向抗体赋予新的结合特异性的超通用方法

摘要

本发明的目的为提供用于通过将肽序列插入至抗体中来向抗体赋予其他结合活性的高效且通用的方法。本发明提供通过在抗体的Fc区中插入具有针对与该抗体所识别的第一靶分子不同的第二靶分子的结合能力的环肽的内部肽序列、从而向抗体赋予针对第二靶分子的结合能力的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及向抗体赋予新的结合特异性的超通用方法等。

背景技术

抗体的功能在本质上是与作为靶分子的唯一一种抗原分子特异性地结合。作为通过蛋白质工程方法得到的修饰抗体，有识别两种以上不同抗原分子的抗体(多特异性抗体：MsAb)。

对于MsAb而言，一个抗体同时与两种以上的靶分子结合，因此，可用作将癌细胞和淋巴细胞这样的异种细胞彼此桥连从而发挥抗癌作用的药物。另外，通过向具有抗体固有的第一结合特异性的抗体赋予第二结合特异性，还能够使MsAb集聚于所期望的组织、细胞。

此外，在原本必须将例如免疫检查点抑制抗体和凋亡诱导抗体这两种抗体组合使用的情况下，通过使用MsAb，能够以一种抗体的施予来代替两种抗体的施予，还可期待减少成本的效果。

如此，MsAb在抗体医药的开发中极受重视。

针对作为MsAb的、将来源于不同抗体的两个抗原识别Fab区组合的形态的双特异性抗体(BsAb)，通过在Fab区以外的位置嵌入第二结合特异性来创造IgG型的BsAb的技术被称为Fcab(非专利文献1)。

Fcab中，两个Fab区保持原来的抗体的形态，因此，关于抗体原本具有的第一结合特异性，可与野生型IgG抗体同样地保证二价的结合。

Fcab中，第二结合特异性通过下述方法得到的：将Fc区的特定的环结构随机化，从中筛选获得了与靶分子的亲和性的结构。这种情况下，与原来的IgG抗体相比，将在Fc区内的多个区域中具有合计约30个残基以下的氨基酸突变，由于第二结合特异性被赋予至独立于Fab区的Fc区，因此，只要能获得具有结合特异性的Fc序列，即可能通过将其与多个抗体(的Fab)组合来创造多种BsAb。

然而，从随机化环文库中筛选特异性结合物(binder)通常成功概率极低，需要大量的反复试验，并且大多数情况下，需要在弱结合物序列的基础上通过人工分子进化等来阶段性地探索能应对实用水平的亲和性的结合物这样的步骤。此外，如此操作能赋予至IgG抗体的新的结合特异性一般为一种。因此，没有已实现赋予第三、第四结合特异性的实例。

虽然并非以制造BsAb为目的，但针对通常在体内的稳定性低的生理活性肽，还公开了基于延长体内寿命等目的而利用抗体的Fc区的技术。

例如，作为使与靶蛋白质特异性结合的肽变得稳定的方法，专利文献1中公开了在该肽仅由天然氨基酸构成时，以添加至Fc区的末端的形式作为融合物进行基因重组，由此进行表达生产。然而，该方法中，由于添加至Fc区的末端，因此，通常无法控制用于担保针对靶标的高结合亲和性和特异性的肽固有的三维结构。

另外，专利文献2中，公开了在Fc区的环结构中插入肽的技术。然而，公开了存在下述问题：尽管作为肽的插入部位已验证了Fc区的环结构上的许多部位，但仅在插入至特定的1处(L139/T140)的情况下保持了所插入的肽的充分的活性，插入至其他部位时，融合肽在大肠杆菌中的表达、与靶分子的结合活性存在问题(实施例13、表12～14)。此外，对于这样的被限定的Fc区的环结构，没有明确公开关于插入何种生理活性肽能重现其活性的条件，从存在数量庞大的天然及非天然(人工)的靶标结合性肽中选择有助于以高成功率创造MsAb的肽是困难的。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2001/083525号

专利文献2：国际公开第2006/036834号

非专利文献

非专利文献1：Protein Eng Des Sel.2010；23(4):289-297

发明内容

发明所要解决的课题

如上所述，虽然针对抗体导入生理活性肽等的技术是已知的，但目前尚不存在能向抗体赋予其他的结合特异性的高效且通用的方法。

因此，本发明是鉴于上述现有技术所具有的问题而完成的，其目的在于提供用于通过将肽序列插入至抗体中来向抗体赋予其他的结合活性的高效且通用的方法。另外，本发明的目的还在于提供通过该方法得到的修饰抗体。

用于解决课题的手段

本申请的发明人进行了锐意研究，结果发现，通过使用环肽的内部序列作为肽序列，能够解决上述课题，从而完成了本发明。

本发明如下所述。

(1)

方法，其通过在抗体的Fc区中插入具有针对与该抗体所识别的第一靶分子不同的第二靶分子的结合能力的环肽的内部肽序列，从而向抗体赋予针对第二靶分子的结合能力。

(2)

如(1)所述的方法，其中，抗体的Fc区来源于人、小鼠、大鼠、兔、马或狗。

(3)

如(1)或(2)所述的方法，其中，插入内部肽序列的部位为Fc区中的露出于分子表面的环部分。

(4)

如(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，环肽为通过展示型探索系统得到的环肽。

(5)

修饰抗体，其具有针对第一靶分子及第二靶分子的结合能力，其中，在抗体的Fc区中插入了具有针对与该抗体所识别的第一靶分子不同的第二靶分子的结合能力的环肽的内部肽序列。

(6)

如(5)所述的修饰抗体，其同时与第一靶分子及第二靶分子结合。

(7)

如(5)或(6)所述的修饰抗体，其中，第一靶分子及第二靶分子为各自不同的细胞表面分子，所述修饰抗体经由与2个不同的细胞表面分子的结合来诱导异种细胞彼此的粘附。

发明效果

根据本发明，通过使用环肽的内部序列作为向抗体中插入的肽序列，并将其插入抗体中，从而能够自由地向抗体赋予其他的结合活性。

附图说明

[图1]示出实施例中使用的环肽的结构。表示环肽的通式中，S表示来自Cys的巯基的硫原子。Xaa表示任意的氨基酸，s为任意的0以上的整数。可变区(Variable region)以单字母记载示出构成环肽的内部结构的氨基酸序列，以小写字母示出的氨基酸(w、y等)分别表示D型的氨基酸(D-Trp、D-Tyr)。序列号1～5示出作为可变区(Variable region)示出的氨基酸序列之中除D型的氨基酸以外的氨基酸序列。

[图2]示出来自人IgG的Fc区的立体结构(PDB ID：1FC1)。以表面模型示出构成Fc区的一条重链(远侧)，以带状模型示出另一条重链(近侧)。能赋予新的特性的外周环结构在以带状模型示出的重链中显示为9处黑色Cα球。

[图3]示出人IgG1的铰链区及Fc区的氨基酸序列(序列号6)。能赋予新的特性的环结构以黑色背景示出。氨基酸编号采用Chothia等的编号。标注下划线的部分示出IgG分子中将Fc区与Fab区连结的铰链区。

[图4]示出从Expi293F细胞中表达·分泌的抗神经纤毛蛋白1抗体(N1 IgG)及其环肽(丛蛋白B1结合肽mP6-9)插入修饰抗体的SDS-PAGE。例如，mP6-9_T1的记载表示将图1中的环肽的mP6-9插入至图2中的T1位点处。

[图5]示出通过FACS评价抗神经纤毛蛋白1抗体(N1 IgG)及其环肽(丛蛋白B1结合肽mP6-9)插入修饰抗体的、与丛蛋白B1表达细胞的结合的结果。肽插入前的野生型N1 IgG的结合直方图以灰色示出，mP6-9插入修饰抗体(插入位点在各面板上部显示)的结合直方图以粗实线示出。

[图6]示出从Expi293F细胞中表达·分泌的抗神经纤毛蛋白1抗体(N1 IgG)及在其B1位点中插入各种环肽而得的修饰抗体的SDS-PAGE。

[图7]示出通过FACS评价抗神经纤毛蛋白1抗体(N1 IgG)及在其B1位点中插入各种环肽而得的修饰抗体的、与对应于环肽的第二靶分子的结合的结果。针对对照细胞的结合直方图以灰色示出，针对表达第二靶分子(关于mP6-9，为丛蛋白B1，关于aMD5，为Met，关于A6-2f，为EGFR，关于trkD5，为TrkB)的细胞的结合直方图以粗实线示出。

[图8]示出从Expi293F细胞中表达·分泌的抗神经纤毛蛋白1抗体(N1 IgG)及其环肽插入修饰抗体的SDS-PAGE(A)、和基于FACS的针对它们的对应靶分子的结合直方图(B)。对于与靶分子的结合而言，得到较之无抗体的直方图(对照，control)的平均荧光强度(mean fluorescence intensity)而言为10倍以上的信号时记为阳性(+)，除此以外则记为阴性(-)。

[图9]示出从Expi293F细胞中表达·分泌的抗PD-L1抗体(Ave IgG)及其环肽插入修饰抗体的SDS-PAGE(A)、和基于FACS的针对它们的对应靶分子的结合直方图(B)。对于与靶分子的结合而言，得到较之无抗体的直方图(对照，control)的平均荧光强度(meanfluorescence intensity)而言为10倍以上的信号时记为阳性(+)，除此以外则记为阴性(-)。

[图10]示出从Expi293F细胞中表达·分泌的抗CD3抗体(OKT3IgG)及其环肽插入修饰抗体的SDS-PAGE(A)、和基于FACS的针对它们的对应靶分子的结合直方图(B)。对于与靶分子的结合而言，得到较之无抗体的直方图(对照，control)的平均荧光强度(meanfluorescence intensity)而言为10倍以上的信号时记为阳性(+)，除此以外则记为阴性(-)。

[图11]示出从Expi293F细胞中表达·分泌的抗转铁蛋白受体抗体(8D3 IgG)及其环肽插入修饰抗体的SDS-PAGE(A)、和基于FACS的针对它们的对应靶分子的结合直方图(B)。对于与靶分子的结合而言，得到较之无抗体的直方图(对照，control)的平均荧光强度(mean fluorescence intensity)而言为10倍以上的信号时记为阳性(+)，除此以外则记为阴性(-)。

[图12]示出从Expi293F细胞中表达·分泌的抗神经纤毛蛋白1抗体(N1 IgG)及其环肽插入修饰抗体的、基于FACS的针对它们的对应靶分子的结合直方图。对于与靶分子的结合而言，将与使这些分子暂时性表达的细胞的结合的阳性率大于10％的情况记为阳性(+)，除此以外则记为阴性(-)。

[图13]示出示明本发明的修饰抗体同时结合两种靶分子的夹心测定体系的原理(A)、和其数据(B)。使用的原始抗体和第一靶分子(抗原)的碱性磷酸酶(AP)融合蛋白质的组合示于图上段，针对涂覆于微量滴定板的环肽的第二靶分子示于图下段，添加的抗体或Addbody名称和得到的AP底物的显色度(A405)示于中段。

[图14]示出利用CD3/Met双特异性抗体(OKT3-Addbody)的异种细胞的粘附诱导试验的原理(A)、和其数据(B、C)。(B)所示的荧光显微镜照片中，将粘附于板上的表达Met的细胞(用红色荧光色素Dil标记)与表达CD3的Jurkat细胞(用绿色荧光色素DiO标记)进行异种细胞粘附的部分以白圈示出，其计数结果(n＝10)示于(C)。

具体实施方式

通过具体实施方式对本发明更具体地进行说明，但本发明不限于以下的具体实施方式，可进行各种变形而实施。

本发明是通过在抗体的Fc区中插入具有针对与该抗体所识别的第一靶分子(也可理解为抗原)不同的第二靶分子的结合能力(也称为结合特异性)的环肽的内部肽序列、从而向抗体赋予针对第二靶分子的结合能力的方法。

根据本发明的方法，能够对识别特定的靶分子的任意的抗体赋予新的结合特异性，得到的修饰抗体不仅具有针对原来的抗体的第一靶分子的结合能力，而且也具有新赋予的环肽的针对第二靶分子的结合能力。

即，本发明的方法中，通过使用环肽的内部序列作为向抗体中插入的肽序列，并将其插入至抗体中，从而能够自由地向抗体赋予其他的结合活性。另外，本发明的方法中，可自由地选择已知针对靶分子具有结合能力的环肽。

作为本发明中使用的环肽，只要是已知针对靶分子具有结合能力的环肽即可，没有特别限定，可使用天然型的环肽，也可使用非天然型的环肽。

此处，作为天然型的环肽，可举出天然存在的环肽、由天然氨基酸构成的环肽等，作为非天然型的环肽，可举出使用非天然氨基酸人工合成的环肽等。

将天然型的环肽呈递至蛋白质上时，使氨基酸残基彼此键合的任何键均可以说是用于形成分子内环状结构的化学交联结构，因此，可采用任何键作为切割分子内环状结构(闭环结构)以使其成为插入的肽序列的键，但以保留被认为是天然型环肽中的活性部位的区域的形态将环肽插入至抗体中。

本发明中，环肽具有针对靶分子的结合能力，但该靶分子与具有供插入的抗体原本具有的结合能力的靶分子不同。

本发明中，将抗体的靶分子称为第一靶分子，将环肽的靶分子称为第二靶分子。第一靶分子与第二靶分子不同。

需要说明的是，也可使用2个以上的同种环肽，但在使用2个以上不同的环肽的情况下，作为具有针对第二靶分子的结合能力的环肽以外的环肽的靶分子，可举出第三靶分子、第四靶分子、或者第三及第四靶分子以外的靶分子等。不同的环肽中，这些环肽具有结合能力的靶分子可以相同，但优选不同。

环肽表示在分子内至少具有由4个以上的氨基酸残基形成的环状结构。由4个以上的氨基酸残基形成的环状氨基酸中的环状结构是在直链状肽中通过将相距2个氨基酸以上的2个氨基酸残基直接或介由接头等结合而在分子内形成的闭环结构。

所谓2个氨基酸残基相距2个氨基酸以上，与在2个氨基酸残基之间存在至少2个氨基酸残基含义相同，2个氨基酸残基介由它们之间的2个以上的氨基酸而结合。

环状结构中的闭环结构没有特别限定，通过2个氨基酸共价结合而形成。

作为2个氨基酸间的共价键，例如，可举出二硫键、肽键、烷基键、烯基键、酯键、硫酯键、醚键、硫醚键、磷酸醚键、偶氮键、C-S-C键、C-N-C键、C＝N-C键、酰胺键、内酰胺桥连、氨基甲酰基键、脲键、硫脲键、胺键、及硫酰胺键等。

2个氨基酸在氨基酸的主链中结合时，经由肽键而形成闭环结构，也可通过2个氨基酸的侧链与侧链、侧链与主链的结合等而形成2个氨基酸间的共价键。

环状结构不限于直链状肽的N末端与C末端的氨基酸的结合，也可通过末端的氨基酸与末端以外的氨基酸的结合、或末端以外的氨基酸彼此的结合而形成。为了形成环状结构而结合的氨基酸中的一个为末端氨基酸、另一个为非末端氨基酸的情况下，环肽具有作为始于环状结构的链状的支链的、使直链的肽呈尾状附接于环状结构而成的结构。

作为形成环状结构的氨基酸，除了蛋白质性氨基酸以外，也包括人造的氨基酸突变体、衍生物，例如，可举出蛋白质性L-氨基酸、具有本领域中已知为氨基酸特征的特性的以化学方式合成的化合物等。

蛋白质性氨基酸(proteinogenic amino acids)以本领域公知的三字母记载表示为Arg、His、Lys、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、Pro、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、及Val。

作为非蛋白质性氨基酸(non-proteinogenic amino acids)，表示蛋白质性氨基酸以外的天然或非天然的氨基酸。

作为非天然氨基酸，例如，可举出主链结构与天然型不同的、α，α-二取代氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、N-烷基-α-氨基酸、D-氨基酸、β-氨基酸、α-羟酸、侧链结构与天然型不同的氨基酸(正亮氨酸、高组氨酸等)、在侧链具有多余的亚甲基的氨基酸(“高(homo)”氨基酸、高苯丙氨酸、高组氨酸等)等、及侧链中的羧酸官能团被磺酸基取代的氨基酸(磺基丙氨酸等)。作为非天然氨基酸的具体例，可举出国际公开第2015/030014号中记载的氨基酸。

形成环状结构的氨基酸的数目只要是4个以上即可，没有特别限定，例如，可以是5个以上、8个以上、10个以上，也可以是30个以下、25个以下、20个以下、15个以下。

作为形成环状结构的氨基酸的数目，优选为4个以上且30个以下，在4个以上且30个以下的范围内，形成环状结构的氨基酸的数目可设为5个以上、8个以上、10个以上，也可设为25个以下、20个以下、15个以下。

形成环状结构的氨基酸的数目可设为8个以上且20个以下，可设为10个以上且20个以下，也可设为10个以上且15个以下。

本发明中使用的环肽是可使用已知的肽合成技术进行制造的环肽。

作为环肽的制造方法，例如，可举出液相法、固相法、将液相法与固相法组合的混合法等化学合成法、基因重组法、利用无细胞翻译系统的翻译合成法等。

本发明中，环肽优选为通过展示型探索系统得到的环肽。通过展示型探索系统，能够选择具有针对靶分子的结合能力的环肽。

环肽可以是通过常规的mRNA展示法制造的肽，可以是通过TRAP法、RaPID法这样的mRNA展示法制造的肽，另外，也可以是通过噬菌体展示法制造的肽。另外，也可以是通过它们的改变方法制造的肽。

环肽包含例如硫醚键或二硫键作为用于形成分子内环状结构的化学交联结构。

通常，就通过RaPID法、TRAP法这样的mRNA展示法、噬菌体展示法选择的环肽而言，硫醚键或二硫键这样的用于形成分子内环状结构的化学交联结构以外的结构大多是具有生理活性的活性位点。

如此，通过将环肽的硫醚键或二硫键置换为与具有环结构的蛋白质形成的键，从而能够将通常通过RaPID法、TRAP法这样的mRNA展示法、噬菌体展示法得到的环肽的高特异性和高亲和性赋予至所期望的蛋白质的所期望的环结构内。另外，并非特别限定，但可通过融合具有硫醚键或二硫键作为分子内环状结构的环肽来使环肽保持通用性地进行融合。

RaPID法中，例如，可制成具有下述表1所示的官能团1的氨基酸、与具有对应的官能团2的氨基酸环化得到的环肽。

官能团1和官能团2中的任一者置于N末端侧均可，可配置在N末端和C末端，可将一方作为末端氨基酸、将另一方作为非末端氨基酸。也可将二者作为非末端氨基酸。

[表1]

式中，X

噬菌体展示法中，可制成Cys彼此结合环化而成的环肽，因此，可制成具有由作为官能团1的-SH与作为官能团2的HS-形成的二硫键的环肽。

作为具有(A-1)的官能团的氨基酸，例如，可使用经氯乙酰化的氨基酸。作为氯乙酰化氨基酸，可举出N-氯乙酰基-L-丙氨酸、N-氯乙酰基-L-苯丙氨酸、N-氯乙酰基-L-酪氨酸、N-氯乙酰基-L-色氨酸、N-3-(2-氯乙酰胺基)苯甲酰基-L-苯丙氨酸、N-3-(2-氯乙酰胺基)苯甲酰基-L-酪氨酸、N-3-(2-氯乙酰胺基)苯甲酰基-L-色氨酸、β-N-氯乙酰基-L-二氨基丙酸、γ-N-氯乙酰基-L-二氨基丁酸、σ-N-氯乙酰基-L-鸟氨酸、ε-N-氯乙酰基-L-赖氨酸、及与它们对应的D-氨基酸衍生物等。

作为具有(A-1)的官能团的氨基酸，优选使用N-氯乙酰基-L-色氨酸及N-氯乙酰基-L-酪氨酸，更优选为D型。

需要说明的是，本说明书中，虽然有时明确记载为L型的情况，但其表示可以是L型，也可以是D型，另外，也可以是L型和D型的任意比例的混合物。关于未明确记载是L型及D型的情况，其也表示可以是L型，也可以是D型，并且也可以是L型和D型的任意比例的混合物。

作为具有(A-2)的官能团的氨基酸，可举出例如半胱氨酸、高半胱氨酸、巯基正缬氨酸、巯基正亮氨酸、2-氨基-7-巯基庚酸、及2-氨基-8-巯基辛酸等。

作为具有(A-2)的官能团的氨基酸，可优选使用半胱氨酸。

利用具有(A-1)的官能团的氨基酸和具有(A-2)的官能团氨基酸的环化方法可举出例如Kawakami,T.等，Nature Chemical Biology 5,888-890(2009)；Yamagishi,Y.等，ChemBioChem 10,1469-1472(2009)；Sako,Y.等，Journal of American ChemicalSociety130,7932-7934(2008)；Goto,Y.等，ACS Chemical Biology 3,120-129(2008)；Kawakami T.等,Chemistry&Biology 15,32-42(2008)、及国际公开第2008/117833号等中记载的方法。

作为具有(B-1)的官能团的氨基酸，例如，可举出炔丙基甘氨酸、高炔丙基甘氨酸、2-氨基-6-庚炔酸、2-氨基-7-辛炔酸、及2-氨基-8-壬炔酸等。

也可使用经4-戊炔酰基(pentynoyl)化、5-己炔酰基(hexynoyl)化的氨基酸。

作为4-戊炔酰基化氨基酸，例如，可举出N-(4-戊烯酰基)-L-丙氨酸、N-(4-戊烯酰基)-L-苯丙氨酸、N-(4-戊烯酰基)-L-酪氨酸、N-(4-戊烯酰基)-L-色氨酸、N-3-(4-戊炔酰胺基)苯甲酰基-L-苯丙氨酸、N-3-(4-戊炔酰胺基)苯甲酰基-L-酪氨酸、N-3-(4-戊炔酰胺基)苯甲酰基-L-色氨酸、β-N-(4-戊烯酰基)-L-二氨基丙酸、γ-N-(4-戊烯酰基)-L-二氨基丁酸、σ-N-(4-戊烯酰基)-L-鸟氨酸、ε-N-(4-戊烯酰基)-L-赖氨酸、及与它们对应的D-氨基酸衍生物等。

作为5-己炔酰基化氨基酸，可举出作为4-戊炔酰基化氨基酸示例的化合物中4-戊炔酰基被5-己炔酰基取代而得的氨基酸。

作为具有(B-2)的官能团的氨基酸，例如，可举出叠氮基丙氨酸、2-氨基-4-叠氮基丁酸、叠氮基正缬氨酸(azidoptonorvaline)、叠氮基正亮氨酸、2-氨基-7-叠氮基庚酸、及2-氨基-8-叠氮基辛酸等。

也可使用叠氮基乙酰化、3-叠氮基戊酰化的氨基酸。

作为叠氮基乙酰化氨基酸，例如，可举出N-叠氮基乙酰基-L-丙氨酸、N-叠氮基乙酰基-L-苯丙氨酸、N-叠氮基乙酰基-L-酪氨酸、N-叠氮基乙酰基-L-色氨酸、N-3-(4-戊炔酰胺基)苯甲酰基-L-苯丙氨酸、N-3-(4-戊炔酰胺基)苯甲酰基-L-酪氨酸、N-3-(4-戊炔酰胺基)苯甲酰基-L-色氨酸、β-N-叠氮基乙酰基-L-二氨基丙酸、γ-N-叠氮基乙酰基-L-二氨基丁酸、σ-N-叠氮基乙酰基-L-鸟氨酸、ε-N-叠氮基乙酰基-L-赖氨酸、及与它们对应的D-氨基酸衍生物等。

作为3-叠氮基戊酰化氨基酸，可举出作为叠氮基乙酰化氨基酸而示例的化合物中的叠氮基乙酰基被3-叠氮基戊酰基取代而得的氨基酸。

利用具有(B-1)的官能团的氨基酸和具有(B-2)的官能团的氨基酸的环化方法可举出例如Sako,Y.等，Journal of American Chemical Society 130,7932-7934(2008)、及国际公开第2008/117833号等中记载的方法。

作为具有(C-1)的官能团的氨基酸，例如，可举出N-(4-氨基甲基-苯甲酰基)-苯丙氨酸(AMBF)及3-氨基甲基酪氨酸等。

作为具有(C-2)的官能团的氨基酸，例如，可举出5-羟基色氨酸(WOH)等。

利用具有(C-1)的官能团的氨基酸和具有(C-2)的官能团的氨基酸的环化方法可举出例如Yamagishi,Y.等，ChemBioChem 10,1469-1472(2009)及国际公开第2008/117833号中记载的方法等。

作为具有(D-1)的官能团的氨基酸，例如，可举出2-氨基-6-氯-己炔酸、2-氨基-7-氯-庚炔酸、及2-氨基-8-氯-辛炔酸等。

作为具有(D-2)的官能团的氨基酸，可举出例如半胱氨酸、高半胱氨酸、巯基正缬氨酸、巯基正亮氨酸、2-氨基-7-巯基庚酸、及2-氨基-8-巯基辛酸等。

利用具有(D-1)的官能团的氨基酸和具有(D-2)的官能团的氨基酸的环化方法可举出例如国际公开第2012/074129号中记载的方法等。

作为(E-1)的氨基酸，例如，可举出N-3-氯甲基苯甲酰基-L-苯丙氨酸、N-3-氯甲基苯甲酰基-L-酪氨酸、N-3-氯甲基苯甲酰基-L-色氨酸、及与它们对应的D-氨基酸衍生物等。

作为(E-2)的氨基酸，例如，可举出半胱氨酸、高半胱氨酸、巯基正缬氨酸、巯基正亮氨酸、2-氨基-7-巯基庚酸、及2-氨基-8-巯基辛酸等。

利用具有(E-1)的官能团的氨基酸和具有(E-2)的官能团的氨基酸的环化方法可参考例如(A-1)和(A-2)的环化方法、(D-1)和(D-2)的环化方法来实施。

作为成环氨基酸，优选具有(A-1)的官能团的氨基酸与具有(A-2)的官能团的氨基酸的组合，更优选H被离去基团取代的N-乙酰基色氨酸与半胱氨酸的组合，进一步优选的是N-卤代乙酰基-D-酪氨酸或N-卤代乙酰基-D-色氨酸、优选N-氯乙酰基-D-酪氨酸或N-氯乙酰基-D-色氨酸与半胱氨酸(Cys)的组合。

本发明中，只要是通过展示型探索系统得到的环肽，即可用作针对规定的靶分子具有结合能力的环肽。

环肽优选为通过RaPID法、TRAP法这样的mRNA展示法、噬菌体展示法制造的环肽。

优选为可通过RaPID法、TRAP法这样的mRNA展示法、噬菌体展示法来适宜地制造的、由官能团1及官能团2形成的环肽。

本发明中，所谓环肽针对靶分子具有结合能力，只要环肽能与靶分子结合则没有特别限定，优选具有与通常抗体针对其靶分子所显示的亲和性值同等的亲和性值(以K

另外，环肽可在对于靶分子具有结合能力的同时作为抑制剂、激活剂发挥功能，也可具有激动剂活性、拮抗剂活性。

作为针对与环肽对应的第二靶分子的结合活性，本发明的修饰抗体具有原来的环肽的与第二靶分子的结合活性的、优选10％以上，例如可具有20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、100％以上。

作为靶分子，可以是第一靶分子，也可以是第二靶分子，另外，也可以是上述以外的靶分子，没有特别限定，可举出细胞表面的分子、例如细胞粘附受体、细胞因子受体、生长因子受体、免疫受体、信号分子受体、G蛋白偶联受体、转铁蛋白受体、转运蛋白、通道分子、或者可溶性分子、例如生长因子、细胞因子、信号分子、转铁蛋白、凝血因子、胞外基质蛋白等。

关于本发明中使用的环肽，在下文中以通过RaPID法制造的环肽为例进行说明。

本发明中，作为通过RaPID法制造的环肽，没有特别限定，可举出以下的通式表示的环肽。

[化学式1]

对于上述通式表示的环肽而言，作为示例，具有表1中记载的官能团1及官能团2为(A)的情况下的结构。

此处，通式中，S表示来自Cys的巯基的硫原子。Xaa表示任意的氨基酸，s为任意的0以上的整数。可变区(Variable region)示出构成环状氨基酸的Cys以外的氨基酸序列。可变区(Variable region)的N末端的氨基酸优选为具有上述(A-1)的官能团的氨基酸。

可变区(Variable region)的氨基酸序列为通过RaPID法制造的环肽中的部分氨基酸序列，只要构成环肽，则可以是任意的氨基酸序列。

作为环肽(Cyclic Peptide，有时记载为“CP”)，使用上述通式表示的肽时，将可变区的N末端的氨基酸残基设为CP

CP

本发明中，将可变区(Variable region)的氨基酸序列的一部分在例如CP

将可通过RaPID法、TRAP法这样的mRNA展示法、噬菌体展示法来适宜地制造的环肽插入至抗体中时，具体而言，也优选进行以下这样的改变。

(1)可将与RaPID法、TRAP法这样的mRNA展示法、噬菌体展示法中的用于形成分子内环状结构的化学交联结构相关的氨基酸残基、例如具有表1中记载的官能团的氨基酸残基(具体而言，为记载为(A-1)～(E-2)的氨基酸)分别置换或删除，将环肽的内部氨基酸序列插入至抗体中。

具体而言，基于RaPID法的环肽中，将具有官能团1的氨基酸残基置换为蛋白质性氨基酸，使具有官能团2的氨基酸残基各自缺失，插入至抗体中。有时可使用D-氨基酸等非蛋白质性氨基酸作为具有官能团1的氨基酸残基。

基于噬菌体展示法的环肽中，可将构成作为化学交联结构的S-S键的Cys残基删除，插入至抗体中。

更具体而言，RaPID法中，采用(A-1)的结构作为官能团1的情况下，一般而言，作为具有(A-1)的结构的氨基酸，多使用ClAc-D-Trp、ClAc-D-Tyr，但在向抗体插入时，优选将该氨基酸残基置换为L-Trp、L-Tyr。另外，可使ClAc-D-Trp、ClAc-D-Tyr缺失。

另外，作为具有(A-2)的结构的氨基酸，多使用Cys，但在向抗体插入时，可使该Cys残基缺失。

(2)可使用(1)中环肽所不具有的、由Ser、Gly及Cys这样的氨基酸残基组成的氨基酸序列作为环肽与抗体的接头序列，插入至来自环肽的氨基酸残基、与来自抗体的氨基酸残基之间。

(3)在将与用于形成分子内环状结构的化学交联结构相关的氨基酸残基变换为L-Cys、将环肽插入至抗体中而得的修饰抗体中，可通过二硫键形成交联结构，并且使用由Ser及Gly这样的氨基酸残基组成的氨基酸序列作为环肽与抗体的结合中的接头序列，插入至来自环肽的氨基酸残基、与来自抗体的氨基酸残基之间。

构成接头序列的氨基酸残基的数目只要是1个以上氨基酸残基即可，氨基酸残基的数目没有特别限定。

所谓环肽的内部肽序列，是构成环肽的肽序列，并且至少包含具有针对靶分子的结合能力的区域即可，没有特别限定。

以下，将环肽的初级序列设为CP

作为环肽，表示为CP

需要说明的是，初级序列中，只要能形成环肽，则Xaa1为任意的氨基酸残基，m为2以上的任意的整数。

环肽可在分子内环状结构以外还具有始于环状结构的链状的支链。

所谓环肽的内部肽序列，可以是CP

另外，环肽的内部肽序列包含表示为CP

此处，m1为m以下的整数。

将环肽的内部肽序列插入至抗体中时，可根据期望而介由接头序列插入至抗体中。

环肽在内部肽序列中包含非蛋白质性氨基酸时，非蛋白质性氨基酸优选被置换为蛋白质性氨基酸，CP

将环肽的内部肽序列插入至抗体中时，来自环肽的氨基酸可在CP

另外，将环肽的内部肽序列插入至抗体中时，来自环肽的氨基酸可在CP

本发明中，作为供环肽的内部肽序列插入的抗体，没有特别限定。

抗体也被称为免疫球蛋白，被分类为IgG、IgM、IgA、IgD、IgE这5种。

本发明中，作为供环肽插入的抗体，可以是IgG、IgM、IgA、IgD、IgE中的任何，可优选使用IgG。

作为IgG，已知有多个亚类。作为IgG的亚类，例如，人中已知IgG1、IgG2、IgG3、IgG4这4种亚类，小鼠中已知IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3这4种，大鼠中已知IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c这4种，可以是任何亚类。

抗体本质上与作为靶分子的唯一一种抗原分子特异性地结合，因此，抗体所识别的抗原可以说是本发明中的第一靶分子。

抗体各自具有重链、轻链各两条，所述重链和轻链具有可以说是识别抗原的部位的可变区、和除此以外的部分即恒定区。

在将抗体用作为蛋白质分解酶的木瓜蛋白酶消化时，连结H链-H链的二硫键(铰链部位)之间被切割，抗体被分成3个片段，将N末端侧的2个片段称为Fab区，将C末端侧的片段称为Fc区。

通常，对于Fc区而言，若为相同的亚类，则其结构在抗体间是相同的。

本发明中使用的抗体包含作为N末端侧的2个片段的Fab区中的至少一个、和Fc区。为包含2个Fab区的抗体的情况下，2个Fab区可以相同或不同，Fab区不同的情况下，抗体所识别的靶分子可以相同或不同。

Fab区不同、抗体所识别的靶分子不同的情况下，将抗体的靶分子作为第一靶分子，保持针对两种靶分子(第一靶分子和与其不同的靶分子)的结合能力，而环肽所具有的针对第二靶分子的结合能力与针对第一靶分子的结合能力不同，虽然也可以是针对与第一靶分子不同的靶分子的结合能力，但优选与针对成为抗体的靶分子的第一靶分子及与其不同的靶分子的结合能力不同。环肽具有针对第二靶分子以外的靶分子的结合能力的情况下，第三靶分子、第四靶分子、或者它们以外的靶分子也同样可与抗体所识别的靶分子即第一靶分子不同。

本发明中，环肽的内部肽序列被插入至抗体的Fc区中。

本发明中，为了插入环肽的内部肽序列，抗体的Fc区中的插入部位没有特别限定，但为了在保持抗体的与第一靶分子的结合能力的状态下赋予环肽的与第二靶分子的结合能力，优选为Fc区中的露出于分子表面的环部分。

环部分优选为Fc区中露出于抗体分子表面的如下结构，其为将2个β折叠股(β-strand)之间连结的多肽链区域，并具有回折结构。

本发明中，向抗体插入环肽时，来自环肽的氨基酸残基与来自抗体的氨基酸残基的结合优选为共价结合。

另外，可在来自环肽的氨基酸残基与来自抗体的氨基酸残基之间插入有成为接头的肽链。

供环肽的内部肽序列插入的环部分在抗体的Fc区中的环结构中没有特别限定，可在保持通用性的前提下选择环结构中的任意的部位。

所谓环结构中的任意的部位，表示用于插入环肽的2个氨基酸残基被从环结构内选出的部位。

使用图2及图3进行说明，但并无特别限定。

图2示出来自人IgG的Fc区的立体结构。以表面模型示出构成Fc区的一条重链(远侧)，以带状模型示出另一条重链(近侧)。

本发明中，作为环肽的插入部位，在图2中示出优选的环部分，作为T1～T3、M1～M3、B1～B3示出的部分即为该部分。

图3示出来自人IgG1的Fc区的氨基酸序列，作为环肽的插入部位，将优选的环部分以黑色背景示出。

关于优选的环部分，可优选举出序列号7所示的来自人IgG1的Fc区的下述部分：

T1(SHEDP、序列号8)：第267～271位；

T2(YNST、序列号9)：第296～299位；

T3(NKALPAP、序列号10)：第325～331位；

M1(VDGV、序列号11)：第279～282位；

M2(KGQ、序列号12)：第340～342位；

M3(SDGS、序列号13)：第400～403位；

B1(TKNQ、序列号14)：第359～362位；

B2(SNG、序列号15)：第383～385位；

B3(QQGNV、序列号16)：第418～422位。

以T1为例，第267～271位在序列号6中相当于第47位～51位，在序列号7中相当于第28位～32位。即，对于作为T2～T3、M1～M3、B1～B3示出的部分而言，在序列号6中，减去220个后的位置的氨基酸与其对应，在序列号7中，减去239个后的位置的氨基酸与其对应。

另外，环肽的插入部位可以是从由氨基酸残基的位置表示的环结构内选择的部位。以T1为例，作为从环结构内选择的部位，可选择第267位和第268位、第268位和第269位、第269位和第270位、第270位和第271位、第267位和第269位、第268位和第270位、第269位和第271位、第267位和第270位、第268位和第271位、第267位和第271位，这些被选择的氨基酸残基的位置可以是抗体中的环肽的内部氨基酸序列的插入部位。

人IgG1以外的抗体中，可将在与序列号6或序列号7所示的氨基酸序列比对时与作为T1～T3、M1～M3、B1～B3示出的部分对应的部分设为环肽的插入部位。

更优选地，序列号7所示的来自人IgG1的Fc区的环部分中，氨基酸残基间的标注了＊符号的位置是插入环肽的更优选部位：

T1(SH＊EDP)：第267～271位；

T2(Y＊NST)：第296～299位；

T3(NKALP＊AP)：第325～331位；

M1(VD＊GV)：第279～282位；

M2(K＊GQ)：第340～342位；

M3(SD＊GS)：第400～403位；

B1(TK＊NQ)：第359～362位；

B2(S＊NG)：第383～385位；

B3(QQ＊GNV)：第418～422位。

通过插入环肽的内部肽序列而与来自环肽的氨基酸残基、或者接头的氨基酸残基进行结合的抗体的环部分的2个氨基酸残基在环结构中可以相邻，也可以是不连续并且在抗体的Fc区中处于在2个氨基酸残基之间存在1～15个氨基酸残基的关系的氨基酸残基。

本发明中，没有特别限定，通过在作为插入部位优选选择的环部分中插入来自不同的环肽的内部肽序列，从而能够除了抗体所具有的固有结合能力以外，还赋予针对环肽具有结合能力的第二、第三、第四、第一～第四以外这样的靶分子的结合特异性。

为了得到多特异性抗体，作为基础的现有抗体可以是任何类型，而只要与第二靶分子的结合能力是已知的，环肽也可以是任何环肽。

使用的抗体、插入的环肽的内部肽序列、及其插入部位可以是任何的组合，因此，只要预先准备与各种抗原进行结合的抗体及环肽，即能够极其简便地创造具有期望的多特异性的修饰抗体。

通过本发明得到的多特异性抗体可作为具有与将2种单一的IgG抗体组合使用的抗体医药同等的效力的医药、同时识别不同的细胞上的靶分子从而诱导异种细胞桥连的医药等各种医药来使用。

作为本发明中使用的抗体，没有特别限定，可举出小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、马抗体、狗抗体、嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体等。

插入环肽的抗体的Fc区优选来自人、小鼠、大鼠、兔、马及狗中的任一者。

对环肽的内部肽序列向本发明中的抗体的Fc区中的插入进行更具体的说明。

本发明中，将与存在于抗体的Fc区中的环肽的内部肽序列进行结合的2个氨基酸残基之中、位于N末端侧的氨基酸残基设为AB

另外，环肽的被插入的内部肽序列也可与AB

AB

不连续的情况下，优选在AB

本发明中，将环肽插入至抗体的Fc区中，赋予插入至抗体中的环肽所具有的针对靶分子的结合能力，为了使环肽插入至抗体的Fc区中，可使用通常的基因工程技术来实施。

本发明中，与使环肽插入至抗体的Fc区中的方法一同，还提供使环肽插入至抗体的Fc区中从而插入有环肽的内部肽序列的修饰抗体及其制造方法。

本发明中的修饰抗体的制造方法为：

作为环肽，选择具有针对与插入的抗体所识别的第一靶分子不同的第二靶分子的结合能力的环肽，优选选择通过展示型探索系统得到的环肽，

从选择的环肽的氨基酸序列中选择插入至抗体中的内部氨基酸序列，选择相当于该内部氨基酸序列的碱基序列，

在抗体的Fc区中选择插入内部氨基酸序列的2个氨基酸残基，

选择相当于抗体的Fc区的氨基酸序列的碱基序列，根据需要，删除与存在于该2个氨基酸残基之间的氨基酸残基相当的碱基序列，插入并组入相当于被选择的环肽的内部氨基酸序列的碱基序列，准备具有如此得到的碱基序列的核酸，

翻译该核酸。

制作插入并组入相当于被选择的环肽的内部氨基酸序列的碱基序列而得的碱基序列时，可插入并组入相当于接头的碱基序列。

作为环肽，优选使用通过RaPID法、TRAP法这样的mRNA展示法或噬菌体展示法选择的环肽，更优选利用mRNA展示法，利用mRNA展示法等，能够容易地理解环肽之中应插入的内部氨基酸序列的碱基序列。

选择与构成抗体的Fc区中的插入环肽的部位的2个氨基酸序列相当的碱基序列、根据需要删除存在于该被选择的碱基序列之间的碱基的方法、准备具有插入并组入相当于被选择的环肽的内部氨基酸序列的碱基序列而得的碱基序列(根据期望也包含相当于接头的碱基序列)的核酸的方法没有特别限定，可以用以往已知的方法来实施。

另外，所准备的核酸的翻译方法是本发明所属技术领域中已然公知的事项，因此，适当应用这些公知的方法实施核酸的翻译即可。

通过本发明得到的修饰抗体在抗体的Fc区中插入有具有针对与该抗体所识别的第一靶分子不同的第二靶分子的结合能力的环肽的内部肽序列，具有针对第一靶分子及第二靶分子的结合能力。

优选同时与第一靶分子及第二靶分子结合，同时与第一靶分子及第二靶分子结合、且第一靶分子及第二靶分子为各自不同的细胞表面分子时，本发明的修饰抗体能够经由与2个不同的细胞表面分子的结合而诱导异种细胞彼此的粘附。

本发明中，例如，通过将癌细胞的抗原作为第一靶标、将T淋巴细胞、NK细胞上的抗原作为第二靶标，从而本发明的修饰抗体能够诱导针对癌细胞的免疫攻击，特异性且高效地伤害、杀死癌。另外，例如，为了基于将治疗用的抗体递送至脑内的目的而使其通过血脑屏障，可将在脑的血管中表达的分子(转铁蛋白受体等)作为第二靶标。

本发明具有下述特性：

(1)不挑选成为基础的现有抗体(规定第一结合特异性)的IgG型、抗原特异性；

(2)不包括以抗体自身的部分随机序列文库为基础的选择步骤；

(3)作为最终产物的修饰抗体的制造步骤和效率与原来的野生型抗体等同；

(4)只要是能通过RaPID法等得到以高亲和性进行结合的环肽的对象，则任何蛋白质均可作为多特异性的靶标；并且

(5)能够向现有抗体同时赋予最多9个独立的追加结合特异性。

以下，给出实施例来具体地说明本发明，但本发明不限于以下的实施例。

针对靶蛋白质的高亲和性的环肽是通过基于国际公开第2011/049157号及日本特开2013-46637号公报等实施RaPID系统而得到的。使用了分别与作为来自人的受体的丛蛋白B1、Met、EGF受体、及TrkB特异性结合的环肽。环肽的结构示于图1。

图1中，将来自各环肽的可变部序列插入至抗体的Fc区中。其中，作为氨基酸序列的N末端氨基酸，将以小写字母表示为w及y的D-氨基酸分别置换为L-氨基酸、或者使其缺失，导入Fc区中。在插入时，以夹持上述的可变部序列的形式追加0～4个残基的接头序列。

〔实施例1〕向神经纤毛蛋白1抗体赋予丛蛋白B1结合特异性

1.肽插入的设计

为了在保持靶标结合活性的状态下将环肽的内部序列呈递至抗体的Fc区，参考抗体的Fc区的立体结构探索了插入部位。从Fc区中选择9处在分子表面露出、将二级结构部分连结的环部分。选择的环部分示于图2。选择的环为Fc区的接近铰链的顶端(Top)部分中3处(T1～3)，中间(Middle)部分中3处(M1～3)，底端(Bottom)部分中3处(B1～3)。它们在全长Fc氨基酸序列上的位置示于图3。

2.双特异性抗体的制备

成为肽插入的基础的抗体使用了针对神经纤毛蛋白1的N1抗体(克隆别名YW64.3)(Liang等，J.Mol.Biol.2007)。将N1抗体的重链可变部与编码人IgG1重链恒定部的DNA连接，将其组入表达载体p3XFLAG-CMV-14(Sigma-Aldrich公司制)。对于轻链而言，将编码其全长的DNA组入相同的p3XFLAG-CMV-14载体中。

以N1重链表达载体为基础，制作在图3所示的Fc区内的9个环结构的中央附近(＊)插入mP6-9肽序列而得的表达载体。插入序列部分使用延伸PCR(extension PCR)法扩增。如此得到的肽插入型抗体分别如N1 IgG(mP6-9_T1)这样记载为“抗体名称(环肽名称_插入位点)”。

将Expi293F细胞(Thermo Fisher Scientific公司制)使用3mL的Expi293Expression Medium(Thermo Fisher Scientific公司制)以细胞成为3x10

基因导入后，在37℃、8％CO

向回收的培养上清液0.3mL中添加30μL蛋白A-Sepharose(Thermo FisherScientific公司制)，旋转混合2小时。通过离心分离使Sepharose沉淀，除去上清液，使用1mL的Tris缓冲盐液(TBS，20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5)将Sepharose洗涤3次，加入20μL的SDS加样缓冲液，于95℃加热2分钟，然后洗脱试样。将洗脱的试样中的5μL在还原条件下供于电泳，使用考马斯亮蓝染色。

电泳的结果示于图4。图4中，样品编号以圆圈数字示出。N1 IgG(样品编号1)在预想相当于重链和轻链的条带的分子量(50kDa及25kDa)的位置处观察到条带，全部的肽插入型抗体(样品编号2～10)的重链显示略高于其的分子量，就总体氨基酸长度而言与16～17个残基长度呼应。均确认到从Expi293F细胞中表达·分泌不逊于N1 IgG(其中未插入肽)的量的插入型抗体。

3.向神经纤毛蛋白1抗体赋予丛蛋白B1结合能力

针对向Fc上的各种位置插入mP6-9肽而得的N1 IgG，为了调查是否保持了环状的mP6-9肽所具有的针对丛蛋白B1的结合能力，实施了基于流式细胞术的结合试验。使N1 IgG及9种mP6-9肽插入体的表达上清液与稳定表达丛蛋白B1的细胞(记载于Cell Chem.Biol，2016，23，1341-1350)反应，将结合的IgG使用AlexaFluor488标记山羊抗人IgG二抗(ThermoFisher公司制)染色，使用EC800型流式细胞仪(SONY公司制)进行分析。

流式细胞术的结果示于图5。未修饰的N1抗体仅仅与稳定表达丛蛋白B1的细胞进行背景水平的轻微结合(面板1，图中以圆圈数字示出)，而插入了mP6-9的全部N1抗体显示其1.5～10倍的结合量，表明这些抗体全部在神经纤毛蛋白1的基础上还新获得了针对丛蛋白B1的结合特异性。

〔实施例2〕向神经纤毛蛋白1抗体赋予各种结合特异性

1.肽插入的设计和抗体的制备

作为肽插入位置，采用实施例1所示的“B1环”，按照实施例1的方法向其中插入图1所示的4种环肽的内部序列，使用所得的表达载体，与实施例1同样地实施了重组抗体的制备和其表达评价。

电泳的结果示于图6。图6中，样品编号以圆圈数字示出。N1 IgG(样品编号1)在预想相当于重链和轻链的条带的分子量(50kDa及25kDa)的位置处观察到条带，在全部的肽插入型抗体(样品编号2～10)中，重链显示略高于N1 IgG(样品编号1)重链的分子量，就总体氨基酸长度而言与17～21个残基长度呼应。均确认到从Expi293F细胞中表达·分泌不逊于N1 IgG(其中未插入肽)的量的环插入型抗体。

2.向神经纤毛蛋白1抗体赋予各种结合能力

针对插入了各种肽的N1 IgG，为了调查是否保持了各环肽所具有的分子结合能力，实施了基于流式细胞术的结合试验。使N1 IgG的4种肽插入体的表达上清液与对照的HEK293细胞(mock cell)或表达各种受体的细胞反应，将结合的IgG使用AlexaFluor488标记山羊抗人IgG二抗(ThermoFisher公司制)染色，使用EC800型流式细胞仪(SONY公司制)进行分析。

流式细胞术的结果示于图7。使用的受体表达细胞为稳定表达丛蛋白B1的细胞(面板1，图中以圆圈数字示出。)、稳定表达Met的细胞(面板2)、EGFR暂时性表达细胞(面板3)、TrkB暂时性表达细胞(面板4)。全部的肽插入型N1抗体中，得到了与对照细胞相比、针对表达各靶分子的细胞明确增大的结合直方图，表明通过插入肽能够向神经纤毛蛋白1抗体赋予新的环肽结合物的结合特性。

〔实施例3〕向各种抗体赋予各种结合特异性

1.双特异性抗体的制备

除了实施例1及2中使用的神经纤毛蛋白1抗体以外，使用两种人IgG1型抗体(人PD-L1抗体阿维单抗(Avelumab)及人CD3抗体OKT3)和1种小鼠IgG1型抗体(小鼠转铁蛋白受体抗体8D3)，制作肽插入型双特异性抗体。阿维单抗、OKT3、8D3的可变部氨基酸序列分别利用WO2013079174A1、Arakawa等，J Biocheme 1996、Boado等，Biotech Bioeng.2008中记载的序列，合成对应的DNA，与实施例1同样地将重链和轻链组入表达载体p3XFLAG-CMV-14(Sigma-Aldrich公司制)。其中，关于8D3，重链及轻链的恒定区使用了来自小鼠IgG1的序列。

2.基于神经纤毛蛋白1抗体的双特异性抗体的评价

通过实施例2所示的方法实施向N1 IgG的B1环中插入Met结合性肽序列(aMD5)及EGF受体结合序列(A6-2f)而得的抗体的重组表达。电泳的结果示于图8A。肽插入体显示出与未插入的N1抗体相同程度的表达效率。它们与靶分子的结合通过与实施例2同样的流式细胞术进行评价。

流式细胞术的结果示于图8B。结果，观察到作为N1抗体的第1结合特异性的与神经纤毛蛋白1的结合相对于使神经纤毛蛋白1暂时性表达的HEK细胞而言是同等的(第二段的面板(panel))，表明没有由于肽插入而丧失原始的结合特性。此外，将aMD5或者A6-2f肽插入至B1环中而得的突变型抗体各自在Met(第三段的面板)及EGF受体表达细胞(第四段的面板)中显示强阳性信号，能够确认成功构建了双特异性抗体。

3.基于PD-L1抗体阿维单抗的双特异性抗体的评价

通过与实施例2所示方法相同的方法，实施向阿维单抗IgG的B1或B2环中插入丛蛋白B1结合性肽序列(mP6-9)、Met结合性肽序列(aMD5)及EGF受体结合序列(A6-2f)而得的抗体的重组表达。电泳的结果示于图9A。肽插入体显示出与未插入的阿维单抗抗体相同程度的表达效率。它们与靶分子的结合通过与实施例2同样的流式细胞术进行评价。

流式细胞术的结果示于图9B。结果，观察到作为阿维单抗抗体的第一结合特异性的与PD-L1的结合相对于恒定表达PD-L1的细胞株(人乳腺癌细胞MDA-MB-231)而言是同等的(第二段的面板)，表明没有由于肽插入而丧失原始的结合特性。此外，将mP6-9、aMD5或者A6-2f肽插入至B1或B2环而得的突变型抗体各自在稳定表达丛蛋白(Plexin)B1的细胞(第三段的面板)、稳定表达Met的细胞(第四段的面板)及EGF受体暂时性表达细胞(第五段的面板)中显示强阳性信号，能够确认成功构建了双特异性抗体。

4.基于CD3抗体OKT3的双特异性抗体的评价

通过与实施例2所示方法相同的方法，实施向OKT3 IgG的B2环中插入丛蛋白B1结合性肽序列(mP6-9)或者Met结合性肽序列(aMD4)而得的抗体的重组表达。电泳的结果示于图10A。肽插入体显示出与未插入的OKT3抗体相同程度的表达效率。它们与靶分子的结合通过与实施例2同样的流式细胞术进行评价。

流式细胞术的结果示于图10B。结果，观察到作为OKT3抗体的第一结合特异性的与人CD3的结合相对于恒定表达CD3的细胞株(Jurkat细胞)而言是同等的(第二段的面板)，表明没有由于肽插入而丧失原始的结合特性。此外，将mP6-9、或者aMD4肽插入至B2环而得的突变型抗体各自在稳定表达丛蛋白B1的细胞(第三段的面板)、稳定表达Met的细胞(第四段的面板)中显示强阳性信号，能够确认成功构建了双特异性抗体。

5.基于转铁蛋白受体抗体8D3的双特异性抗体的评价

针对作为小鼠IgG1的8D3抗体，参考图3在小鼠重链中确定相当于B1～B3的环位置，通过与实施例1同样的方法制备插入有丛蛋白B1结合性肽序列(mP6-9)的表达载体后，与轻链(小鼠kappa链)的表达载体一同转染至Expi293F细胞。使用蛋白G-Sepharose(Thermo Fisher Scientific公司制)使表达分泌至上清液中的重组抗体沉降，通过电泳进行分析。

电泳的结果示于图11A。肽插入体显示出与未插入的8D3抗体相同程度的表达效率。为了评价它们与靶分子的结合，实施了基于流式细胞术的结合试验。使8D3 IgG及3种肽插入体的表达上清液与表达各种受体的细胞反应，将结合的小鼠IgG使用AlexaFluor488标记山羊抗小鼠IgG二抗(ThermoFisher公司制)染色，使用EC800型流式细胞仪(SONY公司制)进行分析。

流式细胞术的结果示于图11B。结果，观察到作为8D3抗体的第一结合特异性的与小鼠转铁蛋白受体的结合相对于暂时性表达TfR的细胞(TfR细胞)而言是同等的(第二段的面板)，表明没有由于肽插入而丧失原始的结合特性。此外，将mP6-9肽插入至B1～B3环而得的突变型抗体在稳定表达丛蛋白B1的细胞(第三段的面板)中显示强阳性信号，能够确认成功构建了双特异性抗体。

6.基于神经纤毛蛋白1抗体的多特异性抗体的评价

评价了将此前个别尝试的各种特异性的赋予向一个抗体同时实施2种以上的情况的活性。使用N1 IgG，向其各种环中插入丛蛋白B1结合性肽序列(mP6-9)、Met结合性肽序列(aMD4)、及EGF受体结合序列(A6-2f)的各种组合，通过实施例2所示的方法实施所得抗体的重组表达，它们与靶分子的结合通过与5.之前同样的流式细胞术进行评价。

流式细胞术的结果示于图12。结果，观察到作为N1抗体的第一结合特异性的与神经纤毛蛋白1的结合相对于使神经纤毛蛋白1暂时性表达的HEK细胞而言是同等的(第二段的面板)，再次表明没有由于肽插入而丧失原始的结合特性。此外，插入mP6-9、aMD4或者A6-2f肽而得的突变型抗体各自针对使丛蛋白B1(第三段的面板)、Met(第四段的面板)、及EGF受体(第五段的面板)分别暂时性表达的HEK细胞显示强阳性信号，并且其结合不依赖于插入位点或同时插入的其他肽的存在。作为结果，可以确认这些修饰抗体除了原来的单一的抗原特异性以外，还在插入1种肽后能够获得双特异性，在插入2种肽后能够获得三特异性，并在插入3种肽后能够获得四特异性。

〔实施例4〕肽插入型IgG的双靶标同时结合能力的确认

1.夹心型分子间桥连试验的原理和靶抗原的制备

针对肽插入型IgG，至实施例3为止示出了第一结合特异性及第二结合特异性的个别评价，为了示明肽插入型IgG能够同时与2个靶标结合，构建了夹心ELISA型的分析体系。原理示于图13A。首先以Protein Exp.Purification，2014，95，240-247中记载的方法为基准，制作编码在3种第二靶抗原(全部为单次跨膜型受体)的胞外区的C末端附加PA标签(和光纯药工业公司制)而得的融合蛋白质的构建体，将其组入表达载体pcDNA3.1(ThermoFisher Scientific公司制)。使用该载体，利用与实施例1同样的方法使其在Expi293F细胞中暂时性表达，制备分别含有作为可溶性受体片段的丛蛋白B1-PA、Met-PA、及EGFR-PA的培养上清液，将它们使用ProteinA Sepharose纯化。对于第一抗原侧而言，使用AP融合表达载体pAPtag-5(GenHunter公司)，将其胞外区的序列融合至AP的N末端(神经纤毛蛋白1及PD-L1)或者C末端(转铁蛋白受体)，利用与实施例1同样的方法使其在Expi293F细胞中暂时性表达，制备了各自含有作为可溶性受体-AP融合物的Nrp-1ec-AP、PD-L1ec-AP、及AP-TfRec的培养上清液。

2.夹心型结合试验

对于基于肽插入型IgG的靶分子间的桥连而言，基于图13A所示的原理，按照以下的方案进行评价。

(1)将稀释为10μg/mL的纯化第二靶抗原溶液50μL添加至96孔板，于4℃静置16小时。

(2)用抽吸器抽吸，加入200μL/孔的5％脱脂奶(在Tris缓冲盐液中)(TBS；20mMTris-HCl，150mM NaCl，pH 7.5)，于室温静置1小时。

(3)加入50μL的各种Addbody表达上清液，于室温静置1小时。

(4)使用200μL/孔的TBS洗涤3次。

(5)加入50μL表达AP融合第一靶抗原的上清液，于室温静置30分钟。

(6)使用200μL/孔的TBS洗涤4次。

(7)以100μL/孔添加显色底物(磷酸酶底物，Sigma-Aldrich公司制)，于室温静置5～60分钟后，测定各孔中的溶液的405nm的吸光度。

结果示于图13B。神经纤毛蛋白抗体N1、PD-L1抗体阿维单抗、及转铁蛋白受体抗体8D3的全部中，肽插入型IgG被将各自的第二靶抗原固定化而得的板捕获，与之后添加的第一靶抗原-AP融合蛋白质结合而使底物显色(灰色棒)。另一方面，未插入肽的未修饰IgG未给出阳性信号(黑色棒)。这表明各Addbody能够与第一靶标及第二靶标同时结合，而非个别地与它们结合。

〔实施例5〕利用肽插入型IgG的异种细胞间粘附的诱导

1.异种细胞间粘附试验的原理和细胞的制备

肽插入型IgG的第一靶分子及第二2靶分子为存在于不同的细胞上的受体时，可期待肽插入型IgG诱导异种细胞间的接近及粘附的效果。为了对此进行调查，使用向CD3抗体OKT3的B2环中插入作为Met结合物的aMD4肽序列而得的OKT3(aMD4_B2)，基于如图14A所示的原理实施了实验。使用了来源于人急性T细胞性白血病的细胞株Jurkat作为表达CD3的细胞，使用了稳定且高表达人Met受体的中国仓鼠卵巢细胞(Met-CHO细胞)作为表达Met的细胞。将Met-CHO细胞使用红色荧光色素DiD(Biotium公司制)标记，接种于96孔板中，在添加有10％血清的培养基中培养3小时，使其粘附。将Jurkat细胞使用绿色荧光色素Neuro DiO(Biotium公司制)标记后，使其与通过与实施例3同样的方法制备的野生型OKT3或肽插入型OKT3(aMD4_B2)表达上清液在冰上反应30分钟，洗涤1次，然后接种至上述Met-CHO细胞上。在含有1mg/ml的BSA的无血清培养基中培养17小时后，在200μL/孔的无血清培养基中洗涤2次，使用数字荧光显微镜(BZ-X700，KEYENCE公司制)记录荧光及相位差图像。

结果的照片示于图14B。红色荧光图像(激发波长620nm，荧光波长700nm)中粘附于板的Met-CHO细胞、绿色荧光图像(激发波470nm，荧光波长525nm)中粘附于板或Met-CHO细胞上的Jurkat细胞分别被可视化。将两张图像叠放，用白圈标出异种细胞彼此的粘附部位(即红色和绿色的细胞重叠的部分)。另外，从多个孔选择合计10个视野来对粘附于Met-CHO细胞的Jurkat细胞的每单位面积的数量进行定量的图示于图14C。由此表明，肽插入型OKT3同时识别Met-CHO细胞上的Met分子和Jurkat细胞上的CD3分子，利用其相互作用而使两种细胞之间桥连。