一种中心切割方式分析砂仁挥发性微量化学成分的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种中心切割方式分析砂仁挥发性微量化学成分的方法及其应用。该方法，包括如下步骤：S1、将预处理后的砂仁样品粉末置于顶空瓶内，并用顶空瓶盖密封，将顶空瓶置于自动进样器上恒温保持使样品中的气固两相达到平衡；S2、设置自动进样器，顶空进样进气相色谱/四级杆飞行时间质谱联用仪分析；S3、再次进样加大进样量，使用中心切割功能把砂仁挥发性化学成分中占比最大的两个目标峰按保留时间切割到柱箱排放，对中心切割方式后的化合物进行定性和半定量分析。本发明采用静态顶空进样前处理方法，并与气相色谱四级杆串联飞行时间质谱结合，通过常规进样加中心切割进样的方式，实现砂仁挥发性化学成分便捷、准确全面的定性和半定量分析。

说明书

技术领域：

本发明属于中药材砂仁分析技术领域，具体涉及一种中心切割方式分析砂仁挥发性微量化学成分的方法及其应用。

背景技术：

砂仁(Fructus Amomi)，是姜科，豆蔻属草本植物阳春砂(Amomum villosumLour.)、海南砂(Amomum longiligulare T.L.Wu)或绿壳砂(Amomum villosumLour.var.xanthioides T.L.Wu et Senjen)的干燥成熟果实。因其良好的药用价值被列为我国著名的“四大南药”之一。其中尤以广东省阳春市地区所产阳春砂最为知名，称“道地南药砂仁”，也叫春砂仁。近年来因广东省气候环境等因素导致春砂仁产量较低，其主产区已转移至广西和云南等地，但道地性仍是以原产地阳春市为佳。已有研究表明，砂仁通过对抗肠胃粘膜的攻击因子而产生肠胃保护作用，能显著抑制胃液胃酸的分泌，从而防止溃疡的形成，现在已是中医用于治疗肠胃疾病的常用药物，同时它还具有降脂、消炎和镇痛等作用，因此具有良好的开发和应用价值。目前市面上最好的阳春砂仁，其一级品已经可以卖到15600元/公斤，而引种到广西、云南的砂仁价格普遍在300-2400元/公斤，因此市场上有些不良商贩为了谋取暴利，以次充好，扰乱了正常市场秩序，影响了阳春砂仁的口碑。因此，砂仁产地的准确鉴定，对于稳定市场和维护消费者的利益是十分重要的。

阳春砂仁气味浓郁，作为天然产物，其所含物质较多，目前已有大量有关其挥发性化学成分方面的研究报道，主要通过气相色谱质谱联用法，检测到的化合物主要包括烯烃、醇类、酮类、醛类、酯类、酚类和羧酸类等化合物，其中含量最高的是乙酸龙脑酯和樟脑，分别占其总挥发性成分的60％和20％左右，其他鲜有超过总含量10％的成分。我们知道，质谱检测器存在一定的峰容量，进样量过大会导致样品残留，并且会产生色谱峰过载而产生平顶峰或三角峰，其积分峰面积与实际值会产生较大偏差，从而影响面积归一化得到的相对含量的准确性。同时，色谱峰过载也会导致其质谱图碎片离子的丰度过载，引起不同碎片离子间丰度比例的改变，不利于谱库检索匹配的准确性。所以，样品进样量需控制在一定范围内，但也因此无法准确检测到砂仁样品中少量或微量挥发性化学成分的信息。

目前，检测砂仁挥发性化学成分主要通过单次进样后，利用质谱的标准谱库比对和面积归一化法得到化合物的定性和半定量信息，而这一方法要么检测到的化合物数量偏少，要么主成分过载而导致化合物相对含量不够准确，无论哪一种都难以兼顾砂仁挥发性化学成分检测的全面性和准确性，不利于通过化学成分的精准信息来达到分辨不同产地砂仁样品的目的。因此，发明一种分析砂仁挥发性微量化学成分的方法具有重要意义。

发明内容：

本发明解决了砂仁挥发性成分检测不全或半定量结果不够准确的问题，提供一种中心切割方式分析砂仁挥发性微量化学成分的方法及其应用，以期达到鉴别不同产地砂仁样品的目的。

本发明的目的是提供一种中心切割方式分析砂仁挥发性微量化学成分的方法，包括如下步骤：

S1、将预处理后的砂仁样品粉末置于顶空瓶内，并用顶空瓶盖密封，将所述的顶空瓶置于自动进样器上在恒温系统中保持一定时间，使样品中的气固两相达到平衡；

S2、设置自动进样器，顶空进样进气相色谱/四级杆飞行时间质谱联用仪分析，所得谱图经计算机谱库检索，并结合标准质谱图确定挥发性成分，用色谱峰面积归一化法测定目标化合物的相对含量，实现对目标化合物进行定性和半定量分析；

S3、再次进样并加大进样量，同时使用中心切割功能把砂仁挥发性化学成分中占比最大的两个目标峰按保留时间切割到柱箱排放，此进样量可加大到以不出现过载峰为宜，所得谱图经计算机谱库检索，并结合标准质谱图确定中心切割方式后的挥发性成分，用色谱峰面积归一化法测定中心切割方式后的化合物的相对含量，实现对中心切割方式后的化合物进行定性和半定量分析；

S4、中心切割方式后的化合物最终半定量结果按切割前所占比例总和重新计算修正，分析砂仁挥发性微量化学成分。

本发明的中心切割功能是采用微板流路控制器实现，优选安捷伦科技有限公司生产的Deans Switch，通过阀的快速切换实现载气流路变化。上述定性和半定量方法为四级杆串联飞行时间质谱法。峰面积归一化法为半定量方法，四级杆飞行时间质谱为定性手段。

本发明提出的方法可排除主要含量较高的主要成分对低含量物质的影响，从而提高低含量物质的响应值。

优选地，S1的具体步骤为：将干燥砂仁样品粉碎后过60目筛，称取50mg过筛后的干燥砂仁样品置于20mL顶空瓶中，用顶空瓶盖将顶空瓶密封，并将上述样品置于自动进样器样品盘上，进样前在恒温系统中保持20min，温度为60℃，使样品中的气固两相达到平衡。

优选地，所述的砂仁样品为砂仁的果实部位。

优选地，所述的S2为常规进样，所述的常规进样气相色谱条件为：色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm,0.25μm)；进样口温度为200℃；进样量为0.2mL，分流比为50:1；程序升温：50℃保持1min，然后以4℃/min的速率上升至230℃；

质谱条件为：离子源为EI，70eV；离子源温度为200℃；四级杆温度为150℃；传输线温度为280℃；扫描质量范围为30-450m/z；采集速度：5Hz；分辨率：20000FWHM。

优选地，所述的S3为中心切割进样，所述的中心切割进样气相色谱条件为：色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm，0.25μm)；进样口温度为200℃；进样量为0.5mL，分流比为10:1，程序升温：50℃保持1min，然后以4℃/min的速率上升至230℃；切割时间段为15.00-15.20min和19.87-20.10min；

质谱条件为：离子源为EI，70eV；离子源温度为200℃；四级杆温度为150℃；传输线温度为280℃；扫描质量范围为30-450m/z；采集速度：5Hz；分辨率：20000FWHM。

本发明还保护上述的中心切割方式分析砂仁挥发性微量化学成分的方法在鉴别砂仁产地中的应用。本发明提出的方法通过验证后，各项分析参数较为稳定，可以快速、准确的对不同产地砂仁样品中挥发性化学成分进行精细化分析，达到鉴别不同产地砂仁样品的目的。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

本发明采用静态顶空进样前处理方法，并与高分辨的气相色谱四级杆串联飞行时间质谱相结合，通过常规进样加中心切割进样的方式，实现了砂仁挥发性化学成分便捷、准确而全面的定性和半定量分析。该方法仅需少量砂仁样品，无需使用任何其他步骤和有机溶剂，安全无污染，这一过程既保证了砂仁样品挥发性成分的稳定性，最大程度的降低了易挥发成分的损失，也最真实的还原了砂仁挥发性化学成分的组成和比例。同时，标准谱库、保留指数和精确分子量的比对最大化的保证了定性结果的可靠性。该方法通过验证后，各项分析参数较为稳定，可以快速、准确的对不同产地砂仁样品中挥发性化学成分进行精细化分析。

附图说明：

图1为实施例1一次进样与中心切割后二次进样的色谱图对比；

图2为实施例2不同产地砂仁挥发性化学成分含量差异图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

除特别说明，本发明中的实验材料和试剂均为本技术领域常规市购产品。气相色谱/四级杆飞行时间质谱联用仪购自安捷伦科技有限公司，型号为7890B-7250。

实施例1:分析方法稳定性测试

一种中心切割方式分析砂仁挥发性微量化学成分的方法，包括以下步骤：

S1、将市售的干燥砂仁样品粉碎后过60目筛，称取50mg过筛后的砂仁样品置于20mL顶空瓶内，用顶空瓶盖将其密封，并将上述样品置于自动进样器样品盘上，顶空平衡温度为60℃，平衡时间为20min；

S2、设置自动进样器取平衡后的样品0.2mL，顶空进样进气相色谱/四级杆飞行时间质谱联用仪分析，所得谱图经计算机谱库检索，并结合标准质谱图确定挥发性成分，用色谱峰面积归一化法测定目标化合物的相对含量，实现对目标化合物进行定性和半定量分析；

详细气相色谱条件：

常规进样：色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm,0.25μm)；进样口温度为200℃，分流比为50:1；程序升温：50℃保持1min，然后以4℃/min的速率上升至230℃；

质谱条件为：离子源为EI，70eV；离子源温度为200℃；四级杆温度为150℃；传输线温度为280℃；扫描质量范围为30-450m/z；采集速度：5Hz；分辨率：20000FWHM。

S3、再次进样并加大进样量，同时使用中心切割功能把砂仁挥发性化学成分中占比最大的两个目标物切割到柱箱排放，即当目标物即将进入检测器时，通过Deans Switch将阀开启改变载气流路，将目标物转移排放，目标物排放完毕后再将阀关闭，将气路转移到原来的流路继续分析，从而实现切割进样的功能。此进样量可加大到以不出现过载峰为宜，所得谱图经计算机谱库检索，并结合标准质谱图确定中心切割方式后的挥发性成分，用色谱峰面积归一化法测定中心切割方式后的化合物的相对含量，实现对中心切割方式后的化合物进行定性和半定量分析；

详细气相色谱条件：

中心切割进样：色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm,0.25μm)；进样口温度为200℃；进样量为0.5mL，分流比为10:1，程序升温：50℃保持1min，然后以4℃/min的速率上升至230℃，切割时间段为15.00-15.20min和19.87-20.10min；

质谱条件为：离子源为EI，70eV；离子源温度为200℃；四级杆温度为150℃；传输线温度为280℃；扫描质量范围为30-450m/z；采集速度：5Hz；分辨率：20000FWHM。

S4、中心切割方式后的化合物最终半定量结果按切割前所占比例总和重新计算修正，分析砂仁挥发性微量化学成分。

将上述检测数据用“未知物分析”软件处理，并结合NIST17版标准谱库比对获得匹配度，同时使用保留指数和精确质量数比对两种辅助定性方式，得到最终的定性结果，其最终筛选依据为匹配度不低于75，保留指数的实测值和文献值误差不超过±5％，若标准谱库中化合物存在分子离子峰，则其精确分子量的理论值和实测值的相对偏差(SD)不超过5ppm。以上三种定性方式的使用进一步确保了定性结果的准确性。同时，根据峰面积归一化法计算化合物相对含量，通过对同一样品进行3次平行测定，计算相对含量的相对标准偏差(RSD)，砂仁常规进样和中心切割进样的挥发性化学成分的检测结果见表1。

表1砂仁常规进样和中心切割进样的挥发性化学成分表

“-”表示化合物匹配度低于75或未能检测到

由上述表1可知，在不过载进样的前提下，常规进样只准确鉴定到了14种化合物，而中心切割进样除缺少切割走的两个主成分外，还准确鉴定到了36种化合物，包含常规进样中除两大主成分外的12种，且匹配度都有了一定程度的上升，说明了该组合进样方式定性结果更全面，准确性也更高。此外，从方法的稳定性看，重复3次进样计算其相对含量的相对标准偏差，结果表明，全部38种化合物的相对标准偏差均不超过30％，其中有29种不超过10％，占到了总化合物数量的74％，因此可以看出该方法的稳定性表现较好。

图1为一次进样与中心切割后二次进样的色谱图对比，可以看出切割掉两个最大的主成分外，加大进样量可以检测到更多化合物信息。

实施例2：不同产地砂仁挥发性化学成分分析

为了进一步验证本发明提出的方法的实用性，采用实施例1的检测步骤分别对广东阳春、广西南宁和云南文山的砂仁样品挥发性化学成分进行了分析，通过上述方法准确鉴定到了50种化学成分，详细名称及相对含量见表2。

表2不同产地砂仁挥发性化学成分表

注：以上检测值均为三次测量平均值。

由表2可知，对不同产地砂仁挥发性化学成分含量进行分析，结果表明，乙酸龙脑酯(53.696％-65.393％)、樟脑(20.126％-38.463％)、2-茨醇(2.165％-6.415％)、莰烯(0.173％-1.286％)、α-蒎烯(0.532％-0.747)、D-柠檬烯(0.300％-0.536％)和双环吉马烯(0.401％-0.522％)为三个产地砂仁中的主要成分，其含量差别详见图2。而三环萜(0.016％)、葑酮(0.042％)、松油酮(0.010％)、α-荜澄茄油烯(0.017％)、衣兰烯(0.005％)、α-古丁烯(0.007％)、α-香柑油烯(0.012％)、α-愈创烯(0.012％)和β-檀香萜烯(0.015％)为云南文山砂仁样品所特有，此外广东阳春样品中未鉴定到α-侧柏烯、β-侧柏烯和α-松油烯，广西南宁样品中未鉴定到马鞭草烯酮，这些差异性化学成分所占比例均不超过总挥发性化合成分的0.05％，但却可用于区分三个不同产地的砂仁样品。由此可见，微量化合物的含量差异可作为鉴别砂仁产地的一项重要参数，本发明提出的方法可以鉴别不同产地的砂仁样品。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的技术方案及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。