一种新抗原RNA及免疫佐剂poly(I:C)复合疫苗及其构建方法

摘要

本发明提供了一种新抗原RNA及免疫佐剂poly(I:C)复合疫苗，该复合疫苗包括PEG‑PLL‑PLLeu自组装纳米胶束，以及负载于PEG‑PLL‑PLLeu自组装纳米胶束上的新抗原RNA疫苗和免疫佐剂Poly(I:C)；其中，所述新抗原RNA其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的新抗原RNA及免疫佐剂poly(I:C)复合疫苗稳定性好、翻译效率高、表达产物易传递，治疗效果好。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种新抗原RNA及免疫佐剂poly(I:C)复合疫苗及其构建方法。

背景技术

肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤，根据国家癌症中心的统计数据，我国新发肺癌病例及肺癌致死病例人数均在升高，且无论是发病率还是死亡率，肺癌均位居所有恶性肿瘤首位，严重威胁人民生命健康。

非小细胞肺癌(NSCLC)为肺癌的主要病理类型，约占80％。在确诊的NSCLC中，超过半数为晚期无法手术的患者，仅适合接受药物或最佳支持治疗，晚期NSCLC的治疗方法一直是研究的热点。自上世纪以来，铂类药物为基础的联合化疗模式成为首选，但它以显著的毒副反应为代价，仅仅有限地提升了患者生存，晚期NSCLC的5年生存率仍仅为2.8％。而自本世纪开始，随着NSCLC驱动基因突变的发现，一系列针对表皮生长因子受体(EGFR)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)等驱动基因突变的小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI) 药物先后应用于临床，使晚期NSCLC驱动基因敏感突变阳性人群的5年生存率提升到了 14.6％。

然而，针对驱动基因突变的疗效受限于敏感突变人群。同时，恶性肿瘤不断克隆进化产生新的耐药突变，导致短时间内小分子靶向药物耐药的发生。晚近，免疫治疗因为免疫检查点抑制剂药物(ICIs)的研制成功而成为热点。在针对NSCLC的研究中，程序死亡分子-1(PD-1)及其配体(PD-L1)和细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)的相关药物取得了良好的临床疗效，已经在国内外获批用于晚期NSCLC的治疗。但是，ICIs 的总体有效率也仅在20％左右，其原因可能是ICIs的疗效发挥需要机体存在有效的抗肿瘤免疫反应和适宜的免疫微环境。目前晚期NSCLC无敏感突变且ICIs治疗疗效不佳人群，仍以化疗为主要手段，预后欠佳，这使得晚期NSCLC的总体5年生存率仍在5％以下，亟待寻求新的治疗手段。

事实上，免疫治疗除了ICIs药物，抗肿瘤疫苗及过继性免疫细胞治疗等也是可行的手段。从原理上看，抗肿瘤免疫反应必须要由肿瘤抗原诱发。当前研究认为，肿瘤突变基因所表达的抗原——新抗原(neoantigen)，为肿瘤细胞所特有，能够避免T细胞的中枢耐受并具备诱导免疫反应的能力。《Nature》和《Cancer Research》的一系列报道证实了基于neoantigen的肿瘤疫苗治疗具有可观的有效率和良好的临床应用潜力。根据采用的疫苗形式不同，目前的研究方向可分为三类：肽疫苗、核酸疫苗和neoantigen 负载的DC细胞疫苗。目前有研究证据表明，核酸疫苗中的RNA疫苗形式有着成本、安全性方面的优势，并且不同于肽疫苗，RNA疫苗的设计无需考虑HLA限制性，极具临床潜力。

然而，肿瘤新抗原RNA疫苗的疗效受到三个重要因素的制约：1.RNA序列的设计。有研究表明，新抗原RNA疫苗的序列需要经过对比肿瘤组织和正常组织的外显子测序结果，找到肿瘤组织特有的突变，再进一步进行免疫原性验证而确定制备疫苗用的RNA序列。2.新抗原RNA疫苗的负载投递。因为RNA容易被酶降解，新抗原RNA疫苗需要由特定载体进行投递，希望既能保护RNA不被降解，又能增强靶向投递作用。3.适合免疫细胞发挥效能的肿瘤免疫微环境。

为了寻求晚期NSCLC的新治疗模式，本发明旨在以小鼠Lewis肺癌细胞C57BL6小鼠移植瘤为模型对象，选取新抗原RNA疫苗为切入点，期望能够成功制备一种新抗原RNA 疫苗和免疫佐剂的复合纳米制剂。

发明内容

技术问题：为了解决现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种新抗原RNA及免疫佐剂poly(I:C)复合疫苗及其构建方法。

技术方案：本发明提供了一种新抗原RNA及免疫佐剂poly(I:C)复合疫苗，该复合疫苗包括PEG-PLL-PLLeu自组装纳米胶束，以及负载于PEG-PLL-PLLeu自组装纳米胶束上的新抗原RNA疫苗和免疫佐剂Poly(I:C)；其中，所述新抗原RNA其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，PEG-PLL-PLLeu自组装纳米胶束和新抗原RNA疫苗的摩尔比在1:1至10:1之间；新抗原RNA疫苗和Poly(I:C)的摩尔比在1:1至5:1之间。

其中，所述PEG-PLL-PLLeu自组装纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：

(1)PEG-PLL-PLLeu的合成：氨基聚乙二醇(NH2-PEG)与LLZ-NCA开环聚合获得PEG-pLLZ聚合物；PEG-pLLZ聚合物和LLeu-NCA进一步开环聚合获得 PEG-pLLZ-pLLeu；去保护反应获得PEG-PLL-PLLeu；

(2)PEG-PLL-PLLeu的自组装：以1mg/ml浓度溶解PEG-PLL-PLLeu，溶剂为超纯水，磁力搅拌过夜，完全溶解后超声获得PEG-PLL-PLLeu自组装纳米胶束。

其中，所述抗原RNA疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)选取pCI-neo(pCI-neo mammalian expression vector)质粒作为载体，将权利要求1所述的RNA疫苗的DNA序列插入pCI-neo质粒XhoI和NotI酶切位点之间，扩增获得负载RNA疫苗序列的质粒；

(2)将负载RNA疫苗序列的质粒利用Sap I内切酶切开质粒使之线性化；

(3)利用体外转录试剂盒(mMESSAGE mMACHINE

(4)转录产物再经过纯化试剂盒(MEGAclear

本发明还提供了上述新抗原RNA及免疫佐剂poly(I:C)复合疫苗的构建方法，包括以下步骤：

(1)PEG-PLL-PLLeu自组装纳米胶束的制备：

(1.1)PEG-PLL-PLLeu的合成：氨基聚乙二醇(NH2-PEG)与LLZ-NCA开环聚合获得PEG-pLLZ聚合物；PEG-pLLZ聚合物和LLeu-NCA进一步开环聚合获得 PEG-pLLZ-pLLeu；去保护反应获得PEG-PLL-PLLeu；

(1.2)PEG-PLL-PLLeu的自组装：以1mg/ml浓度溶解PEG-PLL-PLLeu，溶剂为超纯水，磁力搅拌过夜，完全溶解后超声获得PEG-PLL-PLLeu自组装纳米胶束；

(2)抗原RNA疫苗的制备：

(2.1)选取pCI-neo(pCI-neo mammalian expression vector)质粒作为载体，将权利要求1所述的RNA疫苗的DNA序列插入pCI-neo质粒XhoI和NotI酶切位点之间，扩增获得负载RNA疫苗序列的质粒；

(2.2)将负载RNA疫苗序列的质粒利用Sap I内切酶切开质粒使之线性化；

(2.3)利用体外转录试剂盒(mMESSAGE mMACHINE

(2.4)转录产物再经过纯化试剂盒(MEGAclear

(3)PEG-PLL-PLLeu对新抗原RNA及免疫佐剂poly(I:C)的共负载：将 PEG-PLL-PLLeu胶束溶液、RNA疫苗和Poly(I:C)的水溶液在37℃共孵育，即得新抗原RNA及免疫佐剂poly(I:C)复合疫苗。

优选地，上述新抗原RNA及免疫佐剂poly(I:C)复合疫苗的构建方法，包括以下步骤：

(1)PEG-PLL-PLLeu自组装纳米胶束的制备：

(1.1)PEG-PLL-PLLeu的合成：NH2-PEG与LLZ-NCA的摩尔比例范围为1:10至1:50，共同溶解于干燥的二甲亚砜(dried DMF，wt 10％)，氮气保护下在30℃-80℃之间，搅拌24-96h，再用过量乙醚沉淀得到PEG-PLLZ。取PEG-PLLZ与LLeu-NCA，摩尔比范围1:2至2:1之间，共同溶解于干燥的二甲亚砜(dried DMF，wt 10％)，氮气保护下在 30℃-80℃之间，搅拌24-96h，再用过量乙醚沉淀得到PEG-PLLZ-PLLeu；

PEG-PLLZ-PLLeu溶解于三氯乙酸(wt 5％)和HBr的醋酸溶液(wt 33％)，氮气保护下，在0℃-30℃下，搅拌24-96小时，再用过量乙醚沉淀获得粗产物；

再将粗产物用分子量3500Da的透析膜，先后在氨水(wt 0.1％)和蒸馏水中各透析24-96小时，获得PEG-PLL-PLLeu终产物；

(1.2)PEG-PLL-PLLeu的自组装：以0.5-5mg/ml浓度溶解PEG-PLL-PLLeu，溶剂为超纯水，磁力搅拌过夜，完全溶解后超声获得PEG-PLL-PLLeu自组装纳米胶束；

(2)抗原RNA疫苗的制备：

(2.1)选取pCI-neo(pCI-neo mammalian expression vector)质粒作为载体，将权利要求1所述的RNA疫苗的DNA序列插入pCI-neo质粒XhoI和NotI酶切位点之间，扩增获得负载RNA疫苗序列的质粒；

(2.2)将负载RNA疫苗序列的质粒利用Sap I内切酶切开质粒使之线性化；

(2.3)利用体外转录试剂盒(mMESSAGE mMACHINE

(2.4)转录产物再经过纯化试剂盒(MEGAclear

(3)PEG-PLL-PLLeu对新抗原RNA及免疫佐剂poly(I:C)的共负载：将PEG-PLL-PLLeu 胶束溶液、RNA疫苗和Poly(I:C)的水溶液在37℃共孵育，即得新抗原RNA及免疫佐剂poly(I:C)复合疫苗。

有益效果：本发明提供的新抗原RNA及免疫佐剂poly(I:C)复合疫苗稳定性好、翻译效率高、表达产物易传递，治疗效果好。本发明提供的用于治疗非小细胞肺癌的RNA 疫苗利用密码子优化设计新抗原的核酸序列，并利用linker进行连接，完善SEC、MITD 等序列的插入以及poly A尾的构建，序列设计完毕后构建质粒，再通过线性化和体外转录获得目标RNA序列，即新抗原RNA疫苗，该疫苗稳定性好、翻译效率高、表达产物易传递，治疗效果好。

附图说明

图1为肿瘤新生抗原筛选流程；

图2为pCI-neo的结构示意图；

图3为负载RNA疫苗序列的质粒线性化后的琼脂糖凝胶电泳图；

图4为合成的RNA疫苗凝胶电泳图。

图5为PEG-PLL-PLLeu的氢谱，提示了PEG-PLL-PLLeu结构的各特征峰均正确存在。

图6为PEG-PLL-PLLeu的红外图谱，在1650和1550cm-1两个特征峰，代表多肽中的酰胺键，另外具有位于1105cm-1的峰，为PEG结构中的C-O-C特征峰，证明了本研究合成样品的结构正确。

图7为自组装形成的PEG-PLL-PLLeu纳米粒子，连续测量粒径6周，粒径基本稳定，粒径无统计学差异。

图8为PEG-PLL-PLLeu纳米粒子的电镜照片，其粒径平均测量值为86.1±8.4nm。

图9为DC细胞对PEG-PLL-PLLeu的摄取情况图；

图10为复合制剂对CCK8细胞细胞毒性检测结果图；利用CCK8检测RNA疫苗对 293T细胞生长活性的影响，结果提示细胞活性疫苗组与生理盐水组分别为78.5± 9.8％、88.5±4.7％，无显著统计学差异。

图11为利用Th1/Th2 cytokine panel 6-plex检测给药3h后血清IFNα、β、γ、 TNFα和IL-6的水平。结果表明，生理盐水组在给药后未见明显血清细胞因子水平升高，PM组可见IFNα和IL-6有升高，而R+PM组和R+P+PM明显可见受检测细胞因子水平均有显著升高，但两组之间并无显著差异。

图12为利用流式细胞检测肿瘤组织的浸润淋巴细胞比例情况，包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、Treg细胞和TAM细胞，结果提示：R+PM组和R+P+PM组的CD4+ T 及CD8+ T细胞比例显著高于生理盐水组和PM组，且R+P+PM组较R+PM组升高更为显著；R+PM组和R+P+PM组的Treg细胞所占比例较生理盐水组和PM组有降低，但无明显差异；R+PM组和R+P+PM组的TAM细胞比例升高，但两组间无明显差异。

图13为模型小鼠移植瘤的生长曲线，结果提示：R+PM组和R+P+PM组的生长速度慢于生理盐水组和PM组。

图14为模型小鼠的生存曲线。结果提示：R+PM组和R+P+PM组小鼠的生存情况显著优于生理盐水组和PM组。

具体实施方式

下面给出实施例，结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。以下实施例仅为阐述本发明，而非限制本发明的范围。

以下实施例中的实验方法，除有特殊说明者外，均为常规实验方法。实施例中所采用的原料、实验试剂等，除有特殊说明者外，均为购买获得的市售产品。

实施例1新抗原筛选

1.动物模型的构建与测序

检测肿瘤特有的非同义突变。识别肿瘤新生抗原(neoantigen)的首要步骤是找到肿瘤细胞特有的非同义突变。随着测序技术的进步，同一个体的肿瘤组织和正常组织配对同时进行的全基因测序(WGS)或全外显子测序(WES)已经不难实现。通过对比两者的结果，可以获得肿瘤组织特有的非同义突变位点，包括点突变、插入缺失突变以及移码突变。最新的研究表明，同时配合RNA测序(RNAseq)技术，能够进一步从转录水平对非同义突变的表达情况做出提示，为neoantigen的筛选提供帮助。

本发明针对晚期NSCLC开展研究，动物模型选取了C57BL6小鼠，构建了该小鼠的肺癌Lewis细胞皮下移植瘤模型。分别取小鼠尾部组织和小鼠肺癌Lewis细胞株进行全外显子组测序(WES)，同时对小鼠肺癌Lewis细胞还进行了转录组RNA测序(RNAseq)。对比小鼠尾部组织细胞和肺癌Lewis细胞株的外显子测序结果，发现肺癌Lewis细胞株特有的突变共有3389个，其中特有点突变3029个，特有插入缺失突变360个。

进一步在肺癌Lewis细胞株的RNAseq结果中，比较上述对比获得的特有突变的表达情况，以RNAseq表达fpkm值大于60为界定义为高表达，同时选取满足错义突变且对基因功能预计有中度以上影响的位点，由此筛选出特有突变59个，其中点突变56个，插入缺失突变3个。

筛选流程见图1；小鼠肺癌Lewis细胞之于C57BL6小鼠特有的59个突变见表1。

表1

2.新抗原的筛选

通过WGS/WES联合RNAseq技术寻找到的肿瘤特有非同义突变通常数量众多，但其中并非所有的都具有形成neoantigen及诱导抗肿瘤免疫反应的能力。对 neoantigen“质量”的要求中，较强的HLA结合能力不可或缺。已经有大量实验利用基于质谱的免疫蛋白组技术(MS-based immunopeptidomics)检测了不同从HLA分子上洗脱的抗原肽与HLA分子的结合能力。这些数据信息被计算机学习、归纳建成数据库，形成了诸如IEBD AnalysisResource等在内的多种计算机工具，能够预测特定肽段与HLA I类或II类分子的结合能力。目前也有研究直接利用质谱技术寻找个体肿瘤组织的“优质”neoantigen，但因为其成本高、组织需求量大以及敏感性的欠缺，尚未成为金标准方案。

因此，针对测序技术所获得的非同义突变位点，目前优先选用计算机肽段预测和排序(In silico peptide prediction and prioritization)来筛选具有潜力的neoantigen 群体，本研究亦采用此种方法。

在这一研究部分中，我们通过NCBI资源数据库搜寻并记录前一部分筛选的Lewis细胞特有且高表达的突变外显子位点相应的肽序列。后续根据Ugur Sahin等提供的筛选思路，将上述肽序列利用IEBD数据库的MHC-II Binding Predictions功能，计算获得每一段肽序列与小鼠H2-IAb基因型MHC-II类分子的结合能力。经过计算机计算分析，获得最佳的用于制作核酸疫苗的对应肽序列。分析结果需要满足：1.consensus percentile rank结果显示具有高度MHC-II类分子的结合能力；2.高结合力肽段需要包含检测到的突变密码子位点。其中，与MHC-II类分子的结合力以共识百分位排名 (consensus percentile rank)小于30为临界值。

通过上述筛选条件，我们获得了共计9个拟后续用于串联合成疫苗的肽段序列。以入选的col3a1突变和未入选的Lonp1突变为例，列举其计算机肽段预测和排序结果(表 2)，入选的9个肽段的氨基酸序列(表2)。

表2

表3

以上构建了小鼠肺癌Lewis细胞的C57BL6小鼠皮下移植瘤模型，采用WES检测了Lewis细胞和C57BL6小鼠的基因状态，对比发现Lewis细胞特有突变。进而借助RANseq 筛选其中高表达且基因表达受到显著影响的错义突变，再利用IEBD数据库的MHC-II BindingPredictions功能对上述突变肽段进行计算机预测和排序，进而获得可用于后续串联RNA疫苗的9个新抗原组合。

实施例2新抗原RNA疫苗(用于治疗非小细胞肺癌的RNA疫苗)的建构

为了构建RNA疫苗，需要实现其全核苷酸序列(DNA序列)的体外转录(IVT)。

选取pCI-neo(pCI-neo mammalian expression vector)质粒作为载体，首先将所设计的RNA疫苗的DNA序列插入pCI-neo质粒XhoI和NotI酶切位点之间，扩增获得负载RNA疫苗序列的质粒。pCI-neo的结构示意图，见图2。

将负载RNA疫苗序列的质粒利用Sap I内切酶切开质粒使之线性化，线性化后同样利用琼脂糖凝胶电泳进行验证，结果如图3，表明Sap I内切酶成功线性化了质粒，可开始体外转录步骤。后续利用体外转录试剂盒(mMESSAGE mMACHINE

对合成的RNA疫苗进行浓度、纯度检测和凝胶电泳检测(图4)。合成的RNA产物A260吸光度28.866，A280吸光度13.309，计算A260/A280值为2.17，提示合成产物纯度良好，计算RNA浓度为1154.6ng/ul。同时对合成RNA进行测序检测，测序结果证实了IVT获得RNA序列的正确性，可作为进一步RNA疫苗实验使用。

以上设计了包括Cap、UTR、SEC、Linker、Neoantigen、MITD、UTR、poly A、Sap I 序列串联结构的RNA疫苗。将上述序列的DNA片段插入pCI-neo质粒，Sap I使之线性化。再利用体外转录试剂盒和纯化试剂盒进行线性化质粒的IVT，最终成功获得了所设计的RNA疫苗片段，浓度纯度良好，结构正确。

实施例3 PEG--PLL--PLLeu自组装胶束载体的构建

因为RNA疫苗的结构特殊性，其作用的发挥与给药投递方式密切相关。本发明的RNA疫苗通过纳米粒子包裹再行静脉给药，效果更佳：一方面，纳米粒子可以保护负载的RNA，避免其被降解破坏；另一方面能，纳米粒子的理化特性能够实现缓慢、持续释放RNA疫苗的效果。此外，淋巴结及脾脏等二级淋巴器官是T细胞与DC细胞的识别、活化的重要场所，而纳米粒子静脉投递正有利于RNA疫苗在全身二级淋巴器官的分布。

1、PEG-PLL-PLLeu的合成

聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸(PEG-PLL-PLLeu)可以通过自组装形成阳离子胶束，其粒径在100nm左右且稳定性良好，符合纳米粒子载体的性能要求。另外，因其带有正电荷，它能够高效率负载带有负电荷的核酸(包括DNA、RNA)分子。本发明采用 PEG-PLL-PLLeu阳离子胶束作为载体实现核酸分子的精准投递，效果良好，且同时具有生物相容性好、无明显细胞毒性的特点，适合后续转化用于临床。

本发明采用PEG-PLL-PLLeu作为载体，对其进行化学合成。利用环酸酐(NCA)、 Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸(LLZ)和L-亮氨酸(LLeu)制备LLZ-NCA和LLeu-NCA。选用氨基聚乙二醇(NH2-PEG)与LLZ-NCA开环聚合获得PEG-pLLZ聚合物。再利用 PEG-pLLZ聚合物和LLeu-NCA进一步开环聚合获得PEG-pLLZ-pLLeu。最后利用去保护反应获得PEG-PLL-PLLeu。该方法为常规方法。

PEG-PLL-PLLeu的合成：NH2-PEG与LLZ-NCA的摩尔比例范围为1:25(1:10至 1:50也可以实现本发明的目的)，共同溶解于干燥的二甲亚砜(dried DMF，wt 10％)，氮气保护下在60℃(30℃-80℃可选)，搅拌48h(24-96h可选)，再用过量乙醚沉淀得到PEG-PLLZ。取PEG-PLLZ与LLeu-NCA摩尔比1:1(1:2至2:1可选)，共同溶解于干燥的二甲亚砜(dried DMF，wt 10％)，氮气保护下在60℃(30℃-80℃可选)，搅拌 48h(24-96h可选)，再用过量乙醚沉淀得到PEG-PLLZ-PLLeu；

PEG-PLLZ-PLLeu溶解于三氯乙酸(wt 5％)和HBr的醋酸溶液(wt 33％)，氮气保护下，在15℃(0℃-30℃可选)下，搅拌48h(24-96小时可选)，再用过量乙醚沉淀获得粗产物；

再将粗产物用分子量3500Da的透析膜，先后在氨水(wt 0.1％)和蒸馏水中各透析48h(24-96小时可选)，获得PEG-PLL-PLLeu终产物；

通过傅里叶转换红外光谱(FT-IR)及核磁共振氢谱(1H-NMR)验证获得产物的结构正确性和纯度。相关检测结果如图5和图6所示，结果显示本研究合成的 PEG-PLL-PLLeu的FT-IR具有1650和1550cm-

2、PEG-PLL-PLLeu的自组装及相关表征

为了验证前一部分合成的PEG-PLL-PLLeu可以通过自组装形成阳离子胶束，并探索最佳的自组装浓度。

本发明以0.5-5mg/ml浓度溶解PEG-PLL-PLLeu，溶剂为超纯水，磁力搅拌过夜，完全溶解后超声1小时获得自组装胶束，均可以实现本发明。

本实施例中，以1mg/ml浓度溶解PEG-PLL-PLLeu，溶剂为超纯水，磁力搅拌过夜，完全溶解后超声获得PEG-PLL-PLLeu自组装纳米胶束；

测定自组装胶束的粒径和ζ电位，电镜照片如图8所示。结果显示本研究合成 PEG-PLL-PLLeu能够成功地自组装为纳米胶束，粒径在86.1±8.4nm，ζ电位为58.64 ±2.55mV。连续6周每周测定粒径，结果提示稳定性良好，如图7所示。

以上提供了合成新抗原RNA及免疫佐剂投递的载体。载体选择了已有文献报道的PEG-PLL-PLLeu，利用开环聚合获得样品，通过FT-IR和1H-NMR证实了样品的结构和纯度。进一步利用自组装反应使合成的PEG-PLL-PLLeu自组装成为纳米胶束，测定粒径及ζ电位显示性能良好，连续观测提示粒径稳定，适合用于后续的RNA、佐剂负载和进一步实验。

实施例4新抗原RNA及免疫佐剂poly(I:C)复合疫苗的制备

肿瘤的微环境状态对于抗肿瘤免疫治疗的效果至关重要。Daniel Chen等于2017年在Nature杂志上发表了综述，将恶性肿瘤的微环境分为三种类型，分别是：1.免疫炎症型；2.免疫豁免型；3.免疫沙漠型。其中仅免疫炎症型肿瘤有可能从抗肿瘤免疫治疗中获益。除了利用neoantigen重建抗肿瘤免疫反应，若是能够同时改善肿瘤的微环境，将非免疫炎症型转为免疫炎症型，预计能够下调肿瘤细胞的免疫耐受状态，增强抗肿瘤免疫反应对肿瘤的杀伤作用。

免疫佐剂的应用是改善免疫微环境的重要手段，其通过对抗原和T细胞受体结合信号、共刺激分子结合信号以及微环境细胞因子信号的调节来发挥增强免疫反应的效果。

聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly(I:C))是模拟病毒双链RNA结构的高分子聚合物，它能够同时针对共刺激分子信号及微环境细胞因子信号发挥免疫佐剂作用。作为双链RNA 类似物，Poly(I:C)能够刺激包括DC细胞、NK细胞、T细胞在内的重要抗肿瘤免疫相关细胞，通过与这些细胞的Toll样受体3(TLR3)、黑色素瘤分化相关蛋白5(MDA-5) 及视黄酸诱导蛋白1(RIG-1)相结合，进而实现诱导促炎症因子的释放、促进DC细胞的成熟和活化、增强DC细胞的抗原交叉递呈能力和刺激T细胞活化等诸多积极功效， Poly(I:C)也因此成为免疫佐剂基础和临床研究的焦点。

更为重要的是，Poly(I:C)因为是双链RNA类似物，与RNA疫苗一样也带有负电荷，能够参照相同原理被PEG-PLL-PLLeu纳米胶束所负载，投递后可实现在肿瘤局部聚集、缓释并有效改善肿瘤免疫微环境。

1、PEG-PLL-PLLeu对新抗原RNA及免疫佐剂poly(I:C)的共负载

对于新抗原RNA疫苗和Poly(I:C)的负载，本发明是通过将PEG-PLL-PLLeu胶束溶液、RNA疫苗和Poly(I:C)的水溶液在37℃共孵育实现的，PEG-PLL-PLLeu胶束溶液、 RNA疫苗和Poly(I:C)的摩尔比为10:2:1。孵育过程中因电荷相互作用，RNA疫苗及 Poly(I:C)将吸附至PEG-PLL-PLLeu胶束之中。

测定此情况下粒径和ζ电位的情况，以及粒径的稳定性情况。负载后的纳米胶束粒径在68.6±8.5nm，ζ电位为48.7±5.0mV。

制备一批新抗原RNA及免疫佐剂poly(I:C)复合疫苗：

PEG-PLL-PLLeu自组装纳米胶束和新抗原RNA疫苗的摩尔比1:1；新抗原RNA疫苗和Poly(I:C)的摩尔比1:1；负载后的纳米胶束粒径在64.7±8.2nm，ζ电位为43.2± 4.3mV。

PEG-PLL-PLLeu自组装纳米胶束和新抗原RNA疫苗的摩尔比10:1；新抗原RNA 疫苗和Poly(I:C)的摩尔比5:1；负载后的纳米胶束粒径在66.8±7.3nm，ζ电位为43.9 ±4.8mV。

PEG-PLL-PLLeu自组装纳米胶束和新抗原RNA疫苗的摩尔比5:1；新抗原RNA疫苗和Poly(I:C)的摩尔比3:1；负载后的纳米胶束粒径在69.2±7.4nm，ζ电位为49.2± 4.7mV。

2、复合疫苗的摄取与细胞毒性检测

分离C57BL6小鼠的DC细胞，与PEG-PLL-PLLeu胶束、40ug疫苗RNA和20ug Poly(I:C)的复合制剂(采用Cy5标记RNA序列)进行共培养4h，后荧光显微镜观察DC 细胞的摄取情况。结果如图9所示，提示荧光标记的复合疫苗制剂能够顺利进入DC细胞。

再将含有200ug PEG-PLL-PLLeu胶束、40ug疫苗RNA和20ug Poly(I:C)的复合制剂与293T细胞进行共培养48h，并进行CCK8细胞活性检测以评判细胞毒性，具体结果如图6(CCK8实验数据)所示，结果表明本研究制备的新抗原RNA疫苗、免疫佐剂 Poly(I:C)的复合制剂在治疗浓度下对293T细胞的生长无明显影响，毒性可接受。

以上实验利用合成的PEG-PLL-PLLeu自组装纳米胶束作为载体，成功进行了RNA疫苗以及免疫佐剂Poly(I:C)的负载，负载后测得粒径较PEG-PLL-PLLeu自组装纳米胶束略有增大，ζ电位提示稳定性良好。与小鼠细胞DC细胞共培养结果提示复合制剂能够迅速被DC细胞摄取。细胞毒性实验提示在治疗剂量下的复合制剂未对293T细胞的生长产生显著不良影响。

实施例5新抗原RNA及免疫佐剂poly(I:C)复合疫苗的动物实验

局部肿瘤微环境(TME)中包含多种不同的免疫细胞，对肿瘤的生长、转移以及抗肿瘤免疫治疗具有重要影响。而肿瘤转移是导致肿瘤相关死亡的主要因素。

很多恶性肿瘤TME中的免疫细胞能够产生免疫抑制环境并促进肿瘤生长。这一类型的TME多由肿瘤诱导的髓系细胞主导，如肿瘤相关的巨噬细胞(TAMs)和肿瘤相关中性粒细胞(TANs)。TAMs和TANs能产生多种细胞因子抑制抗肿瘤免疫反应，如精氨酸酶1，单核细胞趋化蛋白1，IL-6和IL-8；另外，它们还能够上调程序性细胞死亡 1(PD-1)和程序性死亡配体1(PD-L1)以来抑制T细胞的抗肿瘤作用。

在TME中调节性T细胞(Tregs)同样是促进免疫抑制状态的重要因素。例如有研究报道了Tregs的存在和PD-1高表达相关，并且前列腺癌骨患者转移瘤在骨髓中具有高水平的功能性Tregs，导致免疫抑制TME状态。还有研究表明，调节性B细胞(Bregs) 能够将CD4+T细胞转化为Tregs并诱导TAMs增加PD-L1的表达来进一步促进免疫抑制微环境的形成。此外，有证据表明，树突状细胞(DC)的功能在抑制性的TME中亦收到影响，导致降低抗原呈递能力，削弱抗肿瘤免疫反应。而TME相对乏氧的状态也影响了自然杀伤(NK)细胞的迁移和趋化能力，从而潜在地促进肿瘤生长、转移。

本发明合成了PEG-PLL-PLLeu纳米胶束负载新抗原RNA疫苗与免疫佐剂Poly(I:C)的新型复合制剂。我们推测该新型复合制剂能够引发抗肿瘤免疫反应，改善肿瘤免疫微环境，进而抑制肿瘤生长、延长生存，为了验证这一推测，本部分构建了小鼠肺癌Lewis 细胞的C57BL6小鼠皮下移植瘤模型，从复合疫苗对模型动物血炎症因子的影响、模型动物肿瘤组织的免疫细胞分型分析和模型动物的肿瘤生长与生存情况三个方面进行探索。

1、复合疫苗对模型动物血炎症因子的影响

分组包括生理盐水对照组(Sal组)、空白纳米胶束载体组(PM组)、单纯RNA纳米胶束组(R+PM)和复合纳米胶束组(R+P+PM)，均尾静脉注射给药。利用Th1/Th2 cytokinepanel 6-plex检测给药3h后血清IFNα、β、γ、TNFα和IL-6的水平。

结果表明，生理盐水组在给药后未见明显血清细胞因子水平升高，PM组可见IFN α和IL-6有升高，而R+PM组和R+P+PM明显可见受检测细胞因子水平均有显著升高，但两组之间并无显著差异，结果如图10所示。

2、模型动物肿瘤组织的免疫细胞分型分析

实验分组同上，自d0种瘤开始，d3、d7、d14分别尾静脉注射各组制剂，于d15 处死模型动物，取肿瘤组织行流式细胞检测。检测的细胞分类包括CD4+ T细胞、CD8+T细胞、Treg细胞和TAM细胞，并进一步分析TAM细胞的分型情况。

检测结果如图11，结果提示：R+PM组和R+P+PM组的CD4+ T及CD8+ T细胞比例显著高于Sal组和PM组，且R+P+PM组较R+PM组升高更为显著；R+PM组和 R+P+PM组的Treg细胞所占比例较Sal组和PM组有降低，但无明显统计学差异；R+PM 组和R+P+PM组的TAM细胞比例升高，进一步分析提示其中TAM II型细胞所占比例显著下降。

3、模型动物的肿瘤生长与生存情况

实验分组同上，自d0种瘤开始，d3、d7、d14、d21、d28分别尾静脉注射各组制剂，每三天测量肿瘤体积，按照公式(a2×b)/2(a,短径；b,长径)计算。并记录每组小鼠的生存情况。

瘤体生长曲线及生存曲线如12和13所示。结果表明，R+PM组和R+P+PM组均能够有效控制小鼠Lewis细胞在C57BL6小鼠体内的生长，延长小鼠的生存，且R+P+PM 组具有更显著优势。

显而易见，对于本领域一般技术人员而言，以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明的应用，可以根据实际情况进行各种等同替换或变形。只要不脱离本发明的精神，所有这些替换或变形均应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 无锡市人民医院

<120> 一种新抗原RNA及免疫佐剂poly (I:C) 复合疫苗及其构建方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1595

<212> DNA/RNA

<213> artificial(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

ctcgagacat ttgcttctga cacaactgtg ttcactagca acctcaaaca gacaccatgc 60

gggtgaccgc tccccgcaca ctgatcctgc tgctgtccgg cgccctggct ctgaccgaga 120

catgggctgg atctggagga agcggaggag gaggatctgg cggagctcgg gatttcaacc 180

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cttttggcgg atctggagga ggaggatccg gaggatctcc acctgctcca ggcaggcccg 300

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