一种柯萨奇A2病毒株构建感染动物模型的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种柯萨奇A2病毒(CVA2)株构建感染动物模型的方法，通过CVA2病毒株的培养、优化CVA2病毒株感染动物模型的相关参数，成功构建了CVA2病毒株感染动物模型。该动物模型可表现出类似人类感染的嗜睡、昏迷、共济失调、肢体麻痹等神经系统症状，成功模拟了人类疾病的大部分症状。本发明还公开了上述方法构建的CVA2病毒株感染动物模型在评价CVA2病毒疫苗、抗病毒药物中的应用。该动物模型可用于评估抗病毒血清被动免疫、母源性抗体、灭活全病毒疫苗主动免疫对新生小鼠的免疫保护作用。该动物模型可用于CVA2病毒抗病毒药物和疫苗的开发，有助于达到预防和控制CVA2相关手足口病的目的。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种柯萨奇A2病毒株构建感染动物模型的方法及其应用。

背景技术

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是由人类肠道病毒(Enterovirus,EV)感染引起的一种常见的急性传染病。我国手足口病发病人数居高不下，位列法定传染病之首，已成为严重公共卫生问题。人类肠道病毒是一种单股正链RNA病毒，由A、B、C和D等四个亚型组成。肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A16(Coxsackievirus A16,CVA16)是导致手足口病的主要病原体。近年来，柯萨奇A2病毒(Coxsackievirus A2,CVA2)感染引起的手足口病爆发在中国大陆、中国香港、中国台湾、泰国、日本等亚太地区广泛报道。CVA2的持续传播和进化导致了遗传多态性，而由CVA2感染引起的疾病在以往的认知中可能被低估。CVA2感染病例一般症状较轻，但一少部分病例可发展为脑脊髓炎和脊髓灰质炎样弛缓性麻痹等神经系统并发症、肺水肿和致死性心肌炎，病情会在短时间内急剧恶化、预后不良。

随着EV71灭活疫苗在中国大陆的广泛应用，EV71已经不再是手足口病致病的主要病原体。近年来，世界上许多国家和地区不断报道CVA2感染病例，且在亚洲等地出现暴发和局部流行。然而与EV71相比，我们对CVA2病毒的了解很少，针对CVA2建立的预防和治疗方法非常有限。由于缺乏有效的抗病毒药物，临床针对CVA2感染重症病例主要采用对症和支持治疗。另外，临床病原体检测的引物的特异性降低，CVA2可能被错误的鉴定为EV71，可能导致CVA2的感染程度被低估。随着全世界范围内CVA2感染导致手足口病的发病率和死亡率增加，因此迫切需要临床医生和生物医学研究人员之间密切合作，开发出针对CVA2感染的疫苗和抗病毒药物。

动物模型是转化医学常用的研究工具，在研究疾病的发病机制和评价疫苗或抗病毒药物的疗效方面发挥着重要作用。近年来，EV71、CVA16、CVA6和CVA10病毒感染动物模型已被建立并应用于相应疫苗的研发，并取得了阶段性进展。然而，目前仍然缺乏一种敏感且可重复的CVA2感染动物模型。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种柯萨奇A2病毒株构建感染动物模型的方法，该方法得到的动物模型可用于CVA2相关疾病的发病机制研究以及抗病毒药物和疫苗的研发，有助于达到预防和控制CVA2相关手足口病的目的。

本发明的目的之二在于提供所述方法构建的CVA2病毒株感染动物模型在评价CVA2全病毒灭活疫苗、抗柯萨奇A2病毒药物中的应用。

本发明的目的之一通过如下技术方案实现：

一种柯萨奇A2病毒株构建感染动物模型的方法，包括以下步骤：

1)所述病毒株的培养；

2)优化构建感染动物模型的参数。

进一步地，所述动物选自BALB/c小鼠、C57BL/6J小鼠、ICR小鼠、仓鼠、沙鼠、转基因老鼠、基因缺陷小鼠中的一种。

进一步地，所述柯萨奇A2病毒株的病毒蛋白VP1基因的核苷酸序列保藏于Genbank数据库，登录号为HN171101，编码区(CDS)全长的核苷酸序列保藏于Genbank数据库，登录号为MT992622。

进一步地，所述步骤1)病毒株在RD细胞株或Vero细胞株中培养。

进一步地，所述步骤2)的参数包括病毒株感染剂量、接种途径、动物日龄。

进一步地，所述病毒株感染剂量为1.0×10

进一步地，所述接种途径为肌肉注射。

进一步地，所述动物日龄5日龄。

本发明的目的之二是提供上述方法构建的柯萨奇A2病毒株(CVA2)感染动物模型在评价柯萨奇A2病毒疫苗、抗柯萨奇A2病毒药物中的应用。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种柯萨奇A2病毒株构建感染动物模型的方法，通过柯萨奇A2病毒株的培养、优化柯萨奇A2病毒株感染动物模型的相关参数，成功构建了柯萨奇A2病毒株感染动物模型。且该感染动物模型可表现出类似人类感染的嗜睡、昏迷、共济失调、肢体麻痹等神经系统症状，成功的模拟了临床患者的大部分症状。本发明还提供了上述方法构建的柯萨奇A2病毒株感染动物模型在评价柯萨奇A2病毒疫苗、抗柯萨奇A2病毒药物中的应用。本发明提供的感染动物模型可用于评估CVA2抗病毒血清被动免疫、母源抗体、灭活的全病毒疫苗的主动免疫对新生小鼠的免疫保护作用。本发明提供的动物模型可用于CVA2相关疾病的发病机制研究以及抗病毒药物和疫苗的进一步研发，有助于达到预防和控制CVA2相关的手足口病的目的。

附图说明

图1为本发明所有病毒分离株在RD细胞中诱导致细胞病变效应图；

图2为本发明所有病毒分离株PCR鉴定电泳图；

图3为本发明CVA2病毒分离株#7、#11、#12菌株PCR鉴定电泳图；

图4为本发明3株CVA2病毒分离株与其他CVA2、CVA4、CVA16和EV71株VP1的系统进化树；

图5为本发明对建立模型使用的#11毒株(HN202009)编码区全长重组分析结果；

图6为本发明CVA2病毒感染Vero细胞后在细胞内的存在状态及灭活病毒的粒径和形态；

图7为本发明CVA2病毒(24hpi，hours post-infection)不同感染复数对Vero细胞影响；

图8为本发明CVA2病毒感染Vero细胞后细胞内caspase-8和caspase-9mRNA表达水平；

图9为HN202009病毒株与NCBI中具有较高同源序列的菌株构建的系统进化树；

图10为本发明实施例1不同感染剂量下接种CVA2小鼠的体重、生存率及临床评分变化；

图11为本发明实施例1不同接种途径下接种CVA2小鼠的体重、生存率及临床评分变化；

图12为本发明实施例1不同日龄小鼠接种CVA2后体重、生存率及临床评分变化；

图13为本发明的CVA2病毒株感染新生小鼠与对照组新生小鼠发病症状表现图，其中a图为感染病毒5dpi的表现，b图为感染病毒7dpi的表现；

图14为本发明感染病毒后小鼠组织病理学检查结果图(HE)；

图15为本发明感染病毒后小鼠内脏或组织中抗原分布情况(IHC)；

图16为本发明感染病毒后小鼠内脏器官或组织病毒载量检测；

图17为本发明炎症细胞因子mRNA在受感染小鼠大脑、肺、骨骼肌中表达情况；

图18为本发明炎症因子蛋白在受感染小鼠大脑、肺、骨骼肌中表达情况；

图19为本发明CVA2抗血清通过被动免疫对小鼠的影响评估结果图；

图20为本发明母源抗体对小鼠的影响评估结果图；

图21为本发明主动免疫对小鼠的影响评估结果图；

图22为本发明细胞因子单克隆抗体疗效的评估结果图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

伦理声明：本发明选用的实验动物为近交、无特定病原体的BALB/c小鼠(证书号DW2019110074)，所有动物实验均严格按照郑州大学生命科学伦理审查委员会批准的方案进行(许可编号：ZZUIRB2020-29)。

本研究使用的BALB/c小鼠获自郑州大学实验动物中心，所有小鼠均郑州大学公共卫生学院无特定病原体设施的独立通气动物笼(IVC)(品牌：Tecniplast)中饲养，小鼠生活环境可以实现12h的明暗循环，并可以随意获取食物和水。

实施例1

柯萨奇A2病毒株构建动物模型的方法：

1)CVA2病毒株的培养

1.1)CVA2病毒株HN202009的获取

根据卫生部诊断标准对手足口病病例进行临床诊断，并于2017年1月至2017年12月收集19名手、脚、口腔黏膜或臀部出现水疱疹的症状并确诊为手足口病的儿童的粪便样本。

从手足口病患者的临床分离株中鉴定CVA2菌株。本研究共包括19名确诊手足口病的患者，其临床特征如表1所示。其中，有8例(占比42.11％)显示肠道病毒(PE)感染，3例(占比15.79％)EV71免疫球蛋白M(IgM)呈阳性，5例(占比26.32％)C反应蛋白(CRP)呈阳性。收集这些患者的粪便标本进行进一步的实验测试。

表1

将人横纹肌瘤(RD)细胞接种于含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM(品牌：GibcoCompany,New York，USA)中(生长液)，并于温度37℃、5％浓度CO

48hpi(接种后小时，hours post-infection)后，来自19个标本的所有分离毒株均可在RD细胞中诱导致细胞病变效应(CPE)，检测结果如图1所示。用Qiagen病毒RNA提取试剂盒收集RD细胞进行总核酸提取，并用RT-PCR仪器(品牌：SensoQuest)进行核酸的扩增和检测，使用肠道病毒、EV71和CVA16的通用引物进行核酸测试，引物序列见表2。

表2

注:*表示CVA2 VP1基因的全长。

结果显示，菌株#4～#19为PE阳性(图2a)，菌株#7、#8和#11～#14为EV71阳性(图2b)，菌株#4、#6、#8、#9和#15～#18为CVA16阳性(图2c)。对上述基因进行RT-PCR过程，产物用于测序。经过序列比对与基于CVA2 VP1基因组全长的一对新引物(表2)做的验证，EV71阳性(#7、#11和#12)的临床分离毒株为CVA2菌株(表3)。

表3

图3为#7、#11和#12菌株的PCR鉴定电泳图，结果表明#7、#11和#12菌株核酸长度与CVA2相近，表4将所测得的序列在Genbank进行Blast分析，确定#7、#11和#12菌株属于CVA2菌株。基于其他CVA2、CVA4、CVA16和EV71株衣壳蛋白VP1的系统发生树也显示了这些CV病毒株为A2类型(图4)。#7、#11和#12菌株中VP1基因组的核苷酸序列以登录号分别为HN170701、HN171101和HN171201保藏在GenBank数据库中。

表4

在这项研究中，我们根据病毒诱导RD细胞的CPE选择了#11菌株(VP1登录号：HN171101)进行动物实验。#11菌株的基因组序列的编码区全长以登录号MT992622保藏在GenBank数据库中。借助于MEGA-X软件，使用邻接法对#11菌株(命名为HN202009)及NCBI中具有较高同源序列的菌株构建系统进化树(如图9所示)。随后，我们进行了HN202009病毒株的重组分析(图5)，结果发现，HN202009在衣壳蛋白编码区域与CVA2原型毒株(AY421760.1)的相似度最高，具有约80％的核苷酸同源性，衣壳区无重组但在非衣壳区存在重组的可能。

将非洲绿猴肾(Vero)细胞ATCC CCL-81接种于含有生长液的培养皿中，并于温度37℃、5％浓度CO

1.2)CVA2(#11菌株，命名为HN202009)的培养

将人横纹肌瘤(RD)细胞接种于含有生长液(同上)的培养皿中，并于温度37℃、5％浓度CO

2)优化构建感染动物模型的参数

为了评估在不同实验条件下新生小鼠模型中CVA2(HN202009)的致病性，本发明根据感染剂量、接种途径和动物日龄建立了感染动物模型。

2.1)确定CVA2病毒株的感染剂量：感染剂量对CVA2敏感性的影响

BALB/c小鼠、C57小鼠、ICR小鼠、仓鼠、沙鼠、转基因老鼠、基因缺陷小鼠均可作为本动物模型构建实施的对象。为了评估CVA2感染剂量对新生小鼠存活率的影响，确定动物模型最佳感染病毒剂量，本发明对5日龄新生BALB/c小鼠进行了肌肉注射，向小鼠接种10倍连续稀释的CVA2(每只小鼠10

感染病毒后小鼠的状况结果如图10所示，感染不同浓度CVA2病毒的小鼠相较于对照组小鼠体重增长缓慢(图10a)；如图10b所示，对照组小鼠于15dpi(感染后天数：dayspost-infection)生存率100％；随着感染CVA2病毒的浓度的增加，小鼠生存率降低，感染10

临床评分标准：为评价病毒株对小鼠治病的严重程度，对不同的临床体征赋予不同的分值，本研究采用的临床评分标准如表5所示。

表5

2.2)确定CVA2病毒株的接种途径：接种途径对CVA2敏感性的影响

为了确定接种途径对CVA2敏感性的影响，确定动物模型感染的最佳接种途径，本发明分别通过颅内注射接种(IC)、腹腔注射接种(IP)或肌肉注射接种(IM)的方式感染5日龄新生BALB/c小鼠，使用致命剂量10

感染后小鼠的状况结果如图11所示，通过颅内注射接种的感染小鼠在1dpi迅速出现病态(图11c)，体重明显下降(图11a)，于感染后5dpi全部死亡(图11b)，存活时间较短，不利于感染模型的建立。通过腹腔注射接种CVA2的小鼠最终生存率为40％，一部分小鼠逐渐恢复健康(图11b)；受感染小鼠临床症状评分最高为4(图11c)，不能完全表现出感染病毒后全部症状，不利于模型的建立以及后续对该模型病毒作用机理的研究。通过肌肉注射接种CVA2的小鼠相较于对照组体重增长缓慢(图11a)，感染后1dpi迅速出现病态，随着受感染后的时间的增长，小鼠表现出临床评分对应的全部症状(图11c)，并于感染后9天全部死亡(图11b)。因此，最终选用肌肉注射接种为CVA2感染的最佳途径。

2.3)确定CVA2病毒株感染动物的日龄：日龄对CVA2感染敏感性的影响

为了确定小鼠日龄对CVA2感染敏感性的影响，确定动物模型感染的最佳小鼠日龄，以肌肉注射的方式将10

感染后小鼠的状况如图12所示，对照组小鼠全程保持健康；感染病毒组3日龄小鼠接种后症状明显，平均临床得分5，存活时间短，感染5天后全部死亡。7日龄小鼠由于日龄大，相比对照组体重变化小、死亡率低，不适合模型的建立。5日龄小鼠接种后相对于对照组体重增长缓慢，受感染小鼠的平均临床评分为5，且受感染的小鼠分别在3到8dpi之间全部死亡。因此选择5日龄为最佳日龄的BALB/c小鼠作为动物模型。

以肌肉注射10

综上，以BALB/c 5日龄小鼠作为最佳构建模型对象、肌肉注射为最佳接种途径、10

实验例1

组织病理学和免疫组化分析：

1.1组织病理学检查

在最终确定建立CVA2感染模型最佳组合条件后，按照实施例1的优化条件(肌肉注射接种、剂量为10

为了鉴定CVA2感染小鼠的病理特征，我们以7dpi时小鼠内脏器官或组织进行了H&E染色。结果如图14所示，我们在具有临床体征的受感染小鼠的大脑和脊髓中观察到了细胞损伤(如变性和神经吞噬)和炎症变化(如神经胶质增生和血管袖套反应)。我们还观察到了CVA2感染的小鼠的肺和骨骼肌的严重病理变化，肺部出现炎症性充血，其特征是大量红细胞泄漏，这是人类感染病毒后肺出血的典型临床表现。骨骼肌表现出肌纤维溶解、坏死和炎性细胞浸润。此外，我们观察到心脏具有病毒性心肌炎症状，其特征在于大量淋巴细胞和单核细胞浸润以及心肌破裂。然而在对照组小鼠的上述器官或组织中未发现组织病变。

1.2病毒载量检测

使用Trizol试剂(品牌：Invitrogen)从对照组和感染小鼠的器官和组织、以及感染的Vero细胞中提取总RNA，并使用逆转录试剂盒(品牌：Yeasen)按照说明书的方法逆转录生成cDNA。使用仪器(品牌：Kubo Tech Co.，Ltd.)通过定量RT-PCR(品牌：Y easyn)测量促炎基因如IL-6、IL-10、IL-1β、肿瘤坏死因子TNF-α，单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、凋亡基因caspase-8和caspase-9和CVA2 VP1。用于上述实验的引物如表2所示。所有结果均以β-肌动蛋白转录水平进行标准化。通过2

对上述步骤中取出的小鼠的内脏器官或组织进行免疫组化(IHC)染色，以确定CVA2感染后小鼠体内的抗原分布情况。如图15所示，小鼠感染CVA2后，在大脑和脊髓样本中受影响的神经元、肺中的肺泡细胞、骨骼肌中的肌纤维细胞和心脏中的心肌细胞中均检测到了病毒抗原(CVA2 VP1)。对照组小鼠在上述器官或组织中未显示任何异常。

通过定量RT-PCR对3、5和7dpi对应的小鼠的多个器官和组织中的CVA2 mRNA水平的病毒载量进行检测(如图16所示)。受CVA2感染的小鼠的大脑，肺，心脏，肾脏，肝脏，骨骼肌和脾脏样本中的病毒载量在7dpi时达到最大。在3dpi时仅在骨骼肌中检测到病毒复制，并且在骨骼肌中检测到极高的病毒载量。此外，CVA2感染小鼠的肺、心脏、肾脏，肝脏和脾脏样本随着时间的延长病毒载量逐渐升高。在受CVA2感染的小鼠的多个器官或组织中检测到病毒复制，并且CVA2对骨骼肌表现出强烈的趋向性，骨骼肌可能是主要复制位点，这与感染病毒后相应组织或器官的病理变化相一致。

1.3炎症细胞因子在CVA2感染小鼠的组织中的表达

为了探究炎症细胞因子在小鼠感染的不同阶段发挥的免疫病理损伤的作用，我们通过定量RT-PCR和ELISA分析了3、5和7dpi时小鼠组织裂解物中炎症细胞因子的转录和表达水平。定量RT-PCR方法及使用样品如试验例1.2所述。如图17所示，在受感染CVA2的小鼠的大脑、肺和骨骼肌的组织中，在7dpi时炎症细胞因子IL-6，IL-10和MCP-1的转录水平均显著提高(P＜0.05)。TNF-α和IL-1β的转录水平仅在7dpi的CVA2感染的小鼠的肺、骨骼肌的组织裂解物中显著增加(P<0.05)。

将试验例1.1受感染小鼠取出的脑、肺和骨骼肌样品称重，并在RIPA裂解液(品牌：Beyotime)中迅速裂解。使用BCA蛋白测定试剂盒(品牌：Biomed)检测总蛋白浓度，操作步骤按照说明书进行，并用酶联免疫吸附测定ELISA试剂盒(品牌：Biolegend)测定炎症细胞因子IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α和MCP-1的表达水平，并以总蛋白浓度对结果进行标准化。受感染了小鼠的脑、肺和骨骼肌组织裂解物中，TNF-α、IL-6、IL-10和MCP-1的蛋白表达水平(图18)小鼠也明显升高，此结果与转录水平一致。组织裂解物中IL-1β的蛋白表达水平低于检测限度。小鼠受感染早期，体内炎症细胞因子IL-6、IL-10和MCP-1的表达水平被诱导，有明显的增长现象。结果表明，促炎性细胞因子(如TNF-α，IL-6和MCP-1)产量的增加可能在CVA2感染的发病机制中起重要作用。

实验例2

动物模型的评价：

2.1CVA2全病毒疫苗、抗病毒血清的制备和抗CVA2抗体滴度的测定

通过将37％的甲醛(GB/T685-1993)与2.45×10

通过腹腔注射的方式将200μL灭活的CVA2乳剂接种至六周大的成年雌性BALB/c小鼠，对成年雌鼠进行两次免疫，每次免疫间隔2周，两次免疫后第10天采集成年雌鼠的血样。4℃下以4,000×g离心10分钟分离得到CVA2抗血清，并于-80℃环境中储存。同时，以相同的方式接种等量的imject

通过体外微中和测定法测定CVA2抗血清含有的中和抗体的GMT(geometric meantiter，几何平均滴度)，使用含有2％FBS的MEM将上述步骤得到的CVA2抗血清样品进行10倍系列稀释(1：1至1：10,000)，稀释比例分别为1:1、1:10、1:100、1:1000、1:10000，得到不同稀释度的CVA2抗血清稀释液。将50μL稀释的抗血清分别与10

2.2CVA2抗血清通过被动免疫对小鼠的影响评估

为了研究CVA2抗血清在小鼠的被动免疫保护作用，将实验例2步骤2.1得到的CVA2抗血清(GMT＝1000)利用生理盐水进行10倍系列稀释(1：1至1：10,000)，将得到的不同CVA2抗血清稀释液通过腹腔注射的方式接种至4日龄BALB/c小鼠体内，每个实验组注射一种稀释梯度的CVA2抗血清稀释液，每组小鼠15只，注射体积为50μL。第二天，即BALB/c小鼠生长至5日龄，按照实施例1构建动物模型的方式，通过肌肉注射的方式给实验组和对照组5日龄BALB/c小鼠肌肉注射接种致死剂量的CVA2(10

结果如图19所示，只注射正常血清的小鼠全程保持健康；小鼠接受正常血清和稀释的CVA2抗血清后感染CVA2，均在1dpi开始出现肢体麻痹的临床体征，并在9dpi全部死亡(图19a)。给予稀释的CVA2抗血清的小鼠未观察到对其有保护作用。相比之下，注射原始浓度CVA2抗血清的小鼠在1-4dpi时出现了短时肢体麻痹，随着时间的延长，小鼠渐渐恢复健康，没有观察到神经系统症状(图19b)。结果表明原始CVA2抗血清可以为感染的新生小鼠提供100％的保护。

2.3母源抗体对小鼠的影响评估

为了评估母源抗体对新生小鼠的免疫保护作用，对6周龄的成年BALB/c雌鼠腹腔接种200μL实验例2中步骤2.1得到的CVA2全病毒疫苗。第一次免疫后允许成年雌鼠和成年雄鼠交配，间隔两周进行第二次免疫，第二次免疫后7至10天母鼠分娩得到的小鼠即为实验组新生BALB/c小鼠。对照组设置是对6周龄的成年雌鼠腹腔注射等量维持液培养基和imject

结果如图20所示，具有母源抗体的小鼠感染CVA2病毒1-3dpi症状逐渐加重，3dpi后抗体发挥作用，症状逐渐减轻直至康复，存活率为100％。感染过程中未出现共济失调和肢体麻痹的临床体征，表明母源抗体可以为幼崽提供免疫保护。然而，对照组小鼠的临床症状很严重，小鼠在3-8dpi全部死亡。

2.4主动免疫对小鼠的影响评估

给3日龄新生小鼠腹腔接种50μL灭活的CVA2全病毒疫苗以使小鼠体内产生免疫作用，小鼠生长至5日龄时，按照实施例1构建动物模型的方式给获得主动免疫的BALB/c小鼠肌肉接种致死剂量(10

结果如图21所示，在CVA2感染后，主动免疫组中的小鼠的存活率为100％，而未接种疫苗的小鼠全部在9dpi死亡(图21A)。疫苗接种的小鼠在6天内仅表现出轻微的临床症状，临床症状评分为1或2，并在之后监测的时间内保持正常(图21B)。相反，未接种疫苗的小鼠在2dpi时开始表现出临床体征，并在4～9dpi时全部发展为重症或死亡。以上数据表明，灭活的CVA2全病毒疫苗可以在新生小鼠中产生免疫保护作用。

2.5细胞因子单克隆抗体疗效的评估

为了评估细胞因子单克隆抗体的治疗效果，按照实施例1构建动物模型的方式，以肌肉注射的方式将致死剂量的CVA2接种至5日龄新生BALB/c小鼠。12小时后，腹腔注射用抗IL-6单克隆抗体(mAb)、抗TNF-α单克隆抗体和MCP-1单克隆抗体(品牌：Biolegend)，每只小鼠注射浓度分别为1.33mg/kg、50mg/kg、10mg/kg。给同种型对照组(isotype control)的小鼠注射等效的纯化大鼠IgG1(品牌：Biolegend)，空白对照组(control)为仅向5日龄新生BALB/c小鼠肌肉注射等量维持液。感染后每天监测所有哺乳小鼠的临床体征(临床分数与临床体征对照如表5所示)和死亡率，直至感染后第15天作为实验终点。

结果如图22所示，抗IL-6mAb和抗MCP-1mAb治疗可显着提高生存率和延缓疾病发作，但差异无统计学意义(P>0.05)。此外，抗TNF-αmAb治疗对CVA2感染小鼠的存活率和平均临床评分无影响。因此，促炎细胞因子的控制不能完全阻止CVA2感染引起的疾病恶化。

统计分析

使用GraphPad Prism版本8.3(GraphPad 8.3软件，美国加利福尼亚州圣地亚哥)进行统计分析。使用Mantel-Cox对数秩检验比较不同组小鼠的存活率。结果表示为平均值±标准偏差(SD)。使用未配对的t检验或单向方差分析(ANOVA)确定细胞因子、病毒载量、平均临床评分、表达或转录水平的差异。P值<0.05被认为是显著的。

本发明成功构建了一种CVA2感染动物模型，以BALB/c 5日龄小鼠作为最佳构建模型对象，肌肉注射为最佳接种途径，10

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。