与脑梗死相关的代谢标志物及其在诊疗中的应用

摘要

本发明公开了与脑梗死相关的代谢标志物及其在诊疗中的应用。与健康对照相比，代谢标志物在脑梗死中的呈现显著性差异。本发明同时公开了以代谢标志物作为检测变量，ROC曲线具有较高的曲线下面积，提示所述代谢标志物应用于脑梗死的诊断具有较高的准确性。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及与脑梗死相关的代谢标志物及其在诊疗中的应用。

背景技术

脑梗死(cerebral infarction，CI)又称缺血性脑卒中，是指由于各种原因所致脑部血液供应障碍，使局部脑组织发生不可逆性损害，导致脑组织缺血缺氧性坏死，出现相应的神经功能缺损。随着我国社会人口老年化加快，发病率不断上升的脑血管疾病，严重影响着患者的健康和生活质量，给患者及其家庭带来了沉重的负担。脑梗死约占所有脑血管疾病的70％-80％，是最常见的脑血管疾病。一直以来认为神经功能损伤是不可逆的，神经损伤的治疗是多种神经系统疾病治疗的共同关键，也是临床上的难题。因此，研究如何预防及早期诊断脑梗死具有重要意义。

代谢组学(Metabolomics，Metabonomics)是指生物体系因生物刺激病理生理扰动或遗传信息改变等引起的总体动态的代谢变化。代谢组学作为系统生物学最下游的组学，是整体性研究生命体系功能变化的重要学科分支。代谢组学的研究对象为复杂的生物体系，种类非常多，常见的生物样本包括生物体液(尿液血清、血浆、唾液、胆汁、脑脊液、羊水、眼泪、胰液、肠液等)动物或人体组织(肿瘤、肝脏、脑、脂肪组织等)和细胞(Gika H G，ZisiC，Theodoridis G，Wilson I D.J.Chromatogr.B，2016，1:15-25)。代谢组学常用的研究手段包括质谱和核磁两大类，随着生物技术的发展，检测手段也不断更新，从而为代谢组学研究的全面展开奠定了基础。代谢组学已被广泛应用于疾病诊断、药物研究、营养学、毒理学、运动医学等领域。运用代谢组学技术考察和分析与疾病相关的代谢物的变化，对于探究病证本质，阐明药物作用机理有极大的助益。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供与脑梗死相关的代谢标志物，通过检测代谢标志物的水平，可以判断患者是否患有脑梗死，从而为脑梗死的早期诊断提供一种新的手段。

本发明的目的之二，在于提供一种诊断脑梗死的系统。

本发明的目的之三，在于提供一种诊断脑梗死的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案:

本发明提供了代谢物在制备早期诊断脑梗死的试剂盒中的应用，所述代谢物包括PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))。

进一步，所述代谢物还包括PE(P-18:0/18:2(9Z,12Z))和/或吲哚乙酸。

进一步，所述试剂盒包括检测样本中所述代谢物水平的试剂。

进一步，所述试剂包括通过靶向或非靶向的核磁共振法、色谱法、光谱法、质谱法检测样本中代谢物含量的试剂。

其中，所述样本是生物学样本。生物来源的样本(即生物学样本)通常包含多种代谢物。待用于本发明方法的优选实验样本是来自体液，优选来自血液、血浆、血清、淋巴、汗、唾液、眼泪、精液、阴道液体、粪便、尿液或脑脊液的样本，或来自例如通过活体解剖来自细胞、组织或器官的样本。这也包括包含亚细胞区室或细胞器(如线粒体、高尔基体网络或过氧化物酶体)的样本。此外，生物学样本也包括气体样本，如生物体的挥发物。生物学样本来自如此处其他地方具体说明的受试者。用于获得上述不同类型生物学样本的技术为本领域所熟知。例如，通过血液采集获得血液样本，通过尿液采集获得尿液样本。

优选地，在上述样本用于本发明方法前将其预处理。所述预处理可包括释放或分离化合物，或去除多余物质或废物所需要的处理。合适的技术包含离心、萃取、分馏、纯化和/或富集化合物。此外，进行其他预处理以提供适合于化合物分析的形式或浓度的化合物。例如，如果气相层析偶联质谱用于本发明的方法，将需要在所述气相层析前衍生化化合物。合适并必要的预处理依赖于进行本发明方法的工具并为本领域技术人员所熟知。如前描述的预处理的样本也包含在如本发明所用的术语“样本”中。

进一步，所述样本选自血液、血清、血浆。

在从已知未患有脑梗死的受试者或群体中获得参考结果的情况下，可以基于从试验样本中获得的试验结果与上述参考结果的差异，即基于关于至少一种代谢物的定性或定量组成中的差异来诊断所述疾病或易感性。差异可以是代谢物绝对或相对量的增加(有时称作代谢物上调)或代谢物所述量的减少或无可检测的量(有时称作代谢物下调)。优选地，相对或绝对量的差异是显著的，即在45到55百分位数、40到60百分位数、30到70百分位数、20到80百分位数、10到9百分位数、5到95百分位数的参考值区间外。相对量改变的优选值(即“倍数”变化)或改变类型(即导致更高或更低相对量和/或绝对量的“上”调或“下”调)。如果指定代谢物在受试者中是“上调的”，相对和/或绝对量将增加，如果其为“下调的”，代谢物的相对和/或绝对量将减少。此外，“倍数”变化表示增加或减少的程度，例如，2倍的增加指与参考相比，所述量是代谢物量的两倍。

因此，在优选实施方案中包括来自已知患有脑梗死的受试者或组的参考，或已知具有其易感性的受试者或组的参考。最优选地，试验样本和所述参考的相同或相似结果(即所述至少一种代谢物相似的相对或绝对量)在该情况下指示脑梗死或其易感性。在本发明另一个优选实施方案中，所述参考来自已知未患有脑梗死的受试者或已知不具有其易感性的受试者，或者所述参考是可计算参考。

本发明提供了一种诊断脑梗死的试剂盒，所述试剂盒包括检测样本中代谢物PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PE(P-18:0/18:2(9Z,12Z))或吲哚乙酸水平的试剂。

进一步，所述试剂包括通过靶向或非靶向的核磁共振法、色谱法、光谱法、质谱法检测样本中代谢物水平的试剂。

进一步，所述色谱法包括GC，CE，LC，HPLC和UHPLC；光谱法包括UV/Vis，IR，NIR和NMR；其中，GC＝气相色谱，CE＝毛细管电泳，LC＝液相色谱，HPLC＝高度液相色谱，UHPLC＝超高效液相色谱，UV-Vis＝紫外可见，IR＝红外，NIR＝近红外，NMR＝核磁共振。

质谱法包括例如串联质谱法、基质辅助激光解吸电离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱法、MALDI-TOF-TOF质谱法、MALDI四极杆-飞行时间(Q-TOF)质谱法、电喷射离子化(ESI)-TOF质谱法、ESI-Q-TOF、ESI-TOF-TOF、ESI-离子阱质谱法、ESI三重四极杆质谱法、ESI傅立叶变换质谱法(FTMS)、MALDI-FTMS、MALDI-离子阱-TOF和ESI-离子阱TOF。以其最基本的水平，质谱法涉及使分子电离和随后测量所得离子的质量。由于分子以公知的方式电离，可以精确地由离子的质量确定分子的分子量。

串联质谱法涉及首先获得所关注的离子的质谱，随后破碎该离子并获得片段的质谱。串联质谱法因此提供分子量信息和破碎谱，其可一起结合分子量信息使用以识别肽或蛋白质或小分子(低于1500道尔顿)的确切序列。

本发明提供了代谢物在构建预测脑梗死的计算模型或嵌入所述计算模型的系统或装置中的应用，所述代谢物包括PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))；或其与PE(P-18:0/18:2(9Z,12Z))或吲哚乙酸的组合。

正如熟练技术人员会领会的，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合代谢物和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于脑梗死的风险或与有助于评估脑梗死患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有脑梗死风险的个体、具有脑梗死的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。

用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(DA)(即线性、二次、规则DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估脑梗死中使用的数学算法的统计方法选自DA(即线性、二次、规则判别分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。

接受者操作曲线下面积(＝AUC)是诊断规程的性能或精确性的一项指标。诊断方法的精确性由它的接受者操作特征(ROC)描述得最好。ROC图是源自在观察的整个数据范围上连续改变决策阈的所有灵敏度/特异性对的线图。

实验室测试的临床性能取决于它的诊断精确性，或将受试者正确分类入临床有关亚组的能力。诊断精确性测量测试正确辨别所调查的受试者的两种不同状况的能力。此类状况是例如健康和疾病或者疾病进展对无疾病进展。

在每种情况中，ROC线图通过对于决策阈的整个范围将灵敏度对1-特异性绘图来描绘两种分布之间的交叠。y轴上是灵敏度，或真阳性分数[定义为(真阳性测试结果的数目)/(真阳性的数目+假阴性测试结果的数目)]。这也称作疾病或状况的存在的阳性。它仅仅自受影响亚组来计算。x轴上是假阳性分数，或1-特异性[定义为(假阳性结果的数目)/(真阴性的数目+假阳性结果的数目)]。它是特异性的一项指标，而且完全自不受影响的亚组来计算。因为真和假阳性分数通过使用来自两个不同亚组的测试结果完全分开计算，所以ROC线图不依赖于样品中疾病的流行程度。ROC线图上的每个点代表一个对应于特定决策阈的灵敏度/1-特异性对。一项具有完美区分(两种结果分布没有交叠)的测试具有通过左上角的ROC线图，那里真阳性分数为1.0，或100％(完美灵敏度)，且假阳性分数为0(完美特异性)。一项不区分(两个组的结果分布相同)的测试的理论线图是从左下角到右上角的45°对角线。大多数线图落在这两种极端之间。(如果ROC线图完全落在45°对角线以下，那么这容易通过将“阳性”的标准从“大于”颠倒成“小于”或反之来矫正。)定性地，线图越接近左上角，测试的整体精确性越高。

量化实验室测试的诊断精确性的一项便利目标是通过单一数值来表述它的性能。最常见的全局度量是ROC曲线下面积(AUC)。常规地，此面积总是≥0.5(如果不是这样，那么可以颠倒决策规则来使之这样)。数值范围介于1.0(完美分开两个组的测试值)和0.5(两个组的测试值之间没有明显分布差异)之间。面积不仅取决于线图的特定部分诸如最接近对角线的点或90％特异性处的灵敏度，而且还取决于整个线图。这是ROC线图如何接近完美者(面积＝1.0)的一种定量、描述性表述。

整体测定法灵敏度会取决于实施本文公开的方法要求的特异性。在某些优选设置中，特异性75％可能是充分的，而且统计方法和所得算法可以基于此特异性要求。在一个优选实施方案中，用于评估有脑梗死风险的个体的方法基于特异性80％、85％、或还优选90％或95％。

本发明提供了一种系统，包含：

1)用于测定样本中代谢物PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))特征值的工具；

2)比较样本中代谢物特征值的工具；

3)数据存储介质；

其中，所述代谢物包括PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))；或

PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))与PE(P-18:0/18:2(9Z,12Z))；或

PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))与吲哚乙酸；或

PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))与PE(P-18:0/18:2(9Z,12Z))和吲哚乙酸。

本发明中的数据存储介质存储数据集合，术语“数据集合”指在物理上和/或逻辑上集合的数据集合。因此，数据集合可落实到单个数据存储介质中或彼此有效连接的物理上分离的数据存储介质中。优选地，数据集合落实到数据库中。因此，如此处所用的数据库包含在合适的存储介质上的数据集合。此外，数据库优选还包含数据库管理系统。数据库管理系统优选为基于因特网的分级数据库管理系统或面对对象数据库管理系统。此外，数据库可以是联合数据库或集成数据库。更优选地，数据库将落实为分布式(联合)系统，例如Client-Server-System。更优选地，构造数据库以允许搜索算法来比较试验数据组和包含数据集合的数据组。尤其是，通过使用此类算法，可以搜索数据库(即查询搜索)得到指示脑梗死或其易感性的相似或相同数据组。因此，如果可以在数据集合中鉴定到相同的或相似的数据组，试验数据组将与脑梗死或其易感性相关。结果，从数据集合中获得的信息可以基于从受试者获得的试验数据组用于诊断脑梗死或其易感性。更优选地，数据集合包含上文记载的任何一组包含的所有代谢物的特征值。

术语“数据存储介质”包括基于单个物理实体如CD、CD-ROM、硬盘、光存储介质或磁盘的数据存储介质或者云盘。此外，所述术语还包括由物理分离实体组成的数据存储介质，所述物理分离实体以提供上述数据集合的方式，优选以查询搜索的合适方式彼此有效连接。

本发明中的“系统”涉及彼此有效连接的不同工具。所述工具可落实到单个装置中或可以是彼此有效连接的物理上分离的装置。用于比较代谢物特征值的工具优选基于用于比较的算法而进行运作。数据存储介质优选包含上述数据集合或数据库，其中存储数据组的每一组指示脑梗死或其易感性。因此，本发明的系统允许鉴定存储在数据存储介质中数据集合是否包含试验数据组。结果，本发明的系统可用作诊断脑梗死或其易感性的诊断工具。

在系统的优选实施方案中，包含用于测定样本代谢物特征值的工具。

术语“用于测定代谢物特征值的工具”优选涉及用于测定代谢物的如质谱分析装置、NMR装置，或进行代谢物化学或生物测定的装置。

此外，本发明涉及诊断工具，其包含用于测定选自上述提及组中任何一组的至少一种代谢物的工具。

本发明提供了代谢物在制备治疗脑梗死的药物组合物中的应用，所述代谢物包括PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))或吲哚乙酸。

进一步，所述药物组合物包括代谢物PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))的抑制剂，或PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))、吲哚乙酸的促进剂，抑制剂是指能够使上调差异代谢物下调的物质，促进剂是指能使下调差异代谢物上调的物质。

术语“代谢物”是指代谢的中间产物和最终产物，(也有时称为具有小于1500道尔顿的分子量的小分子或分析物)。代谢物被分类为直接参与正常生长、发育和繁殖的初级代谢物。次级代谢物不直接参与后面的过程，但可以具有重要的生态学功能(例如，抗生素、色素)。代谢物的示例性生物学功能包括作为生物合成途径中的中间或终点产物或作为细胞信号分子。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了与脑梗死相关的代谢标志物-PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))或吲哚乙酸。通过检测上述代谢标志物的水平，可以判断受试者是否患有脑梗死以及患脑梗死的风险，以期实现脑梗死的早期的诊断，从而在脑梗死早期进行干预治疗，提高患者的生存质量。使用上述标志物进行脑梗死的诊断，能有效的区分脑梗死患者与健康对照，具有较高的敏感性和特异性。

附图说明

图1是各组色谱总离子流图，其中，图A是反向色谱正离子各组总离子流图，图B是反向色谱负离子各组总离子流图，图C是亲水色谱正模式各组总离子流图；图A、B、C中的上部分为脑梗死的总离子流图，下部分为健康对照的总离子流图。

图2是OPLS-DA统计分析图，其中图A是反向色谱正离子统计分析图；图B是反向色谱负离子统计分析图；图C是亲水色谱正离子统计分析图。

图3是代谢物的诊断效能图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例 脑梗死相关代谢物的筛选及效能判断

1、样本收集

收集21例硬化脑梗死患者及18例健康对照的血液样本。

脑梗死组纳入标准：

1)受试者已签署知情同意书

2)符合《中国急性缺血性脑卒中诊疗指南(2014版)》急性脑梗死诊断标准。

3)年龄18-65周岁。

4)BMI 18.5-23.9kg/m

5)血常规：红细胞计数、MCHC、血红蛋白、白细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数在正常范围。

6)TG、TC、HDL-C、LDL-C、血糖、糖化血红蛋白在正常范围。

排除标准：

1)合并其他疾病：神经系统疾病(既往脑梗死、脑出血、多发性硬化等)；各种慢性消化系统疾病，3个月内患有急性消化系统疾病；循环系统疾病(冠心病、心力衰竭、房颤)；呼吸系统疾病(慢性阻塞性肺疾病、慢性支气管炎、哮喘)；代谢性疾病(肥胖、高脂血症、糖尿病、代谢综合征、骨质疏松症)；泌尿系统疾病(慢性肾脏病、肾衰竭、肾结石)；血液系统疾病(贫血)；其他(痛风、抑郁、精神疾病、慢性疲劳综合征、纤维肌痛症、食物过敏、肿瘤)。

2)既往有输血史、消化系统疾病手术史及外伤史。

3)心电图异常的患者。

4)3个月内服用以下药物：抗生素、泻药、氯硝西泮、性激素类药物、口服避孕药、美沙拉嗪、TNF-α抑制剂、免疫抑制剂、抗抑郁药、PPI、卢帕他定、阿片类、钙剂、维生素D、二甲双胍、叶酸、β-交感神经吸入剂、中药。

5)3个月内服用益生菌制剂。

6)本次发病前应用抗血小板及他汀类药物。

7)进行静脉溶栓和血管内介入治疗的患者。

8)妊娠期或哺乳期妇女。

9)本研究期间，患者已入选或计划入选另一项临床药物或装置/干预性研究。

健康对照组纳入标准：

1)受试者已签署知情同意书。

2)年龄18-65周岁。

3)BMI 18.5-23.9kg/m

4)血常规：红细胞计数、MCHC、血红蛋白、白细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数在正常范围。

5)TG、TC、HDL-C、LDL-C、血糖、糖化血红蛋白在正常范围。

排除标准：

1)存在其他疾病：神经系统疾病(脑梗死、脑出血、多发性硬化等)；各种慢性消化系统疾病，3个月内患有急性消化系统疾病；循环系统疾病(冠心病、心力衰竭、房颤)；呼吸系统疾病(慢性阻塞性肺疾病、慢性支气管炎、哮喘)；代谢性疾病(肥胖、高脂血症、糖尿病、代谢综合征、骨质疏松症)；泌尿系统疾病(慢性肾脏病、肾衰竭、肾结石)；血液系统疾病(贫血)；其他(痛风、抑郁、精神疾病、慢性疲劳综合征、纤维肌痛症、食物过敏、肿瘤)。

2)既往有输血史、消化系统疾病手术史及外伤史。

3)心电图异常。

4)3个月内服用以下药物：抗生素、泻药、氯硝西泮、性激素类药物、口服避孕药、美沙拉嗪、TNF-α抑制剂、免疫抑制剂、抗抑郁药、PPI、卢帕他定、阿片类、钙剂、维生素D、二甲双胍、叶酸、β-交感神经吸入剂、中药、抗血小板药物及他汀类药物。

5)3个月内服用益生菌制剂。

6)妊娠或哺乳期妇女。

7)本研究期间，受试者已入选或计划入选另一项临床药物或装置/干预性研究。

2、非靶向代谢组学检测

2.1 血清样本制备

2.1.1 反相色谱分析血清样本处理方法

1)血浆/血清样本在4℃的冰融化为30-60min。

2)取40μl血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入300μl的甲醇和1ml甲基叔丁基醚。

3)充分振荡15s，进行蛋白沉淀。12000rpm，4℃，离心10min，取上层溶液100μl，置于200μl内衬管中，待测。

2.1.2 亲水色谱分析血清样本处理方法：

1)血浆/血清样本在4℃的冰融化为30-60min。

2)取50μl血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入150μl的乙腈。

3)充分振荡15s，进行蛋白沉淀。12000rpm，4℃，离心10min，取上层溶液100μl，置于200μl内衬管中，待测。

2.2 色谱条件

色谱分离采用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱使用反相色谱和亲水色谱对血清样本进行分析。

2.2.1 反相色谱分离条件

色谱柱:waters UPLC HSS T3(1.8μm 2.1mm*100mm)；

流动相:A(乙腈/水4:6，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)和B(乙腈/异丙醇9:1，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)；

洗脱程序：见表1；

流速：0.3ml/min；

进样量为1.0μL；

柱温：50℃。

表1 C18反相色谱测定洗脱程序

2.2.1 亲水色谱分离条件

色谱柱:waters UPLC BEH Amide(1.7μm 2.1mm*100mm)；

流动相:A(乙腈，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)和B(水，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)；

洗脱程序：见表2；

流速：0.3ml/min；

进样量：1.0μL；

柱温：40℃。

表2 HILIC测定极性小分子洗脱程序

2.3 质谱条件

质谱分析采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪。正负离子离子源电压分别为3.7kv和3.5kV。毛细管加热温度320℃。翘气压力30psi，辅助气压力10psi。容积加热蒸发温度300℃。翘气和辅助气均为氮气。碰撞气为氮气，压力为1.5mTorr。一级全扫描参数为：分辨率70000，自动增益控制目标为1×10

3、靶向代谢组学检测

3.1 血清样本处理方法

1)血浆样本于4℃放置30min解冻。

2)取50μl血浆样本至1.5ml离心管中，加入150μl的甲醇(含有吲哚乙酸-D2500ppb，吲哚丙酸-D2 50ppb组成)，旋涡震荡30min。

3)12000rpm离心5min，取上清液100μl，置于200μl内衬管中，待测。

3.2 色谱条件

色谱分离采用Waters ACQUITY UPLC I-CLASS超高压液相色谱系统，色谱分离条件如下：

色谱柱:Waters UPLC BEH C8(1.7μm 2.1mm*100mm)；

流动相:A(水，0.5Mm NH

洗脱梯度：见表3；

流速：0.3ml/min；

进样量：1.0μL；

柱温：45℃。

表3 洗脱程序

3.3 质谱条件

质谱分析仪器为Waters公司XEVO TQ-XS型串联四级杆质谱仪。正离子离子源电压为3kv，锥孔电压为20V。去溶剂温度550℃，源温度150℃。去溶剂气流速1000L/Hr，锥孔气流速7L/h。

3.4靶向代谢组数据处理

靶向代谢组数据峰面积计算采用masslynx定量软件，保留时间允许误差15s。浓度计算采用单点同位素内标法获取定量结果。

4、数据处理

4.1 数据质控

为了评价样品采集过程中系统的稳定性和重复性，使用了质控样本。质控样本是所有样本均移取固定体积混合均匀后得到的。指控样本的前处理方法和其他样品一样。为了得到可信赖的且可重复性的代谢物，三个因素需要考虑：1)保留时间，2)信号强度，3)质量准确度。本次实验首先采用5个空白样本平衡色谱柱，再采用3个质控样本平衡柱条件。然后每间隔6-8个样本插入1个质控样本用于监测整个液质系统的稳定性和重复性。同时计算质控样本中提取的代谢特征的变异系数值，变异系数超过15％的代谢特征被删除。

4.2 PCA分析

所有采集好的数据，无论是何种分离模式或是正负离子模式，均采用ProgenesisQI软件处理，包括的步骤依次为导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理，最终形成保留时间、质荷比和峰强度的表格。反相色谱和亲水色谱提取峰的时间依次为1至16和1至12min。各种添加剂离子如加氢和加钠等均去卷积到每一个离子特征。代谢物鉴定采用人类代谢组数据库和脂质数据库进行一级分子量匹配。

4.3 OPLS-DA分析

为了获得在脑梗死组和健康对照组呈现显著差异的代谢物信息，进一步采用监督性的多维统计方法即偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)对两组样本进行统计分析。

采用OPLS-DA模型的VIP(Variable Importance in the Projection)值(阈值>1)，并结合t-test的p值(p＜0.05)来寻找差异性表达代谢物。差异性代谢物的定性方法为：搜索在线数据库(HMDB)(比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量mass，误差限制0.01Da)。

4.4 ROC分析

根据代谢物的水平，使用spss绘制受试者工作特征曲线(ROC)，计算二项精确置信空间，分析差异代谢物的诊断效能。

5、结果

脑梗死组与健康对照组各组反相色谱正离子和负离子、亲水色谱正的总离子流图如图1所示。

质控结果显示，质控样本相对聚集在一起，系统重复性较好，所采集的数据可以进行进一步的研究。

反向色谱正离子、反向色谱负离子、亲水色谱正离子的结果分别如表4和图2所示。

表4 OPLS-DA分析模型参数

差异分析结果显示，与健康对照组相比，PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))在脑梗死组的水平显著增加，PE(P-18:0/18:2(9Z,12Z))或吲哚乙酸在脑梗死组的水平显著降低。

PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))平均水平(健康对照组vs脑梗死组)：1432268055vs 2115933920；

PE(P-18:0/18:2(9Z,12Z))平均水平(健康对照组vs脑梗死组)：6516422.011vs3623222.165；

吲哚乙酸平均水平(健康对照组vs脑梗死组)：453.899vs 124.657。

使用ROC曲线来分析PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))、或其与PE(P-18:0/18:2(9Z,12Z))或吲哚乙酸联合的诊断效能分别如图3和表5所示，1-4的cutoff值分别为：0.684、0.637、0.727、0.500；1-4的都具有较高的准确性(曲线下面积均大于0.8)，其中，1-4表示如下：

1：PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))；

2：PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))+PE(P-18:0/18:2(9Z,12Z))；

3：PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))+吲哚乙酸；

4：PC(16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))+PE(P-18:0/18:2(9Z,12Z))+吲哚乙酸。

表5 代谢标志物的曲线下面积

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。