一种从桂花果皮中提取多酚类物质的方法及应用

摘要

本发明公开了一种从桂花果皮中提取多酚类物质的方法及应用，具体而言，该制备方法包含以下步骤：a)取桂花果皮，干燥至水分质量分数含量为9％‑13％，粉碎，过筛，得桂花果皮干粉；b)取桂花果皮干粉按物料比1∶35‑1∶45，采用体积分数为50％‑75％的乙醇水溶液，在温度低于40℃、微波功率为400W‑600W的条件下萃取32‑60min，得到桂花果皮多酚提取物。在多酚提取物干粉浓度0.5mg/mL‑2mg/mL时，对酪氨酸酶抑制率在50％‑75％左右，因此制得的桂花果皮多酚提取物可用于制备酪氨酸酶抑制剂，用于具有抗老年斑和美白活性的化妆品、食品、保健品以及抑制食品褐变的保鲜剂中。

说明书

技术领域

本发明涉及生物制剂的技术领域，具体涉及一种从桂花果皮中提取多酚类物质的方法及该提取物作为酪氨酸酶抑制剂的应用。

背景技术

桂花为木犀科(Osnzanthus fragrans Lour.)木犀属(Osmanthus)植物，又名木犀，是我国十大传统名花之一。桂花每年8月份开花，次年4月份结果，果实为紫黑色椭圆形，4月中下旬成熟，最外层为外果皮，成熟后由青绿色渐变为紫黑色，果肉部分为绿色，角质化的硬壳为内果皮，其中包被着种子。《本草纲目》记载：桂花籽，味甘、辛，性温，能暖胃、平肝、益胃、散寒，《植物名实图考长编》记载桂籽能治心痛，《江苏药材志》记载桂花籽“暖胃，平肝，益肾，散寒”，民间用作止痛剂，治肝胃气痛。桂花果中含有环烯醚萜苷、色素、多羟基酚类、多糖、红景天苷、齐墩果酸等多种化合物，具有抗氧化、抗血栓等活性。多酚是植物的次生代谢产物，广泛存在于水果、蔬菜以及植物衍生食品中基于多酚化学结构的复杂性，可以将其分为黄酮类化合物和非黄酮类化合物。具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保护皮肤等功效。

酪氨酸酶又称多酚氧化酶(PPO)，是一种广泛存在于动植物、微生物和人体内的含铜金属氧化还原酶，是一种活性中心含有双核铜离子的氧化还原酶。酪氨酸酶是黑色素合成反应的限速酶，黑色素过度积累会导致果蔬褐变、皮肤色斑和黑色素瘤形成，而酪氨酸酶活性大小同生物体中黑色素生成量密切相关。在人体中，黑色素的合成、分布影响了皮肤的颜色。过量的黑色素积累导致黄褐斑等各种皮肤病，因此减少黑色素合成为美白祛斑的主要方法。酪氨酸酶是1种含有铜离子的氧化酶，为体内黑色素生物合成的关键酶。抑制酪氨酸酶的合成、抑制酪氨酸酶向黑素小体转运以及抑制酪氨酸酶活性是减少黑色素合成的有效方法，天然的酪氨酸酶抑制剂包括曲酸、氢醌、熊果苷、鞣花酸、白藜芦醇、芦荟苦素等已被广泛应用于研究果蔬保鲜剂，化妆品美白剂。桂花果实包括果皮及种子，民间用作止痛剂，治肝胃气痛，桂花果中含有环烯醚萜苷、色素、多羟基酚类、多糖、红景天苷、齐墩果酸等多种化合物，具有抗氧化、抗血栓等活性。目前尚未有针对桂花果皮多酚抑制酪氨酸酶活性抑制剂开发研究，为今后开发桂花果保健品、食品、化妆品等方面提供可靠依据，同时解决桂花果资源浪费问题及桂花果对城市街道卫生环境污染难题，促进桂花产业集约化发展。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从桂花果皮中提取多酚类物质的方法；还提供由该方法制得的多酚提取物及该多酚提取物作为酪氨酸酶抑制剂的应用，为桂花果资源的开发利用提供实验依据，同时研究出一种天然来源的经济、安全的酪氨酸酶抑制剂。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种从桂花果皮中提取多酚类物质的方法，所述提取方法包括以下步骤：

a)取桂花果皮，干燥至水分质量分数含量为9％-13％，粉碎，过筛，得桂花果皮干粉；

b)取桂花果皮干粉按物料比1∶35-1∶45，采用体积分数为50％-75％的乙醇水溶液，在温度低于40℃、微波功率为400W-600W的条件下萃取32-60min，得到桂花果皮多酚提取物。

优选的，步骤a)中所述干燥的温度低于45℃。

优选的，所述桂花果皮多酚提取物的主要组分为奎宁酸、芦丁、番石榴苷、白藜芦醇苷、原儿茶醛、金丝桃苷。

2、由所述方法获得的桂花果皮多酚提取物。

3、所述桂花果皮多酚提取物作为酪氨酸酶抑制剂的应用。

本发明中，所述应用为以桂花果皮多酚提取物作为活性成分，用于抗老年斑和美白活性的化妆品、食品、保健品，或抑制食品褐变的保鲜剂中。

本发明的有益效果在于：从桂花果皮原料中提取出桂花果皮多酚，并对其进行酪氨酸酶活性抑制实验，通过体外抑制酪氨酸酶活性研究发现，桂花果皮多酚提取物干粉浓度在 0.5mg/mL-2mg/mL时，对酪氨酸酶抑制率在50％-75％左右，与熊果苷活性相比，同样具有抑制酪氨酸酶活性作用。桂花果实成熟之后，散落在地，不仅造成城市环境污染，同时增加了城市环卫工人的负担。近几年，植物资源的副产物综合开发利用备受关注，从开发酪氨酸酶抑制剂这一观点出发，为食品添加剂、化妆品、饲料添加剂奠定基础，同时解决了桂花果资源再利用的问题。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为没食子酸的Folin-Ciocalteus反应标准曲线；

图2为桂花果皮多酚提取物HPLC-MS/MS色谱图；

图3为不同浓度的桂花果皮多酚提取物和熊果苷对酪氨酸酶的抑制作用(XGG为熊果苷， GHPDF为桂花果皮多酚提取物)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、桂花果皮中多酚类物质的提取

桂花果采摘自重庆市药物种植研究所内，经重庆市药物种植研究所刘正宇研究员鉴定为八月桂(Osmanthus fragrans)桂花果实，将采收的桂花果清洗干净，去籽留果皮，至真空干燥箱内45℃真空干燥，干燥至水分质量分数含量为9％，粉碎并过60目筛，得到桂花果皮干粉备用。

以干燥后的桂花果皮干粉为原材料，按物料比1∶35，采用浓度为75％的乙醇水溶液，在温度为40℃的条件下微波功率400W，萃取32min，得到桂花果皮多酚提取物。

为了便于保存再将桂花果皮多酚提取物于45℃减压浓缩，冷冻干燥后得到粉末状的桂花果皮多酚提取物。

本实施例中果皮的含水量在分数含量为9％-13％，物料比在1∶35-1∶45，乙醇水溶液体积分数在50％-75％，萃取在温度低于40℃，微波功率为400W-600W的条件下萃取32-60min，均可实现发明目的。

实施例2、桂花果皮多酚提取物中总多酚含量测定

采用福林酚显色法对提取物中的多酚显色，确定总多酚含量：吸取0.1mg/mL没食子酸对照品溶液0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mL于具塞试管内，加入1.5mL福林酚试剂，混匀静止5min，加入2mL 10％Na

没食子酸的Folin-Ciocalteus反应标准曲线如图1。没食子酸质量浓度在0-0.32mg/mL时，吸光值A765nm与标准液浓度有良好的线性关系，以吸光度(A)对没食子酸质量浓度(X)进行回归，得方程为Y＝3.2998X-0.162(R

实施例3、桂花果皮多酚提取物组分测定

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm)，流动相A：0.25％甲酸水；流动相B：0.25％甲酸乙腈溶液，流速：0.3mL/min，进样量：10uL，柱温：35℃，洗脱条件见表1；选取实施例1制得的未经减压浓缩的桂花果皮多酚提取物，经离心、过滤后作为进样品。

表1.洗脱条件

PDA检测：200～360nm连续扫描；质谱检测：多反应监测(MRM)检测条件：喷雾电压2.0kv，锥孔电压30v，脱溶剂温度500℃，脱溶剂气(N2)1000L/h；质谱扫描条件：ESI+模式，喷雾电压2.0kv，锥孔电压30v，脱溶剂温度500℃，脱溶剂气(N2)1000L/h，扫描范围： 100～1000m/Z；ESI-模式：喷雾电压2.0kv，锥孔电压30v，脱溶剂温度500℃，脱溶剂气 (N2)1000L/h；扫描范围：100～1000m/Z；桂花果皮多酚提取物HPLC-MS/MS色谱图见图2，多酚组分数据见表2。由表2可知，桂花果皮多酚提取物中主要组分为奎宁酸、芦丁、番石榴苷、白藜芦醇苷、原儿茶醛、金丝桃苷等，其中白藜芦醇苷、原儿茶醛、金丝桃苷等具有美白活性。

表2、桂花果皮提取物中多酚各组分含量

实施例4、桂花果皮多酚提取物对酪氨酸酶活力的影响

称取冷冻干燥后粉末状桂花果皮多酚提取物0.2g，定容至25mL，采用二倍稀释法，浓度梯度为0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8mg/mL。吸取不同浓度样品50μL置96孔酶标板中，加入90μLPBS(0.1mol/L pH6.8)，加体积分数为0.03％酪氨酸10μL。于37℃的恒温箱孵育15min，加10μL的酪氨酸酶(350U/mL)水溶液，将溶液混合均匀，置于37℃的恒温箱反应25min后，用酶标仪于475nm测定吸光度(A)；样品空白组处理以等体积的PBS代替酪氨酸酶溶液，用紫外分光光度计于475nm测定吸光度(B)；阳性对照组以等体积的蒸馏水代替多酚提取物溶液，用紫外分光光度计于475nm测定吸光度(C)；阴性对照组以等体积蒸馏水代替多酚提取物溶液，并以等体积PBS代替酪氨酸酶溶液，用紫外分光光度计于475nm测定吸光度(D)。同时，以熊果苷浓度梯度为0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8mg/mL作为阳性对照组。每个浓度多酚提取物溶液实验重复3次。抑制率计算如下公式。抑制率(％) ＝[(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100％。将所得数据导入GraphPad Prism 8.3.0进行绘图，通过酶活力，计算半抑制率IC50值。

固定酪氨酸浓度和酶浓度，测定不同浓度桂花果皮多酚提取物对酪氨酸酶影响。由图3 可知，桂花果皮中的多酚提取物对酪氨酸酶具有一定的抑制性，随着多酚提取物浓度的升高，对酪氨酸酶抑制率升高，在多酚提取物干粉浓度为0.5mg/mL-2mg/mL时，对酪氨酸酶抑制率在50％-75％左右；熊果苷抑制率最高在60％-80％左右，当多酚提取物浓度升高到4mg/mL时，随着多酚提取物浓度升高，对酪氨酸酶抑制作用减弱，IC50值为0.3527mg/mL。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。