使用富集有功能性线粒体的干细胞的线粒体增强疗法

摘要

本发明提供了富集有健康的功能性线粒体的干细胞和利用此类细胞在需要的对象中缓解包括衰老和年龄相关疾病以及抗癌疗法的衰弱效应在内的令人衰弱的病症的治疗方法。

说明书

技术领域

本发明涉及富集有功能性线粒体的干细胞，以及利用此类细胞减轻包括衰老和年龄相关疾病在内的各种不同病症的虚弱效应以及抗癌疗法治疗的虚弱效应的治疗方法。

背景技术

线粒体是存在于大多数真核细胞中，直径在0.5至1.0μm范围内的膜约束的细胞器。线粒体存在于几乎所有真核细胞中，其数目和位置随着细胞类型而变。线粒体含有它们自己的DNA(mtDNA)和自己的用于合成RNA和蛋白质的机制。mtDNA仅含有37个基因，因此哺乳动物体内的大多数基因产物由核DNA编码。

线粒体在真核细胞中执行大量必不可少的任务，例如丙酮酸氧化、克雷布斯循环以及氨基酸、脂肪酸和甾类的代谢。然而，线粒体的主要功能是利用电子传递链和氧化磷酸化系统(“呼吸链”)产生作为三磷酸腺苷(ATP)的能量。线粒体参与的其他过程包括产热、钙离子储存、钙信号传导、程序化细胞死亡(凋亡)和细胞增殖。

细胞内的ATP浓度通常为1–10mM。ATP可以使用单糖和复合糖(碳水化合物)或脂类作为能源通过氧化还原反应来生产。对于将要用于合成ATP的复杂燃料来说，首先需要将它们分解成更小的、更简单的分子。复杂的碳水化合物被水解成单糖例如葡萄糖和果糖。脂肪(甘油三酯)被代谢以给出脂肪酸和甘油。

将葡萄糖氧化成二氧化碳的总过程被称为细胞呼吸，并且从单个葡萄糖分子可以产生约30个ATP分子。ATP可以通过大量不同的细胞过程产生。在真核生物体中用于产生能量的三个主要途径是糖酵解和柠檬酸循环/氧化磷酸化(两者均为细胞呼吸的组分)以及β-氧化。非光合真核生物的这种ATP生产大部分发生在线粒体中，所述线粒体可以占典型细胞总体积的接近25％。已知各种不同的线粒体障碍由线粒体DNA中的缺陷基因引起。

属于本发明人的WO 2016/135723公开了用于治疗线粒体疾病的线粒体富化的哺乳动物骨髓细胞。

US 2012/0058091公开了与线粒体障碍相关的诊断和治疗性治疗。所述方法包括将异源线粒体显微注射到卵母细胞或胚胎细胞中，其中所述异源线粒体能够在所述卵母细胞或胚胎细胞中实现至少正常水平的线粒体膜电位。

WO 2001/046401公开了通过跨物种核移植产生的胚胎或类干细胞。核转移效率通过引入相容的细胞质或线粒体DNA(与供体细胞或核相同或相似的种类)来增强。

WO 2013/002880描述了包含生物能药剂的组合物和方法，其用于恢复衰老的卵母细胞的质量、增强卵原干细胞或改善其衍生物(例如细胞质或分离的线粒体)，以用于增强生育力的程序中。

US 20130022666提供了包含脂类载体和线粒体的组合物以及将外源线粒体递送到细胞的方法和在需要的哺乳动物对象中治疗与线粒体功能障碍相关的障碍或逆转所述障碍的发展的方法。

WO 2017/124037涉及包含分离的线粒体或合并的线粒体药剂的组合物以及使用此类组合物治疗障碍的方法。

US 20080275005涉及线粒体靶向性抗氧化化合物。所述发明的化合物包含共价偶联到抗氧化组成部分的亲脂性阳离子。

US 9855296描述了一种在需要的人类对象中增强心或心血管功能的方法，所述方法包括向所述对象给药足以增强所述心或心血管功能的量的包含分离的且基本上纯的线粒体的药物组合物，其中所述线粒体是同系线粒体或同种异体线粒体。

US 9603872提供了用于在由线粒体功能障碍引起的障碍的治疗中进行线粒体替换的方法、药剂盒和组合物。所述发明还描述了在线粒体结构异常的基础上诊断神经精神(例如双相障碍)和神经变性障碍的方法。

US 20180071337公开了一种治疗性组合物，其包含从细胞分离的人类线粒体和可药用赋形剂，其中所述线粒体可以与或不与至少一种多肽或糖蛋白一起存在于包含脂质双层的载体、囊泡或脂质体中。

US 20010021526提供了与线粒体缺陷相关的疾病的细胞和动物模型。描述了作为模型系统用于研究与线粒体缺陷相关的障碍的胞质杂种细胞系。

属于本发明人的WO 2013/035101涉及线粒体组合物和使用它们的治疗方法，并公开了部分纯化的功能性线粒体的组合物和使用所述组合物治疗从线粒体功能提高获益的病症的方法，所述方法包括向需要的对象给药所述组合物。

已报道了诱导线粒体转移到宿主细胞或组织中的尝试。大多数方法需要通过注射进行线粒体的主动转移(例如McCully等，Am J Physiol Heart Circ Physiol.2009,296(1):H94-H105)。被吞没在媒介物例如脂质体内的线粒体的转移也是已知的(例如Shi等，Ethnicity and Disease,2008；18(S1):43)。

已显示，线粒体转移可以在体外在细胞之间自发发生，尽管只能确定是mtDNA而不是完整的功能性线粒体被转移(例如Plotnikov等，Exp Cell Res.2010,316(15):2447-55；Spees等，Proc Natl Acad Sci,2006；103(5):1283-8)。也已证实了通过胞吞或内化进行的体外线粒体转移(Clark等，Nature,1982:295:605-607；Katrangi等，RejuvenationResearch,2007；10(4):561-570)。

US 20110105359提供了采取自维持体形式的细胞以及细胞和亚细胞级分的低温冻存的组合物。另一方面，在早期再灌注期间为提供心脏保护而注射分离的线粒体的尝试显示心脏保护需要新鲜分离的线粒体，因为冷冻的线粒体无法提供心脏保护，并且与新鲜分离的线粒体相比表现出明显降低的氧消耗量(McCully等，同上)。

WO 2016/008937涉及将从供体细胞群体分离的线粒体细胞间转移到受体细胞群体中的方法。所述方法对一定量的线粒体显示出提高的转移效能。

US 2012/0107285涉及细胞的线粒体增强。某些实施方式包括但不限于修饰干细胞的方法或将修饰的干细胞给药到至少一个生物组织的方法。

衰老是许多人类疾病的最大已知风险因素之一。年龄相关疾病是最常见的疾病，随着衰老的增加其频率增加。本质上，年龄相关疾病是由衰老引起的并发症。年龄相关疾病应该与衰老过程本身区分开，因为所有成年动物都会衰老，但并非所有成年动物都会经历年龄相关疾病。

线粒体质量和活性的下降已与正常衰老相关联，并与广范围的年龄相关疾病的发生相关。线粒体对衰老过程的特定方面包括细胞衰老、慢性炎症和干细胞活性的年龄依赖性下降有贡献。大量的支持性证据表明，由于线粒体DNA突变的积累，线粒体功能障碍随着衰老而发生。已显示，在人类脑、心脏、骨骼肌和肝组织中，各种不同的线粒体DNA点突变随衰老而显著增加。在动物模型和人类两者中，也已报道线粒体DNA缺失/插入的频率随着年龄增加而提高。据推测，复制周期和线粒体DNA突变的积累可能是干细胞衰老背后的保守机制，使得线粒体影响或调控衰老的许多关键方面(Sun等，Cell,2016,61:654-66；Srivastava,Genes,2017,8:398；Ren等，Genes,2017,8:397)。

癌症由身体的器官或组织中异常细胞的不受控制的增殖引起。各种不同类型的癌症治疗是可用的，包括：手术，化疗，放疗，免疫疗法，靶向疗法，激素疗法或干细胞移植。所述癌症治疗常常引起严重不良效应，包括：疲劳，恶心和呕吐，贫血，腹泻，食欲不振，血小板减少，谵妄，脱发，生育问题，周围神经病，疼痛，淋巴水肿。这些虚弱效应显著降低癌症患者的生活质量。使用骨髓细胞补充患有造血恶性肿瘤并已经历骨髓消融的癌症患者的骨髓，是众所周知的。骨髓移植最通常使用匹配的健康供体。然而，在某些情况例如多发性骨髓瘤中，可以进行自体骨髓移植。在非造血癌症患者的治疗中常规不使用骨髓细胞来治疗非造血癌症。

对于提高由于各种不同的病症例如衰老和年龄相关疾病而遭受虚弱效应的对象以及经历化学或放疗的癌症患者的生活质量，存在着尚未满足的需求。逆转线粒体功能的下降可以减缓衰老的效应并减轻年龄相关疾病以及抗癌治疗的虚弱效应。

发明内容

本发明提供了富集有健康的功能性线粒体的哺乳动物干细胞，以及减轻包括衰老和年龄相关疾病在内的许多病症的虚弱效应和抗癌治疗的不良事件的方法。出人意料的是，现在首次显示了移植富集有健康线粒体的健壮细胞可以显著延迟衰老的症状和年龄相关疾病的演进。此外，使用富集有健康线粒体的干细胞的线粒体增强疗法可以在经历抗癌治疗的癌症患者中减轻化疗、放疗和/或使用单克隆抗体的免疫疗法的虚弱效应。具体来说，本发明提供了包含富集有功能性线粒体的干细胞、包括自体或供体干细胞的组合物。这些细胞在引入到待治疗的对象中时可用于缓解或降低令人衰弱的病症的效应。

在特定实施方式中，将所述对象用富集有从健康供体获得的功能性线粒体的干细胞治疗。健康供体线粒体的方便的来源包括但不限于胎盘线粒体或源自于血液细胞的线粒体。因此，本发明提供了使用同种异体、自体或同系的“线粒体富集的”干细胞来治疗或减轻衰老和年龄相关疾病以及癌症患者中抗癌治疗的虚弱效应的方法。

本发明部分是基于下述发现，即接受富集有来自于鼠类胎盘的健康线粒体的骨髓细胞的衰老C57BL小鼠与接受未富集有线粒体的骨髓的年龄匹配的小鼠相比，显示出功能、认知和生理血液测试的改善。

根据各种不同实施方式，干细胞的来源可以是自体、同系的或来自于供体。提供具有令人衰弱的病症的对象的干细胞、用健康线粒体离体富集并将其返回到同一对象，与涉及同种异体细胞疗法的其他方法相比提供了益处。例如，所述提供的方法消除了对筛查人群并找出与所述对象人类白细胞抗原(HLA)匹配的供体这个长且高成本并且不总是成功的过程的需求。所述方法还有利地消除了对所述对象的终生免疫抑制疗法的需求，所述终生免疫抑制疗法是为了使所述对象的身体不排斥同种异体细胞群体。因此，本发明有利地提供了一种离体疗法的独特方法，其中从所述对象的身体取出人类干细胞，用健康的功能性线粒体离体富集并返回到同一对象。此外，本发明涉及干细胞的给药，所述干细胞不受任何理论或机制限制在整个身体内的不同组织中流通，并由此提高具有令人衰弱的病症的对象的生活质量。

本发明部分是基于下述令人吃惊的发现，即功能性线粒体可以进入完整的成纤维细胞、造血干细胞和骨髓细胞，并且用功能性线粒体处理成纤维细胞、造血干细胞和骨髓细胞提高了线粒体含量、细胞存活率和ATP生产。

本发明首次提供了具有增强或提高的线粒体活性的衰老对象或癌症患者的干细胞。这些干细胞可以富集有来自于适合的来源的健康的功能性线粒体。通常，所述线粒体可以从血液细胞、胎盘细胞、胎盘细胞培养物或其他适合的细胞系获得。每种可能性是本发明的独立实施方式。

一方面，本发明提供了一种治疗或减轻各种不同病症的虚弱效应的方法，所述方法包括将分离或部分纯化的冻融过的功能性人类线粒体引入到获自或源自于患有令人衰弱的病症的对象或供体的干细胞中，并将在能够支持所述细胞生存的可药用液体介质中的至少10

根据另一方面，本发明提供了在对象中治疗或减轻令人衰弱的病症的方法，所述方法包括向所述对象肠胃外给药包含至少5×10

根据又一个方面，本发明提供了一种用于在对象中治疗或减轻令人衰弱的病症的药物组合物，所述药物组合物包含至少10

在某些实施方式中，将所述量的分离的线粒体以所需浓度添加到所述受体细胞。线粒体供体细胞数目与线粒体受体细胞数目的比例为高于2:1(供体细胞相比于受体细胞)的比例。在典型实施方式中，所述比率为至少5或至少10或更高。在特定实施方式中，从其收集线粒体的供体细胞与受体细胞的比率为至少20、50、100或更高。每种可能性是独立的实施方式。

在某些实施方式中，所述具有令人衰弱的病症的对象是衰老对象。在某些实施方式中，所述具有令人衰弱的病症的对象患有一种或多种年龄相关疾病。在其他实施方式中，所述具有令人衰弱的病症的对象是经历化疗、放疗、使用单克隆抗体的免疫疗法或其组合的癌症患者。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

在某些实施方式中，所述健康的功能性人类外源线粒体是同种异体线粒体。在其他实施方式中，所述健康的功能性人类外源线粒体是自体或同系的，即具有相同的母系血统。

另一方面，本发明提供了一种使人类干细胞富集有健康线粒体的体外方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供第一组合物，其包含获自或源自于患有令人衰弱的病症的个体或未患有令人衰弱的病症的健康供体的多个人类干细胞；(ii)提供第二组合物，其包含从未患有令人衰弱的病症的健康供体获得的多个分离或部分纯化的冻融过的人类功能性健康外源线粒体；(iii)将所述第一组合物的人类干细胞与所述第二组合物的冻融过的人类功能性线粒体以0.088-176mU CS活性/10

在特定实施方式中，所述患有令人衰弱的病症的对象是用令人衰弱的抗癌治疗治疗后的癌症患者。因此，本发明提供了一种使人类干细胞富集有健康的功能性外源线粒体的体外方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供第一组合物，其包含来自于患有恶性疾病的个体或未患有恶性疾病的健康对象的多个人类干细胞；(ii)提供第二组合物，其包含在抗癌治疗之前从患有所述恶性疾病的相同个体或从未患有恶性疾病的健康对象获得的多个分离的或部分纯化的冻融过的人类功能性线粒体；(iii)将所述第一组合物的人类干细胞与所述第二组合物的冻融过的人类功能性线粒体以0.088-176mU CS活性/10

在某些实施方式中，所述允许健康的功能性人类外源线粒体进入人类干细胞的条件包括将所述人类干细胞与所述健康的功能性人类外源线粒体在16至37℃范围内的温度下温育0.5至30小时范围内的时间。在某些实施方式中，所述允许健康的功能性人类外源线粒体进入人类干细胞的条件包括将所述人类干细胞与所述健康的功能性人类外源线粒体在培养基中，在支持细胞存活的环境下，在16至37℃范围内的温度下温育0.5至30小时范围内的时间。根据某些实施方式，所述培养基是含有人血清白蛋白的盐水。在某些实施方式中，所述用于温育的条件包括含有5％CO

在某些实施方式中，所述方法还包括在温育之前、期间或之后离心所述人类干细胞和健康的功能性外源线粒体。在某些实施方式中，在温育之前所述方法还包括将所述人类干细胞和健康的功能性人类外源线粒体以高于2500xg的离心力单次离心。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

在某些实施方式中，与未经历冻融循环的对照线粒体相比，所述已经历冻融循环的线粒体在融化后表现出可比的氧消耗速率。

在某些实施方式中，上述方法还包括冷冻线粒体富化的人类干细胞，并任选地还包括融化线粒体富化的人类干细胞。

在另外的实施方式中，在线粒体增强之前或之后将所述人类干细胞扩增。

所述干细胞对功能性线粒体的可检测的富集可以通过功能和/或酶测定法来确定，包括但不限于氧(O

根据某些实施方式，在所述供体与被治疗的对象之间线粒体可以根据mtDNA单倍群进行匹配。根据其他实施方式，在干细胞富集之前根据特定的不同mtDNA单倍群选择线粒体。

在某些实施方式中，所述第一组合物或第四组合物中干细胞的线粒体含量通过确定柠檬酸合酶的活性水平来确定。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

在某些实施方式中，所述使人类干细胞富集有线粒体的过程在所述细胞冷冻之前进行。在其他实施方式中，所述使人类干细胞富集有线粒体的过程在所述细胞冷冻和融化之后进行。

在某些实施方式中，在患有所述令人衰弱的病症之前将所述自体人类干细胞冷冻并储存。在其他实施方式中，所述使人类干细胞富集有线粒体的过程在所述细胞冷冻和融化之后进行。

在某些实施方式中，所述干细胞是多能干细胞(PSC)。在其他实施方式中，所述PSC是非胚胎干细胞。在某些实施方式中，所述干细胞是诱导PSC(iPSC)。在某些实施方式中，所述干细胞源自于骨髓细胞。在特定实施方式中，所述干细胞表达骨髓造血祖细胞抗原CD34(CD34

在某些实施方式中，所述干细胞是骨髓细胞。

在某些实施方式中，所述干细胞是包含成髓细胞的骨髓来源的干细胞。在某些实施方式中，所述骨髓来源的干细胞包含红细胞生成细胞。在某些实施方式中，所述骨髓来源的干细胞包含多能造血干细胞(HSC)。在某些实施方式中，所述骨髓来源的干细胞包含共同髓系祖细胞、共同淋巴系祖细胞或其任何组合。在某些实施方式中，所述骨髓来源的干细胞包含巨核细胞、红细胞、肥大细胞、成肌细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、小淋巴细胞、T淋巴细胞，B淋巴细胞、浆细胞、网状细胞或其任何组合。在某些实施方式中，所述骨髓来源的干细胞包含间充质干细胞。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

在特定实施方式中，所述干细胞是CD34

在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从衰老对象或供体获得。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞是从衰老对象或供体的骨髓获得的骨髓细胞。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞直接或间接地从所述衰老对象的骨髓或供体的骨髓获得。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从所述衰老对象的骨髓动员或从供体的骨髓动员。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从所述衰老对象的外周血获得或从供体的外周血获得。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从患有恶性疾病的对象获得。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从患有非造血恶性疾病的对象或未患有恶性疾病的健康对象获得。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从患有非造血恶性疾病的对象或未患有恶性疾病的健康对象的骨髓获得。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从所述患有非造血恶性疾病的对象的骨髓动员，或从未患有恶性疾病的健康对象的骨髓动员。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞直接从所述患有非造血恶性疾病的对象的骨髓获得，或直接从未患有恶性疾病的健康对象的骨髓获得。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞间接地从所述患有非造血恶性疾病的对象的骨髓获得，或间接地从未患有恶性疾病的健康对象的骨髓获得。在某些实施方式中，所述第一组合物中的骨髓细胞从所述患有非造血恶性疾病的对象的外周血获得，或从未患有恶性疾病的健康对象的外周血获得。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

在某些实施方式中，所述干细胞被至少部分纯化。

在某些实施方式中，所述健康的功能性线粒体源自于选自胎盘、在培养物中生长的胎盘细胞和血液细胞的细胞或组织。

在某些实施方式中，所述药物组合物被给药到患有选自衰老、年龄相关疾病和抗癌治疗的后遗症的令人衰弱的病症的对象。在其他实施方式中，所述药物组合物被给药到特定组织或器官。在另外的其他实施方式中，所述药物组合物通过系统性肠胃外给药来给药。在其他实施方式中，所述药物组合物包含至少约10

在某些实施方式中，上述方法还包括前期步骤，所述步骤包括向患有选自衰老或非造血恶性疾病的令人衰弱的病症的对象或向健康供体给药诱导干细胞从骨髓向外周血动员的药剂。在某些实施方式中，所述药剂选自粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、1,1′-[1,4-亚苯基双(亚甲基)]双[1,4,8,11-四氮杂环十四烷](普乐沙福)、其盐及其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，上述方法还包括从患有选自衰老或非造血恶性疾病的令人衰弱的病症的对象的外周血或从健康对象的外周血分离干细胞的步骤。在某些实施方式中，所述分离通过单采分离来进行。

在某些实施方式中，上述方法还包括向患有选自衰老、年龄相关疾病和抗癌治疗的后遗症的令人衰弱的病症的对象给药阻止、延迟、最小化或消除所述对象与同种异体的供体的干细胞之间的不利免疫原性反应的药剂的步骤。在另外的实施方式中，所述第二组合物中的功能性线粒体在抗癌治疗之前从患有恶性疾病的对象获得。

在某些实施方式中，上述方法还包括在温育之前或期间浓缩所述第三组合物中的干细胞和功能性线粒体。在某些实施方式中，上述方法还包括在温育之前、期间或之后离心所述第三组合物。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

在可选实施方式中，将所述衰老对象或患有一种或多种年龄相关疾病的对象用线粒体富化的干细胞移植。在某些实施方式中，所述干细胞来自于未患有年龄相关疾病的供体。在特定实施方式中，所述干细胞是自体骨髓干细胞。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从衰老对象或患有一种或多种年龄相关疾病的对象的骨髓动员，或者从未患有年龄相关疾病的健康供体的骨髓动员。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从所述衰老对象或患有一种或多种年龄相关疾病的对象的外周血获得，或从未患有年龄相关疾病的健康供体的外周血获得。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

在可选实施方式中，所述对象患有造血恶性肿瘤，并且所述移植到对象中的干细胞富集有线粒体。在某些实施方式中，所述干细胞来自于未患有恶性疾病的健康供体。在特定实施方式中，所述干细胞是自体骨髓干细胞，例如在各种不同的造血恶性肿瘤包括多发性骨髓瘤和某些类型的淋巴瘤中使用的。根据这些实施方式，所述第一组合物中的干细胞从患有造血恶性疾病的对象的骨髓获得，或从未患有恶性疾病的健康对象的骨髓获得。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从患有造血恶性疾病的对象的骨髓动员，或从未患有恶性疾病的健康对象的骨髓动员。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从从患有造血恶性疾病的对象的外周血获得，或从未患有恶性疾病的健康对象的外周血获得。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

在某些实施方式中，上述方法还包括前期步骤，所述步骤包括向对象给药诱导骨髓干细胞从骨髓向外周血动员的药剂。在某些实施方式中，所述药剂选自粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、1,1′-[1,4-亚苯基双(亚甲基)]双[1,4,8,11-四氮杂环十四烷](普乐沙福)、其盐及其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，上述方法还包括从患有造血恶性疾病的对象的外周血或从未患有恶性疾病的健康对象的外周血分离干细胞的步骤。在某些实施方式中，所述分离通过单采分离来进行。

在某些实施方式中，上述方法还包括在温育之前或期间浓缩组合物(iii)中的干细胞和功能性线粒体。在某些实施方式中，上述方法还包括在温育之前、期间或之后离心组合物(iii)。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从具有选自衰老、年龄相关疾病和经历令人虚弱的疗法的恶性疾病的令人衰弱的病症的对象获得，并且与未患有所述令人衰弱的病症的对象相比具有(i)降低的氧(O

在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从未患有令人衰弱的病症的健康供体获得，具有(i)正常的氧(O

在某些实施方式中，所述富集有健康的功能性线粒体的干细胞与线粒体富集之前的干细胞相比具有(i)提高的氧(O

根据某些示例性实施方式，所述富集有健康的功能性线粒体的干细胞与线粒体富集之前的干细胞相比具有(i)提高的柠檬酸合酶活性水平；和(ii)提高的正常线粒体DNA含量。

在某些实施方式中，所述部分纯化的线粒体中线粒体蛋白的总量在所述样品中细胞蛋白的总量的20％-80％之间。用于获得此类分离或部分纯化的线粒体的组合物的示例性方法公开在WO 2013/035101中。

另一方面，本发明还提供了通过上述方法的任一实施方式获得的多个富集有健康线粒体的人类干细胞。应该明确地理解，根据本发明所述的富集有功能性线粒体的人类干细胞不源自于患有原发性线粒体疾病的对象。根据某些特定实施方式，所述富集有健康线粒体的干细胞不是骨髓干细胞。

另一方面，本发明还提供了用线粒体离体富集的多个人类干细胞，其中所述干细胞具有选自下述的至少一种性质：相对于线粒体富集之前所述干细胞中的相应水平(a)提高的线粒体DNA含量；(b)提高的柠檬酸合酶活性水平；(c)提高的选自SDHA和COX1的至少一种线粒体蛋白的含量；(d)提高的氧(O

根据某些实施方式，所述干细胞是CD34

在某些实施方式中，所述部分纯化的线粒体中线粒体蛋白的总量在所述样品中细胞蛋白的总量的20％-80％之间。

在某些实施方式中，上述多个人类干细胞是CD34

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包含如上所述的多个离体富集有健康的功能性线粒体的人类骨髓干细胞。

另一方面，本发明还提供了上述药物组合物，其用于治疗患有令人衰弱的病症的人类对象。根据某些实施方式，所述患有令人衰弱的病症的对象是衰老对象。在某些实施方式中，所述患有令人衰弱的病症的对象患有年龄相关疾病或疾病。在某些实施方式中，所述患有令人衰弱的病症的对象患有经历令人虚弱的疗法的恶性疾病。在其他实施方式中，上述药物组合物被用于恶性疾病缓解中或恢复后的人类对象。

另一方面，本发明还提供了一种治疗患有令人衰弱的病症的人类对象的方法，所述方法包括向所述患者给药上述药物组合物的步骤。根据某些实施方式，所述患有令人衰弱的病症的对象是衰老对象。在某些实施方式中，所述患有令人衰弱的病症的对象患有一种或多种年龄相关疾病。在某些实施方式中，所述患有令人衰弱的病症的对象患有经历令人虚弱的疗法的恶性疾病。在其他实施方式中，上述药物组合物被用于治疗恶性疾病缓解中或恢复后的人类对象。在某些实施方式中，所述药物组合物包含的干细胞对于所述患有令人衰弱的病症的对象来说是自体或同系的。在某些实施方式中，所述药物组合物包含的干细胞对于所述患有令人衰弱的病症的对象来说是同种异体的。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

本发明的其他实施方式和完整的适用性范围将从后文中给出的详细描述变得显而易见。然而应该理解，所述详细描述和特定实例尽管指示了本发明的优选实施方式，但仅仅是为了说明而提供，因为对于本领域技术人员来说，从该详细描述，在本发明的精神和范围之内的各种不同改变和修改将变得显而易见。

附图说明

图1是通过荧光共聚焦显微术获得的三张显微照片，示出了表达线粒体GFP的小鼠成纤维细胞(左图)、与分离的RFP标记的线粒体温育过的小鼠成纤维细胞(中图)和叠加(右图)。

图2是条形图，示出了未处理(对照)、用线粒体复合物I不可逆抑制剂(鱼藤酮)处理或用鱼藤酮和小鼠胎盘线粒体(鱼藤酮+线粒体)处理的小鼠成纤维细胞中ATP水平的比较。数据被呈现为平均值±SEM。(*)p值<0.05。RLU-相对发光单位。

图3是通过荧光共聚焦显微术获得的四张显微照片，示出了与从小鼠骨髓瘤细胞分离的GFP标记的线粒体温育过的小鼠骨髓细胞。

图4是条形图，示出了在富集有来自于C57BL小鼠的外源线粒体的骨髓细胞的IV注射后的各个不同时间点，FVB/N小鼠的骨髓中的C57BL mtDNA水平。

图5是条形图，示出了在离心或未离心的与不同量的从小鼠骨髓瘤细胞分离的GFP标记的线粒体温育过的小鼠骨髓(BM)细胞中柠檬酸合酶(CS)活性的比较。

图6A是条形图，示出了在富集有增加量的GFP标记的线粒体后，鼠类BM细胞中CS活性的比较。图6B是条形图，示出了在这些细胞中细胞色素C还原酶活性(黑色条)与GFP标记的线粒体中的活性(灰色条)的比较。

图7A是条形图，示出了与未处理的细胞(NT)相比，在将FVB/N骨髓细胞与各种不同浓度(0.044、0.44、0.88、2.2、4.4、8.8、17.6毫单位CS活性)的来自于C57BL小鼠的外源线粒体温育后，所述细胞中C57BL mtDNA的拷贝数。图7B是条形图，示出了与未处理的细胞(NT)相比，在将FVB/N骨髓细胞与各种不同浓度(0.044、0.44、0.88、2.2、4.4、8.8、17.6毫单位CS活性)的来自于C57BL小鼠的外源线粒体温育后，所述细胞中mtDNA编码的(COX1)蛋白的含量，所述含量被归一化到Janus水平。图7C是条形图，示出了与未处理的细胞(NT)相比，在将FVB/N骨髓细胞与各种不同浓度(0.044、0.44、0.88、2.2、4.4、8.8、17.6毫单位CS活性)的来自于C57BL小鼠的外源线粒体温育后，所述细胞中核编码的(SDHA)蛋白的含量，所述含量被归一化到Janus水平。

图8A是条形图，示出了在对照的未处理的人类BM细胞和离心或未离心的与从人类胎盘细胞分离的GFP标记的线粒体温育过的人类BM细胞中CS活性的比较。图8B是条形图，示出了在对照的未处理的人类BM细胞和离心的与从人类胎盘细胞分离的GFP标记的线粒体温育过的人类BM细胞中ATP水平的比较。

图9A描绘了在未与GFP标记的线粒体温育过的人类BM细胞中FACS分析的结果。图9B描绘了在离心后的与GFP标记的线粒体温育过的人类BM细胞中FACS分析的结果。

图10A是条形图，示出了未处理(NT)或用血液来源的线粒体(MNV-BLD)处理的来自于健康供体的人类CD34

图11是通过荧光共聚焦显微术获得的三张显微照片，示出了与从HeLa-TurboGFP-线粒体细胞分离的GFP标记的线粒体温育过的CD34+细胞。

图12A是皮尔逊综合症患者脐带血细胞中mtDNA缺失的图示说明以及示出了所述缺失的DNA印迹分析。图12B是条形图，示出了与用未增强的脐带血细胞(UCB)注射的小鼠相比，在使用富集有人类线粒体的皮尔逊综合症的脐带血细胞(UCB+Mito)的线粒体增强疗法后2个月NSGS小鼠的骨髓中的人类mtDNA拷贝数。

图13A是条形图，示出了在给药富集有从C57BL胎盘获得的健康的功能性线粒体的干细胞后1个月，FVB/N小鼠的骨髓中FVB/N ATP8突变的mtDNA的水平。图13B是条形图，示出了在给药富集有从C57BL胎盘获得的健康的功能性线粒体的干细胞后3个月，FVB/N小鼠的肝脏中FVB/N ATP8突变的mtDNA的水平。

图14A-14C是条形图，通过MAT后直至3个月时小鼠的骨髓(图14A)、脑(图14B)和心脏(图14C)中C57BL mtDNA的量说明了线粒体富化的骨髓细胞的生物分布。白色条和伴随的点指示增强的骨髓样品，灰色条是对照。

图15是条形图，示出了在未治疗的FVB/N小鼠(原初

图16A-16C示出了线图，说明了在治疗前和治疗后9个月，用下述物质治疗的12月龄C57BL/6J小鼠的旷场行为测试表现：线粒体富化的BM细胞(MNV-BM-PLC，1x10

图16D是线图，说明了在治疗前和治疗后9个月，用下述物质治疗的12月龄C57BL/6J小鼠的血液尿素氮(BUN)水平：线粒体富化的BM细胞(MNV-BM-PLC，1x10

图16E-16F示出了条形图，说明了用线粒体富化的骨髓(BM)细胞(MNV-BM-PLC，1x10

图16G-16J示出了条形图，说明了用线粒体富化的骨髓(BM)细胞(MNV-BM-PLC，1x10

图17A是计划图，描绘了对患者1进行的临床试验中的治疗和评估过程，所述患者是年轻的皮尔逊综合症(PS)和PS相关的范可尼综合征(FS)患者，在其mtDNA中具有涵盖ATP8的缺失突变。图17B是条形图，示出了在富集有功能性线粒体的干细胞给药前、所述富集有干细胞给药后2.5个月和8个月的有氧任务代谢当量(MET)评分。图17C是条形图，说明了在疗法之前和之后通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的血液中的乳酸盐水平随时间的变化。图17D是线图，说明了在疗法之前和之后通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的体重和身高的标准偏差评分随时间的变化。图17E是线图，说明了在疗法之前和之后通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的碱性磷酸酶(ALP)水平随时间的变化。图17F是线图，说明了在本发明提供的疗法之前和之后，PS患者中血液红血细胞(RBC)水平的长期升高。图17G是线图，说明了在本发明提供的疗法之前和之后，PS患者中血液血红蛋白(HGB)水平的长期升高。图17H是线图，说明了在本发明提供的疗法之前和之后，PS患者中血液血细胞比容(HCT)水平的长期升高。图17I是线图，说明了在疗法之前和之后通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的肌酐水平随时间的变化。图17J是线图，说明了在疗法之前和之后通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的碳酸氢盐水平随时间的变化。图17K是线图，说明了在疗法之前和之后通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的碱过量水平随时间的变化。图17L是条形图，说明了在镁增补之前和之后，在疗法之前和之后通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的血镁水平随时间的变化。图17M是条形图，说明了在疗法之前和之后通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的尿液中葡萄糖与肌酐比率随时间的变化。图17N是条形图，说明了在疗法之前和之后通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的尿液中钾与肌酐比率随时间的变化。图17O是条形图，说明了在疗法之前和之后通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的尿液中氯化物与肌酐比率随时间的变化。图17P是条形图，说明了在疗法之前和之后通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的尿液中钠与肌酐比率随时间的变化。

图18A是线图，示出了在通过本发明中提供的方法治疗的3位PS患者(Pt.1、Pt.2和Pt.3)中正常mtDNA的含量在疗法之前和之后随时间的变化，其通过数字PCR来测量缺失区域(在每位患者中)，与代表每个细胞的正常mtDNA数量的18S基因组DNA进行比较，并根据基线进行归一化。

图18B是线图，示出了在MAT后的基线处，3位PS患者(Pt.1、Pt.2和Pt.3)中的异质性水平(存在缺失的mtDNA与总mtDNA相比)。虚线表示每位患者的基线。

图19A是由本发明进一步提供的皮尔逊综合症(PS)患者的不同治疗阶段的另一个计划图。图19B是条形图，示出了在通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的血液中乳酸盐水平在疗法之前(B)和之后随时间的变化。图19C是条形图，示出了通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的坐立试验评分在疗法之前和之后随时间的变化。图19D是条形图，示出了通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的6分钟行走试验评分在疗法之前和之后随时间的变化。图19E是条形图，示出了通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的三次连续重复(R1、R2、R3)的测力计评分在疗法之前和之后随时间的变化。图19F是条形图，示出了在通过本发明中提供的方法治疗的PS患者中尿液镁与肌酐的比率在疗法之前和之后随时间的变化。图19G是条形图，示出了在通过本发明中提供的方法治疗的PS患者中尿液钾与肌酐的比率在疗法之前和之后随时间的变化。图19H是条形图，示出了在通过本发明中提供的方法治疗的PS患者中尿液钙与肌酐的比率在疗法之前和之后随时间的变化。图19I是条形图，示出了在通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的尿液中ATP8与18S拷贝数的比率在疗法之前和之后随时间的变化。图19J是条形图，示出了在通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的淋巴细胞中ATP水平在疗法之前和之后随时间的变化。

图20A是由本发明进一步提供的皮尔逊综合症(PS)患者和Kearns-Sayre综合征(KSS)患者的不同治疗阶段的又一个计划图。图20B是条形图，说明了在通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的血液中乳酸盐的水平在疗法之前(B)和之后随时间的变化。图20C是条形图，示出了通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的AST和ALT水平在疗法之前和之后随时间的变化。图20D是条形图，示出了通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的甘油三酯、总胆固醇和VLDL胆固醇水平在疗法之前和之后随时间的变化。图20E是条形图，示出了通过本发明中提供的方法治疗的PS患者的血红蛋白A1C(HbA1C)评分在疗法之前和之后随时间的变化。图20F是线图，示出了通过本发明提供的方法治疗的PS患者(Pt.3)的坐立试验评分在疗法之前和之后随时间的变化。图20G是线图，示出了通过本发明提供的方法治疗的PS患者(Pt.3)的6分钟行走试验评分在疗法之前和之后随时间的变化。

图21是条形图，示出了在疗法之前和之后，通过本发明提供的方法治疗的KSS患者的外周血中的ATP含量。

具体实施方式

本发明提供了用于治疗显著量的全功能健康线粒体的靶向和系统性递送的细胞平台，更具体来说是干细胞来源的细胞平台，以及将它们用于患有令人衰弱的病症的对象，包括衰老对象和患有一种或多种年龄相关疾病的对象以及患有包括化疗、放疗或使用单克隆抗体的免疫疗法在内的抗癌治疗的后遗症的癌症患者的方法。本发明是基于几项令人吃惊的发现，其中包括本文中示例的临床结果，这些结果显示富集有正常的有功能的健康线粒体的骨髓来源的造血干细胞的静脉内注射可以有益地影响对象的各个不同组织。换句话说，在富集有健康线粒体的干细胞的给药后，可以在各种不同器官和组织中实现功能改善。

本发明部分是基于下述发现，即骨髓细胞易于接受用完整的功能性线粒体进行的富集，并且人类骨髓细胞特别易于接受用线粒体进行的富集，正如在例如WO 2016/135723中公开的。不受任何理论或机制限制，据推测干细胞与健康线粒体的共温育促进完整的功能性线粒体转移到干细胞中。

还已发现，干细胞包括但不限于骨髓来源的造血干细胞富集线粒体的程度和细胞的线粒体功能的改善取决于用于线粒体富集的条件，包括但不限于分离或部分纯化的线粒体的浓度以及温育条件，并因此可以被操控，以便产生所需富集。

一方面，本发明提供了一种治疗和/或减轻各种不同病症的虚弱效应的方法，所述方法包括将部分纯化的健康人类线粒体离体引入到获自或源自于患有令人衰弱的病症的对象或健康供体的干细胞中，并将该“线粒体富化的”干细胞移植到所述患有令人衰弱的病症的对象中。

在某些实施方式中，所述患有令人衰弱的病症的对象患有衰老或一种或多种年龄相关疾病。在其他实施方式中，所述患有虚弱效应的对象是经历化疗、放疗或使用单克隆抗体的免疫疗法的癌症患者。在某些实施方式中，所述癌症患者是患有非造血恶性疾病的对象。在其他实施方式中，所述癌症患者是患有造血恶性疾病的对象。

在其他实施方式中，所述给药到对象的人类干细胞对于所述对象来说是自体的。在其他实施方式中，所述给药到对象的人类干细胞来自于供体，即对于所述对象来说是同种异体的。

在某些实施方式中，所述自体或同种异体人类干细胞是多能干细胞(PSC)或诱导性多能干细胞(iPSC)。在其他实施方式中，所述自体或同种异体人类干细胞是间充质干细胞。

根据几个实施方式，所述人类干细胞源自于脂肪组织、口腔粘膜、血液、脐带血或骨髓。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在特定实施方式中，所述人类干细胞源自于骨髓。

另一方面，本发明提供了一种用于在对象中治疗或减轻令人衰弱的病症的药物组合物，所述药物组合物包含至少10

在某些实施方式中，所述药物组合物包含至少10

另一方面，本发明提供了一种使人类干细胞富集功能性线粒体的离体方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供第一组合物，其包含获自或源自于患有令人衰弱的病症的对象或未患有令人衰弱的病症的健康供体的多个人类干细胞；(ii)提供第二组合物，其包含从未患有令人衰弱的病症的健康供体获得的多个分离或部分纯化的人类功能性线粒体；(iii)将所述第一组合物的人类干细胞与所述第二组合物的人类功能性线粒体相接触，从而形成第三组合物；以及(iv)将所述第三组合物在允许所述人类功能性线粒体进入所述人类干细胞的条件下温育，由此使所述人类干细胞富集所述人类功能性线粒体，从而形成第四组合物；其中所述第四组合物中经富集的人类干细胞的线粒体含量可检测地高于所述第一组合物中人类干细胞的线粒体含量。

一方面，本发明提供了一种使人类骨髓细胞富集功能性线粒体的离体方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供第一组合物，其包含获自或源自于患有恶性疾病的患者或未患有恶性疾病的健康对象的多个人类骨髓细胞；(ii)提供第二组合物，其包含从患有恶性疾病的同一患者在抗癌治疗之前或从未患有恶性疾病的健康对象获得的多个分离的人类功能性线粒体；(iii)将所述第一组合物的人类骨髓细胞与所述第二组合物的人类功能性线粒体混合，从而形成第三组合物；以及(iv)将所述第三组合物在允许所述人类功能性线粒体进入所述人类骨髓细胞的条件下温育，由此使所述人类骨髓细胞富集所述人类功能性线粒体，从而形成第四组合物；其中所述第四组合物中人类骨髓细胞的线粒体含量可检测地高于所述第一组合物中人类骨髓细胞的线粒体含量。

当在本文中使用时，术语“离体方法”是指包括专门在人体外部进行的步骤的任何方法。具体来说，离体方法包括在体外操作细胞，随后将其重新引入或移植到待治疗的对象中。

当在本文中使用时，术语“富集”是指被设计用于提高哺乳动物细胞的线粒体含量例如完整线粒体的数目或线粒体的功能的任何行动。具体来说，富集有功能性线粒体的干细胞与富集之前的同一干细胞相比将显示出增强的功能。

当在本文中使用时，术语“干细胞”通常是指任何哺乳动物干细胞。干细胞是未分化的细胞，其可以分化成其他类型的细胞并且可以分裂以产生更多相同类型的干细胞。干细胞可以是全能或多能的。

当在本文中使用时，术语“人类干细胞”通常是指人类中天然存在的所有干细胞，以及离体产生或衍生并与人类相容的所有干细胞。与干细胞相同，“祖细胞”具有分化成特定类型细胞的倾向性，但已经比干细胞更加特异，并被推向分化成它的“靶”细胞。干细胞与祖细胞之间的最重要区别在于干细胞可以无限复制，而祖细胞只能分裂有限的次数。当在本文中使用时，术语“人类干细胞”还包括“祖细胞”和“未完全分化的干细胞”。

在某些实施方式中，所述干细胞用健康的功能性人类外源线粒体的富集包括在将所述人类干细胞与所述健康的功能性人类外源线粒体温育后清洗线粒体富化的干细胞。这个步骤提供了线粒体富化的干细胞的组合物，其基本上不含细胞碎片或线粒体膜残留物和未进入所述干细胞的线粒体。在某些实施方式中，清洗包括在将所述人类干细胞与所述健康的功能性人类外源线粒体温育后离心线粒体富化的干细胞。根据某些实施方式，将所述包含线粒体富化的人类干细胞的药物组合物与游离线粒体即未进入所述干细胞的线粒体或其他细胞碎片分离开。根据某些实施方式，所述包含线粒体富化的人类干细胞的药物组合物不包含可检测量的游离线粒体。

当在本文中使用时，术语“多能干细胞(PSC)”是指能够无限繁殖并产生身体中的多种细胞类型的细胞。全能干细胞是可以产生身体中的每种其他细胞类型的细胞。胚胎干细胞(ESC)是全能干细胞，并且诱导性多能干细胞(iPSC)是多能干细胞。

当在本文中使用时，术语“诱导性多能干细胞(iPSC)”是指可以从人类成年体细胞产生的一类多能干细胞。

当在本文中使用时，术语“胚胎干细胞(ESC)”是指源自于囊胚的内部细胞团的一类全能干细胞。

当在本文中使用时，术语“骨髓细胞”通常是指在人类骨髓中天然存在的所有人类细胞，并且是指人类骨髓中天然存在的所有细胞群体。术语“骨髓干细胞”和“骨髓来源的干细胞”是指源自于骨髓的干细胞群体。

术语“功能性线粒体”和“健康线粒体”在本文中可互换使用，并且是指表现出指示正常mtDNA和正常的、非病理性的活性水平的参数的线粒体。线粒体的活性可以通过本领域中公知的各种不同方法来度量，例如膜电位、O

当在本文中使用时，短语“从患有令人衰弱的病症的对象或未患有令人衰弱的病症的供体获得的干细胞”是指在从对象分离时是所述对象/供体中的干细胞的细胞。

当在本文中使用时，短语“源自于患有令人衰弱的病症的对象或未患有令人衰弱的病症的供体的干细胞”是指不是所述对象/供体中的干细胞并且已被操作以变成干细胞的细胞。当在本文中使用时，术语“操作”是指使用本领域中已知的方法中的任一者(Yu J.等，Science,2007,Vol.318(5858)，第1917-1920页)将体细胞重编程到未分化的状态并变成诱导性多能干细胞(iPSc)，并任选地进一步将所述iPSC重编程以变成所需谱系或群体的细胞(Chen M.等，IOVS,2010,Vol.51(11)，第5970–5978页)，例如骨髓细胞(Xu Y.等，2012,PLoS ONE,Vol.7(4)，第e34321页)。

当在本文中使用时，术语“CD34

当在本文中使用时，术语“患有令人衰弱的病症的对象”是指经历由某些病症引起的虚弱效应的人类对象。所述令人衰弱的病症可以是指衰老、年龄相关疾病或经历抗癌治疗的癌症患者以及其他令人衰弱的病症。

术语“衰老”是指随着年龄的增长生理功能不可避免的逐步恶化，其人口统计学特征是死亡率的年龄依赖性增加以及各种身体和精神能力的下降。

当在本文中使用时，术语“年龄相关疾病”是指“老年人疾病”，随着衰老的增加出现频率不断提高的疾病。年龄相关疾病包括但不限于动脉粥样硬化和心血管疾病、癌症、关节炎、白内障、骨质疏松症、2型糖尿病、高血压和痴呆症例如阿茨海默氏病。所有这些疾病的发病率随着年龄增长而逐渐提高。

当在本文中使用时，术语“患有恶性疾病的对象”是指被诊断为患有恶性疾病、被怀疑患有恶性疾病或在发生恶性疾病的风险组中的人类对象。由于某些类型的恶性肿瘤是遗传的，因此被诊断为患有恶性疾病的对象的后代被认为是发生恶性疾病的风险组。

当在本文中使用时，术语“未患有恶性疾病的对象/供体”是指未被诊断为患有恶性疾病和/或未被怀疑患有恶性疾病的人类对象。

当在本文中使用时，术语“患有非造血恶性疾病的对象”是指被诊断为患有非造血恶性疾病和/或被怀疑患有非造血恶性疾病的人类对象。

当在本文中使用时，术语“患有造血恶性疾病的对象”是指被诊断为患有造血恶性疾病和/或被怀疑患有造血恶性疾病的人类对象。

术语“健康供体”和“健康对象”可互换使用，并且是指未患有待治疗的疾病或病症的对象。

术语“接触”是指使线粒体和细胞的组合物足够接近，以促进所述线粒体进入到所述细胞中。术语“将线粒体引入到靶细胞中”可以与术语“接触”互换使用。

当在本文中使用时，术语“分离的或部分纯化的人类功能性线粒体”是指从获自未患有线粒体疾病的健康对象的细胞分离的完整线粒体。所述部分纯化的线粒体中线粒体蛋白的总量在所述样品中细胞蛋白的总量的20％-80％之间。

当在本文和权利要求书中在线粒体的背景中使用时，术语“分离的”包括从所述来源中存在的其他组分至少部分纯化的线粒体。在某些实施方式中，所述包含多个分离的健康的功能性外源线粒体的第二组合物中线粒体蛋白的总量，在所述样品中细胞蛋白的总量的20％-80％、20-70％、40-70％、20-40％或20-30％之间。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，所述包含多个分离的健康的功能性外源线粒体的第二组合物中线粒体蛋白的总量在所述样品中细胞蛋白的总量的20％-80％之间。在某些实施方式中，所述包含多个分离的健康的功能性外源线粒体的第二组合物中线粒体蛋白的总量在所述线粒体和其他亚细胞级分的合并重量的20％-80％之间。在其他实施方式中，所述包含多个分离的健康的功能性外源线粒体的第二组合物中线粒体蛋白的总量高于所述线粒体和其他亚细胞级分的合并重量的80％。

根据某些实施方式，所述用于使人类干细胞富集健康的功能性外源线粒体的方法不包括测量所述细胞的膜电位。

在某些实施方式中，使所述干细胞富集健康的功能性外源线粒体包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.044直至176毫单位CS活性/百万个细胞的线粒体。在某些实施方式中，使所述干细胞富集健康的功能性外源线粒体包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.088直至176毫单位CS活性/百万个细胞的线粒体。在其他实施方式中，使所述干细胞富集健康的功能性外源线粒体包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.2直至150毫单位CS活性/百万个细胞的线粒体。在其他实施方式中，使所述干细胞富集健康的功能性外源线粒体包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.4直至100毫单位CS活性/百万个细胞的线粒体。在某些实施方式中，使所述干细胞富集健康的功能性外源线粒体包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.6直至80毫单位CS活性/百万个细胞的线粒体。在某些实施方式中，使所述干细胞富集健康的功能性外源线粒体包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.7直至50毫单位CS活性/百万个细胞的线粒体。在某些实施方式中，使所述干细胞富集健康的功能性外源线粒体包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.8直至20毫单位CS活性/百万个细胞的线粒体。在某些实施方式中，使所述干细胞富集健康的功能性外源线粒体包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.88直至17.6毫单位CS活性/百万个细胞的线粒体。在某些实施方式中，使所述干细胞富集健康的功能性外源线粒体包括在所述干细胞中引入剂量为至少0.44直至17.6毫单位CS活性/百万个细胞的线粒体。

线粒体剂量可以根据CS活性的单位或mtDNA拷贝数或本文中所解释的健康的功能性线粒体的量的其他可定量测量值来表示。“CS活性的单位”被定义为能够在1mL反应体积中在1分钟内转化1微摩尔底物的量。

在某些实施方式中，所述内源线粒体与已被引入到靶细胞中之后的外源线粒体的鉴定/辨别可以通过各种不同手段来进行，包括例如但不限于：鉴定所述内源线粒体与外源线粒体之间mtDNA序列的差异例如不同的单体型，鉴定起源于所述外源线粒体的来源组织的特定线粒体蛋白例如来自于胎盘的细胞色素p450胆固醇侧链切割(P450SCC)、来自于棕色脂肪组织的UCP1等，或其任何组合。

术语“外源的”对于线粒体来说是指从细胞外部的来源引入到靶细胞(例如干细胞)的线粒体。例如，在某些实施方式中，外源线粒体通常源自或分离自与所述靶细胞不同的供体细胞。例如，外源线粒体可以在供体细胞中生产/制造，从所述供体细胞纯化/分离/获得，随后引入到所述靶细胞中。

术语“内源的”对于线粒体来说是指由细胞制造/表达/生产并且不是从外部来源引入到所述细胞中的线粒体。在某些实施方式中，内源线粒体含有由所述细胞的基因组编码的蛋白质和/或其他分子。在某些实施方式中，术语“内源线粒体”等同于术语“宿主线粒体”。

当在本文中使用时，术语“自体细胞”或“自体的细胞”是指患者自身的细胞。术语“自体线粒体”是指从患者自身的细胞或母系相关细胞获得的线粒体。术语“同种异体细胞”或“同种异体线粒体”是指来自于不同的供体个体。

当在本文和权利要求书中使用时，术语“同系”是指足以允许个体之间的移植而没有排斥的遗传同一性或遗传近同一性。在线粒体的情形中，术语“同系”在本文中可以与意味着相同的母系血统的术语“自体线粒体”互换使用。

术语“外源线粒体”是指从细胞外部的来源引入到靶细胞(即干细胞)的线粒体或线粒体DNA。例如，在某些实施方式中，外源线粒体可以源自或分离自与所述靶细胞不同的细胞。例如，外源线粒体可以在供体细胞中生产/制造，从所述供体细胞纯化/分离/获得，随后引入到所述靶细胞中。

当在本文中使用时，短语“允许所述人类功能性线粒体进入所述人类干细胞的条件”通常是指诸如时间、温度、培养基和所述线粒体与干细胞之间的接近性等的参数。例如，人类细胞和人类细胞系常规地在液体培养基中温育，并保持在无菌环境中，例如在组织培养箱中，在37℃和5％CO

在某些实施方式中，将所述人类干细胞与所述健康的功能性外源线粒体在约16至约37℃范围内的温度下温育0.5至30小时范围内的时间。在某些实施方式中，将所述人类干细胞与所述健康的功能性外源线粒体温育1至30或5至25小时范围内的时间。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在特定实施方式中，温育进行20至30小时。在某些实施方式中，温育进行至少1、5、10、15或20小时。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在其他实施方式中，温育进行至多5、10、15、20或30小时。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在特定实施方式中，温育进行24小时。在某些实施方式中，温育在室温(16℃至30℃)进行。在其他实施方式中，温育在37℃进行。在某些实施方式中，温育在5％CO

在另外的其他实施方式中，所述温育在增补有人血清白蛋白(HSA)的培养基中进行。在另外的实施方式中，所述温育在增补有HSA的盐水中进行。根据某些示例性实施方式，所述允许功能性线粒体进入人类干细胞从而使所述人类干细胞富集所述人类功能性线粒体的条件包括在增补有4.5％人血清白蛋白的盐水中在室温下温育。

通过操控所述温育的条件，人们可以操控所述产物的特点。在某些实施方式中，所述温育在37℃进行。在某些实施方式中，所述温育进行至少6小时。在某些实施方式中，所述温育进行至少12小时。在某些实施方式中，所述温育进行12至24小时。在某些实施方式中，所述温育以每份具有或表现出4.4毫单位CS的外源线粒体的量1×10

当在本文中使用时，术语“线粒体含量”是指细胞内功能性线粒体的量或多个细胞内功能性线粒体的平均量。

当在本文中和权利要求书中使用时，术语“线粒体疾病”和术语“原发性线粒体疾病”可以互换使用。当在本文中使用时，术语“原发性线粒体疾病”是指通过线粒体DNA中的已知或无争议的致病突变或通过核DNA的基因中的突变而诊断的线粒体疾病，所述核DNA的基因产物被输入到线粒体中。根据某些实施方式，所述原发性线粒体疾病是先天性疾病。根据某些实施方式，所述原发性线粒体疾病不是继发性线粒体功能障碍。术语“继发性线粒体功能障碍”和“获得性线粒体功能障碍”在整个本申请中可互换使用。

在某些实施方式中，上文在各种不同实施方式中描述的方法还包括在将所述干细胞与所述外源线粒体温育之前、期间或之后进行离心。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，上文在各种不同实施方式中描述的方法包括在将所述干细胞与所述外源线粒体温育之前、期间或之后进行单个离心步骤。在某些实施方式中，所述离心力在1000g至8500g的范围内。在某些实施方式中，所述离心力在2000g至4000g的范围内。在某些实施方式中，所述离心力高于2500g。在某些实施方式中，所述离心力在2500g至8500g的范围内。在某些实施方式中，所述离心力在2500g至8000g的范围内。在某些实施方式中，所述离心力在3000g至8000g的范围内。在其他实施方式中，所述离心力在4000g至8000g的范围内。在特定实施方式中，所述离心力为7000g。在其他实施方式中，所述离心力为8000g。在某些实施方式中，离心进行2分钟至30分钟范围内的时间。在某些实施方式中，离心进行3分钟至25分钟范围内的时间。在某些实施方式中，离心进行5分钟至20分钟范围内的时间。在某些实施方式中，离心进行8分钟至15分钟范围内的时间。

在某些实施方式中，离心在4至37℃范围内的温度下进行。在某些实施方式中，离心在4至10℃或16-30℃范围内的温度下进行。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在特定实施方式中，离心在2-6℃下进行。在特定实施方式中，离心在4℃下进行。在某些实施方式中，上文描述的方法在其各种不同实施方式中包括在将所述干细胞与所述外源线粒体温育之前、期间或之后进行单次离心，然后将所述细胞在低于30℃的温度下静息。在某些实施方式中，允许所述人类功能性线粒体进入所述人类干细胞的条件包括在将所述干细胞与所述外源线粒体温育之前、期间或之后进行单次离心，然后将所述细胞在16至28℃范围内的温度下静息。

在某些实施方式中，所述第一组合物是新鲜的。在某些实施方式中，所述第一组合物被冷冻，然后在温育之前融化。在某些实施方式中，所述第二组合物是新鲜的。在某些实施方式中，所述第二组合物被冷冻，然后在温育之前融化。在某些实施方式中，所述第四组合物是新鲜的。在某些实施方式中，所述第四组合物被冷冻，然后在给药之前融化。

在特定实施方式中，从患有恶性疾病的患者或健康对象获得的干细胞是骨髓细胞或骨髓来源的干细胞。

术语“富集有功能性线粒体的哺乳动物干细胞”是指人类和非人类哺乳动物。

根据本发明的原理，将健康的功能性人类外源线粒体引入到人类干细胞中，由此使这些细胞富集有健康的功能性人类线粒体。应该理解，这种富集改变了所述人类干细胞的线粒体含量：原初人类干细胞基本上具有一个宿主/自体线粒体群体，而富集有外源线粒体的人类干细胞基本上具有两个线粒体群体，第一个群体是宿主/自体/内源线粒体，另一个群体是引入的线粒体(即外源线粒体)。因此，术语“富集有”是指所述细胞在接受/并入外源线粒体后的状态。确定所述两个线粒体群体的数目和/或其间的比率是直截了当的，因为所述两个群体在几个方面例如在它们的线粒体DNA方面存在差异。因此，短语“富集有健康的功能性人类线粒体的人类干细胞”等同于短语“包含内源线粒体和健康的功能性外源线粒体的人类干细胞”。例如，包含总线粒体的至少1％的健康的功能性外源线粒体的人类干细胞，被认为以99:1的比例包含宿主/自体/内源线粒体和健康的功能性外源线粒体。例如，“总线粒体的3％”意味着在富集后所述原始的(内源)线粒体含量为总线粒体的97％，并且所述引入的(外源)线粒体为总线粒体的3％，这等同于(3/97＝)3.1％的富集。另一个实例“总线粒体的33％”意味着在富集后所述原始的(内源)线粒体含量为总线粒体的67％，并且所述引入的(外源)线粒体为总线粒体的33％，这等同于(33/67＝)49.2％的富集。

异质性是在细胞或个体内存在超过一种类型的线粒体DNA。异质性水平是突变体mtDNA分子相对于野生型/功能性mtDNA分子的比例，并且是考虑线粒体疾病的严重性中的重要因素。较低的异质性水平(足够量的线粒体是功能性的)与健康的表型相关，而较高的异质性水平(不足量的线粒体是功能性的)与病理相关。在某些实施方式中，所述第四组合物中干细胞的异质性水平比所述第一组合物中干细胞的异质性水平低至少1％。在某些实施方式中，所述第四组合物中干细胞的异质性水平比所述第一组合物中干细胞的异质性水平低至少3％。在某些实施方式中，所述第四组合物中干细胞的异质性水平比所述第一组合物中干细胞的异质性水平低至少5％。在某些实施方式中，所述第四组合物中干细胞的异质性水平比所述第一组合物中干细胞的异质性水平低至少10％。在某些实施方式中，所述第四组合物中干细胞的异质性水平比所述第一组合物中干细胞的异质性水平低至少15％。在某些实施方式中，所述第四组合物中干细胞的异质性水平比所述第一组合物中干细胞的异质性水平低至少20％。在某些实施方式中，所述第四组合物中干细胞的异质性水平比所述第一组合物中干细胞的异质性水平低至少25％。在某些实施方式中，所述第四组合物中干细胞的异质性水平比所述第一组合物中干细胞的异质性水平低至少30％。

在某些实施方式中，所述富集有健康线粒体的人类干细胞(在本文中也被称为第四组合物的细胞)的线粒体含量可检测地高于所述第一组合物中的人类干细胞的线粒体含量。根据各种不同实施方式，所述第四组合物的线粒体含量比所述第一组合物的线粒体含量高至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少100％、至少200％或更高。在某些实施方式中，所述第一组合物新鲜使用。

在某些实施方式中，所述第一组合物被冷冻然后储存，并在融化后使用。在其他实施方式中，所述包含多个功能性人类线粒体的第二组合物新鲜使用。在其他实施方式中，将所述第二组合物冷冻并在使用前融化。在其他实施方式中，所述第四组合物不需冷冻和储存直接使用。在另外的其他实施方式中，所述第四组合物在冷冻、储存和融化后使用。适合于冷冻和融化细胞制备物以保留存活力的方法在本领域中是公知的。适合于冷冻和融化线粒体以保留结构和功能的方法公开在属于本发明人的WO 2013/035101和WO 2016/135723和其中引用的参考文献中。

柠檬酸合酶(CS)位于线粒体基质中，但由核DNA编码。柠檬酸合酶参与克雷布斯循环的第一步，并通常被用作完整线粒体存在的定量酶标记物(Larsen S.等，2012,J.Physiol.,Vol.590(14)，第3349–3360页；Cook G.A.等，Biochim.Biophys.Acta.,1983,Vol.763(4)，第356-367页)。

在某些实施方式中，通过确定柠檬酸合酶的含量来确定所述第一组合物、第二组合物或第四组合物中干细胞的线粒体含量。在某些实施方式中，通过确定柠檬酸合酶的活性水平来确定所述第一组合物、第二组合物或第四组合物中干细胞的线粒体含量。在某些实施方式中，所述第一组合物、第二组合物或第四组合物中干细胞的线粒体含量与柠檬酸合酶的含量相关。在某些实施方式中，所述第一组合物、第二组合物或第四组合物中干细胞的线粒体含量与柠檬酸合酶的活性水平相关。CS活性可以通过可商购的试剂盒例如使用CS活性试剂盒CS0720(Sigma)来测量。

真核生物的NADPH-细胞色素C还原酶(细胞色素C还原酶)是一种定位于内质网的黄素蛋白。它将电子从NADPH传递到几种加氧酶，其中最重要的是负责异生物质脱毒的细胞色素P450家族的酶。细胞色素C还原酶被广泛用作内质网标志物。在某些实施方式中，所述第二组合物基本上没有细胞色素C还原酶或细胞色素C还原酶活性。在某些实施方式中，所述第四组合物与所述第一组合物相比未富集细胞色素C还原酶或细胞色素C还原酶活性。

在某些实施方式中，所述干细胞是多能干细胞(PSC)。在其他实施方式中，所述PSC是非胚胎干细胞。根据某些实施方式，胚胎干细胞被明确排除在本发明的范围之外。在某些实施方式中，所述干细胞是诱导性PSC(iPSC)。在某些实施方式中，所述干细胞是胚胎干细胞。在某些实施方式中，所述干细胞源自于骨髓细胞。在特定实施方式中，所述干细胞是CD34

在某些实施方式中，所述骨髓来源的干细胞包含成髓细胞。当在本文中使用时，术语“成髓细胞”是指参与骨髓形成，例如参与骨髓和从其产生的所有细胞即所有血液细胞的生成的细胞。

在某些实施方式中，所述骨髓来源的干细胞包含红细胞生成细胞。当在本文中使用时，术语“红细胞生成细胞”是指参与红细胞生成，例如参与红血细胞(红细胞)的产生的细胞。

在某些实施方式中，所述骨髓来源的干细胞包含多潜能造血干细胞(HSC)。当在本文中使用时，术语“多潜能造血干细胞”或“成血细胞”是指通过造血过程产生所有其他血液细胞的干细胞。

在某些实施方式中，所述骨髓来源的干细胞包含共同髓系祖细胞、共同淋巴系祖细胞或其任何组合。在某些实施方式中，所述骨髓来源的干细胞包含间充质干细胞。当在本文中使用时，术语“共同髓系祖细胞”是指产生髓系细胞的细胞。当在本文中使用时，术语“共同淋巴系祖细胞”是指产生淋巴细胞的细胞。

在某些实施方式中，所述第一组合物的骨髓来源的干细胞还包含巨核细胞、红细胞、肥大细胞、成肌细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、小淋巴细胞、T淋巴细胞，B淋巴细胞、浆细胞、网状细胞或其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

在某些实施方式中，所述骨髓来源的干细胞包含间充质干细胞。当在本文中使用时，术语“间充质干细胞”是指可以分化成各种不同的细胞类型包括成骨细胞(骨细胞)、软骨细胞、肌细胞(肌肉细胞)和脂肪细胞的多能基质细胞。

在某些实施方式中，所述骨髓来源的干细胞由成髓细胞构成。在某些实施方式中，所述骨髓来源的干细胞由红细胞生成细胞构成。在某些实施方式中，所述骨髓来源的干细胞由多潜能造血干细胞(HSC)构成。在某些实施方式中，所述骨髓来源的干细胞由共同髓系祖细胞、共同淋巴系祖细胞或其任何组合构成。在某些实施方式中，所述骨髓来源的干细胞由巨核细胞、红细胞、肥大细胞、成肌细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、小淋巴细胞、T淋巴细胞，B淋巴细胞、浆细胞、网状细胞或其任何组合构成。在某些实施方式中，所述骨髓来源的干细胞由间充质干细胞构成。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

也被称为CD34抗原的造血祖细胞抗原CD34是在人类中由CD34基因编码的蛋白质。CD34是细胞表面糖蛋白中的一种分化抗原簇，并起到细胞-细胞黏附因子的作用。在某些实施方式中，所述骨髓干细胞表达骨髓祖细胞抗原CD34(是CD34

在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞直接源自于所述患有令人衰弱的病症的对象。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞直接源自于未患有令人衰弱的病症的供体。当在本文中使用时，术语“直接源自于”是指直接源自于其他细胞的干细胞。在某些实施方式中，所述造血干细胞(HSC)源自于骨髓细胞。在某些实施方式中，所述造血干细胞(HSC)源自于外周血。

在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞间接源自于所述患有令人衰弱的病症的对象。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞间接源自于未患有令人衰弱的病症的供体。当在本文中使用时，术语“间接源自于”是指源自于非干细胞的干细胞。在某些实施方式中，所述干细胞源自于被操作以变成诱导性多能干细胞(iPSC)的体细胞。

在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从所述患有令人衰弱的病症的对象的骨髓直接获得。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从未患有令人衰弱的病症的供体的骨髓直接获得。当在本文中使用时，术语“直接获得”是指例如通过诸如手术或利用注射器经针头吮吸的手段从骨髓本身获得的干细胞。

在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从所述患有令人衰弱的病症的患者的骨髓间接获得。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从未患有令人衰弱的病症的供体的骨髓间接获得。当在本文中使用时，术语“间接获得”是指从骨髓本身之外的其他位置获得的骨髓细胞。

在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从所述患有令人衰弱的病症的对象的外周血获得。在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从所述未患有令人衰弱的病症的对象的外周血或从未患有令人衰弱的病症的对象的外周血获得。当在本文中使用时，术语“外周血”是指在血液系统中循环的血液。

在某些实施方式中，所述第一组合物包含从外周血获得的多个人类骨髓干细胞，其中所述第一组合物还包含巨核细胞、红细胞、肥大细胞、成髓细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、小淋巴细胞、T淋巴细胞，B淋巴细胞、浆细胞、网状细胞或其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

在某些实施方式中，上述方法还包括前期步骤，所述步骤包括向所述患有令人衰弱的病症的对象给药诱导骨髓细胞向外周血动员的药剂。在某些实施方式中，上述方法还包括前期步骤，所述步骤包括向未患有令人衰弱的病症的供体给药诱导骨髓细胞向外周血动员的药剂。

在某些实施方式中，所述诱导骨髓中产生的骨髓细胞/干细胞向外周血动员的药剂选自粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、1,1′-[1,4-亚苯基双(亚甲基)]双[1,4,8,11-四氮杂环十四烷](普乐沙福，CAS编号155148-31-5)、其盐及其任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

在某些实施方式中，上述方法还包括从患有令人衰弱的病症的对象的外周血分离所述干细胞的步骤。在某些实施方式中，上述方法还包括从未患有令人虚弱的疾病的供体的外周血分离所述干细胞的步骤。当在本文中使用时，术语“从外周血分离”是指将干细胞与血液的其他组成成分分离开。

在单采分离期间，将对象或供体的血液通过一种装置，所述装置分离出一种特定组成成分并将剩余组分返回到循环。因此，它是在身体外部进行的医学程序。在某些实施方式中，所述分离通过单采分离来进行。

在某些实施方式中，上述方法还包括在温育之前浓缩所述第三组合物中的干细胞和功能性线粒体。在某些实施方式中，上述方法还包括在温育期间浓缩所述第三组合物中的干细胞和功能性线粒体。

在某些实施方式中，上述方法还包括在温育之前将所述第三组合物离心。在某些实施方式中，上述方法还包括在温育期间将所述第三组合物离心。在某些实施方式中，上述方法还包括在温育之后将所述第三组合物离心。

在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从患有令人衰弱的病症的对象获得，并且所述干细胞具有(i)正常的氧(O

在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从患有令人衰弱的病症的对象获得，并且与未患有令人衰弱的病症的对象相比所述干细胞具有(i)降低的氧(O

应该强调的是，对针对多个细胞或线粒体的任何可测量的特点或特征或情况的任何指称，针对的是所述多个细胞或线粒体的所述可测量的平均特点或特征或情况。

在某些实施方式中，所述第一组合物中的干细胞从未患有令人衰弱的病症的供体获得，并具有(i)正常的氧(O

在某些实施方式中，所述第二组合物中的分离的人类功能性线粒体从具有正常线粒体DNA的健康对象获得，并具有(i)正常的氧(O

在某些实施方式中，所述第四组合物中的干细胞与所述第一组合物中的干细胞相比具有(i)提高的氧(O

当在本文中使用时，术语“提高的氧(O

当在本文中使用时，术语“提高的柠檬酸合酶含量或活性水平”是指可检测地高于线粒体富集之前所述第一组合物中的柠檬酸合酶含量值或活性水平的柠檬酸合酶含量或活性水平。

当在本文中使用时，术语“提高的三磷酸腺苷(ATP)生产速率”是指可检测地高于线粒体富集之前所述第一组合物中的三磷酸腺苷(ATP)生产速率的三磷酸腺苷(ATP)生产速率。

当在本文中使用时，术语“提高的线粒体DNA含量”是指可检测地高于线粒体富集之前所述第一组合物中的线粒体DNA含量的线粒体DNA含量。线粒体含量可以通过测量SDHA或COX1含量来确定。在本说明书和权利要求书的上下文中，术语“正常的线粒体DNA”是指不带有/具有已知与线粒体疾病相关的突变或缺失的线粒体DNA。当在本文中使用时，术语“正常的氧(O

根据某些方面，本发明提供了一种在需要治疗的人类患者中治疗令人衰弱的病症或其症状的方法，所述方法包括向所述患者给药包含多个人类干细胞的药物组合物的步骤，其中所述人类干细胞富集有冻融过的在线粒体DNA中没有致病突变的健康的功能性外源线粒体。

在某些实施方式中，所述症状选自行走能力受损、运动技能受损、语言技能受损、记忆受损、体重减轻、恶病质、血液碱性磷酸酶水平低、血镁水平低、血液肌酐水平高、血液碳酸氢盐水平低、血液碱过量水平低、尿液葡萄糖/肌酐比率高、尿液氯化物/肌酐比率高、尿液钠/肌酐比率高、血液乳酸盐水平高、尿液镁/肌酐比率高、尿液钾/肌酐比率高、尿液钙/肌酐比率高、糖尿、镁尿、血液尿素水平高、C-肽水平低、HbA1C水平高、甲状旁腺功能减退、上睑下垂、听觉损失、心脏传导障碍、淋巴细胞中的ATP含量和氧消耗量低、心境障碍包括双相障碍、强迫症、抑郁症以及人格障碍。每种可能性代表本发明的独立实施方式。应该理解，将症状定义为“高”和“低”分别对应于“可检测地高于正常”和“可检测地低于正常”，其中所述正常水平是未患有线粒体疾病的多个对象中的相应水平。

在某些实施方式中，所述药物组合物被给药到特定组织或器官。在某些实施方式中，所述药物组合物包含至少10

在某些实施方式中，所述药物组合物通过肠胃外给药来给药。在某些实施方式中，所述药物组合物通过系统性给药来给药。在某些实施方式中，所述药物组合物通过静脉内注射给药。在某些实施方式中，所述药物组合物通过静脉输注给药。在某些实施方式中，所述药物组合物包含至少10

线粒体DNA含量可以通过在线粒体富集之前和之后进行线粒体基因的定量PCR并归一化到核基因来测量。

在特定情况下，将线粒体富集之前的同一种细胞用作对照以测量CS和ATP活性并确定富集水平。

在某些实施方式中，本文中所使用的术语“可检测地高于”是指所述正常与提高的值之间的统计学显著的提高。在某些实施方式中，本文中所使用的术语“可检测地高于”是指非病理性提高，即提高到其中没有与所述实质性更高的值相关的病理症状变得显而易见的水平。在某些实施方式中，当在本文中使用时，术语“提高的”是指比在健康对象或多个健康对象的相应细胞或相应线粒体中或线粒体富集之前所述第一组合物的干细胞中存在的相应值高1.05倍、1.1倍、1.25倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍或更高的值。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

在某些实施方式中，所述第四组合物中的干细胞具有下述中的至少一者：(i)与线粒体富集之前所述干细胞的线粒体DNA含量相比提高的正常线粒体DNA含量；(ii)与线粒体富集之前干细胞中的氧(O

在某些实施方式中，所述第二组合物中线粒体蛋白的总量在所述样品中细胞蛋白的总量的20％-80％之间。

当在本文中使用时，术语“约”是指所指示的数值的±10％。通常，本文中使用的数值是指所述指定数值的±10％。

在某些实施方式中，所述方法还包括冷冻所述第四组合物。在某些实施方式中，所述方法还包括冷冻然后解冻所述第四组合物。

另一方面，本发明还提供了通过上述方法获得的多个富集有功能性线粒体的人类干细胞。

在某些实施方式中，将所述多个干细胞在用功能性线粒体富集之前冷冻。在其他实施方式中，将所述多个干细胞冷冻，然后在用功能性线粒体富集之前融化、在其他实施方式中，将所述多个富集有功能性线粒体的干细胞冷冻。在其他实施方式中，将所述多个富集有功能性线粒体的干细胞冷冻，然后在使用之前融化。

另一方面，本发明还提供了多个人类干细胞，其中所述干细胞与根据本发明的原理富集健康线粒体之前来自于同一来源的人类干细胞相比具有选自下述的至少一种性质：(a)提高的线粒体含量；(b)提高的氧(O

当在本文中使用时，术语“提高的线粒体含量”是指可检测地高于线粒体富集之前所述第一组合物的线粒体含量的线粒体含量。

在某些实施方式中，将所述多个细胞冷冻。在某些实施方式中，将所述多个细胞冷冻，然后在使用之前融化。

在某些实施方式中，所述多个人类干细胞是CD34

在某些实施方式中，所述多个人类干细胞具有提高的线粒体含量、提高的正常线粒体DNA水平、提高的(O

另一方面，本发明还提供了包含如上所述的多个富集有功能性线粒体的人类干细胞的药物组合物。

当在本文中使用时，术语“药物组合物”是指包含细胞，还包含将其中的细胞维持在存活状态下的介质或载体的任何组合物。

在某些实施方式中，所述药物组合物被冷冻。在某些实施方式中，所述药物组合物被冷冻，然后在使用之前融化。

在某些实施方式中，上述药物组合物用于在具有令人衰弱的病症的人类对象中治疗某些症状的方法中。当在本文中使用时，术语“治疗”包括与对象患有的病症的虚弱效应相关或由其引起的至少一种症状的减轻、缓和或改善。

另一方面，本发明还提供了一种在患有恶性疾病的人类对象中缓解或减轻包括但不限于衰老、年龄相关疾病或抗癌疗法的病症的虚弱效应的方法，所述方法包括向所述对象给药上述药物组合物的步骤。

当在本文中使用时，术语“方法”通常是指用于实现给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于那些为化学、制药学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知或容易从已知的方式、手段、技术和程序开发的方式、手段、技术和程序。

在某些实施方式中，所述药物组合物被冷冻，并且上述方法包括在使用之前将所述冷冻的药物组合物解冻。

在某些实施方式中，所述干细胞对于所述患有令人衰弱的病症的对象来说是自体的。

将功能性线粒体与所述患有令人衰弱的病症的对象自体的干细胞相接触，导致所述干细胞的复壮/复苏。

在某些实施方式中，上文描述的方法在其各种不同实施方式中还包括通过将所述第一组合物的干细胞在能够扩增干细胞的增殖培养基中培养，来扩增所述干细胞。在其他实施方式中，所述方法还包括通过将所述第四组合物的线粒体富化的干细胞在能够扩增干细胞的培养基或增殖培养基中培养，来扩增所述细胞。当在整个本申请中使用时，术语“培养或增殖培养基”是为细胞提供营养物的流体介质例如细胞培养基、细胞生长培养基、缓冲液。当在整个本申请和权利要求书中使用时，术语“药物组合物”包含为细胞提供营养物的流体载体例如细胞培养基、细胞生长培养基、缓冲液。

在某些实施方式中，所述通过功能性线粒体复壮的干细胞在所述患有虚弱效应的对象中的给药可以减少这些效应。在某些实施方式中，所述复壮干细胞的给药可以恢复所述患有令人衰弱的病症的对象的肠绒毛中上皮细胞的组织和分布。在其他实施方式中，所述复壮干细胞的给药可以恢复所述对象的肠隐窝中上皮干细胞的活性。在其他实施方式中，所述复壮干细胞的给药可以恢复所述对象中的真皮厚度。在另外的其他实施方式中，所述复壮干细胞的给药可以恢复所述对象中的毛囊活性。在另外的实施方式中，所述复壮干细胞的给药可以恢复对象真皮组织中的伤口愈合活性。根据某些实施方式，富集有功能性线粒体的干细胞可以复壮自体造血干细胞移植物中的血液前体细胞。根据其他实施方式，富集有功能性线粒体的干细胞可以复壮同种异体造血干细胞移植物中的血液前体细胞。根据另外的其他实施方式，富集有功能性线粒体的干细胞可以复壮真皮或肠上皮前体细胞。在另外的实施方式中，所述复壮干细胞的给药可以恢复对象中胰腺β-细胞的功能。根据某些实施方式，富集有功能性线粒体的干细胞可以复壮肝细胞。根据其他实施方式，富集有功能性线粒体的干细胞可以延迟肾功能劣化。根据另外的其他实施方式，富集有功能性线粒体的干细胞可以减少黄斑变性。

在某些实施方式中，所述干细胞对于所述患有令人衰弱的病症的对象来说是同种异体的。当在本文中使用时，术语“对于所述对象来说是同种异体的”、“来自于供体”和“来自于健康供体”可互换使用，并且是指来自于不同供体个体的干细胞或线粒体。如果可能，所述供体干细胞优选地与所述患者的细胞HLA匹配或至少部分HLA匹配。根据某些实施方式，所述供体根据特定线粒体DNA单倍群的鉴定与所述患者匹配。

当在本文中使用时，术语“HLA匹配”是指需要所述患者和干细胞的供体尽可能接近地HLA匹配，至少达到所述患者不发生针对所述供体的干细胞的急性免疫应答的程度。这种免疫应答的预防和/或治疗可以在进行或不进行免疫抑制剂的急性或慢性使用的情况下实现。在某些实施方式中，来自于所述供体的干细胞与所述患者HLA匹配到其中所述患者不排斥所述干细胞的程度。

在某些实施方式中，所述患者进一步通过免疫抑制疗法进行治疗，以防止所述干细胞移植物的免疫排斥。

在某些实施方式中，所述线粒体来自于一致的单倍群。

在其他实施方式中，所述线粒体来自于不同的单倍群。

在某些实施方式中，上述方法还包括在给药所述药物组合物之前向所述患者给药移植前调理剂的前期步骤。当在本文中使用时，术语“移植前调理剂”是指能够杀死人类对象骨髓中的骨髓细胞的任何药剂。在某些实施方式中，所述移植前调理剂是白消安。

在某些实施方式中，所述药物组合物被系统性给药。在某些实施方式中，所述药物组合物向对象的给药通过选自静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、玻璃体内和直接注射到组织或器官中的途径来进行。每种可能性代表本发明的独立实施方式。根据某些实施方式，所述药物组合物被直接注射到受本发明所述的令人衰弱的病症影响的组织和器官。已知显示出与线粒体质量和活性的下降相关的功能受损的具体组织或器官包括但不限于眼、肾脏、肝脏、胰腺、脑和心脏。

在某些实施方式中，所述功能性线粒体从选自胎盘、在培养物中生长的胎盘细胞和血液细胞的人类细胞或人类组织获得。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

根据某些实施方式，所述功能性线粒体已经历冻融循环。不希望受到任何理论或机制限制，与未经历冻融循环的对照线粒体相比，已经历冻融循环的线粒体在融化后表现出可比的氧消耗速率。

根据某些实施方式，所述冻融循环包括在融化之前将所述功能性线粒体冷冻至少24小时。根据其他实施方式，所述冻融循环包括在融化之前将所述功能性线粒体冷冻至少1个月、几个月或更长时间。每种可能性代表本发明的独立实施方式。根据另一个实施方式，所述功能性线粒体在所述冻融循环后的氧消耗量等于或高于所述功能性线粒体在所述冻融循环之前的氧消耗量。

当在本文中使用时，术语“冻融循环”是指将所述功能性线粒体冷冻到低于0℃的温度，将所述线粒体在低于0℃的温度下维持确定的时间段，并将所述线粒体融化到室温或体温或能够用所述线粒体处理所述干细胞的任何高于0℃的温度。每种可能性代表本发明的独立实施方式。当在本文中使用时，术语“室温”通常是指18℃至25℃之间的温度。当在本文中使用时，术语“体温”是指35.5℃至37.5℃之间的温度，优选为37℃。在另一个实施方式中，已经历冻融循环的线粒体是功能性线粒体。

在另一个实施方式中，将所述已经历冻融循环的线粒体在-70℃或更低的温度下冷冻。在另一个实施方式中，将所述已经历冻融循环的线粒体在-20℃或更低的温度下冷冻。在另一个实施方式中，将所述已经历冻融循环的线粒体在-4℃或更低的温度下冷冻。根据另一个实施方式，所述线粒体的冷冻是逐渐的。根据某些实施方式，线粒体的冷冻通过闪冻进行。当在本文中使用时，术语“闪冻”是指通过使所述线粒体经历超低温而将它们快速冷冻。

在另一个实施方式中，将所述经历冻融循环的线粒体在融化之前冷冻至少30分钟。根据另一个实施方式，所述冻融循环包括将所述功能性线粒体在融化之前冷冻至少30、60、90、120、180、210分钟。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在另一个实施方式中，将所述已经历冻融循环的线粒体在融化之前冷冻至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24、48、72、96或120小时。每个冷冻时间代表本发明的独立实施方式。在另一个实施方式中，将所述已经历冻融循环的线粒体在融化之前冷冻至少4、5、6、7、30、60、120、365天。每个冷冻时间代表本发明的独立实施方式。根据另一个实施方式，所述冻融循环包括将所述功能性线粒体在融化之前冷冻至少1、2、3周。每种可能性代表本发明的独立实施方式。根据另一个实施方式，所述冻融循环包括将所述功能性线粒体在融化之前冷冻至少1、2、3、4、5、6个月。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

在另一个实施方式中，将所述已经历冻融循环的线粒体在融化之前在-70℃冷冻至少30分钟。不希望受到任何理论或机制限制，冷冻线粒体并将它们在长时间段后融化的可能性使得能够容易地储存和使用所述线粒体并获得可重复的结果，即使是在长时间储存后。

根据某个实施方式，融化在室温下进行。在另一个实施方式中，融化在体温下进行。根据另一个实施方式，融化在能够按照本发明的方法给药所述线粒体的温度下进行。根据另一个实施方式，融化逐渐地进行。

根据另一个实施方式，将所述经历冻融循环的线粒体在冷冻缓冲液内冷冻。根据另一个实施方式，将所述经历冻融循环的线粒体在分离缓冲液内冷冻。当在本文中使用时，术语“分离缓冲液”是指本发明的线粒体在其中被分离的缓冲液。在非限制性实例中，所述分离缓冲液是蔗糖缓冲液。不希望受到任何机制或理论限制，将线粒体在所述分离缓冲液中冷冻节省时间和分离步骤，因为不需要在冷冻之前用冷冻缓冲液代替所述分离缓冲液或在融化后替换所述冷冻缓冲液。

根据另一个实施方式，所述冷冻缓冲液包含低温防护剂。根据某些实施方式，所述低温防护剂是糖、寡糖或多糖。每种可能性代表本发明的独立实施方式。根据另一个实施方式，所述冷冻缓冲液中的糖浓度是足以用于保护线粒体功能的糖浓度。根据另一个实施方式，所述分离缓冲液包含糖。根据另一个实施方式，所述分离缓冲液中的糖浓度是足以用于保护线粒体功能的糖浓度。根据另一个实施方式，所述糖是蔗糖。

在某些实施方式中，所述方法还包括下述前期步骤：(a)冷冻所述富集有健康的功能性人类外源线粒体的人类干细胞，(b)融化所述富集有健康的功能性人类外源线粒体的人类干细胞，和(c)将所述富集有健康的功能性人类外源线粒体的人类干细胞给药到所述患者。

在某些实施方式中，所述健康的功能性外源线粒体占线粒体富化的细胞中总线粒体的至少3％。在某些实施方式中，所述健康的功能性外源线粒体占线粒体富化的细胞中总线粒体的至少10％。在某些实施方式中，所述健康的功能性外源线粒体占线粒体富化的细胞中总线粒体的至少约3％、5％、10％、15％、20％、25％或30％。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

所述干细胞富集功能性线粒体的程度可以通过功能和/或酶测定法来确定，包括但不限于氧(O

TMRM(四甲基罗丹明甲酯)或相关的TMRE(四甲基罗丹明乙酯)是细胞穿透性产荧光染料，常用于通过鉴定线粒体膜电位的变化来评估活细胞中的线粒体功能。根据某些实施方式，所述富集水平可以通过用TMRE或TMRM染色来确定。

根据某些实施方式，线粒体膜的完整性可以通过本领域中已知的任何方法来确定。在非限制性实例中，线粒体膜的完整性使用四甲基罗丹明甲酯(TMRM)或四甲基罗丹明乙酯(TMRE)荧光探针来测量。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在显微镜下观察到并显示出TMRM或TMRE染色的线粒体具有完整的线粒体外膜。当在本文中使用时，术语“线粒体膜”是指选自线粒体内膜、线粒体外膜和两者的线粒体膜。

在某些实施方式中，线粒体富化的人类干细胞中的线粒体富集水平，通过对所述细胞中总线粒体DNA的至少统计学代表性部分进行测序并确定宿主/内源线粒体DNA和外源线粒体DNA的相对水平来确定。在某些实施方式中，线粒体富化的人类干细胞中的线粒体富集水平通过单核苷酸多态性(SNP)分析来确定。在某些实施方式中，所述最大的线粒体群体和/或最大的线粒体DNA群体是所述宿主/内源线粒体群体和/或宿主/内源线粒体DNA群体；和/或所述第二大的线粒体群体和/或第二大的线粒体DNA群体是所述外源线粒体群体和/或外源线粒体DNA群体。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

根据某些实施方式，所述干细胞用健康的功能性线粒体的富集可以通过本领域中公知的常规测定法来确定。在某些实施方式中，线粒体富化的人类干细胞中的线粒体富集水平通过下述水平来确定：(i)宿主/内源线粒体DNA和外源线粒体DNA的水平；(ii)选自柠檬酸合酶(CS)、细胞色素C氧化酶(COX1)、琥珀酸脱氢酶复合物黄素蛋白亚基A(SDHA)的线粒体蛋白及其任何组合的水平；(iii)CS活性水平；或(iv)(i)、(ii)和(iii)的任何组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

在某些实施方式中，线粒体富化的人类干细胞中的线粒体富集水平通过下述中的至少一者来确定：(i)在同种异体线粒体的情况下宿主线粒体DNA和外源线粒体DNA的水平；(ii)柠檬酸合酶活性的水平；(iii)琥珀酸脱

氢酶复合物黄素蛋白亚基A(SDHA)或细胞色素C氧化酶(COX1)蛋白的水平；(iv)氧(O

在某些方面，本发明提供了一种用于在对象中治疗或减轻病症的虚弱效应的药物组合物，其包含富集有健康的功能性线粒体的人类干细胞，其中所述病症的虚弱效应选自但不限于衰老、年龄相关疾病和抗癌治疗的后遗症。

在某些实施方式中，本发明提供了一种在对象中治疗或减轻病症的虚弱效应的方法，所述方法包括向所述对象给药包含富集有健康的功能性线粒体的人类干细胞的药物组合物，其中所述病症的虚弱效应选自但不限于衰老、年龄相关疾病和抗癌治疗的后遗症。在特定实施方式中，所述抗癌治疗选自辐射、化疗、使用单克隆抗体的免疫疗法或其任何组合。

根据某些实施方式，所述健康的功能性线粒体从根据所述对象的令人衰弱的病症选自特定线粒体单倍群的供体分离。例如，对于衰老对象来说，给药富集有来自于J线粒体单倍群的功能性线粒体的干细胞是适合的，因为它与长寿和较低的血压相关(DeBenedictis等，FASEB J.1999；13(12):1532-6；Rea等，AGE 2013；34(4):1445-56)。H和N单倍群与更好的肌肉功能和力量相关(Larsen等，Biochim Biophys Acta.2014；1837(2):226-31；Fuku等，Int J Sports Med.2012；33(5):410-4)。D4b单倍群可能针对中风提供保护(Yang等，Mol Genet Genomics.2014；289(6):1241-6)，K、U、H和V单倍群可能针对认知缺损提供保护(Colicino等，Environ Health.2014；13(1):42)，并且已显示R单倍群提供从脓毒性脑病恢复的更好预后(Yang等，Intensive Care Med.2011；37(10):1613-9)。单倍群N9a提供对糖尿病(Fuku等，Am J Hum Genet.2007；80(3):407-15)和代谢综合征(Tanaka等，Diabetes 2007；56(2):518-21)的抗性。H单倍群针对发生包括年龄相关的黄斑变性(AMD)在内的眼病提供保护(Mueller等，PloS one 2012；7(2):e30874)。

根据某些实施方式，所述第一组合物的干细胞来自于根据所述对象的令人衰弱的病症选自特定线粒体单倍群的供体。例如，对于患有抗癌治疗的虚弱效应的对象，可以考虑J、K2和U单倍群，因为已显示它们是用于同种异体造血干细胞移植的更好的供体，引发更少的GVHD和/或复发(Ross等，Biol Blood Marrow Transplant 2015；21:81-88)。

当在本文中使用时，术语“单倍群”是指在母系血统上享有共同祖先的人类遗传学群体组。线粒体单倍群通过测序来确定。

在某些情况下，我们可能希望在供体和受体之间匹配单体型。

当在本文中使用时，术语“约”意味着比所指示的整数、数目或量低10％至高10％的范围。例如，短语“约1×10

尽管已参考某些实施方式对本发明进行了描述，但本领域技术人员将会理解，可以做出各种不同的改变并且可以用等同方式替换而不背离本发明的范围。此外，在不背离本发明的范围的情况下可以做出许多修改，以使特定情况或材料适应于本发明的教导。因此，不打算将本发明限于所公开的特定实施方式，而是本发明将包括落于权利要求书的范围之内的所有实施方式。

提供下面的实施例是为了提供对本发明的更完全的理解。为说明本发明的原理而阐述的具体技术、条件、材料、比例和报告的数据是示例性的，并且不应被解释为限制本发明的范围。

实施例

线粒体可以如以前在WO 2013/035101和WO 2016/135723中所公开的进行分离和保存。

下面是用于线粒体(MNV-BLD)从外周血细胞的分离和CD34

将在其线粒体中表达绿色荧光蛋白(GFP)的小鼠成纤维细胞(3T3)(左图)与从在其线粒体中表达RFP的小鼠成纤维细胞(3T3)分离的红色荧光蛋白(RFP)标记的线粒体(中图)温育24小时。如以前在WO2016/135723中所述，使用荧光共聚焦显微术鉴定表现为黄色的被GFP和RFP两者标记的成纤维细胞(右图)(图1)。

图1中演示的结果表明线粒体可以进入成纤维细胞细胞。

将小鼠成纤维细胞(10

图2中演示的结果清楚地表明，尽管单独的鱼藤酮将ATP水平降低约50％，但添加线粒体能够基本上消除鱼藤酮的抑制效应，达到对照细胞的ATP水平。所述实验为线粒体能够在线粒体活性损伤或受损的细胞中增加线粒体ATP生产提供了证据。

将小鼠骨髓细胞(10

图3中演示的结果表明线粒体可以进入骨髓细胞。

将来自于野生型(ICR)和线粒体突变(FVB/N，带有ATP8中的突变)小鼠的骨髓细胞与不同起源的分离的线粒体在37℃和5％CO

为了研究线粒体增强疗法的体内效应，将用4.4毫单位CS活性的C57/BL胎盘线粒体富集的FVB/N骨髓细胞(1x10

将小鼠骨髓细胞(10

表2.

图5中演示的结果表明添加的线粒体以剂量依赖性方式提高细胞的CS活性，并且提高浓度以及因此推测例如通过离心增加所述线粒体与细胞之间的接触导致CS活性的进一步提高。

将小鼠骨髓细胞(10

将FVB/N骨髓细胞(在mtDNA ATP8中带有突变)与从胎盘分离的C57/BL野生型(WT)线粒体以各种不同的剂量(在1mL中0.044、0.44、0.88、2.2、4.4、8.8、17.6毫单位CS活性/1M个细胞)温育。正如可以在图7A中看到的，使用WT特异性序列的dPCR显示，对于大多数剂量来说WT mtDNA以剂量依赖性方式增加。所述富集的细胞也显示出mtDNA编码的(COX1)(图7B)和核编码的(SDHA)(图7C)含量的剂量依赖性提高。

将人类CD34

表3.

图8中演示的结果(参见表3)清楚地表明，通过与分离的人类线粒体相互作用和共温育，人类骨髓细胞的线粒体含量可以提高许多倍，其程度超过人类或鼠类成纤维细胞或鼠类骨髓细胞的能力。

将图8B中描绘的细胞群体通过FACS分析进行进一步评估。在未与GFP标记的线粒体温育过的CD34

通过单采分离获得用GCS-F处理的健康供体的人类CD34

用血液来源的线粒体处理的CD34

将来自于健康供体的CD34

正如可以在图11中看到的，外源线粒体快至在MAT后0.5小时即进入CD34

将CD34

在不同培养条件下的细胞存活率概述在表4中。

表4.

表4中演示的结果表明，当在RT下使用人血清白蛋白在盐水而不是培养基中培养时，CD34

将皮尔逊综合症患者的脐带血细胞与0.88mU人类线粒体温育24hr，然后除去培养基，将细胞清洗并重悬浮在4.5％HSA中。将所述富集的细胞IV注射到NSGS小鼠(每只小鼠100,000个CD34

图12A是皮尔逊综合症患者的脐带血细胞中mtDNA缺失的图示说明，示出了4978kb的缺失的UCB mtDNA区域(左图)，以及示出了所述缺失的DNA印迹分析(右图)。

在MAT后2个月从小鼠收集骨髓，并使用鉴定UCB不存在缺失的WT mtDNA序列的引物和探针在dPCR中分析不存在缺失的WT mtDNA的拷贝数。

正如可以在图12B中看到的，在线粒体增强疗法后2个月，所述小鼠的骨髓与用未增强的脐带血细胞注射的小鼠的骨髓相比含有多出～100％的人类mtDNA。

实施例10.体内安全性和生物分布动物模型

将线粒体引入到来自于两种不同背景的对照健康小鼠的骨髓细胞中：线粒体的来源是来自于具有不同mtDNA序列的小鼠(Jenuth JP等，Nature Genetics,1996,Vol.14，第146-151页)。

从野生型小鼠(C57BL)胎盘分离线粒体。从FVB/N小鼠分离骨髓细胞。将所述突变的FVB/N骨髓细胞(10

方法的步骤如下：(1)从C57BL小鼠的胎盘分离线粒体，在-80℃下冷冻并解冻，或新鲜使用；(2)从mtDNA突变的FVB/N小鼠获得骨髓细胞；(3)将所述线粒体与骨髓细胞相接触，以8000g离心5分钟，重悬浮并温育24小时；(4)将所述骨髓细胞用PBS清洗两次并注射到FVB/N小鼠的尾静脉中。在移植后的各个不同时间点例如24小时、一周、一个月和3个月后，收集组织(血液、骨髓、淋巴细胞、脑、心、肾、肝、肺、脾、骨骼肌、眼、卵巢/睾丸)并提取DNA用于进一步序列分析。

在移植后1个月骨髓中FVB/N水平的降低描绘在图13A中。正如在图13B中看到的，在移植后3个月FVB/N小鼠肝脏中的mtDNA水平也降低。

将从雌性FVB/N收获的骨髓用C57BL/6胎盘线粒体(4.4mU CS活性/1X10

线粒体从野生型小鼠(C57BL)肝脏分离。骨髓细胞从具有突变的线粒体的小鼠(FVB/N小鼠)分离。将所述突变的FVB/N骨髓细胞用所述健康的功能性C57BL线粒体装载。比较了未治疗的FVB/N小鼠(对照)、给药所述富集线粒体的FVB/N小鼠、在给药所述富集线粒体之前用化疗药剂(白消安)治疗的FVB/N小鼠和在给药所述富集线粒体之前经历全身辐照(TBI)的FVB/N小鼠。

所述方法的步骤是：(1)从C57BL小鼠的肝脏分离线粒体，在-80℃冷冻并解冻，或新鲜使用；(2)从mtDNA突变的FVB/N小鼠获得骨髓细胞；(3)将所述线粒体与骨髓细胞相接触，以8000g离心5分钟，重悬浮并温育24小时；(4)用PBS清洗所述骨髓细胞两次；(5)对预定组进行白消安给药或全身辐照(TBI)；(6)将所述富集有C57BL小鼠健康线粒体的FVB/N小鼠骨髓细胞注射到FVB/N小鼠的尾静脉中。移植后1个月，收集组织(血液、骨髓、淋巴细胞、脑、心、肾、肝、肺、脾、胰腺、骨骼肌、眼、卵巢/睾丸)并提取DNA用于进一步序列分析。

在移植后1个月，在线粒体、TBI和白消安治疗的小鼠的脑中FVB/N水平的降低描绘在图15中。

线粒体从C57BL鼠类胎盘分离。获得12月龄C57BL小鼠的骨髓细胞。将线粒体富化的骨髓细胞(MNV-BM-PLC，1x10

正如可以在图16A-16D中看到的，移植有富集健康线粒体的骨髓细胞(MNV-BM-PLC)的衰老小鼠(12月龄)与移植有不富集线粒体的骨髓(BM对照)的年龄匹配的小鼠和完全未移植的小鼠(对照)相比，表现出改善的身体活动和探索行为。MNV-BM-PLC治疗的小鼠与它们的对照相比显示出：更大的移动距离(图16A)，在笼子中心花费更多时间(图16B)，在笼壁附近花费更少时间(图16C)，这是更年轻小鼠的典型行为模式。向衰老小鼠给药富集有功能性线粒体的骨髓也制止肾功能恶化，正如在图16D中描绘的。

在运动场所中心区域花费的时间的增加表明经历线粒体增强疗法的小鼠的强烈探索行为。它与焦虑样行为相关的趋触性的降低合在一起，证明了线粒体增强的抗焦虑效应。

还在这些小鼠中使用转棒装置评估了总运动表现和协调能力。

正如在图16E-16F中所示，在给药后1个月，介质和BM对照组显示出从转棒上掉落的等待时间的减少(与基线相比减少-2.82％和-2.18％，ns)，其在给药后3个月相对于基线进一步下降14.15％和21.79％(***p＝0.0008)。MNV-BM-PLC小鼠在线粒体富集疗法后1个月表现出从转棒上掉落的等待时间的16.17％的减少(*p＝0.0464)，在富集后3个月停止减少(与基线相比减少-8.72％，ns)。

所述结果证实，相对于年龄匹配的对照，线粒体富化的中年小鼠中运动功能损伤更加轻微，暗示线粒体富集疗法可以减弱年龄相关的运动功能恶化。

还在这些小鼠中通过前肢握力试验评估了骨骼肌功能。

正如在图16G-16H中所示，MNV-BM-PLC小鼠在线粒体增强疗法后1个月和3个月时维持它们的握力评分恒定(分别为基线的-1.29％和-1.40％)，并从给药后3个月开始表现出抓握时间(放开抓握的等待时间)的较慢变差(给药后1和3个月分别为基线的+6.07％和-0.69％)。

正如在图16I-16J中所示，与介质和BM对照组相比在给药后1个月观察到的与基线相比-4.80％和-0.9％的降低，在2个月后进一步加剧(分别为基线的-15.3％和-6.35％，ns)。在给药后1个月，介质和BM对照小鼠的基线握力提高(与基线相比+6.01％和+4.06％，ns)，到2个月后分别下降到基线的-6.03％(**p＝0.0084)和-17.77％(*p＝0.0404)。

这些结果显示出在富集线粒体治疗的小鼠中握力和停留时间恶化的减缓/减轻，表明线粒体富集疗法可以改善年龄相关的肌肉功能受损。

用于在衰老人类对象或患有一种或多种年龄相关疾病的对象中减轻虚弱效应的方法的步骤是：(1)向所述衰老对象或供体以10-16μg/kg的剂量给药G-CSF共5天；(2)在第5天，考虑向所述对象给药Mozobil 1-2天；(3)在第6天，对所述对象的血液进行单采分离，以获得骨髓细胞。如果干细胞的量不足，可以在第7天再次进行单采分离；(4)平行地，从健康供体的血液样品或胎盘分离功能性线粒体。所述功能性线粒体的分离也可以在这个过程之前进行，将冷冻的线粒体储存在-80℃(至少)，并在使用前解冻；(5)将骨髓细胞与功能性线粒体温育24小时；(6)清洗所述骨髓细胞；以及(7)将线粒体富化的骨髓细胞输注到所述衰老对象。在整个过程期间，评估患者的食物消耗量、体重、乳酸性酸中毒、血液计数和生物化学血液标志物的变化。

用于减轻衰老人类对象或患有一种或多种年龄相关疾病的对象的虚弱效应的另一种方法是：(1)使用手术程序例如抽脂术获得所述衰老对象的脂肪组织；(2)分离间充质干细胞(MSC)，将所述细胞在培养基中繁殖，并任选地超低温保存所述细胞；(3)平行地，从健康供体的血液样品或胎盘分离功能性线粒体。所述功能性线粒体的分离也可以在这个过程之前进行，将冷冻的线粒体储存在-80℃(至少)，并在使用前解冻；(5)将MSC与功能性线粒体温育24小时；(6)清洗所述MSC；以及(7)将线粒体富化的MSC输注到所述对象。在整个过程期间，评估患者的食物消耗量、体重、乳酸性酸中毒、血液计数和生物化学血液标志物的变化。

患有非造血肿瘤病的人类患者的疗法的方法步骤是：(1)向患有肿瘤病的患者以10-16μg/kg的剂量给药G-CSF共5天；(2)在第6天对所述患者的血液进行单采分离以获得骨髓细胞；(3)平行地，从健康供体的血液样品分离功能性线粒体；(4)将骨髓细胞与功能性线粒体温育24小时；(5)清洗所述骨髓细胞；和(6)将装载有线粒体的骨髓细胞输注到所述患者。在整个过程期间，评估患者的食物消耗量、体重、乳酸性酸中毒、血液计数和生物化学血液标志物的变化。

6.5岁男性患者(患者1)被诊断为患有皮尔逊综合症，在其mtDNA中具有第5835-9753位核苷酸的缺失。在线粒体增强疗法(MAT)之前，他的体重为14.5KG，不能行走超过100米或爬楼梯。在治疗之前他的生长显著延迟3年，并且在基线时他的体重为-4.1标准偏差评分(SDS)，身高为-3.2SDS(相对于群体)，并且尽管通过胃造口管(G管)喂食超过一年但仍没有改善。他具有肾衰竭(GFR 22ml/min)和近端肾小管病，需要补充电解质。他具有需要补充钙的甲状旁腺功能减退，并且在心电图上具有不完全性右束支传导阻滞(ICRBB)。

造血干细胞和祖细胞(HSPC)的动员通过单独地皮下给药GCSF(10μg/kg)共5天来进行。白细胞单采使用Spectra Optia系统(TerumoBCT)，按照机构指南通过外周静脉接口来进行。使用CliniMACS CD34试剂，按照制造商的说明书对动员的外周血来源的细胞进行CD34阳性选择。使用pH 7.4的250mM蔗糖缓冲液，通过差速离心从母体外周血单核细胞(PBMC)分离线粒体。为了进行线粒体增强疗法(MAT)，将自体CD34

正如可以在图17B中看到的，在富集线粒体的细胞移植后4个月，所述患者的有氧任务代谢当量(MET)评分提高，这种效果在移植后8个月保持不变。所述数据说明在疗法后所述患者的有氧MET评分随时间显著提高，从5(中等强度活动，例如步行和骑自行车)提高到8(高强度活动，例如跑步、慢跑和跳绳)。所述MET是表示身体活动的能量代价的生理度量。富集细胞移植改善这个参数的能力对于衰老对象来说是令人鼓舞的，因为有氧MET评分随衰老而下降。

图17C展示了在所述患者的血液中发现的乳酸盐水平随I.V.注射后的时间的变化。血液乳酸盐是在线粒体损伤时或在氧气向组织的递送不足以支持正常的代谢需求时作为无氧代谢的结果而出现在血液中的乳酸，是线粒体功能障碍的标志之一。正如可以在图4C中看到的，在MAT后，患者1的血液乳酸盐水平已降低到正常值。乳酸盐在线粒体中被氧化，这部分造成了乳酸盐在人体中的周转。由于线粒体质量和活性随衰老而下降，因此乳酸盐水平升高。因此，富集的骨髓干细胞降低乳酸盐水平的能力暗示了对衰老对象的潜在效应。

表5展示了所述患者的儿童线粒体疾病量表(IPMDS)–生活质量(QoL)问卷调查结果随细胞疗法后的时间的变化。在“申诉与症状”和“身体检查”两个类别中，0表示相关属性“正常”，而加重的状况根据严重程度被评分为1-5。

应该注意到，所述患者在治疗前的3年中没有增加体重，即自从3.5岁后没有任何体重增加。图17D中呈现的数据示出了通过所述患者的体重和身高的标准偏差评分所度量的生长，数据始于MAT之前4年并涵盖随访期间。所述数据表明在单次治疗后约15个月，所述患者的体重和身高存在增加。

所述患者生长的另一个证据来自于他的碱性磷酸酶水平。碱性磷酸酶水平测试(ALP测试)测量血流中碱性磷酸酶的量。血液中具有低于正常的ALP水平可以指示营养不良，这可能由某些维生素和矿物质的缺乏引起。图17E中展示的数据表明单次治疗足以在仅仅12个月中将所述患者的碱性磷酸酶水平从159提高到486IU/L。体重减轻的趋势逆转以及ALP升高与可能导致体重减轻和营养不良的衰老和抗癌治疗两者相关。

正如可以在图17F-H中看到的，治疗导致红血细胞水平(图17F)、血红蛋白水平(图17G)和血细胞比容水平(图17H)的显著改善。这些结果显示，单次治疗足以改善贫血的症状。

图17I演示了肾脏恶化的停止，正如通过细胞移植后尿液的肌酐水平所描绘的。正如可以在图17J和17K中进一步看到的，细胞治疗也导致在不增补碳酸氢盐的情况下碳酸氢盐(图17J)和碱过量(图17K)水平的显著改善。图17L展示了所述患者的血液中镁的水平随镁增补和细胞疗法后的时间的变化。所述数据表明，所述患者的血液镁水平随时间显著提高，使得不再需要镁增补。在没有镁增补的情况下达到高的镁水平，是镁的吸收以及在肾近端小管中的重吸收得以改善的证据。正如可以在图17M-17P中看到的，单次治疗也导致几种肾小管病指示物的水平的显著降低，例如尿液中的葡萄糖水平(图17M)和某些盐的水平(图17N–钾；图17O–氯化物；图17P-钠)。图17I-17P都与衰老对象相关，因为肾功能随着衰老而变差。

所使用的疗法的成功的遗传指标是每个细胞的正常mtDNA与总mtDNA相比的占有率。正如在图18A(Pt.1)中所示，在所述患者的外周血中总正常mtDNA的占有率从基线时的约1在仅仅4个月中提高到高达1.6(+60％)，并在从治疗起20个月后提高到1.9(+90％)并在大多数时间点高于基线水平。值得注意的是，在大多数时间点，正常mtDNA水平高于基线水平。

移植富集有健康的功能性线粒体的细胞的有效性的另一个指示呈现在图18B中。在患者1中在MAT后存在异质性的轻微降低(存在缺失的mtDNA更少)，其在基线时具有相对高的异质性水平。这在整个随访过程中持续存在。

根据医院的神经科医生报告，在含有不带有缺失突变的健康线粒体的自体细胞移植后证实了神经学改善；所述患者提高了他的行走技巧、爬阶梯的能力和使用剪刀和绘画的能力。在他的执行命令的能力、反应时间以及运动和语言技巧方面，也注意到实质性改善。此外，患者的母亲报告了患者记忆的改善。这些发现对于衰老对象来说是特别相关和重要的，因为运动技巧和记忆的神经学恶化通常在老年中发生。

正如上文展示的数据所指示的，单轮的给药富集有功能性线粒体的骨髓干细胞的治疗方法成功地治疗了大量由衰老引起的令人衰弱的病症。

7岁女性患者(患者2)被诊断为患有皮尔逊综合症，在她的mtDNA中具有4977个核苷酸的缺失。所述患者也患有贫血、内分泌胰腺功能不全，并且是糖尿病人(HbA1C 7.1％)。患者2具有高的乳酸盐水平(>25mg/dL)、低的体重以及进食和增加体重的问题。所述患者还患有高镁尿症(尿液中高水平并且血液中低水平的镁)。患者具有记忆和学习问题、散光和外周淋巴细胞中低的线粒体活性，正如通过TMRE、ATP含量和O

骨髓的动员使用G-CSF(10μg/kg)和1剂普乐沙福Mozobil

通过按照图19A中展示的时间线IV输注1.8×10

图19B描绘了富集线粒体的细胞移植对血液乳酸盐水平的影响，所述血液乳酸盐水平在治疗后5个月降低。

已知肌肉力量和质量随着衰老而变差。图19C-19E在一系列功能试验中演示了富集细胞的移植对这些参数的显著影响。图19C示出了坐立试验结果。在没有支撑的情况下不能从椅子上站起的老年人具有变得更加不活动并因此进一步损害行动能力的风险。邀请所述试验对象在30秒的时间框内进行尽可能多的坐起站立循环。在移植后5个月，患者2能够执行更多的坐起站立循环。图19D描绘了6分钟行走试验(6MWT)，并测量了在指派的6分钟内所述对象通过的以米为单位的距离。患者2在移植后5个月通过正常的距离。图19E示出了在细胞移植后5个月肌肉力量的改善，正如从即使在对抗测力计的阻力下第三次连续重复测试后测力计单位的升高所证实的。

图19F、19G和19H展示了改善的肾功能，其分别通过在所述患者的尿液中发现的镁、钾和钙相比于肌酐的比率随I.V.注射后的时间的变化来说明。

图19I展示了所述患者的尿液中ATP8与18S之间的比率随I.V.注射后的时间的变化。免疫系统随着衰老而变差。在免疫系统组分中，最受衰老影响的是T淋巴细胞。在年轻人中，原初T细胞可以代谢葡萄糖、氨基酸和脂类，以分解代谢性地促进ATP在线粒体中产生。由于也已知线粒体功能随着衰老而受损，因此已提出并正在研究T细胞与线粒体降低之间的可能联系。图19J示出了在所述患者的淋巴细胞中ATP含量的提高。

图18A(Pt.2)展示了正常mtDNA的占有率随I.V.注射后的时间的变化。正如可以在图18A(Pt.2)中看到的，正常mtDNA的占有率在仅仅1个月内从约1的基线提高到高达2(+100％)，并且直至治疗后10个月仍保持相对高。值得注意的是，在所有时间点正常mtDNA水平均高于基线水平。

图18B(Pt.2)展示了异质性水平随MAT后的时间的变化。可以看到，在患者2中，在MAT后存在异质性的降低(存在缺失的mtDNA更少)。这在整个随访期间持续存在。

10.5岁女性患者(患者3)被诊断为患有皮尔逊综合症，在其mtDNA中具有第12113-14421位核苷酸的缺失。所述患者还患有贫血以及发展成肾功能不全第4阶段的范可尼综合征。患者每周三次进行透析治疗。最近，患者还患有严重视觉障碍、视野变窄和近视力丧失。患者完全不能进行任何体力活动(不能行走，坐在手推童车中)。

患者具有高乳酸盐水平(>50mg/dL)和使用胰岛素治疗的胰腺障碍。脑MRI显示出许多病变和萎缩区域。患者仅通过胃造口术进食。患者具有记忆和学习问题。患者在外周淋巴细胞中具有低的线粒体活性，正如通过四甲基罗丹明乙酯(TMRE)、ATP含量和O

造血干细胞和祖细胞(HSPC)的动员以及白细胞单采和CD34阳性选择与患者1(实施例3)类似地进行，区别在于在白细胞单采之前第-1天添加普乐沙福(n＝1)。白血病单采通过永久性透析导管来进行。使用pH 7.4的250mM蔗糖缓冲液，通过差速离心从母体外周血单核细胞(PBMC)分离线粒体。为了进行MAT，将自体CD34

通过按照图20A中展示的时间线IV输注2.8×10

图20B描绘了富集有线粒体细胞的移植对血液乳酸盐水平的有益效果，所述乳酸盐水平在移植后2和3个月降低。在20mg/dl以下的线代表血液乳酸盐的正常水平。

图20C展示了在细胞疗法之前和之后所述患者的血液中AST和ALT肝脏酶的水平随时间的变化。在血液中达到低的肝脏酶水平是肝损伤降低的证据。

图20D展示了在细胞疗法之前和之后所述患者的血液中甘油三酯、总胆固醇和极低密度脂蛋白(VLDL)胆固醇的水平随时间的变化。在血液中达到低的甘油三酯、总胆固醇和VLDL胆固醇水平是肝功能提高和脂类代谢改善的证据。

糖化血红蛋白(有时也被称为血红蛋白A1c、HbA1c、A1C、Hb1c、Hb1c或HGBA1C)是血红蛋白的一种形式，测量它主要是为了鉴定三个月平均血浆葡萄糖浓度。由于红血细胞的寿命为4个月(120天)，因此所述测试限于三个月平均值。图20E展示了在疗法之前和之后所述患者的A1C测试结果随时间的变化。

图20F和20G展示了所述患者的“坐立试验”(20F)和“6分钟行走”(20G)试验的结果随I.V.注射后的时间的变化，显示出在治疗后5个月所述两个参数的改善。

图18A(Pt.3)展示了正常mtDNA的占有率随I.V.注射后的时间的变化。正如可以在图18A(Pt.3)中看到的，正常mtDNA的占有率在治疗后7个月时提高50％。值得注意的是，在大多数时间点正常mtDNA水平高于基线水平。

图18B(Pt.3)展示了异质性水平随MAT后的时间的变化。可以看到，在基线时具有相对低的异质性水平的患者3中，在MAT后存在异质性的降低(存在缺失的mtDNA更少)。这在整个随访期间持续存在。

患者4是被诊断为患有Kearns-Sayre综合征的14岁、19.5kg的女性患者，经历管状视力、上睑下垂、眼肌麻痹和视网膜萎缩。所述患者具有视力问题、CPEO、癫痫发作、病理性EEG、不能坐起或行走的重度肌病、心律失常。所述患者在其线粒体DNA中具有7.4Kb的缺失，包括下述基因：TK，NC8，ATP8，ATP6，CO3，TG，ND3，TR，ND4L，TH，TS2，TL2，ND5，ND6，TE，NC9和CYB。

造血干细胞和祖细胞(HSPC)的动员以及白细胞单采和CD34阳性选择与患者3(实施例5)类似地进行。为了进行MAT，将自体CD34

通过按照图20A中展示的时间线，将患者4用2.2×10

出人意料的是，在用仅富集有3％健康线粒体的CD34

上述特定实施方式的描述如此充分地揭示本发明的总体本质，以至于其他人可以通过应用当前的知识容易地修改这些特定实施方式和/或改编它们以适应于各种不同应用，而无需过多实验并且不背离通用概念，并且因此，这样的改编和修改应当并且旨在被理解为在所公开的实施方式的含义和等同性范围之内。应当理解，本文中使用的短语或术语是出于描述而非限制的目的。用于执行各种公开的功能的装置、材料和步骤可以采用各种不同的替代方案，而不背离本发明。