一株具有高效诱导珊瑚幼虫附着变态作用的印度芽孢杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一株具有高效诱导珊瑚幼虫附着变态作用的印度芽孢杆菌及其应用。印度芽孢杆菌(Bacillus indicus)SCSIO 43739，保藏号：CCTCC NO：M 2020835。本发明从中国海南省三亚鹿回头珊瑚礁区丛生盔形珊瑚中(Galaxea fascicularis)分离获得印度芽孢杆菌(Bacillus indicus)SCSIO 43739，其具有高效诱导珊瑚幼虫附着变态的作用，因此可以用于促进珊瑚幼虫附着变态，从而可以用于珊瑚礁生态修复中。

说明书

技术领域：

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有高效诱导珊瑚幼虫附着变态作用的印度芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

珊瑚礁是世界上最多样化和最复杂的海洋生态系统之一，分布于南纬30度和北纬30度之间的热带和亚热带浅海海域(Stambler,2011)。全球珊瑚礁面积大约30万平方千米，主要分布于印度-太平洋区系和大西洋-加勒比海区系(Stambler,2011)。珊瑚礁通过海岸保护、海洋食品、旅游观光以及海洋药物为人类提供了可观的经济、社会和生态价值(Costanza et al.,2014)。然而，由于全球气候变暖、海表温度上升、海洋酸化以及人类活动的干扰，全球珊瑚礁正面临着严重的退化(Hughes et al.,2003)。过去20年以来，全球珊瑚白化事件造成了数千平方公里的珊瑚和珊瑚礁生物死亡(Hughes et al.,2017)。我国珊瑚礁主要分布于南海海域、海南岛、台湾岛、香港和华南沿岸(如福建、广东和广西沿岸)(Zhang et al.,2001)。自20世纪80年代以来，在沿岸工程建设、破坏性捕捞、水产养殖等人类活动的影响下，同样面临着严峻的衰退形势(蔡玉林等,2018)。珊瑚作为珊瑚礁生态系统的主要造礁生物，其种群数量的动态变化直接影响珊瑚礁生态系统的稳定性。而在珊瑚的生活史中，其幼虫的附着和变态是珊瑚新个体补充的瓶颈，其成功与否直接关系到珊瑚种群数量的变动。因此提高珊瑚幼虫的附着变态率对珊瑚礁群的补充和建设具有重要的生态学意义。

珊瑚是由珊瑚水螅体和多种微生物(包括细菌、真菌、古菌、病毒和原生生物等)组成的共生体。丰富的微生物不仅为珊瑚提供了营养来源、还参与珊瑚的能量代谢和免疫系统的形成(Foo et al.,2017)。此外，已有的研究表明，微生物在珊瑚幼虫的附着变态中也扮演着重要的角色，其可以通过形成生物膜或单种细菌的培养液来发挥作用。如2001年，Negri等人首次从珊瑚钙化藻中分离获得一株假交替单胞菌可以显著诱导威氏鹿角珊瑚(Acropora willisae)和多孔鹿角珊瑚(Acropora millepora)的幼虫发生变态(Negri etal.,2001)。随后陆续从不同的环境中分离获得不同种属的细菌也能诱导不同珊瑚幼虫附着或变态，包括Roseivivax、Thalassomonas、Marinobacter和Cytophaga等属细菌(Ritchieet al.,2012；Shikuma et al.,2014；Sharp et al.,2015)。这些研究结果表明，海洋环境中可能仍存在大量具有诱导能力的菌株有待挖掘。珊瑚礁的保护和修复工作虽然已开展多年，但收效甚微，目前较为成熟的利用珊瑚无性繁殖体来建立苗圃的修复技术，不仅成本高、工作量大，而且受到珊瑚无性繁殖体的限制而不能大规模地培育(Smale et al.,2019；Randall et al.,2020)。因此，筛选获得一株具有高效诱导珊瑚幼虫附着变态、且无毒害的菌株，从而提高珊瑚新个体的补充率，不仅为珊瑚苗圃的培育提供种质资源而且可保护珊瑚的遗传多样性，利于珊瑚礁群的恢复和稳定。

发明内容：

本发明的第一个目的在于提供一株从中国海南省三亚鹿回头珊瑚礁区丛生盔形珊瑚中(Galaxea fascicularis)分离获得的具有高效诱导珊瑚幼虫附着变态作用的印度芽孢杆菌(Bacillus indicus)SCSIO 43739，该菌株于2020年12月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号：CCTCC NO：M 2020835。

通过对印度芽孢杆菌SCSIO 43739的生长曲线进行测定，其结果显示印度芽孢杆菌SCSIO 43739的生长速率快，生长周期短，其在16h逐渐进入平台期。

通过对不同浓度印度芽孢杆菌SCSIO 43739的诱导效果进行验证，其结果显示当菌株的作用终浓度为3.2×10

因此本发明的第二个目的是提供上述印度芽孢杆菌SCSIO 43739或含有印度芽孢杆菌SCSIO 43739的微生物制剂在珊瑚礁生态修复中的应用。

优选，所述的在珊瑚礁生态修复中的应用是诱导珊瑚幼虫附着变态。

优选，所述的珊瑚幼虫为鹿角杯形珊瑚(Pocillopora damicornis)幼虫。

进一步优选，是将鹿角杯形珊瑚幼虫放入浓度为3.2×10

本发明的第三个目的是提供一种诱导珊瑚幼虫附着变态的微生物制剂，其含有印度芽孢杆菌SCSIO 43739作为活性成分。

本发明从中国海南省三亚鹿回头珊瑚礁区丛生盔形珊瑚中(Galaxeafascicularis)分离获得印度芽孢杆菌(Bacillus indicus)SCSIO 43739，其具有高效诱导珊瑚幼虫附着变态的作用，因此可以用于促进珊瑚幼虫变态，从而可以用于珊瑚礁生态修复中。

印度芽孢杆菌(Bacillus indicus)SCSIO 43739于2020年12月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2020835。

附图说明：

图1是印度芽孢杆菌SCSIO 43739的系统进化发育树；

图2是印度芽孢杆菌SCSIO 43739的生长曲线；

图3是不同浓度的印度芽孢杆菌SCSIO 43739对鹿角杯形珊瑚幼虫附着变态的影响。

具体实施方式：

以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍，但不是对本发明的限制。

实施例1：印度芽孢杆菌SCSIO 43739的分离、纯化和鉴定

菌株的分离：印度芽孢杆菌SCSIO 43739于2017年11月，从中国海南省三亚鹿回头珊瑚礁区中采集的丛生盔形珊瑚中分离、纯化获得，用50％的甘油保存于-80℃中。

印度芽孢杆菌SCSIO 43739的16s序列的鉴定：利用细菌DNA提取试剂盒(Takara，日本)提取印度芽孢杆菌SCSIO 43739菌株基因组DNA，Nannodrop1000测定DNA的纯度和浓度，将质量合格的DNA进行16srRNA基因的扩增，扩增引物分别为：正向引物为27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，反向引物为1492R(5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)；PCR扩增体系为：TaqPCR mix 12.5μl，DNA模板1μl，引物27F/1492R各0.5μl，dd H

实施例2

一、印度芽孢杆菌SCSIO 43739的活化

将保存于-80℃的印度芽孢杆菌SCSIO 43739取出，室温下解冻，颠倒混匀，取200ul菌液涂布于2216E固体培养基上，放置28℃培养箱中培养，挑取单菌落进行平板划线，备用。

其中2216E固体培养基的成分如下：

2216E固体培养基的组成：胰蛋白胨5g，酵母提取物1g，FePO

二、印度芽孢杆菌SCSIO 43739菌体的制备

菌体的制备：挑取平板上的印度芽孢杆菌SCSIO 43739单菌落接种于MA液体培养基，放于摇床中培养(32℃，180rpm)。待菌液培养至浑浊状态，8000rpm离心5min去除上清液，即得实验菌体。

其中MA液体培养基的成分如下：

MA液体培养基的组成：Difco Marine Broth 18g，NaCl 9g，ddH

三、印度芽孢杆菌SCSIO 43739生长曲线的绘制

菌株生长曲线的绘制：将印度芽孢杆菌SCSIO 43739单菌落接种至250ml MA液体培养基，放于28℃180rpm摇床中培养。4h后取第一次样，后续每2h进行一次取样，使用分光光度计测定600nm处的OD值，使用MA液体培养基进行调零校准，每次做3个重复。结果如图2所示，随着培养时间的增加，印度芽孢杆菌SCSIO 43739的数量逐渐增加，于4h后开始进入对数式生长，在16h逐渐进入平台期，培养至18h的菌体数量最多，此时的OD

四、印度芽孢杆菌SCSIO 43739最佳诱导浓度的筛选

最佳诱导浓度的筛选：挑取印度芽孢杆菌SCSIO 43739单菌落接种于MA液体培养基，放于摇床中培养(32℃，180rpm)。待菌液培养至平台期，8000rpm离心5min去除上清液，使用0.2μm工业滤袋过滤的海水进行重悬，并稀释为6个浓度梯度，分别加入到6孔培养板中，菌株的6个终浓度分别为：3.2×10

以上仅是本发明的优选实施方式，需要说明的是，上述实施方式不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 一株具有高效诱导珊瑚幼虫附着变态作用的印度芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1411

<212> DNA

<213> 印度芽孢杆菌SCSIO 43739 (Bacillus indicus)

<400> 1

tgcaagtcga gcggacctct tcggaggtca gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggcaa 60

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggagct aataccggat actatgtcaa 120

accgcatggt ttgacattca aagacggttt cggctgtcac ttacagatgg gcccgcggcg 180

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