何合适的(多个)簇特性以能够跨两个样本群体选择感兴趣的剪接事件。在一个示例中，可以计算出针对簇的差别(differential)剪接特性以确定两个群体中的样本之间的相对丰度的差异(例如，Δψ)。例如，差别剪接可以被确定为：

ΔΨ＝|Ψ

其中c定义阈值(例如0.1或0.2)。根据一些实施例的可以计算出的簇特性的另一个示例是簇的纯度。簇的纯度表示在簇中具有感兴趣特性的样本除以簇中的样本总数的百分比。例如，当簇中90％的样本与感兴趣的选择性剪接事件相关联时，簇的纯度可以被认为是90％。其他簇特性可以包括但不限于簇中的感兴趣的样本的数目、在样本群体之一中的剪接事件的非常低的表达或没有表达(例如，在正常组织中的表达)以及与患者(簇中的样本从其获得)相关联的存活信息。

在两个群体是具有和不具有癌症的样本的一个实施方案中，可以确定每个簇内具有癌症的样本的比例(或者可替代地，不具有癌症的样本的比例)。图4例示出了簇成分的图，其中示出了对于三个簇中的每一个，簇中具有癌症和不具有癌症的样本的比例。图5示出了在PSI矩阵的行的每个簇C1、C2和C3内的每种样本类型(例如，癌症、正常)的数值计数的图。例如，簇C3包括41个具有癌症的样本和4个不具有癌症的样本。图6示出了针对三个簇C1、C2和C3中的每一个的PSI值，这些簇由具有癌症的样本和不具有癌症的样本进行组群。图7示出了针对与癌组织相关联的簇C3的PSI值与针对TCGA数据集中的所有正常组织的PSI值之间的比较。图8示出了根据本文所描述的技术的一个实施方案在GMM分析中使用的(例如，癌性的和正常的)样本的总数。在该示例中，来自597名乳腺癌患者的样本和108个正常组织样本被用于GMM分析。可以在动作210中计算一个或多个前述簇特性和/或任何其他合适的簇特性，并且实施例在这方面不受限制。

处理200然后前进到动作212，其中至少部分地基于在动作210中标识的簇特性来过滤在PSI矩阵中标识的簇。例如，用于将簇包括在簇的子集中的一个或多个包含准则可以被规定，并且簇特性可以被用来确定特定簇是否满足该包含准则。可以使用以下簇特性中的一个或多个来标识在具有癌症的样本中具有经增加的表达的簇：簇包括大于阈值百分比(例如90％)的具有癌症的样本(即，簇的纯度>90％)；簇包括大于阈值百分比的相比正常值的PSI值增加(例如，ΔΨ>10％，其中Ψ

如上所述，在一些实施例中，将簇包含在子集中可以被进一步限制，以要求在两个样本群体之一(例如，不具有癌症的组织)中选择性剪接事件的表达非常低或没有表达。例如，仅在具有癌症的样本中的表达(或大部分仅在其中的表达，例如＞95％)可能被需要，以用于将其包括到剪接事件生物标记物的子集中。

在一些实施例中，可以至少部分地基于与从中确定了PSI矩阵中的数据的样本相关联的存活信息，来进一步确定将簇包括在子集中。可以将从其获得样本的患者的存活信息与队列中其他患者的存活信息进行比较。例如，图9示出了簇C3中的患者与TCGA中其余患者的存活分析。该分析表明，与不在簇C3中的患者相比，C3(例如，表达选择性外显子)中的患者具有较差的总体存活率(较短的例如以天为单位的存活时间)。

在图10中示出了可以与本文所提供的本公开的任何实施例结合使用的计算机系统1000的例示性实施方案。计算机系统1000包括一个或多个计算机硬件处理器1010和一个或多个制品，其包括非瞬态计算机可读存储介质(例如，存储器1020和一个或多个非易失性存储设备1030)。(多个)处理器1010可以以任何合适的方式控制向存储器1020和非易失性存储设备1030写入数据以及从存储器1020和非易失性存储设备1030读取数据。为了执行本文所描述的任何功能性，(多个)处理器1010可以执行存储在一个或多个非瞬态计算机可读存储介质(例如，存储器1020)中的一个或多个处理器可执行指令，其可以用作存储用于由(多个)处理器1010执行的处理器可执行指令的非瞬态计算机可读存储介质。

在一些实施例中，计算机系统1000还包括向(多个)处理器1010提供信息的测定系统1100。测定系统1100可以使用一个或多个有线或无线通信网络可通信地耦合至(多个)处理器1010。在一些实施例中，(多个)处理器1010可以与测定系统集成在集成设备中。例如，(多个)处理器1010可以在被布置在还包括测定系统1100的设备内的芯片上实现。

测定系统1100可以被配置为对来自患者的生物样本执行测定，以确定样本是否包括包含在一个或多个选择性剪接事件小组中的选择性剪接事件。例如，如果小组包括二十个选择性剪接事件(例如，外显子包含事件)，则测定系统1100可以被配置为确定生物样本是否在小组中表达二十个选择性剪接事件中的任何一个，并且信息可以被提供给(多个)处理器1010。

在一些实施例中，计算机系统1000还包括与(多个)处理器1010通信的用户接口1200。用户接口1200可以被配置为至少部分地基于由测定系统1100提供的测定结果来向医疗保健专业人员提供治疗建议。在一些实施例中，治疗建议可以另外基于与小组中的一个或多个选择性剪接事件相关联的存活信息，从而与仅基于例如由医疗保健专业人员观察到的症状来对患者进行治疗相比，治疗建议被用来以更具个性化或针对性的方式对患者进行治疗。

本文在一般意义上使用术语“程序”或“软件”来指代可以被采用来对计算机或其他处理器(物理或虚拟)进行编程以实现如上所述的实施例的各个方面的任何类型的计算机代码或处理器可执行指令集。另外，根据一个方面，在被执行时执行本文所提供的本公开的方法的一个或多个计算机程序不必驻留在单个计算机或处理器上，而是可以以模块化的方式分布在不同的计算机或处理器之中以实现本文所提供的本公开的各个方面。

处理器可执行指令可以采用一种或多种计算机或其他设备执行的多种形式，诸如程序模块。通常，程序模块包括执行特定任务或实现特定抽象数据类型的例程、程序、对象、组件、数据结构等。通常，程序模块的功能性可以进行组合或分布。

而且，数据结构可以以任何合适的形式被存储在一个或多个非瞬态计算机可读存储介质中。为了说明简单起见，数据结构可以被示为具有通过数据结构中的位置而相关的字段。同样地，可以通过为字段的存储指派非瞬态计算机可读介质中的传达字段之间的关系的位置来实现这种关系。但是，可以使用任何合适的机制来建立数据结构的字段中的信息之间的关系，包括通过使用指针、标签或在数据元素之间建立关系的其他机制。

各种发明概念可以被体现为一个或多个过程，其示例已被提供。可以以任何合适的方式对作为每个过程一部分而被执行的动作进行排序。因此，可以构造各实施例，在其中各动作以与所例示的顺序不同的顺序而被执行，其也可以包括同时执行的一些动作——即使在例示性实施例中被示为顺序的动作。

如本文在说明书和权利要求书中所使用的，在提及一个或多个元素的列表时，短语“至少一个”应被理解为意指从该元素列表中的任何一个或多个元素中选择的至少一个元素，但不一定包括元素列表中具体列出的每个和每一个元素中的至少一个，并且不排除元素列表中的元素的任何组合。该定义还允许除了短语“至少一个”所指代的元件列表内特别标识的元件之外的元件可以可选地存在——无论与特别标识的那些元件有关还是无关。因此，例如，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地，“A和/或B中的至少一个”)可以在一个实施例中指代至少一个(可选地包括一个以上)A，不存在B(并且可选地包括B以外的元素)；在另一个实施例中指代至少一个(可选地包括一个以上)B，不存在A(并且可选地包括A以外的元素)；在又一个实施例中指代至少一个A和至少一个B(可选地包括其他元素)；等等。

在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应被理解为意指这样连接的元素中的“一者或两者”，即在一些情况下共同存在而在其他情况下分开存在的元素。用“和/或”列出的多个元素应以相同的方式进行解释，即，如此连接的元素中的“一个或多个”。除了由“和/或”子句特别标识的元素以外，还可以可选地存在其他元素——无论与特别标识的那些元素有关还是无关。因此，作为非限制性示例，在与诸如“包括”的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用可以在一个实施例中指代仅A(可选地包括除B以外的元素)；在另一个实施例中指代仅B(可选地包括除A以外的元素)；在又一个实施例中指代A和B(可选地包括其他元素)；等等

权利要求中修饰权利要求元素的诸如“第一”、“第二”、“第三”之类的序数术语本身并不意味着一个权利要求元素相对于另一个或时间上的任何优先级、优先权或顺序或者执行方法的动作的时间顺序。此类术语仅被用作标记，以将具有特定名称的一个权利要求元素与具有相同名称(但使用序数术语)的另一元素区分开。本文所使用的措词和术语是出于描述的目的，并且不应被视为限制。“包括”、“包含”、“具有”及其变体的使用意在涵盖其后列出的项目和其他项目。

已经详细描述了本文所描述的技术的若干实施例，本领域技术人员将容易想到各种修改和改进。这样的修改和改进旨在落入本公开的精神和范围内。因此，前面的描述仅是示例性的，而无意是限制性的。该技术仅如所附权利要求书及其等效物所限定。