非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L的DNA疫苗和亚单位疫苗及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L的DNA疫苗和亚单位疫苗及其制备方法与应用。所述的DNA疫苗包括编码非洲猪瘟病毒p30、p54、p72和B602L蛋白的四个重组pCAGGS真核表达质粒；亚单位疫苗包括利用重组杆状病毒表达系统的三个蛋白：单独表达的非洲猪瘟病毒p30蛋白、非洲猪瘟病毒p54蛋白，联合表达的非洲猪瘟病毒p72蛋白和非洲猪瘟病毒B602L蛋白，以及药学上可以接受的佐剂。针对亚单位疫苗及核酸疫苗免疫后仅能提供部分保护或者无保护力的问题，为提高亚单位疫苗和核酸疫苗的免疫效果，通过猪源及昆虫细胞的密码子优化，且采取“鸡尾酒”式混合免疫，用以提高疫苗的免疫效果。

说明书

技术领域

本发明属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域，特别涉及一种非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L的DNA疫苗和亚单位疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

非洲猪瘟(Afican swine fever，ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swinefever virus，ASFV)引起的高度接触、出血性、病毒性的传染病，病死率高达100％，严重危及养猪业发展。非洲猪瘟自1921年在肯尼亚发现以来，疫情在全球范围内不断的蔓延，仍然具有流行扩大的趋势，且目前没有安全有效的疫苗以及治疗手段，仅能从生物防控方面阻止疾病的传播。我国自2018年8月以来，国内报道了首例ASF疫情，随后ASFV蔓延至我国所有的省份和地区，给我国的生猪养殖造成了巨大的经济损失。由于ASFV免疫保护机制不清楚、结构复杂、且大部分基因功能未知、病毒与宿主细胞相互作用的机制不明确等因素存在，所以疫苗的研发较为困难。在特异性免疫应答的过程中，细胞免疫和体液免疫起到不同的作用。

非洲猪瘟疫苗的研究于上世纪60年代开始，由于对ASFV的生物学特性研究不充分，非洲猪瘟的灭活疫苗虽能刺激猪产生抗体，但未能检测到中和抗体的存在，且因难以刺激机体产生细胞免疫，均以失败告终。通过细胞传代、天然致弱等方式研制的弱毒疫苗，有部分能抵御同源毒株的攻击，但无法提供异源毒株的交叉保护，且存在较大的安全性问题，故此类疫苗的研发及应用不是未来的研究重点。

ASFV可编码产生多达167种蛋白，在选择哪些蛋白作为亚单位疫苗的候选抗原是一个需要深入研究的过程。现阶段已经报道了几种ASFV蛋白可作为病毒中和的靶标，并且实验验证了这些蛋白诱导产生的保护力。其中包括使用杆状病毒表达系统表达的p54和p30蛋白，使用修饰的痘病毒载体表达p72、CD2v和C型凝集素等。ASFV的DNA疫苗研究中，有研究人员将ASFV血凝素的胞外域、p54蛋白、p30蛋白和泛素基因进行融合，可产生部分保护效果；基于ASFV-Ba71v毒株的80多个开放阅读框的基因序列，与泛素基因进行融合后，将构建的表达文库进行免疫接种后，使用高毒力的毒株进行攻毒，可产生60％的保护效力。

ASFV的亚单位疫苗研究中，有研究人员使用杆状病毒表达系统表达的p54和p30蛋白，分3次免疫猪，单次免疫100μg抗原，在使用高毒力的欧洲ASFV E75毒株进行攻毒后，有3/6(50％)的动物死亡，且存活动物中表现出临床症状及病毒血症；有研究将p30、p54、p72、p22等基因从ASFV-Pr毒株上克隆后使用杆状病毒表达系统表达蛋白，免疫4次，单次免疫200μg抗原，在使用亲本ASFV-Pr4毒株(基因Ⅰ型)攻毒后，仅观察到疾病及进程有两天的延迟和病毒血症的水平有所降低，但是对于疾病的进展以及最终的攻毒实验不提供保护力，均在7～10d死亡。

ASFV的核酸疫苗及亚单位疫苗能够诱导猪产生特异性抗体和中和抗体，但是无法提供攻毒保护效果，且存在抗体依赖性增强效应，抗体水平高的动物，其ASF发病过程、病毒血症均更加严重。在亚单位疫苗的研究中，有研究人员将病毒中和表位已经明确的p30、p54、p72这三种蛋白使用杆状病毒表达系统进行蛋白表达，免疫猪后产生中和抗体，但经过攻毒实验后，实验组的动物表现为疾病进程推迟两天，最终无法提供保护性免疫力。DNA疫苗的潜在优势包括刺激B细胞和CD4+、CD8+T细胞反应。在另一项研究中表明，构建了表达ASFV血凝素(sHA)的胞外域与p30、p54和泛素融合蛋白的DNA质粒，进行免疫后，在未能检测到抗体存在的情况下，有33％的实验动物产生了免疫保护效力，证实了T细胞免疫反应在针对ASFV的保护性免疫中的重要作用。由此可见，单一形式的DNA疫苗或者亚单位疫苗的使用，刺激机体产生的免疫反应效果不佳，因此，需要开发出新的疫苗组合方案及免疫程序进行免疫效果的提升。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L的DNA疫苗和亚单位疫苗。

本发明的又一目的在于提供所述的非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L的DNA疫苗和亚单位疫苗的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述的非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L的DNA疫苗和亚单位疫苗的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L的DNA疫苗和亚单位疫苗，所述的DNA疫苗包括编码非洲猪瘟病毒p30、p54、p72和B602L蛋白的四个重组pCAGGS真核表达质粒；所述的亚单位疫苗包括利用重组杆状病毒表达系统的三个蛋白：单独表达的非洲猪瘟病毒p30蛋白、非洲猪瘟病毒p54蛋白，联合表达的非洲猪瘟病毒p72蛋白和非洲猪瘟病毒B602L蛋白，以及药学上可以接受的佐剂。

构建重组pCAGGS表达质粒过程中，对非洲猪瘟病毒各蛋白的基因序列进行猪源密码子优化：

所述的非洲猪瘟病毒p30基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述的非洲猪瘟病毒p54基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述的非洲猪瘟病毒p72基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述的非洲猪瘟病毒B602L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

构建重组杆状病毒过程中，对非洲猪瘟病毒各病毒蛋白的基因进行昆虫细胞密码子优化：

编码所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

编码所述的非洲猪瘟病毒p54蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

编码所述的非洲猪瘟病毒p72蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

编码所述的非洲猪瘟病毒B602L蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

所述的药学上可以接受的佐剂优选包括水包油包水佐剂；更优选为MontanideTMISA201 VG佐剂。

所述的非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L的DNA疫苗和亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1)DNA疫苗的制备：

将非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L基因分别与pCAGGS空载体连接，得到连接产物，将连接产物转化、筛选，分别得到重组质粒pCAGGS-p30、pCAGGS-p54、pCAGGS-p72和pCAGGS-B602L，加入佐剂，即得非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L的DNA疫苗；

所述的用于扩增上述目的基因的引物分别如下表1所示：

表1：

(2)亚单位疫苗的制备：

1)将编码所述的非洲猪瘟p30、p54蛋白的核苷酸序列分别克隆入PACE BAC 1质粒构建重组表达载体PACE BAC 1-p30和PACE BAC 1-p54；

2)先将编码所述的非洲猪瘟p72蛋白的核苷酸序列克隆入pFastBac Dual载体构建重组载体pFastBac Dual-p72，再将编码所述的非洲猪瘟B602L蛋白的核苷酸序列克隆入重组载体pFastBac Dual-p72构建得到重组表达载体pFastBac Dual-p72-B602L；

3)分别将上述重组表达载体PACE BAC 1-p30、PACE BAC 1-p54和pFastBac Dual-p72-B602L转入昆虫-杆状病毒表达系统进行蛋白表达，然后加入佐剂，即得非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L的亚单位疫苗。

步骤1)中所述的构建重组表达载体的具体步骤优选为：针对编码所述的非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L蛋白的核苷酸序列，通过设计引物进行PCR，然后分别进行如下操作：

S1.分别将非洲猪瘟p30、p54基因和PACE BAC 1质粒载体双酶切后构建得到重组表达载体PACE Bac 1-p30和PACE BAC 1-p54；

S2.将非洲猪瘟p72基因片段双酶切后与pFastBac Dual载体连接，构建得到pFastBac Dual-p72重组载体，然后将非洲猪瘟B602L基因片段双酶切后与pFastBac Dual-p72重组载体连接构建得到pFastBac Dual-p72-B602L重组表达载体。

其中，所述的引物为：

表2：

所述的用于双酶切非洲猪瘟p30、p54基因和PACE BAC 1载体的酶均优选为BamH l和Hind III限制性内切酶。

所述的用于双酶切非洲猪瘟p72基因和pFastBac Dual载体的酶均优选为Xhol和Kpnl限制性内切酶。

所述的用于双酶切B602L基因和pFastBac Dual-p72重组载体的酶均优选为BamHl和EcoRI限制性内切酶。

所述的非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L的DNA疫苗和亚单位疫苗在预防和/或治疗非洲猪瘟病毒引起的猪相关疾病中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)针对亚单位疫苗及核酸疫苗免疫后仅能提供部分保护或者无保护力的问题，为提高亚单位疫苗和核酸疫苗的免疫效果，通过猪源及昆虫细胞的密码子优化，且采取“鸡尾酒”式混合免疫，用于提高疫苗的免疫效果。本发明将ASFV抗原基因：p30、p54、p72和B602L蛋白选为研究目标，进行猪源密码子优化，构建了pCAGGS-p30、pCAGGS-p54、pCAGGS-p72和pCAGGS-B602L等哺乳动物真核表达DNA质粒；同时利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统构建了重组杆状病毒：BAC-p30、BAC-p54和BAC-p72-B602L。该非洲猪瘟疫苗免疫4周龄仔猪后，于一免后28天时可检测到显著高于对照组的体液免疫和细胞免疫。

(2)本发明根据表达目的基因的物种-草地贪夜蛾进行核苷酸序列的优化，实现了目的蛋白的稳定和大量表达。

(3)本发明是通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达的非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L蛋白，由于利用的表达系统属于真核表达系统，因此表达产物与天然外源产物有极高的理化特性和生物学活性剂免疫原性，同时由于对无脊椎动物无感染性，因此其表达产物具有较高的生物安全性。

(4)本发明实施例中利用摇瓶悬浮培养昆虫细胞的方式表达蛋白，摇瓶培养细胞量较普通贴壁培养大，日后可利用发酵罐等方式大量表达蛋白，能极大地降低生产成本。

附图说明

图1为实施例1中p30、p54、p72和B602L基因的PCR扩增结果图；其中，泳道M为DNAMarker DL2000，泳道1为p30基因扩增产物；泳道2为阴性对照；泳道3为p54基因扩增产物；泳道4为阴性对照；泳道5为p72基因扩增产物；泳道6为阴性对照；泳道7为B602L基因扩增产物；泳道8为阴性对照。

图2为实施例1中重组质粒pCAGGS-p30和pCAGGS-p54的酶切鉴定结果图；其中，泳道M为DNA Marker DL10000，泳道1为pCAGGS-p30的双酶切产物；泳道2为pCAGGS-p30的单酶切产物；泳道3为pCAGGS-p30的未酶切质粒；泳道4为阴性对照；泳道5为pCAGGS-p54的双酶切产物；泳道6为pCAGGS-p54的单酶切产物；泳道7为pCAGGS-p54未酶切质粒；泳道8为阴性对照。

图3为实施例1中重组质粒pCAGGS-p72和pCAGGS-B602L的酶切鉴定结果图；其中，泳道M为DNA Marker DL 10000，泳道1为pCAGGS-p72的双酶切产物；泳道2为pCAGGS-p72的单酶切产物；泳道3为pCAGGS-p72的未酶切质粒；泳道4为阴性对照；泳道5为pCAGGS-B602L的双酶切产物；泳道6为pCAGGS-B602L的单酶切产物；泳道7为pCAGGS-B602L未酶切质粒；泳道8为阴性对照。

图4为重组质粒pCAGGS-p30、pCAGGS-p54、pCAGGS-p72和pCAGGS-B602L转染293T细胞的间接免疫荧光试验(IFA)的实验结果图。

图5为实施例2中目的产物的琼脂糖凝胶电泳结果图；其中，泳道M为DNA MarkerDL2000；泳道1为p30基因扩增产物；泳道2为阴性对照；泳道3为p54基因扩增产物；泳道4为阴性对照；泳道5为p72基因扩增产物；泳道6为阴性对照；泳道7为B602L基因扩增产物；泳道8为阴性对照。

图6为实施例2中PACE BAC 1-p30、PACE BAC 1-p54的酶切结果图；其中，泳道M为DNA Marker DL 50000；泳道1为PACE BAC 1-p30质粒的双酶切产物；泳道2为PACE BAC 1-p30质粒的单酶切产物；泳道3为PACE BAC 1-p30质粒的未酶切质粒；泳道4为阴性对照；泳道5为PACE BAC 1-p54质粒的双酶切产物；泳道6为PACE BAC 1-p54质粒的单酶切产物；泳道7为PACE BAC 1-p54的未酶切质粒；泳道8为阴性对照。

图7为实施例2中pFastBac dual-p72-B602L质粒的酶切结果图；其中，泳道M为DNAMarker DL 10000；泳道1为p72基因的双酶切产物；泳道2为B602L基因的双酶切产物；泳道3为pFastBac dual-p72-B602L的单酶切质粒；泳道4为pFastBac dual-p72-B602L的未酶切质粒；泳道5为阴性对照。

图8为实施例2中p30蛋白的Western-Blot鉴定结果图；其中，泳道M为180kDa的Marker；泳道1为72h、p30细胞上清鉴定结果；泳道2为72h、p30细胞沉淀鉴定结果；泳道3为96h、p30细胞上清鉴定结果；泳道3为96h、p30细胞沉淀鉴定结果；泳道5为全细胞样阴性对照。

图9为实施例2中p54蛋白的Western-Blot鉴定结果图；其中，泳道M为180kDa的Marker；泳道1为p54细胞上清鉴定结果；泳道2为p54细胞沉淀鉴定结果；泳道3为全细胞样阴性对照。

图10为实施例2中p72蛋白的Western-Blot鉴定结果图；其中，泳道M为180kDa的Marker；泳道1为p72细胞上清鉴定结果；泳道2为p72细胞沉淀鉴定结果；泳道3为全细胞样阴性对照。

图11为实施例2中B602L蛋白的Western-Blot鉴定结果图；其中，泳道M为180kDa的Marker；泳道1为B602L细胞上清鉴定结果；泳道2为B602L细胞沉淀鉴定结果；泳道3为全细胞样阴性对照。

图12为实施例2中p30蛋白和p54蛋白的定量Western-Blot鉴定结果图；其中，泳道M为180kDa的Marker；泳道1-3为p30细胞上清的鉴定结果；泳道4为Flic蛋白上清的鉴定结果；泳道5-6为p54细胞沉淀的鉴定结果；泳道7为Flic蛋白上清的鉴定结果；泳道8为sf9空白细胞样结果。

图13为实施例2中p72-B602L蛋白的定量Western-Blot鉴定结果图；其中，泳道M为180kDa的Marker；泳道1-2为p72-B602L细胞沉淀的鉴定结果；泳道3为Flic蛋白上清的鉴定结果；泳道4为sf9空白细胞样结果。

图14为p54特异性抗体水平变化趋势图。

图15为pCAGGS-p30、pCAGGS-p54、pCAGGS-p72、pCAGGS-B602L四个质粒分别转染293T细胞的间接免疫荧光试验结果图。

图16为pCAGGS-p72和pCAGGS-B602L质粒共转染组与pCAGGS-B602L质粒单转染组的间接免疫荧光试验结果图。

图17为初免42天后PBMC中分泌IFN-γ的淋巴细胞数量结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：重组真核表达质粒pCAGGS-p30、pCAGGS-p54、pCAGGS-p72、pCAGGS-B602L的构建及验证

1.1、ASFV p30、p54、p72及B602L的合成及扩增

根据Genbank提供的基因Ⅱ型ASFV毒株序列：包括格鲁吉亚毒株(GenBank登录号：NC_044959.1)、中国境内第一株ASFV-SY18(GenBank登录号：MH766894.1)和ASFV-DB/LN/2018(GenBank登录号：MK333181.1)，进行序列比分析对后，选定编码非洲猪瘟病毒p30蛋白、非洲猪瘟病毒p54蛋白、非洲猪瘟病毒p72蛋白和非洲猪瘟病毒B602L蛋白的基因序列，并进行核苷酸优化，通过通过华大基因公司进行合成，并克隆于pUC57载体上。

其中，编码非洲猪瘟病毒p30蛋白的核苷酸原序列如SEQ ID NO.1所示，优化后如SEQ ID NO.5所示，根据优化后的非洲猪瘟病毒p30基因核苷酸序列设计引物，在基因上下游分别添加EcoRⅠ和KpnⅠ两种限制性内切酶酶切位点；

编码非洲猪瘟病毒p54蛋白的核苷酸原序列如SEQ ID NO.2所示，优化后如SEQ IDNO.6所示，根据优化后的非洲猪瘟病毒p54基因核苷酸序列设计引物，在基因上下游分别添加EcoRⅠ和KpnⅠ两种限制性内切酶酶切位点；

编码非洲猪瘟病毒p72蛋白的核苷酸原序列如SEQ ID NO.3所示，优化后如SEQ IDNO.7所示，根据优化后的p72基因核苷酸序列设计引物，在基因上下游分别添加EcoRⅠ和KpnI两种限制性内切酶酶切位点；

编码非洲猪瘟病毒B602L蛋白的核苷酸原序列如SEQ ID NO.4所示，优化后如SEQID NO.8所示，根据优化后的B602L基因核苷酸序列设计引物，在基因上下游分别添加EcoRⅠ和KpnI两种限制性内切酶酶切位点；

表1：引物序列如下所示：

以含有目的基因的pUC57-p30、pUC57-p54、pUC57-p72、pUC57-B602L为模板，以相应的引物进行目的基因的扩增，使用Premix PrimeSTAR HS高保真酶进行PCR扩增。PCR完成后，将50μL PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示，其中p30基因扩增目的条带(携带酶切位点)大小为624bp，p54基因扩增目的条带大小为573bp，p72基因扩增目的条带大小为1959bp，B602L基因扩增目的条带大小为1611bp，符合预期，进行目的基因的胶回收。

1.2、pCAGGS重组质粒构建与鉴定

将PCR扩增产生的目的基因与质粒抽提产生的空载体进行双酶切实验：根据不同基因使用相对应的两种限制性内切酶对胶回收的目的基因与pCAGGS空载体(由华南农业大学兽医学院传染病教研室提供)进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳的方式回收酶切产物。

目的片段与载体连接：酶切产物回收完成后，通过连接反应将各个目的基因与载体连接，使用T4连接酶进行目的基因与载体的连接。于16℃的恒温连接仪中，反应过夜12～16h，得到连接产物。

连接产物转化DH5α感受态细胞，使用Amp+抗性琼脂平板进行筛选。筛选出来的单菌落扩大培养后进行菌液PCR鉴定，将阳性菌寄送至华大基因公司进行测序分析，并同时使用阳性菌抽提质粒进行重组质粒pCAGGS-p30、pCAGGS-p54、pCAGGS-p72和pCAGGS-B602L的双酶切鉴定。酶切鉴定结果如图2、3所示。

间接免疫荧光转染实验：为验证构建的4个pCAGGS质粒真核细胞中的蛋白表达情况，通过间接免疫荧光实验进行质粒的蛋白表达情况验证，实验步骤如下：实验用细胞系为293T细胞(购于ATCC)，将处于对数生长期的293T细胞经胰酶消化分散后铺于12孔细胞培养板中，加入含有10％血清的DMEM完全培养基(购于Sigma-Aldrich公司)培养18～24h，直至细胞生长至90％～95％的细胞密度。使用Lipofectamine 2000作为转染试剂，转染质粒质量为1.6μg/孔，转染试剂使用量为4.0μL。分别将1.6μg重组质粒pCAGGS-p30、pCAGGS-p54、pCAGGS-p72和pCAGGS-B602L溶于100μL Opti-men无血清培养基(购于Sigma-Aldrich公司)中(A液)，将4μL lipofectamine 2000转染试剂溶于100μL Opti-men无血清培养基中(B液)，室温混匀放置5min。将两管置于1.5mL EP管中混合，放置20min。将12孔板使用PBS缓冲液(pH7.4，0.01mol/L)洗涤两遍，更换为无血清培养基，每孔加入400μL，并将混合液加入到12孔板对应的孔中，4小时后更换成DMEM完全培养基(购于Sigma-Aldrich公司)。

间接免疫荧光实验：将转染质粒24h后的细胞从培养箱取出后，弃去培养基，每孔加入1mL PBS缓冲液(pH7.4，0.01mol/L)轻轻漂洗3遍细胞，弃去PBS缓冲液后，最后倒扣于纱布上静置3min，吸干多余水分。每孔加入500μL多聚甲醛，固定细胞活动，室温静置孵育20min。接着弃去多聚甲醛，每孔加入1mL PBS缓冲液轻轻漂洗3遍细胞。每孔加入500μL0.5％(v/v)曲拉通溶液(使用PBS缓冲液稀释)进行通透处理，室温静置孵育10min。漂洗细胞，弃去曲拉通溶液，每孔加入1mL PBS缓冲液，置于80rpm的摇床上摇洗10min，总共洗涤细胞3次。封闭处理，每孔加入500μL 5％(w/v)脱脂奶粉(使用PBS缓冲液稀释)，37℃静置孵育30min。漂洗细胞，弃去脱脂奶粉溶液，每孔加入1mL PBST(1×，pH7.5)溶液，置于80rpm的摇床上摇洗10min，总共洗涤细胞3次。一抗孵育，每孔加入PBS缓冲液稀释的非洲猪瘟耐过猪的阳性血清，每孔500μL，置于4℃孵育过夜(10～16h)；漂洗细胞，弃去一抗溶液，每孔加入1mL PBST溶液，置于80rpm的摇床上摇洗10min，总共洗涤细胞3次。二抗孵育，每孔加入500μL羊抗猪FITC二抗(使用PBS缓冲液(pH7.4，0.01mol/L)按1:500比例稀释，置于80rpm的摇床上避光摇晃30min，于室温条件进行。漂洗细胞，弃去二抗溶液，每孔加入1mL PBST溶液，置于80rpm的摇床上摇洗10min，总共洗涤细胞3次；荧光显微镜下观察，每孔添加500μL PBS缓冲液，避光转移至倒置荧光显微镜下观察实验结果。实验结果如图4所示。

实施例2：杆状病毒表达载体的构建及蛋白表达验证结果

2.1、杆状病毒表达系统使用的ASFV p30、p54、p72、B602L基因的合成

基因合成：参照实施例1已经选定的基因序列，根据昆虫细胞(草地贪夜蛾为宿主)进行密码子优化，优化后各基因中GC含量在60％左右。p30蛋白的核苷酸原序列如SEQ IDNO.1所示，优化后如SEQ ID NO.9所示；p54蛋白的核苷酸原序列如SEQ ID NO.2所示，优化后如SEQ ID NO.10所示；p72蛋白的核苷酸原序列如SEQ ID NO.3所示，优化后如SEQ IDNO.11所示；B602L蛋白的核苷酸原序列如SEQ ID NO.4所示，优化后如SEQ ID NO.12所示。ASFV-p30、p54基因上下游分别添加BamHⅠ和Hind III两种限制性内切酶酶切位点。ASFV-p72基因上下游分别添加Xhol和Kpnl两种限制性内切酶酶切位点。ASFV-B602L基因上下游分别添加BamHI和EcoRI两种限制性内切酶酶切位点。将最终优化好的目的基因通过华大基因公司进行合成，并克隆于pUC57质粒载体上。

2.2、引物设计

根据优化后的基因合成序列，使用Primer Premier 6和SnapGene软件进行扩增引物的设计，引物具体序列如下：

表2：

每个基因的酶切位点和6×His标签均通过引物添加，6×His标签添加于p30、p54、p72基因的起始密码子后方和终止密码子前方，B602L基因的起始密码子后方添加Flag标签(用于鉴定)，终止密码子前方添加His标签(用于纯化)。

2.3、PCR扩增及产物回收

以含有目的基因的pUC57-p30、pUC57-p54、pUC57-p72、pUC57-B602L为模板，以相应的引物进行目的基因的扩增。使用Premix PrimeSTAR HS高保真酶进行PCR扩增。PCR完成后，进行目的产物的琼脂糖凝胶电泳及目的基因的胶回收，扩增结果如图5所示。

2.4、重组转递质粒的构建与鉴定

目的片段和质粒载体的双酶切：(1)对于构建单表达p30、p54这两个目的基因的PACE BAC 1质粒，p30、p54这两个目的基因和PACE BAC 1质粒载体的双酶切，使用BamH I和Hind III两种限制性内切酶；(2)对于构建联合表达p72基因和B602L基因的pFastBac Dual的重组质粒，p72基因使用Xhol和Kpnl两种限制性内切酶，pFastBac Dual空载体(购于Sigma-Aldrich公司)同时使Xhol和Kpnl两种限制性内切酶。当连接上p72基因后，对B602L基因使用BamHI和EcoRI两种限制性内切酶酶切，构建好的pFastBac Dual-p72使用BamHI和EcoRI两种限制性内切酶酶切。各个目的基因跟载体双酶切完成后，进行凝胶电泳分离条带，并进行酶切产物的胶回收，结果如图6、7所示。

目的基因与载体的连接与转化：使用T4连接酶将将目的基因和质粒载体进行连接反应。接着进行连接产物转化DH5α感受态细胞，将转化完成的菌液涂布于相应抗性的固体琼脂平板上(含PACE BAC 1质粒的为Gen+抗性平板，含pFastBac Dual质粒的为AMP+抗性平板)。

单克隆阳性菌筛选：重组PACE质粒阳性菌选用Gen+抗性培养基，pFastBac Dual质粒阳性菌选用AMP+抗性培养基进行扩大培养。扩大培养后进行菌液PCR验证。将初步验证为阳性的菌寄送至华大基因公司进行测序分析。测序正确的质粒，命名为PACE BAC 1-p30、PACE BAC 1-p54、pFastBac Dual-p72-B602L，并将测序正确的菌株进行保菌处理和质粒抽提。

2.5、重组杆状病毒质粒的获得与鉴定

将抽提的重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞中，实验操作步骤如下：将DH10Bac感受态细胞从-80℃环境中取出，置于冰上解冻10min。将1μg重组质粒加入到100μL感受态细胞中，轻轻吹打混匀，置于冰上冰浴30min，冰浴结束置于42℃水浴锅中热应激42s，再返回冰浴状态5min。在每管感受态细胞中加入600μL无抗LB液体培养基(购于北京鼎国昌盛生物技有限责任公司)，于37℃恒温摇床中220rpm震荡培养4h。培养结束后，使用无抗LB液体培养基对菌液进行10倍梯度稀释，稀释至10

挑单克隆菌落验证：使用10μL移液器枪头进行单菌落挑选，依据视野中菌落大小排序，优先挑选体积大的白色单菌落。将菌体置于1.5mL离心管中，加入800μL三抗LB培养基，置于37℃恒温摇床中，220rpm震荡培养4h。随后进行菌液PCR鉴定。菌液PCR鉴定成功后，则表明目的基因3成功转座重组杆状病毒穿梭载体Bacmid。

重组杆状病毒质粒的抽提：将PCR鉴定正确的菌株进行扩大培养，培养基使用三抗LB培养基。收集菌体后使用异丙醇沉淀法抽提重组杆毒质粒。

2.6、重组杆状病毒的获得与表达鉴定

(1)重组杆状病毒BV-p30、BV-p54、BV-p72-B602L的获得

利用

确认Sf9昆虫细胞处于对数期(1.0～2.5×10

(2)蛋白表达步骤：

假设P2代重组病毒的滴度为5×10

(3)Western-Blot鉴定p30、p54、p72和B602L蛋白的表达

SDS-PAGE电泳实验：将浓度为12％的蛋白胶放置于倒满SDS-PAGE缓冲液的电泳槽中，将制备好的蛋白样依次加入至孔中，每孔加入20μL样品，第一列为蛋白Maker。将电泳仪电压设置为80V，恒压电泳30min；随后将电压设置为120V，恒压电泳至目的蛋白条带与其他蛋白充分分离。蛋白胶电泳完成后，将上层浓缩胶弃去，把分离胶放置于考马斯亮蓝染色液中染色30min。将染色液弃去后，加入脱色液摇洗脱色，置于摇床上以80rpm的转速摇洗3h，更换脱色液，重复漂洗3次。当背景基本漂洗干净，目的蛋白清洗可见时，漂洗结束。将脱色完毕的蛋白胶置于双色激光成像分析系统进行扫描观察，拍照记录结果。

Western-Blot实验：依据上述SDS-PAGE电泳实验步骤进行凝胶电泳，电泳结束后，参照蛋白Maker的大小，将目的蛋白上下的凝胶切出，依据切下的胶体长宽，裁剪相同大小的硝酸纤维素膜(NC膜)。将滤纸裁剪好，并将转膜仪中的海绵板、滤纸及硝酸纤维素膜浸润到预冷的转膜液中。将准备好的各种材料按以下(-)黑板+海绵板+滤纸+胶+NC膜+滤纸+海绵板+白板(+)顺序组装，放入转膜仪中，在电泳槽中注满电泳缓冲液，并将转膜仪放入冰盒中。将电流设置为200mA，使用恒流转膜70min。封闭处理，将NC膜取出，加入5％的脱脂奶粉，置于37℃恒温摇床封闭1h，弃去封闭液，使用PBS缓冲液(pH7.4，0.01mol/L)置于摇床上摇洗10min，重复操作3次。将NC膜用1:5000稀释好的His-tag(4C2)monoclonal antiboby孵育，置于4℃孵育过夜，随后吸弃一抗溶液，置于摇床用PBST(1×，pH7.5)摇洗三次，每次10min。避光加入以1：10000稀释好的

各蛋白的表达量定量：采用灰度分析法进行定量，使用本实验室之前利用杆状病毒表达系统表达的带有His标签的鞭毛蛋白为标准参照品，该蛋白经镍柱成功纯化后使用BCA试剂盒定量。纯化后鞭毛蛋白的浓度为：1.029mg/mL。将待检测样品与标准参照品分别使用6×Protein Loading Buffer制混匀，放入沸水中加热变性10min制备样品，通过Western-Blot进行蛋白灰度分析。进行Western-Blot点样时，检测样品和标准参照以相同体积点样。将Western-Blot结果导入至图片分析软件Image Studio中，经软件分析得到样品与标准参照品的灰度值，将样品灰度值与标准参照品灰度值进行比对，再根据标准参照品蛋白浓度求得待测样品浓度。样品浓度为：

表3：

实施例3：DNA及亚单位疫苗的制备

本实验制作DNA疫苗以及亚单位疫苗使用的佐剂均为SEPPIC公司生产的MontanideTM ISA201 VG佐剂(水包油型乳剂)，根据实验操作手册指示，乳化步骤不需要高剪切，但高度依赖温度的变化，疫苗配制的乳化步骤如下：按重量比50/50准备两相，水相为DNA质粒溶液或蛋白溶液，油相为MontanideTM ISA201佐剂。将两相均置于水浴锅中加热10min至32℃，将两相抽吸至注射器中，注射器连接乳化管，快速互推10循环，单次循环小于1s。随后将乳化完全的疫苗制剂置于20℃水浴锅中冷却1h。冷却完成后即可用于注射使用。

实施例4：DNA及亚单位疫苗联用的免疫原性研究

4.1、实验分组

将6只无特定病原(ASFV、PRRSV、PRV和CSFV)4周龄断奶仔猪由广东省云浮市梁益棠养殖场提供。随机分为2组，每组3只，具体分组情况如下：

表4：

组别设置：空白组，将DNA质粒(空pCAGGS质粒)和PBS缓冲溶液，使用等体积的MontanideTM ISA201佐剂(购自Seppic公司)制备后注射免疫；实验组，在三次免疫的过程中，每次免疫均为DNA疫苗(每种质粒均免疫1mg)+亚单位疫苗(每种蛋白均免疫500μg)。

免疫程序：实验猪于4周龄进行免疫，总免疫次数为3次，每次间隔14d，免疫量如上表所示，将疫苗通过多点注射的方式进行免疫，分为颈部斜方肌、股四头肌和耳后皮下注射，每个部位注射1/3剂量的疫苗。每次免疫后2周抽血，收集血液中的外周血淋巴细胞以及血清，外周血淋巴细胞用于ELISpot实验，血清用于特异性抗体和中和抗体检测。

4.2、ELISA检测p54蛋白抗体水平

血清的采集于处理：在采血前8小时内禁止喂食，采集首免后2周、4周及6周的血清，通过猪前腔静脉采血10mL，置于37℃恒温培养箱中，静置2h析出血清，后转移至4℃，自然沉降3～4h，750g离心20min，将血清分装于无菌EP管中，置于-80℃冻存备用。

ELISA检测p54抗体：采用武汉科前生物股份有限公司生产的非洲猪瘟间接ELISA抗体检测试剂盒进行检测。操作步骤按说明书进行。结果判读依据为：将酶标仪测量波长设置为630nm，10min内读取数据。结果判定，试验成立标准是阳性对照孔OD630nm值均应≥1.0，阴性对照孔OD630nm值均应≤0.2。成立后计算样品S/P值。

若S/P≥0.25，结果判定为非洲猪瘟病毒抗体阳性；

若S/P＜0.25，结果判定为非洲猪瘟病毒抗体阴性。

结果如图14所示。从图14可以看出，非洲猪瘟病毒p54抗体呈阴性。

4.3、IFA验证各蛋白的特异性抗体

本试验使用的血清为各组首免后42天时采集的血清。

IFA验证各蛋白在动物体内抗体产生情况：将构建完成的pCAGGS-p30、pCAGGS-p54、pCAGGS-p72、pCAGGS-B602L四个质粒，分别转染293T细胞，转染步骤参考实施例2的2.5部分。转染36h之后，将各组血清(1:200稀释后)作为一抗，将兔抗猪FITC荧光二抗(1:500稀释后)作为二抗。结果如图15所示。

IFA验证p72与B602L共转染步骤：设置两个试验组，组一为pCAGGS-p72和pCAGGS-B602L质粒共转染组，组内的p72质粒转染剂量一致，B602L质粒转染剂量设置梯度，分别设置为0.1倍(0.05μg)、0.4倍(0.2μg)、原剂量1.0倍(0.5μg)进行转染；组二为pCAGGS-B602L质粒单转染组(未转染pCAGGS-p72)，转染剂量同上。转染后于36h，使用“双加强组”动物血清(1:200稀释后)作为一抗，将兔抗猪FITC荧光二抗(1:500稀释后)作为二抗。结果如图16所示。

4.4、外周血淋巴细胞IFN-γELISpot测定

猪外周血淋巴细胞(PBMC)的分离：通过前腔静脉无菌采集血液2.5mL于肝素钠抗凝管中，立即摇晃混匀。将抗凝血与等量3％胎牛血清PBS缓冲液混匀，以提高分离效果，降低细胞凝聚效应。取等体积的淋巴细胞分离液(5mL)，置于无菌15mL离心管中，将稀释后的抗凝血液平铺于分离液之上。于室温条件下，800g水平离心机离心20min。此时离心管中分为4层，最上层为血浆层，第2层为乳白色的淋巴细胞层，第3层为分离液，第4层为红细胞，使用移液枪小心吸取第二层细胞加入到新15mL离心管中，添加5mL 3％胎牛血清PBS缓冲液洗涤细胞，250g离心10min。弃去上层PBS缓冲液，使用3mL红细胞裂解液重悬，并静置10min。于室温条件下，250g离心5min，使用3％胎牛血清PBS重悬并吹打洗涤细胞。弃去上层PBS缓冲液，使用10mL RPMI-1640培养基(购于Sigma-Aldrich公司)重悬并进行细胞计数。使用4％台盼蓝与等量分离细胞混合均匀，静置2min后镜检，此时活细胞不着色，死细胞染成蓝色，要求细胞活率95％以上。

刺激剂准备：多肽合成，使用http://www.cbs.dtu.dk/services/网站(CBS预测服务器)对p30、p54、p72和B602L等4个基因的蛋白序列进行分析，依据神经网络计算出能与MHC I类分子相结合的T细胞表位，依据计算结果，择优选取了13条肽段，每条肽段的大小均为14aa，肽段信息如下：

表4：

ELISpot实验：从密封的包装中将ELISpot板取出，使用无菌PBS洗涤板孔，200μL/孔，洗涤4次。使用完全培养基孵育ELISpot板，含有10％血清的RPIM-1640培养基，100μL/孔，孵育30min。将上述步骤的培养液弃掉，将与刺激剂预混好的细胞悬液加入板中，每孔含有细胞数量在40万至60万之间，在37℃二氧化碳培养箱中培育12～48h，当捕获抗体捕获足够的IFN-γ后，一般32h后，即可开始检测斑点。将细胞从板中移除，使用PBS溶液洗板5次，200μL/孔。将检测抗体(P2C11-biotin)稀释至0.5μg/mL(使用含有0.5％小牛血清的PBS进行稀释)，每孔添加100uL，置于室温下作用2h。使用PBS溶液洗板5次，200μL/孔。稀释链酶亲和素-ALP(1:1000稀释)，使用含有0.5％小牛血清的PBS进行稀释)，每孔添加100μL，置于室温下作用1h。使用PBS溶液洗板5次，200μL/孔。使用0.45μm的滤膜将(BCIP/NBT-plus)溶液过滤，并每孔添加100μL，直至斑点出现。使用大量水进行冲洗，停止斑点颜色反应。避光将板在晾干，在显微镜下或者ELISpot读板仪器上进行计数。实验结果如图17所示。从图17可以看出，针对免疫的4个ASFV抗原蛋白设计合成的肽段，在免疫后产生了差异显著的IFN-γ刺激效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L的DNA疫苗和亚单位疫苗及其制备方法与应用

<160> 41

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 585

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<223> ASFV p30原始序列

<400> 1

atggatttta ttttaaatat atccatgaaa atggaggtca tcttcaaaac ggatttaaga 60

tcatcttcac aagttgtgtt tcatgcgggt agcctgtata attggttttc tgttgagatt 120

atcaatagcg gtagaattgt tacgaccgct ataaaaacat tgcttagtac tgttaagtat 180

gatattgtga aatctgctcg tatatatgca gggcaagggt atactgaaca tcaggctcaa 240

gaagaatgga atatgattct gcatgtgctg tttgaagagg agacggaatc ctcagcatct 300

tcggagaaca ttcatgaaaa aaatgataat gaaaccaatg aatgcacatc ctcctttgaa 360

acgttgtttg agcaagagcc ctcatcggag gtacctaaag actccaagct gtatatgctt 420

gcacaaaaga ctgtgcaaca tattgaacaa tatggaaagg cacctgattt taacaaggtt 480

attagagcac ataattttat tcaaaccatt tatggaaccc ctctaaagga agaagaaaaa 540

gaggtggtaa gactcatggt tattaaactt ttaaaaaaaa aataa 585

<210> 2

atggattctg aattttttca accggtttat ccgcggcatt atggtgagtg tttgtcacca 60

gtcactacac caagcttctt ctccacacat atgtatacta ttctcattgc tatcgtggtc 120

ttagtcatca ttatcatcgt tctaatctat ctattctctt caagaaagaa aaaagctgct 180

gctattgagg aggaagatat acagtttata aatccttatc aagatcagca gtgggtagaa 240

gtcactccac aaccaggtac ctctaaacca gctggagcga ctacagcaag tgtaggcaag 300

ccagtcacgg gcagaccggc aacaaacaga ccagcaacaa acaaaccagt tacggacaac 360

ccagttacgg acagactagt catggcaact ggcgggccgg cggccgcacc tgcggccgcg 420

agtgctcctg ctcatccggc tgagccttac acgacagtca ctactcagaa cactgcttca 480

caaacaatgt cggctattga aaatttacga caaagaaaca cctatacgca taaagaccta 540

gaaaactcct tgtaa 555

<210> 3

atggcatcag gaggagcttt ttgtcttatt gctaacgatg ggaaggccga caagattata 60

ttggcccaag acttgctgaa tagcaggatc tctaacatta aaaatgtgaa caaaagttat 120

gggaaacccg atcccgaacc cactttgagt caaatcgaag aaacacattt ggtgcatttt 180

aatgcgcatt ttaagcctta tgttccagta gggtttgaat acaataaagt acgcccgcat 240

acgggtaccc ccaccttggg aaacaagctt acctttggta ttccccagta cggagacttt 300

ttccatgata tggtgggcca tcatatattg ggtgcatgtc attcatcctg gcaggatgct 360

ccgattcagg gcacgtccca gatgggggcc catgggcagc ttcaaacgtt tcctcgcaac 420

ggatatgact gggacaacca aacaccctta gagggcgccg tttacacgct tgtagatcct 480

tttggaagac ccattgtacc cggcacaaag aatgcgtacc gaaacttggt ttactactgc 540

gaataccccg gagaacgact ttatgaaaac gtaagattcg atgtaaatgg aaattcccta 600

gacgaatata gttcggatgt cacaacgctt gtgcgcaaat tttgcatccc aggggataaa 660

atgactggat ataagcactt ggttggccag gaggtatcgg tggagggaac cagtggccct 720

ctcctatgca acattcatga tttgcacaag ccgcaccaaa gcaaacctat tcttaccgat 780

gaaaatgata cgcagcgaac gtgtagccat accaacccga aatttctttc acagcatttt 840

cccgagaact ctcacaatat ccaaacagca ggtaaacaag atattactcc tatcacggac 900

gcaacgtatc tggacataag acgtaatgtt cattacagct gtaatggacc tcaaacccct 960

aaatactatc agccccctct tgcgctctgg attaagttgc gcttttggtt taatgagaac 1020

gtgaaccttg ctattccctc agtatccatt cccttcggcg agcgctttat caccataaag 1080

cttgcatcgc aaaaggattt ggtgaatgaa tttcctggac tttttgtacg ccagtcacgt 1140

tttatagctg gacgccccag tagacgcaat atacgcttta aaccatggtt tatcccagga 1200

gtcattaatg aaatctcgct cacgaataat gaactttaca tcaataacct gtttgtaacc 1260

cctgaaatac acaacctttt tgtaaaacgc gttcgctttt cgctgatacg tgtccataaa 1320

acgcaggtga cccacaccaa caataaccac cacgatgaaa aactaatgtc tgctcttaaa 1380

tggcccattg aatatatgtt tataggatta aaacctacct ggaacatctc cgatcaaaat 1440

cctcatcaac accgagattg gcacaagttc ggacatgttg ttaacgccat tatgcagccc 1500

actcaccacg cagagataag ctttcaggat agagatacag ctcttccaga cgcatgttca 1560

tctatatctg atattagccc cgttacgtat ccgatcacat tacctattat taaaaacatt 1620

tccgtaactg ctcatggtat caatcttatc gataaatttc catcaaagtt ctgcagctct 1680

tacataccct tccactacgg aggcaatgcg attaaaaccc ccgatgatcc gggtgcgatg 1740

atgattacct ttgctttgaa gccacgggag gaataccaac ccagtggtca tattaacgta 1800

tccagagcaa gagaatttta tattagttgg gacacggatt acgtggggtc tatcactacg 1860

gctgatcttg tggtatcggc atctgctatt aactttcttc ttcttcagaa cggttcagct 1920

gtgctgcgtt acagtaccta a 1941

<210> 4

atggcagaat ttaatattga tgagcttctc aaaaacgtat tggaggatcc ctctactgaa 60

atatccgaag aaacgcttaa acagctttac caaaggacga acccttacaa acagttcaaa 120

aatgatagca gggtggcctt ttgctctttt acaaatttgc gggagcagta tattcgacgt 180

cttataatga ctagctttat tggatatgtc ttcaaagctc tgcaggaatg gatgccttcc 240

tattcaaaac ctacccacac gaccaaaact cttctcagtg agctaataac gttagttgat 300

actttgaaac aggaaactaa tgatgttccc tctgaatcgg tagtaaatac aattttatct 360

atagcagata gctgcaaaac ccagacgcag aaaagcaagg aagctaaaac aacgatcgat 420

agctttttac gagaacattt tgtgtttgat cctaatcttc atgctcaaag tgcgtatact 480

tgtgcagata ccaatgtaga cacttgtgca agcatgtgtg cagataccaa tgtagacacc 540

tgtgcaagca tgtgtgcaga taccaatgta gatacctgtg caagcacttg tacaagcaca 600

gaatacaccg atttagcaga tcctgagcgc atccctttac acatcatgca aaaaacatta 660

aatgtgccta atgagcttca ggccgatatt gatgcaatca cccaaacccc acagggctat 720

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gaagagttgc gggccgctac ggaaagcatc tacccagaaa aacccgacct agagtttgcc 960

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aaatataaag accagatttt ctcagaggtt tcatccattc aattaggcaa ctggacactc 1080

ctgggaagct ttaaggccaa cagagagcgc tacaattatt ttaatcaaaa taatgaaata 1140

ataaaacgga ttttggaccg tcatgaggaa gacctaaaga taggaaaaga gattttacga 1200

aatactattt accacaaaaa agcaaaaaat atacaagaaa ctggcccgga tgctccgggg 1260

ctctccatct ataattcaac ctttcacacg gatagcggga ttaagggact gctttccttt 1320

aaggagctaa aaaacctaga aaaagcatct ggaaatatca aaaaagctcg agagtatgat 1380

tttatagacg actgcgaaga aaaaattaag caactgctta gtaaagaaaa tttaaccccc 1440

gatgaagaaa gcgagctgat aaaaacaaaa aaacagttag ataatgcgct tgaaatgctc 1500

aatgtgcctg atgatacgat acgggtagat atgtgggtca acaataataa taaactcgaa 1560

aaagaaattt tatatacaaa agcagaattg taa 1593

<210> 5

atggacttca tcctgaacat cagcatgaag atggaagtga tcttcaagac cgacctgcgc 60

agcagcagcc aggtggtgtt tcatgccgga agcctgtaca actggttcag cgtggaaatc 120

atcaacagcg gccgcatcgt gaccaccgcc atcaaaacac tgctgagcac cgtgaagtac 180

gacatcgtga agtccgccag gatctacgcc ggacagggat acacagagca ccaggctcaa 240

gaggaatgga acatgatcct gcacgtgctg ttcgaggaag agacagagag cagcgccagc 300

agcgagaaca tccacgagaa gaacgacaac gagacaaacg agtgcaccag cagcttcgag 360

acactgtttg agcaagagcc cagctccgag gtgcccaagg acagcaaact gtacatgctg 420

gcccagaaaa ccgtgcagca catcgagcag tacggcaagg ccccagactt caacaaagtg 480

atcagggccc acaacttcat ccagaccatc tacggcaccc cactgaaaga ggaagaaaaa 540

gaggtcgtcc gcctgatggt catcaagctg ctgaagaaga tcagcttcta cctgacctac 600

atctga 606

<210> 6

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gtgacaaccc caagcttctt cagcacccac atgtacacca tcctgatcgc catcgtggtg 120

ctggtcatca tcattatcgt gctgatctac ctgttcagca gccgcaagaa gaaggccgct 180

gccatcgagg aagaggacat ccagttcatc aacccctacc aggaccagca gtgggtcgaa 240

gtgacaccac agccaggcac ctctaaacca gccggcgcta caacagccag cgtgggaaaa 300

ccagtgaccg gaaggccagc cacaaacaga ccagccacca acaagcccgt gacagacaac 360

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<210> 7

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gacgagtaca gcagcgacgt gacaaccctc gtgcgcaagt tctgtatccc cggcgacaag 660

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gtgaacctgg ctatcccctc cgtgtctatc cctttcggcg agcgcttcat caccatcaaa 1080

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gtgatcaacg agatcagcct gaccaacaac gagctgtaca tcaacaacct gttcgtgacc 1260

ccagagatcc acaacctctt cgtcaagcgc gtgcggttct ctctgatccg cgtgcacaaa 1320

acccaagtga cccacaccaa caacaaccac cacgatgaga agctgatgag cgccctgaag 1380

tggcccatcg agtacatgtt catcggcctg aagccaacct ggaacatctc cgaccagaat 1440

ccacaccagc accgcgactg gcacaagttc ggacacgtgg tcaacgccat catgcagcca 1500

acacaccacg ccgaaatcag cttccaggac agggatacag ccctgccaga cgcctgtagc 1560

tccatcagcg atatcagccc cgtgacatac cccatcacac tgcccatcat caaaaacatc 1620

agcgtgacag cccacggcat caacctgatc gacaagttcc catccaagtt ctgcagcagc 1680

tacatcccct tccactacgg cggcaatgcc atcaagacac cagatgaccc aggcgccatg 1740

atgatcacct tcgctctgaa gccccgcgag gaataccagc caagcggaca catcaacgtg 1800

tccagggctc gcgagttcta catcagctgg gacacagact acgtgggcag catcacaaca 1860

gccgacctgg tcgtgtctgc cagcgccatc aattttctgc tgctccagaa cggcagcgcc 1920

gtgctgagat acagcacatg a 1941

<210> 8

atggccgagt tcaacatcga cgagctgctg aagaacgtgc tggaagatcc cagcaccgag 60

atcagcgagg aaaccctgaa gcagctgtac cagcgcacaa acccctacaa gcagttcaag 120

aacgacagcc gcgtggcctt ctgcagcttc accaatctgc gcgagcagta catccgccgc 180

ctgatcatga ccagcttcat cggctacgtg ttcaaggccc tgcaagagtg gatgcccagc 240

tacagcaagc ccacacacac caccaagaca ctgctgagcg agctgatcac cctggtggac 300

accctgaaac aagagacaaa cgacgtgccc agcgagagcg tggtcaacac catcctgtct 360

atcgccgaca gctgcaagac ccagacacag aagtccaaag aggccaagac aacaatcgac 420

agcttcctgc gcgaacactt cgtgttcgac ccaaacctgc acgcccagag cgcctacaca 480

tgtgccgaca caaacgtgga cacctgtgcc agcatgtgcg ccgacaccaa tgtggatact 540

tgcgcctcta tgtgtgccga tacgaatgtc gacacatgcg ccagcacctg tacctccacc 600

gagtacacag atctggctga ccccgagagg atcccactgc acatcatgca gaaaacactg 660

aacgtgccaa acgagctgca ggccgacatc gacgccatca cacagacacc acagggatat 720

agagccgccg ctcacatcct ccagaacatc gagctgcacc agagcatcaa gcacatgctc 780

gaaaacccca gggccttcaa gcccatcctg ttcaacacca agatcacccg ctacctgagc 840

cagcacatcc caccacagga caccttctac aagtggaact actacatcga ggacaactac 900

gaggaactga gggccgccac cgagagcatc tacccagaga aacccgacct ggaatttgcc 960

ttcatcatct acgacgtggt ggacagcagc aaccagcaga aggtggacga gttctactac 1020

aagtacaagg accagatctt cagcgaggtg tccagcatcc agctcggcaa ttggactctg 1080

ctgggcagct tcaaagccaa ccgcgagcgc tacaactact tcaaccagaa caacgagatc 1140

atcaagcgga tcctggaccg ccacgaagag gacctgaaga tcggcaaaga gatcctgagg 1200

aacaccatct accacaagaa ggccaagaac atccaagaga caggccccga cgctccaggc 1260

ctgtccatct acaacagcac cttccacacc gacagcggca tcaagggact gctgtccttc 1320

aaagagctga aaaacctgga aaaggccagc ggcaacatca agaaagcccg cgagtacgac 1380

ttcatcgacg attgcgagga aaagatcaag cagctcctga gcaaagagaa tctgacccca 1440

gacgaggaaa gcgaactgat caagaccaag aagcagctcg acaacgccct ggaaatgctg 1500

aatgtgcccg acgacacaat cagagtggat atgtgggtca acaacaacaa caagctggaa 1560

aaagagatcc tctacaccaa ggccgagctg tga 1593

<210> 9

atggacttca tcctgaacat cagcatgaaa atggaagtga tcttcaagac tgacctgcgt 60

tcctcctccc aggtcgtctt ccacgctggt tccctgtaca actggttcag cgtggagatc 120

atcaactccg gtcgtatcgt caccaccgcc atcaagactc tgctgtccac cgtgaagtac 180

gacatcgtga agtccgcccg tatctacgct ggccagggtt acactgaaca ccaggcccag 240

gaagagtgga acatgatcct gcacgtgctg ttcgaagaag agaccgaatc ctccgcctcc 300

agcgaaaaca tccacgagaa gaacgacaac gagactaacg aatgcacctc ctccttcgag 360

actctgttcg aacaggagcc tagcagcgaa gtgcctaagg actccaagct gtacatgctg 420

gcccagaaga ccgtccagca catcgaacag tacggtaaag cccctgactt caacaaggtc 480

atccgcgccc acaacttcat ccagaccatc tacggtactc ccctgaagga agaggaaaag 540

gaggtcgtcc gcctgatggt catcaagctg ctgaagaaga tcagcttcta cctgacttac 600

atctaa 606

<210> 10

atggactccg agttcttcca gcctgtctac ccccgtcact acggcgaatg cctgagcccc 60

gtgactaccc ccagcttctt cagcacccac atgtacacta tcctgatcgc tatcgtggtg 120

ctggtcatca tcatcatcgt gctgatctac ctgttctcca gccgtaagaa gaaggctgct 180

gccatcgagg aagaagacat ccagttcatc aacccttacc aggaccagca gtgggtcgag 240

gtgactcccc agcccggtac ttccaagccc gctggtgcta ccaccgcctc cgtcggtaaa 300

cctgtgactg gccgtcctgc taccaaccgc cccgctacta acaagcccgt caccgacaac 360

cccgtcactg accgtctggt catggccacc ggtggccccg ctgctgctcc agctgctgct 420

tccgcccccg ctcaccctgc tgaaccttac actaccgtca ctacccagaa cactgccagc 480

cagactatgt ccgctatcga gaacctgcgc cagcgcaaca cttacactca caaggacctg 540

gagaactccc tgtaa 555

<210> 11

atggcctccg gcggagcttt ctgcctgatc gctaacgacg gcaaggccga caagatcatc 60

ctggcccagg acctgctgaa ctcccgtatc tccaacatca agaacgtgaa caagtcctac 120

ggcaagcctg accctgagcc taccctgagc cagatcgagg agacccacct ggtccacttc 180

aacgcccact tcaagcccta cgtgcctgtg ggcttcgagt acaacaaggt ccgccctcac 240

accggcaccc ccaccttggg aaacaagctg actttcggca tccctcagta cggtgacttc 300

ttccacgaca tggtcggtca ccacatcctg ggcgcctgcc acagctcctg gcaggacgct 360

cccatccagg gcacctccca gatgggtgct cacggtcagc tgcagacttt ccctcgcaac 420

ggttacgact gggacaacca gactcctctg gagggcgctg tctacaccct ggtggaccct 480

ttcggccgtc ctatcgtgcc tggtactaag aacgcttacc gcaacctggt gtactactgc 540

gaataccctg gtgaacgcct gtacgagaac gtgcgtttcg acgtcaacgg taacagcctg 600

gacgagtaca gcagcgacgt gactaccctg gtccgcaagt tctgcatccc tggtgacaag 660

atgaccggct acaagcacct ggtgggccag gaggtgagcg tggaaggtac tagcggtccc 720

ctgctgtgca acatccacga cctgcacaag cctcaccaga gcaagcccat cctgaccgac 780

gaaaacgaca ctcagcgcac ctgcagccac accaacccta agttcctgtc ccagcacttc 840

cctgagaact cccacaacat ccagactgcc ggtaaacagg acatcacccc tatcactgac 900

gctacctacc tggacatccg ccgcaacgtg cactactcct gcaacggccc tcagaccccc 960

aagtactacc agccccccct ggctctgtgg atcaagctgc gcttctggtt caacgagaac 1020

gtgaacctgg ccatccctag cgtgagcatc cccttcggcg agcgtttcat caccatcaag 1080

ctcgcttccc agaaggacct ggtcaacgag ttccctggtc tgttcgtgcg ccagagccgt 1140

ttcatcgccg gccgtcccag ccgtcgtaac atccgtttca agccctggtt catccctggc 1200

gtgatcaacg agatctccct gactaacaac gagctgtaca tcaacaacct gttcgtgacc 1260

cccgaaatcc acaacctgtt cgtcaagcgc gtgcgtttca gcctgatccg tgtgcacaag 1320

actcaggtga cccacaccaa caacaaccac cacgacgaga agctgatgag cgctctgaag 1380

tggcctatcg agtacatgtt catcggtctg aagcccactt ggaacatctc cgaccagaac 1440

cctcaccagc accgcgactg gcacaagttc ggccacgtcg tgaacgccat catgcagccc 1500

actcaccacg ctgaaatctc cttccaggac cgtgacaccg ctctgcccga cgcttgcagc 1560

tccatctccg acatctcccc tgtcacttac cccatcaccc tgcccatcat caagaacatc 1620

tccgtgaccg cccacggtat caacctgatc gacaagttcc cctccaagtt ctgctccagc 1680

tacatccctt tccactacgg cggcaacgcc atcaagaccc ccgacgaccc tggcgctatg 1740

atgatcactt tcgccctgaa gcctcgtgag gagtaccagc cttccggcca catcaacgtc 1800

agccgtgctc gcgagttcta catcagctgg gacaccgact acgtgggctc catcactact 1860

gccgacctgg tcgtgtccgc cagcgctatc aacttcctgc tgctgcagaa cggctccgct 1920

gtgctgcgtt actccaccta a 1941

<210> 12

atggccgagt tcaacatcga cgagctgctg aagaacgtgt tggaggaccc ctccaccgag 60

atctccgagg aaactctgaa gcagctgtac cagcgtacta acccctacaa gcagttcaag 120

aacgactccc gtgtggcttt ctgctccttc accaacctgc gcgagcagta catccgtcgt 180

ctgatcatga cttccttcat cggctacgtg ttcaaggctc tgcaagagtg gatgccctcc 240

tactccaagc ctactcacac caccaagact ctgctgtccg agctgatcac cctggtggac 300

accctgaagc aagagactaa cgacgtgccc tccgagtccg tggtcaacac catcctgtct 360

atcgctgact cctgcaagac ccagactcag aagtccaaag aggccaagac tactatcgac 420

tccttcctgc gtgaacactt cgtgttcgac cccaacctgc acgctcagtc cgcttacact 480

tgcgctgaca ccaacgtgga cacatgcgct tccatgtgcg ccgacactaa tgtcgatacc 540

tgcgctagca tgtgcgcgga tacaaacgtc gacacttgtg cttctacctg cacctctacc 600

gagtacaccg acctggctga ccctgagaga atccctctgc acatcatgca aaagaccctg 660

aacgtgccca acgagctgca ggctgacatc gacgctatca ctcagacccc tcagggttac 720

cgtgctgctg ctcacatcct gcagaacatc gagctgcacc agtccatcaa gcacatgctg 780

gaaaaccctc gtgctttcaa gcccatcctg ttcaacacca agatcacccg ttacctgtct 840

cagcacatcc cacctcagga caccttctac aagtggaact actacatcga ggacaactac 900

gaggaactgc gtgctgctac cgagtctatc taccccgaga agcccgactt ggagttcgct 960

ttcatcatct acgacgtggt ggactcctcc aaccagcaga aggtggacga gttctactac 1020

aagtacaagg accagatctt ctccgaggtg tcctccatcc agctcggcaa ctggactctg 1080

ctcggttcct tcaaggctaa ccgcgagcgt tacaactact tcaaccagaa caacgagatc 1140

atcaagcgta tcctggaccg tcacgaagag gacctgaaga tcggcaaaga gatcctgagg 1200

aacaccatct accacaagaa ggccaagaac atccaagaga ctggtcccga cgctcccggc 1260

ctgtccatct acaactctac cttccacacc gactccggta tcaagggcct gctgtccttc 1320

aaagaactga agaacctgga aaaggcctcc ggcaacatca agaaggctcg cgagtacgac 1380

ttcatcgacg attgcgagga aaagatcaag cagctcctga gcaaagagaa cttgacccct 1440

gacgaggaat ccgaactgat caagaccaag aagcagctcg acaacgctct ggaaatgctg 1500

aacgtccccg acgacaccat ccgtgtggat atgtgggtta acaacaacaa caagctggaa 1560

aaagagatcc tctacaccaa ggccgagctg taa 1593

<210> 13

ccggaattca tggacttcat cctgaacatc ag 32

<210> 14

cggggtacct cagatgtagg tcaggtagaa g 31

<210> 15

ccggaattca tggacagcga gttcttcc 28

<210> 16

cggggtacct cacaggctgt tttccagg 28

<210> 17

ccggaattca tggcttctgg cggagcc 27

<210> 18

cggggtacct catgtgctgt atctcagc 28

<210> 19

ccggaattca tggccgagtt caacatcg 28

<210> 20

cggggtacct cacagctcgg ccttggtg 28

<210> 21

cgcggatcca tgcatcatca ccatcaccat gacttcatcc tgaacatc 48

<210> 22

cccaagcttt tagtgatggt gatggtgatg gatgtaagtc aggtagaagc tg 52

<210> 23

cgcggattca tgcatcatca ccatcaccat gactccgagt tcttccag 48

<210> 24

cccaagcttt tagtgatggt gatggtgatg cagggagttc tccaggtcc 49

<210> 25

ccgctcgaga tgcatcatca ccatcaccat gcctccggcg gagctttc 48

<210> 26

cggggtacct tagtgatggt gatggtgatg ggtggagtaa cgcagc 46

<210> 27

cgcggatcca tggattacaa ggatgacgac gataaggccg agttcaacat cgac 54

<210> 28

cgggaattct tagtgatggt gatggtgatg cagctcggcc ttggtgtag 49

<210> 29

Ile Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu Ser Ser Ala

1 5 10

<210> 30

Phe Glu Gln Glu Pro Ser Ser Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys

1 5 10

<210> 31

Ile Tyr Gly Thr Pro Leu Lys Glu Glu Glu Lys Glu Val Val

1 5 10

<210> 32

Arg Lys Lys Lys Ala Ala Ala Ile Glu Glu Glu Asp Ile Gln

1 5 10

<210> 33

Asn Lys Pro Val Thr Asp Asn Pro Val Thr Asp Arg Leu Val

1 5 10

<210> 34

Gln Arg Asn Thr Tyr Thr His Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu

1 5 10

<210> 35

Gly Lys Pro Asp Pro Glu Pro Thr Leu Ser Gln Ile Glu Glu

1 5 10

<210> 36

Asp Leu His Lys Pro His Gln Ser Lys Pro Ile Leu Thr Asp

1 5 10

<210> 37

Ile Pro Phe Gly Glu Arg Phe Ile Thr Ile Lys Leu Ala Ser

1 5 10

<210> 38

Pro Asp Ala Cys Ser Ser Ile Ser Asp Ile Ser Pro Val Thr

1 5 10

<210> 39

Ile Asp Glu Leu Leu Lys Asn Val Leu Glu Asp Pro Ser Thr

1 5 10

<210> 40

Leu Glu Phe Ala Phe Ile Ile Tyr Asp Val Val Asp Ser Ser

1 5 10

<210> 41

Asp Cys Glu Glu Lys Ile Lys Gln Leu Leu Ser Lys Glu Asn

1 5 10