一种多肽体外促进人骨髓间充质干细胞成骨分化的用途

摘要

本发明公开了一种多肽体外促进人骨髓间充质干细胞成骨分化的用途。本发明发现序列为NH2‑GHPYYSIKKS‑COOH的多肽具有体外促进人骨髓间充质干细胞成骨分化的活性，可以开发成体外促进人骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导培养基。

说明书

技术领域

本发明属于干细胞领域，涉及一种多肽体外促进人骨髓间充质干细胞成骨分化的用途。

背景技术

骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓中的一种多能干细胞，具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向诱导分化能力，具有来源广泛、获取简单、易于培养、体外增殖能力强和自体移植无排斥反应等特点，广泛应用于组织工程及再生医学领域，被公认为是骨组织工程最为常用的种子细胞。

寻找促进BMSC骨形成的诱导因素已成为近年来的研究热点，主要包括化学药物、细胞因子、物理刺激、中药及其提取物等，其中：化学药物目前常用的有地塞米松和雌激素等，细胞因子目前常用的有骨形态发生蛋白、转化生长因子β和碱性成纤维因子等，物理刺激包括机械应力、电磁场和超声波等。

更多促进BMSC骨形成的诱导物质在不断研究和发现中。苦瓜多肽MC2为从苦瓜中分离得到的一种多肽，活性结果显示其具有降血糖活性(金晶等，苦瓜多肽MC2的合成和降血糖活性，中国天然药物，2011年1月第9卷第1期)。苦瓜多肽MC2的序列如下：

NH

发明内容

本发明旨在提供一种多肽体外促进人骨髓间充质干细胞成骨分化的用途。

实现本发明目的的技术方案为：

一种多肽体外促进人间充质干细胞成骨分化的用途，该多肽的序列为：

NH

进一步地，所述人间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞。

上述多肽制备体外促进人间充质干细胞成骨分化的培养基的用途。

进一步地，所述人间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞。

有益效果：

本发明发现序列为NH

附图说明

图1为Westernblot检测结果；

图2为茜素红染色结果。

具体实施方式

一、材料和方法

1、试验材料

人骨髓间充质干细胞购自上海中乔新舟生物科技有限公司，原代细胞，品牌为ScienCell。

人骨髓间充质干细胞完全培养基购自武汉益普生物科技有限公司，品牌为Procell。

苦瓜多肽MC2的序列如下所示，纯度≥98％：

NH

2、BMSCs细胞培养

将人骨髓间充质干细胞复苏后用人骨髓间充质干细胞完全培养基于37℃、5％CO

3、分组和诱导培养

取第3代生长状态良好的人骨髓间充质干细胞，用人骨髓间充质干细胞完全培养基制成细胞悬液，然后接种于12孔培养板，每孔2.5×10

4、成骨分化检测

4.1Western blot检测成骨蛋白Runx2、OCN表达

按照“分组和诱导培养”中的方法分组、培养，其中，诱导组包括低浓度诱导组(多肽浓度为10μg/mL)和高浓度诱导组(多肽浓度为20μg/mL)。继续培养14d后，消化收集细胞，PBS洗涤，RIPA裂解液冰上裂解，离心收集上清液，BCA法测定蛋白浓度。取50μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳，并转移至PVDF膜上，经5％脱脂奶粉封闭，分别加入Runx2、OCN、GAPDH一抗于4℃孵育过夜，次日用TBS-T洗涤液洗膜，加入二抗室温孵育1h，ECL法进行显色、曝光，用图像分析软件Image J进行灰度分析。

4.2茜素红染色检测钙结节形成

按照“分组和诱导培养”中的方法分组、培养，其中，诱导组多肽浓度为20μg/mL。继续培养9d后，经4％多聚甲醛固定30min，茜素红S染色，显微镜观察，拍照。

二、试验结果

1、成骨蛋白Runx2、OCN表达水平

如图1所示，与常规组相比，不同浓度的诱导组人骨髓间充质干细胞中成骨蛋白Runx2、OCN表达水平均显著上调，且高浓度诱导组表达水平明显高于低浓度诱导组表达水平。Runx2、OCN是成骨标志性蛋白，其中：Runx2是成骨分化和骨形成过程中关键的转录因子，是骨形成过程中早期并最具特征性的标志蛋白；OCN是由成熟成骨细胞分泌的最丰富的非胶原蛋白之一，是成骨细胞分化晚期的特异性指标。可见不同浓度诱导组的人骨髓间充质干细胞均出现了明显的成骨分化，且高浓度诱导组成骨分化更显著。

2、钙结节形成水平

如图2所示，常规组未见明显的钙结节，诱导组钙结节形成明显。本领域技术人员知道，成骨细胞逐渐成熟后矿化活力逐渐增强，可以促进细胞外基质矿化，进而形成钙化结节。可见诱导组人骨髓间充质干细胞出现了明显的成骨分化。

上述试验说明，序列为NH

序列表

<110> 淮安市厚沐医疗技术咨询中心

<120> 一种多肽体外促进人骨髓间充质干细胞成骨分化的用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 苦瓜(Momordica charantia)

<400> 1

Gly His Pro Tyr Tyr Ser Ile Lys Lys Ser

1 5 10