利用乙酸或其盐生产(R)-3-羟基丁酸的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法及应用

摘要

本发明提供利用乙酸或其盐生产(R)‑3‑羟基丁酸的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法及应用，代谢途径为使用乙酸或其盐经β‑酮基硫解酶和乙酰乙酰CoA还原酶，最终利用丙酰CoA转移酶的不专一性生产(R)‑3‑羟基丁酸。本发明改造途径为构建乙酰CoA生产(R)‑3‑羟基丁酸的外源代谢途径，该途径利用了丙酰CoA转移酶的不专一性，比传统途径步骤少，且耗能少。本发明实现了在大肠杆菌中以乙酸为碳源生产(R)‑3‑羟基丁酸，并通过使用不同的丙酰CoA转移酶和宿主大肠杆菌，提高了(R)‑3‑羟基丁酸的产量与得率，证明了该代谢路径在大肠杆菌中具有通用性。本发明实现了以含乙酸的合成气发酵液为培养基发酵生产(R)‑3‑羟基丁酸。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，更具体地讲，涉及利用乙酸或其盐生产(R)-3-羟基丁酸的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法及应用。

背景技术

乙酸是一种廉价易得的碳源，目前主要通过化学法合成，合成工艺主要有乙醛法、丁烷(或轻油)液相氧化法和甲醇羰基化法，其中甲醇羰基化法催化效率高，原料价格低，操作工艺简单，反应条件较其他工艺温和，是乙酸化学合成的主要方法，世界上近40％乙酸由甲醇羰基化法制备，而石油价格低廉的地方丁烷(或轻油)液相氧化法具有优势。此外，乙酸也可以通过生物发酵获得，醋杆菌属的乙醇氧化和梭菌属或不含乙醇作为中间体的醋酸杆菌属的厌氧发酵，都可以产生乙酸。如今，使用梭菌属进行合成气发酵生产乙酸成为了热门研究方向。

羟基丁酸(3-hydroxybutyric，3-HB)又称β-羟基丁酸，分子式为C

化学法生产3-HB具有反应条件苛刻、对设备要求高、催化剂及有机溶剂价格昂贵和产品光学纯度低等缺点，逐渐被生物法取代。最近，许多研究者的兴趣集中在使用代谢工程菌株利用可再生能源生产3-HB，以降低成本并得到高光学纯度的3-HB。为了实现生物法生产3-HB，许多代谢路径被构建，其中大多数以葡萄糖为底物。首先，先利用碳源合成聚3-羟基丁酸酯(PHB)，再降解PHB生成3-HB的代谢路径被构建。近些年，不经过PHB直接合成3-HB的代谢路径成为主流。至今，仍未有使用代谢工程菌种利用乙酸生产3-HB的报道。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种利用乙酸或其盐生产(R)-3-羟基丁酸的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法。

本发明的第二个目的在于提供利用上述构建方法得到的代谢工程大肠杆菌菌株。

本发明的第三个目的在于提供利用上述构建方法得到的代谢工程大肠杆菌菌株在以乙酸或其盐为碳源发酵生产(R)-3-羟基丁酸中的应用。

为了实现上述第一个目的，本发明公开以下技术方案：一种利用乙酸或其盐生产(R)-3-羟基丁酸的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，代谢途径为使用乙酸或其盐经β-酮基硫解酶和乙酰乙酰CoA还原酶，最终利用丙酰CoA转移酶的不专一性生产(R)-3-羟基丁酸。

作为一个优选方案，过表达β-酮基硫解酶编码基因(phaA)、乙酰乙酰CoA还原酶编码基因(phaB)和丙酰CoA转移酶编码基因(pct)。

作为一个优选方案，所述乙酸或其盐是指乙酸或者乙酸盐，所述乙酸盐包括乙酸钠和乙酸铵中的一种或两种。

为了实现上述第二个目的，本发明公开以下技术方案：利用上述乙酸或其盐生产(R)-3-羟基丁酸的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法得到的代谢工程大肠杆菌菌株。

为了实现上述第三个目的，本发明公开以下技术方案：代谢工程大肠杆菌菌株在以乙酸或其盐为碳源发酵生产(R)-3-羟基丁酸中的应用。

作为一个优选方案，以含乙酸的合成气发酵液为培养基发酵生产(R)-3-羟基丁酸。

本发明的优选实施例中，代谢工程改造的大肠杆菌以乙酸为碳源发酵(R)-3-羟基丁酸，其改造途径为构建乙酰CoA生产(R)-3-羟基丁酸的代谢途径，改造途径至少包括：

(1)构建乙酰CoA生产丙酮或异丙醇的代谢途径：该途径涉及3个酶，分别为β-酮基硫解酶(PhaA)、乙酰乙酰CoA还原酶(PhaB)和丙酰CoA转移酶(Pct)，编码该3个酶的基因分别为富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)中的phaA、phaB和拜氏羧菌(Clostridiumbeijeriinckii 8052)中的pct

作为一个优选方案，构建乙酰CoA生产(R)-3-羟基丁酸的改造途径为：同时过表达来源于Ralstonia eutropha的phaA、phaB和Clostridium beijeriinckii8052的pct

本发明以野生型大肠杆菌BW25113为出发菌，通过构建(R)-3-羟基丁酸生产途径，并用能量消耗更低的丙酰CoA转移酶替换传统生产途径中的硫酯酶，构建一条更加高效的(R)-3-羟基丁酸生产途径。同时，本发明以乙酸或乙酸盐为碳源，是指以乙酸或乙酸盐为主要碳源或者唯一碳源。合成途径中消耗的ATP和还原力由TCA和乙醛酸循环提供。同时，使用含有乙酸的羧菌合成气发酵液作为底物，证明了代谢工程大肠杆菌能够利用合成气发酵液中的乙酸生产(R)-3-羟基丁酸，实现利用合成气发酵生产的乙酸进一步生产(R)-3-羟基丁酸，提高发酵液的价值。

本发明的优点在于：本发明改造途径为构建乙酰CoA生产(R)-3-羟基丁酸的外源代谢途径，该途径利用了丙酰CoA转移酶的不专一性，比传统途径步骤少，且耗能少。本发明实现了在大肠杆菌中以乙酸为碳源生产(R)-3-羟基丁酸，并通过使用不同的丙酰CoA转移酶和宿主大肠杆菌，提高了(R)-3-羟基丁酸的产量与得率，证明了该代谢路径在大肠杆菌中具有通用性。

附图说明

图1为大肠杆菌利用乙酸或其盐生产(R)-3-羟基丁酸((R)-3-HB)代谢图。Ace，乙酸盐；AcP，乙酰磷酸；acs，乙酰CoA合成酶；ackA，乙酸激酶；pta，磷酸转乙酰酶；AcCoA，乙酰CoA；Acetoacetyl-CoA，乙酰乙酰CoA；3-HB-CoA，(R)-3-羟基丁酰CoA；3-HB，(R)-3-羟基丁酸；phaA，β-酮基硫解酶；phaB，乙酰乙酰CoA还原酶；pct，丙酰CoA转移酶；gltA，柠檬酸合酶；CIT，柠檬酸；acnAB，顺乌头酸酶；ICT，异柠檬酸；icdA，异柠檬酸脱氢酶；αKG，α酮戊二酸；sucAB，α酮戊二酸脱氢酶；SucCoA，琥珀酰CoA；sucCD，琥珀酸硫激酶；SUC，琥珀酸；aceA，异柠檬酸裂解酶；iclR，异柠檬酸裂解酶阻遏物；GOX，乙醛酸；aceB，苹果酸合成酶；MAL，苹果酸；mdh，苹果酸脱氢酶；OAA，草酰乙酸；fumABC，延胡索酸酶；FUM，延胡索酸；frdABCD，延胡索酸还原酶；sdhABCD，琥珀酸脱氢酶；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；PYR，丙酮酸；aceEF，丙酮酸脱氢酶复合体；ppsA，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A；pykAF，丙酮酸激酶；ppc，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；pckA，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；sfcA/maeA，NAD

具体实施方式

以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.(R)-3-羟基丁酸生成途径的构建

由乙酰CoA生成(R)-3-羟基丁酸的酶分别为β-酮基硫解酶(由来源于Ralstoniaeutropha的phaA编码)、乙酰乙酰CoA还原酶(由来源于Ralstonia eutropha的phaB编码)和丙酰CoA转移酶(由来源于Clostridium beijeriinckii8052的pct

质粒构建方法如下：

由NCBI中查找来源于Ralstonia eutropha的phaA和phaB基因序列，将以上两个基因串联表达，并在基因之间加入经过计算优化的RBS，最后连接入线性化pTrc99a载体。由K中查找来源于Clostridium beijeriinckii 8052的pct

phaA基因通过酶切位点EcoRI和SacI酶切连接到pTrc99a上，phaB基因通过诺唯赞公司的Clone Express MultiS One Step Cloning Kit试剂盒连接到pTrc99a上。构建好的质粒通过钙转转入E.coli DH5α中，然后通过菌落PCR和测序验证。

表1构建质粒引物

以上序列参见SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.6。

表2菌株和质粒

实施例2.最优宿主及pct基因筛选摇瓶发酵

以大肠杆菌MG1655、BW25113、W3110为出发菌(MG1655、BW25113、W3110由The ColiGenetic Stock Center提供)，通过钙转转入构建(R)-3-羟基丁酸生产途径的质粒，分别得到MG1655(pTrc-99a-phaAB,pBAD33-Trc-pct

摇瓶发酵操作：挑取平板上的单菌落接种于装有3mL LB的试管中培养过夜，然后转接到装有50mL LB培养基的锥形瓶中，接种量2％，培养条件均为37℃，220rpm。二级种子培养10h后，转入摇瓶发酵培养基(M9培养基)。M9培养基中添加10g/L乙酸钠和2g/L酵母提取物。接种量为2％，培养条件为37℃，220rpm，至OD

M9培养基组成(每升)：Na

(R)-3-羟基丁酸及乙酸的测定方法：摇瓶发酵培养期间，间隔8h取样，12000rpm离心10分钟分离菌体和上清。发酵液上清经0.22μm微孔膜过滤，采用安捷伦高效液相色谱仪监测发酵液上清中的(R)-3-羟基丁酸及乙酸有机酸。色谱柱为BioRadAminex HPX-87离子色谱柱(300mm*7.8mm)，配有紫外检测器和示差折光检测器。流动相为5mM的H

细胞浓度的测定采用分光光度计法测定600nm下的吸光值。

摇瓶发酵结果如表3所示。BW25113(PhaAB,pct

表3基因工程菌(R)-3-羟基丁酸产量及得率

实施例3.发酵温度优化摇瓶发酵

以大肠杆菌BW25113或W3110为出发菌，通过钙转转入构建(R)-3-羟基丁酸生产途径的质粒，分别得到BW25113(pTrc-99a-phaAB,pBAD33-Trc-pct

M9培养基组成、(R)-3-羟基丁酸和乙酸的测定方法以及细胞浓度的测定方法同实施例2中所述,。摇瓶发酵操作除诱导后转入不同温度培养(25℃、30℃或37℃)外，同实施例2中所述。

摇瓶发酵结果如表4所示。诱导后25℃培养BW25113(phaAB,pct

表4基因工程菌(R)-3-羟基丁酸产量及得率

实施例4.上海植物生物研究所合成气发酵液摇瓶发酵

以大肠杆菌BW25113或W3110为出发菌，通过钙转转入构建(R)-3-羟基丁酸生产途径的质粒，分别得到BW25113(pTrc-99a-phaAB,pBAD33-Trc-pct

(R)-3-羟基丁酸和乙酸的测定方法以及细胞浓度的测定方法同实施例2中所述。培养条件为37℃，220rpm，至OD

摇瓶发酵结果如表5所示。BW25113(PhaAB,pct

表5基因工程菌(R)-3-羟基丁酸产量及得率

实施例5.合成气发酵液静息细胞转化

以大肠杆菌BW25113为出发菌，通过钙转转入构建(R)-3-羟基丁酸生产途径的质粒，分别得到BW25113(pTrc-99a-phaAB,pBAD33-Trc-pct

(R)-3-羟基丁酸和乙酸的测定方法以及细胞浓度的测定方法同实施例2中所述。培养条件为37℃，220rpm，至OD

不含NH

合成气发酵液使用3％活性炭，58℃，处理2h。合成气发酵液121℃，20min高压蒸汽灭菌后，加入CaCl

静息细胞结果如表6所示。BW25113(phaAB,pct

表6基因工程菌(R)-3-羟基丁酸产量及得率

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 利用乙酸或其盐生产(R)-3-羟基丁酸的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法及应用

<130> /

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cccgaattca tgactgacgt tgtcatcg 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccgagctct tatttgcgct cgactgcc 28

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgactcagc gcattgcg 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcagcccata tgcaggcc 18

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggcctgcata tgggctgacc tgccgtcaca caggaaac 38

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caatgcgctg agtcatgtcc actccttgat tggcttcgt 39

<210> 7

<211> 1557

<212> DNA

<213> Clostridium beijeriinckii 8052

<400> 7

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<210> 8

<211> 1545

<212> DNA

<213> Clostridium beijeriinckii 8052

<400> 8

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<210> 9

<211> 1527

<212> DNA

<213> Clostridium beijeriinckii 8052

<400> 9

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gttgcagtag gtggatttgt tggatgtgcc catccagaac aaattacatt agaaatagaa 120

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ggtaaactta atgaaattac aaaagaggat attgtaaaag tagttaatat tgaagagaag 480

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gatgaagacg gaaatgcaac aatggaaaaa gaggctttaa cacttgatgc aacagcaatg 600

gctcaagctg ctaaaaattc agggggaata gtaatactac aagttgaaaa ggttgtaact 660

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gttgcatcaa cagaaaacca aatgcaaact tttagtgaaa actttaatcc agcatattgt 780

ggagatacta aggtaccagt ggattcaata gaaccattac tacttaatga aaggaaggta 840

atagcaagaa gatgtgctaa ggaactagta ccaaatgctg ttactaattt aggtattggc 900

ataccagaag gaatagctat agttgctaat gaagaaggta ttgcagatca aatgacttta 960

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ttagaaaagg atattctaga taatatggat tttaagccaa taatatctcc tgaattaaag 1500

cttatggatg aaaatatgtt taaatag 1527

<210> 10

<211> 1554

<212> DNA

<213> Clostridium beijeriinckii 8052

<400> 10

gtgagaaaag taaaagtttt aacaagtcgc gaagcagtac aaatagtgaa ggatggagat 60

gtgttagtaa ctggcggatt tgttggtagt tgtgcacctg aaactcttag ttgtgcttta 120

gaaaaacgtt tcattgaaac aaatcatccg caaaatataa ctttatttca tgcagcagga 180

caaggcgata gtaaggggaa aggttcagat cattatgccc acgaaggctt acttaagaga 240

gtggttgcag gtcattataa tttagcaccg aaaattggaa agttaattaa tgaaaataaa 300

atagaagctt ataatctacc acaagggaca atttctcaat tatttagaga tattgcggga 360

aaaagaattg ggacaataac tcacgttgga ttgaatacat ttgtggatcc aagaattagt 420

ggtggaaaat taaatgaaaa aacaaaagaa gatctagtaa agctaataaa tatagaaggt 480

gaagaaaaat tattatacaa atcaattcca gttaatgtct gcttcttaag aggatctttt 540

gcagatgaat acggtaatgt atcattagaa aaagaaatag ctacacttga ggatacgtca 600

atagcccaag cttgtaagaa taatggcgga aaagtaatag ttcaagtaga aaaagtagtt 660

gaagcaggat ctttagaccc acgtcttata aaaattccag gtatatatgt agatgcggtt 720

gtaatctcaa ctcccgaaga gcatgaacaa tccttcgaat gcccatttaa tccagcagta 780

acaggtgaaa tgagaattcc attaaacagt gtagaaaaag ctccattaaa tgagagaaag 840

ataattgcga gaagagcagc tatggaatta aagaaagata cggtagtaaa tttaggtata 900

gggataccag aagttatttc tttagttgcg aatgaagaag gaattggtga atatatgaca 960

ttaactgtag aagccggtcc aataggaggt ataccacaag gatgcacagc ttttggagcg 1020

agtataaatc cagaagctat tatagatcag ccatatcaat ttgattttta tgatggtgga 1080

ggcgtcgata tagcattttt aggactagct caggttgatg aacatggaaa tttgaatgta 1140

agtaagtttg ggcctagaat tgctggatgt ggtggattca taaatataac tcaaaatgct 1200

aagaaagtgt tattttgtgg aacattcact gcaggaggct taaaagtagt aacaggagat 1260

ggcaaattag aaattaaaca agaaggaaaa gctaaaaaat tcattaagga tgtagagcaa 1320

attacattta gtggagatta tgcaagaagg atggatcaac aagttatgta tataactgag 1380

agagcagtat ttgagttaag gaaagatgga ttatacctta cagaaatagc gcctgggata 1440

gatctaaaaa aggatgtatt ggatttaatg gatttcaaac ctaaaatgga tggagtacct 1500

agactaatga atggaagaat attttatgat aagttgatgg gattaaggga gtaa 1554