一种对外界环境中可利用磷酸盐浓度变化发生感应的分子元件及其突变分子元件和应用

摘要

本发明提供了一种对外界环境中可利用磷酸盐浓度变化发生感应的分子元件及其突变分子元件和应用，属于分子生物学技术领域。一种对外界环境中可利用磷酸盐浓度变化发生感应的分子元件的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述分子元件在有机膦降解或构建有机膦降解的转基因微生物中的应用。本发明还提供了一种对外界环境中可利用磷酸盐浓度变化发生感应的突变分子元件，在所述分子元件的基础上将Pho box3结构域突变为TGCCGGCC，该突变分子元件在蓝细菌中表现出比野生型分子元件灵敏度更高的磷酸盐检测能力，与荧光报告基因相连导入微生物中，可用于环境中可利用磷浓度的精细检测。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种对外界环境中可利用磷酸盐浓度变化发生感应的分子元件及其突变分子元件和应用。

背景技术

磷元素是一切生命体的必需成分，是遗传物质包括DNA，RNA以及生命活动的体现物质蛋白质的重要组成部分。作为在植物生长过程中必须的，不可或缺的大量元素，是否有充足的磷源常常成为植物生长的重要限制因素

随着工业化时代的发展，很多工业以及生活的必需品中都含有大量的有机膦成份，包括染料，抗生素，洗涤剂，农药等产品中都含有有机膦成分

最新的报道显示具有有机膦降解基因簇的蓝细菌菌株大约有27株，其仅占所有基因组测序蓝细菌种类的5％左右

考虑到在利用微生物进行生物修复和降解环境及废水中有机膦过程中不可避免的会面临环境中所具有的无机磷成份的存在及其对有机膦的降解有一定程度的抑制作用，因此，急需提供一种指示环境中无机磷浓度的分子元件。

磷元素作为植物及藻类的必需营养成份，其存在对于植物的生长及健康非常重要。但其过量积累尤其在水环境中会引起水体的富营养化，导致水体中藻类等生物体的大量生长并通过呼吸作用过度消耗了水体中的氧气，从而对水体中其他生物的生存造成了致命的伤害。因此建立起一套简单易行并且可以快速检测水体环境中的生物体可利用的磷营养元素浓度变化的技术就显的尤为重要。而目前的磷浓度的检测主要通过化学反应然后借助光学以及电化学的仪器进行检测

参考文献

[1].Ceulemans,T.et al.Phosphorus resource partitioning shapesphosphorus acquisition and plant species abundance in grasslands.Nat.PLANTS3,(2017).

[2].Karl,D.M.Microbially Mediated Transformations of Phosphorus inthe Sea:New Views of an Old Cycle.Annu.Rev.Mar.Sci.6,279–337(2014).

[3].McGrath,J.W.,Chin,J.P.&Quinn,J.P.Organophosphonates revealed:newinsights into the microbial metabolism of ancientmolecules.Nat.Rev.Microbiol.11,412–419(2013).

[4].Sasaki,M.Current Status of Organophosphorus Insecticide andStereochemistry.Phosphorus Sulfur Silicon Relat.Elem.183,291–299(2008).

[5].Salgado-Escobar,O.,Hernández-Guadarrama,A.,Romero-Estudillo,I.&Linzaga-Elizalde,I.Direct Synthesis of Phosphonates andα-Amino-phosphonatesfrom1,3-Benzoxazines.Molecules 24,(2019).

[6].Kononova,S.V.&Nesmeyanova,M.A.Phosphonates and their degradationby microorganisms.Biochem.Biokhimiia 67,184–195(2002).

[7].Teikari,J.E.et al.Strains of the toxic and bloom-formingNodularia spumigena(cyanobacteria)can degrade methylphosphonate and releasemethane.ISME J.12,1619–1630(2018).

[8].Dyhrman,S.T.et al.Phosphonate utilization by the globallyimportant marine diazotroph Trichodesmium.Nature 439,68–71(2006).

[9].Drzyzga,D.,Forlani,G.,Vermander,J.,Kafarski,P.&Lipok,J.Biodegradation of the aminopolyphosphonate DTPMP by the cyanobacteriumAnabaena variabilis proceeds via a C–P lyase-independentpathway.Environ.Microbiol.19,1065–1076(2017).

[10].Bhaya,D.et al.Population level functional diversity in amicrobial community revealed by comparative genomic and metagenomicanalyses.ISME J.1,703–713(2007).

[11].Islam,S.,Reza,M.N.,Jeong,J.-T.&Lee,K.-H.Sensing Technology forRapid Detection of Phosphorus in Water:A Review.J.Biosyst.Eng.41,138–144(2016).

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种对外界环境中可利用磷酸盐浓度变化发生感应的分子元件及其应用，所述分子元件可以依据外界磷酸盐浓度的高低表达出不同的荧光报告基因强度，从而建立起外界环境中磷酸盐浓度变化与细胞表达荧光报告基因的线性关系。

本发明还提供了一种对外界环境中可利用磷酸盐浓度变化发生感应的突变分子元件及其应用，在蓝细菌中表现出比野生型分子元件(pPcpl)灵敏度更高的磷酸盐检测能力。

本发明提供了一种对外界环境中可利用磷酸盐浓度变化发生感应的分子元件，所述分子元件的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供了所述对外界环境中可利用磷酸盐浓度变化发生感应的分子元件在有机膦降解中的应用。

本发明提供了一种用于有机膦降解的转基因微生物，包含所述分子元件。

本发明提供了一种利用所述分子元件检测外界环境中可利用磷酸盐浓度的方法，包括以下步骤：

1)将所述分子元件与GFP荧光报告基因相连并分子克隆到载体中，得到重组载体；

2)将所述重组载体以三亲结合方法转入集胞藻中，得到重组集胞藻；

3)将所述重组集胞藻置于标准BG11培养基中培养36～40h后置于外部环境中，检测荧光信号。

优选的，当所述外部环境中磷酸盐浓度≥115μM时所述分子元件被抑制，GFP绿色荧光蛋白不表达；在磷酸盐浓度≤23μM时所述分子元件被彻底激活，完全表达GFP绿色荧光蛋白；在磷酸盐浓度为57.5μM时，所述分子元件处于半开状态，表达GFP绿色荧光蛋白。

本发明提供了一种对外界环境中可利用磷酸盐浓度变化发生感应的突变分子元件，在所述分子元件的基础上，将TATCAGGC突变为TGCCGGCC。

优选的，所述突变分子元件的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明提供了所述突变分子元件在精细指示环境中可利用磷酸盐浓度或构建指示环境中可利用磷酸盐浓度的重组细胞中的应用。

优选的，与所述分子元件相比，所述突变分子元件对外部磷酸盐浓度的变化会产生更为明显的下游报告基因的荧光强度及敏感性。

本发明提供了一种用于指示环境中可利用磷酸盐浓度的检测试剂盒，包括含所述分子元件或所述突变分子元件的重组细胞。

本发明提供了一种对外界环境中可利用磷酸盐浓度变化发生感应的分子元件，所述分子元件的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明首次从Synechococcus OS-B’中鉴定到了一段具有介导蓝细菌对外界环境中可利用磷酸盐浓度变化发生感应的分子元件，该元件可以在外界磷酸盐浓度发生变化时条件性表达下游的荧光报告基因。同时本发明提供的分子元件根据环境中不同浓度的磷酸盐而表现出不同的活性，具体为所述分子元件的调控是通过感受系统实现，该感受系统是在Pho操纵子的操纵下完成，该操纵子的主要成份由跨膜的磷酸感受激酶SphS以及下游的应答操纵元件SphR双组分系统组成。该操纵单元还需要磷酸盐结合蛋白PstS，跨膜的PstA，PstB和PstC蛋白复合体以及起变构作用的SphU蛋白的参与。当细胞处于低磷浓度时，磷酸感受激酶SphS处于默认的磷酸化激活状态，并可以进一步对下游的应答操纵元件SphR磷酸化。磷酸化的SphR作为转录因子进一步结合到所鉴定到的分子元件上，从而起始下游荧光报告基因的表达。而在磷元素富集的条件下，跨膜感受系统复合物(PstAB2C)会激活SphS的组胺化磷酸酶活性并导致下游的应答操纵元件SphR的去磷酸化，从而使所述分子元件处于抑制状态，导致下游报告基因表达关闭。并且该分子元件可以依据外界磷酸盐浓度的高低表达出不同的荧光报告基因强度，从而建立起外界环境中磷酸盐浓度变化与细胞表达荧光报告基因的线性关系。实验表明，当所述外部环境中磷酸盐浓度≥115μM时所述分子元件被抑制，GFP绿色荧光蛋白不表达；在磷酸盐浓度≤23μM时所述分子元件被彻底激活，完全表达GFP绿色荧光蛋白；在磷酸盐浓度为57.5μM时，所述分子元件处于半开状态，中度表达GFP绿色荧光蛋白。

本发明提供了所述对外界环境中可利用磷酸盐浓度变化发生感应的分子元件在有机膦降解中的应用。由于本发明提供的分子元件处于半开状态(强度约为50％)时磷酸盐浓度(57.5μM)高于正常环境中无机磷浓度，因此将所述分子元件应用于转基因微生物的有机膦降解中，所述分子元件因感应外界环境中磷酸盐的浓度高于实际环境中无机磷的含量，因此可以启动下游有关降解有机膦的基因的表达，从而实现有机膦的降解不受环境中无机磷存在的限制。

本发明提供了一种利用所述分子元件检测外界环境中可利用磷酸盐浓度的方法，本发明利用藻类本身的可以对作为生物体营养元素的磷类化合物的一个整体感受系统及关键操作子所述分子元件，能够将所有可以被蓝细菌吸收和利用作为营养元素的含磷化合物进行一个整体的应答，从而使其在水体富营养化的环境监测中具有更为贴切的应用意义和价值。在本发明中，将所述分子元件与下游荧光报告基因相连，从而获得一套可用于检测环境中生物体可利用磷浓度高低的方法，具有应用价值高、可回收利用的特点。

本发明提供的对外界环境中可利用磷酸盐浓度变化发生感应的突变分子元件，是在所述分子元件的基础上将TATCAGGC突变为TGCCGGCC。本发明对所述分子元件中的三个核心结构域的功能进行了鉴定，结果表明Pho box1和Pho box2是所述分子元件感受外界磷酸盐浓度变化所必须的基本元件，它们中任意一个的缺失都会导致分子元件彻底失去感受外界磷酸盐浓度变化的能力，Pho box3则不是该分子元件感受外界磷酸盐浓度变化所必须的，但Pho box3突变分子元件(pPcplB3)在蓝细菌中表现出比野生型分子元件(pPcpl)灵敏度更高的磷酸盐检测能力，分析其原因可能是Pho boxes的三个结构域可能与应答操纵元件SphR有着不同的结合方式，在起始分子元件的表达上起着不同的作用。其中Pho box1和2可能结合在SphR的同侧，起着正向的促进作用；而Pho box3却通过回旋的方式结合在SphR的异侧，从而能够减缓SphR起始转录的效率，使所述分子元件的表达强度能够控制在一个合适的范围。当将Pho box3中的TATCAGGC突变为TGCCGGCC序列后，其失去了与SphR结合和控制转录起始效率的能力，从而使得pPcplB3突变分子元件应答强度提高。实验表明，Phobox3突变体表现出比野生型分子元件更高的活性。实验表明，突变分子元件与所述分子元件相比其对外部磷酸盐浓度的变更会产生更为明显的下游报告基因的荧光强度及敏感性。由于所述突变分子元件的灵敏度较高，可以用于精细指示环境中无机磷浓度及其变化情况。

附图说明

图1为本发明提供的分子元件的调控机理示意图；

图2为包含分子元件的重组细胞的构建方法示意图；图2A为将所述分子元件与GFP荧光报告基因相连并克隆在蓝细菌可复制质粒载体上；图2B为将所构建载体转化进入模式菌株集胞藻后，对细胞的后继处理流程以及荧光信号强度的检测；

图3为SyPcpl菌株在不同磷浓度BG11培养基处理后，该研究中的分子元件的激活与抑制状态与细胞外磷元素的浓度的关系，其中图3A是通过酶标仪进行了细胞群体的荧光检测结果；图3B是GFP蛋白的Western杂交技术检测结果；图3C是利用荧光共聚焦显微镜进行了单个细胞水平的荧光检测结果；

图4为所述分子元件的活性与细胞外磷原子浓度之间的线性关系；图4A为SyPcpl菌株在不同磷酸盐浓度BG11培养基下细胞群体的荧光检测结果柱形图；图4B为SyPcpl菌株在不同磷酸盐浓度BG11培养基下细胞群体表达荧光强度；表明分子元件在磷酸盐浓度大于等于115μM时被抑制，而在磷元素浓度小于23μM时彻底激活；

图5为对Pho Boxes的三个核心结构域的功能进行了进一步的鉴定结果，其中图5A是对Pho boxes的三个结构域进行突变的载体的构建；图5B是将构建的重组载体转化进入集胞藻后，分子元件及其突变体在高磷及低磷浓度下的活性检测，图5C为Pho box3突变体表现出比野生型分子元件更高的活性，图5D为Pho box3突变体的调控模式图。

具体实施方式

本发明提供了一种对外界环境中可利用磷酸盐浓度变化发生感应的分子元件，所述分子元件的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示(TAGCTTTCGCTAAGGATGATTTCTGGCTCCTCCGGTGAAAGGGCTCTGGGGGACTGCCAAGAGAGGCCCGAGATCACAGCAGCAGCCATAAGGGTTTGGCAGAAAACCAATCGAGATTATTAGCAGGATAGCAGAGCAAGCTCTCCCAGGGGTACCTCCAAGAGCGCCCTCCAGGCCAAAGCCAGTTTCGAGAAGCCATTGAGAAGTCCTGCTGCCCAGGCCAGCAAAGCTTAACTTGGTTTTAACTTCAGTATCAGGCCAATCTGCTAAGTTTGTTACCGGTTTTCCCGCCGTGAGGTAGCTTATGCGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTG)，长度为332bp。所述分子元件来源于Synechococcus OS-B’。所述分子元件可以在外界磷酸盐浓度发生变化时条件性表达下游的荧光报告基因。该分子元件可以依据外界磷酸盐浓度的高低表达出不同的荧光报告基因强度，从而建立起外界环境中磷酸盐浓度变化与细胞表达荧光报告基因的线性关系。实验表明，在230μM、172.5μM、115μM、57.5μM、23μM、11.5μM和23μM的磷酸盐浓度下，采用不同方式测定所述分子元件下游连接的荧光报告基因表达强度和荧光信号值，结果表明，当所述外部环境中磷酸盐浓度≥115μM时所述分子元件被抑制，GFP绿色荧光蛋白不表达；在磷酸盐浓度≤23μM时所述分子元件被彻底激活，完全表达GFP绿色荧光蛋白；在磷酸盐浓度为57.5μM时，所述分子元件处于半开状态，表达GFP绿色荧光蛋白。因此，本发明提供的所述分子元件可用于检测环境中可利用磷酸盐浓度的指示分子标记。

所述分子元件处于半开状态(强度约为50％)时，环境中磷酸盐浓度为57.5μM，而该浓度高于环境中正常无机盐浓度，因此，当将所述分子元件与有机膦降解相关的基因一同克隆至微生物中时，转基因微生物可以启动有机膦降解相关基因的表达，从而实现有机膦的降解。基于此，本发明提供了所述对外界环境中可利用磷酸盐浓度变化发生感应的分子元件在有机膦降解中的应用。在所述有机膦降解过程中，优选包括构建用于降解有机膦的转基因微生物和利用所述转基因微生物降解有机膦。在本发明中，所述用于降解有机膦的转基因微生物的构建方法，优选包括将所述分子元件和对有机膦底物种类特异性限制较低的C-P裂解酶基因连接后分子克隆至载体中，将得到的重组载体导入微生物中，经鉴定，得到转基因微生物。本发明对所述分子元件和降解有机膦的基因连接后分子克隆至载体的方法不做具体限定，采用本领域所熟知的基因连接和克隆方法即可。本发明所述微生物的种类不做具体限定采用本领域所熟知的微生物即可，例如蓝细菌、细菌等。本发明对所述鉴定的方法不做具体限定，采用本领域所熟知的构建方法即可，例如采用PCR扩增的方法检测分子元件或降解有机膦相关基因。利用所述转基因微生物降解有机膦的方法优选将所述转基因微生物置于待降解有机膦的环境中，以便实现有机膦的降解。

本发明提供了一种用于有机膦降解的转基因微生物，包含所述分子元件。本发明对所述转基因微生物的构建方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的构建方法即可。

本发明提供了一种利用所述分子元件检测外界环境中可利用磷酸盐浓度的方法，包括以下步骤：

1)将所述分子元件与GFP荧光报告基因相连并分子克隆到载体中，得到重组载体；

2)将所述重组载体以三亲结合方法转入集胞藻中，得到重组集胞藻；

3)将所述重组集胞藻置于标准BG11培养基中培养36～40h后置于外部环境中，检测荧光信号。

本发明将所述分子元件与GFP荧光报告基因相连并分子克隆到载体中，得到重组载体。

在本发明中，优选将所述分子元件与GFP荧光报告基因(atgcgtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactactttcggttatggtgttcaatgctttgcgagatacccagatcatatgaaacagcatgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaaagaactatatttttcaaagatgacgggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattcttggacacaaattggaatacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagttaacttcaaaattagacacaacattgaagatggaagcgttcaactagcagaccattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaataataa，SEQ IN NO:10)相连并分子克隆到利用EcoRI和PstI双酶切的在蓝细菌可复制质粒pPMQAK1中，从而得到pPcpl-GFP重组载体。经过鉴定后，将含分子元件与GFP荧光报告基因的重组载体用于后续实验。所述鉴定的方法优选采用PCR扩增方法进行，所述PCR扩增用引物对包括正向引物(CGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC，SEQ IN NO:3)和反向引物(CCTTGCCCTTTTTTGCCGGAC，SEQ IN NO:4)。

得到重组载体后，本发明将所述重组载体以三亲结合方法转入集胞藻中，得到重组集胞藻。

在本发明中，所述三亲结合方法可参见现有技术(Elhai,J.&Wolk,C.P.Conjugaltransfer of DNA to cyanobacteria.Methods Enzymol.167,747–754(1988).)进行。

得到重组集胞藻后，本发明将所述重组集胞藻置于标准BG11培养基中培养36～40h后置于外部环境中，检测荧光信号。

在本发明中，所述标准BG11培养基的配方如下：

其中，其它微量元素的组成成分如下:

在本发明中，所述外部环境包括无磷BG11培养基和低磷BG11培养基。在无磷和低磷BG11培养基的配制中，其它所有成分都是相同的，只是去除或者减少了K

。

在本发明中，所述外部环境还优选包括富磷水体。当所述外部环境中磷酸盐浓度≥115μM时所述分子元件被抑制，GFP绿色荧光蛋白不表达；在磷酸盐浓度≤23μM时所述分子元件被彻底激活，完全表达GFP绿色荧光蛋白；在磷酸盐浓度为57.5μM时，所述分子元件处于半开状态，表达GFP绿色荧光蛋白。在本发明中，所述荧光检测方法优选包括荧光共聚焦细胞观察、GFP蛋白抗体western杂交技术以及酶标仪的荧光检测技术。

本发明提供了一种对外界环境中可利用磷酸盐浓度变化发生感应的突变分子元件，在所述分子元件的基础上，将TATCAGGC突变为TGCCGGCC。所述突变分子元件的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：2所示(TAGCTTTCGCTAAGGATGATTTCTGGCTCCTCCGGTGAAAGGGCTCTGGGGGACTGCCAAGAGAGGCCCGAGATCACAGCAGCAGCCATAAGGGTTTGGCAGAAAACCAATCGAGATTATTAGCAGGATAGCAGAGCAAGCTCTCCCAGGGGTACCTCCAAGAGCGCCCTCCAGGCCAAAGCCAGTTTCGAGAAGCCATTGAGAAGTCCTGCTGCCCAGGCCAGCAAAGCTTAACTTGGTTTTAACTTCAGTGCCGGGCCAATCTGCTAAGTTTGTTACCGGTTTTCCCGCCGTGAGGTAGCTTATGCGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTG)。

在本发明中，前期的文献报道在蓝细菌中得出的结论是Pho Boxes中的三个结构域(Pho box1、Pho box2和Pho box3)对DNA的结合及活性功能都较为重要(Suzuki,S.,Ferjani,A.,Suzuki,I.&Murata,N.The SphS-SphR Two Component System Is theExclusive Sensor for the Induction of Gene Expression in Response toPhosphate Limitation in Synechocystis.J.Biol.Chem.279,13234–13240(2004).和Elhai,J.&Wolk,C.P.Conjugal transfer of DNA to cyanobacteria.MethodsEnzymol.167,747–754(1988).)，本发明对所述分子元件中的三个核心结构域的功能进行了鉴定。对三个结构域分别构建了不同的结构域突变载体，并将其转入集胞藻中进行检测。鉴定结果显示，Pho box1和Pho box2是该研究中的分子元件感受外界磷酸盐浓度变化所必须的基本元件，Pho box3对维持该研究中分子元件感受外界磷酸盐浓度变化并不必要，但是它却在维持该分子元件在菌体中表现出正常活性非常关键，它的缺失使得菌体对外界磷酸盐浓度变化反应强度过大。本发明提供的Pho box3突变分子元件(pPcplB3)在蓝细菌中表现出比野生型分子元件(pPcpl，SEQ ID NO:1)灵敏度更高的磷酸盐检测能力。在本发明中，突变分子元件与所述分子元件相比其对外部磷酸盐浓度的变更会产生更为明显的下游报告基因的荧光强度及敏感性。

由于所述突变分子元件比野生型分子元件(pPcpl)灵敏度更高的磷酸盐检测能力，因此本发明提供了所述突变分子元件在精细指示环境中可利用磷酸盐浓度或构建指示环境中可利用磷酸盐浓度的重组细胞中的应用，同时本发明提供了一种用于指示环境中可利用磷酸盐浓度的检测试剂盒，包括含所述突变分子元件的重组细胞。

本发明对所述精细指示环境中可利用磷酸盐浓度的方法没有特殊限制，采用上述记载的检测方法即可，在此不做赘述。本发明对含所述突变分子元件的重组细胞的构建方法不做具体限定，采用上述记载的构建含所述分子元件的重组微生物的方法即可，在此不做赘述。

下面结合实施例对本发明提供的一种对外界环境中可利用磷酸盐浓度变化发生感应的分子元件及其突变分子元件和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种含pPcpl分子元件或突变分子元件的重组细胞的构建方法

1.重组载体的构建

利用Gibson片段组装的方法进行载体的构建，其主要由三部分构成：

第一部分为质粒载体pPMQAK1的酶切，该部分来自于将Ptrc1O-GFP质粒(参见Huang,H.-H.,Camsund,D.,Lindblad,P.&Heidorn,T.Design and characterization ofmolecular tools for a Synthetic Biology approach towards developingcyanobacterial biotechnology.Nucleic Acids Res.38,2577–2593(2010).)进行EcoRI和PstI双酶切，从而产生7981bp的片段并切胶回收。

第二部分为根据分子元件部分(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列合成的DNA片段进行EcoRI和PstI双酶切。

第三部分为荧光报告基因的扩增：采用正向引物(CGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC，SEQIN NO:3)和反向引物(CCTTGCCCTTTTTTGCCGGAC，SEQ IN NO:4)以Ptrc1O-GFP质粒(Huang,H.-H.,Camsund,D.,Lindblad,P.&Heidorn,T.Design and characterization ofmolecular tools for a Synthetic Biology approach towards developingcyanobacterial biotechnology.Nucleic Acids Res.38,2577–2593(2010).)为模板扩增得到。

将通过Gibson片段组装(Gibson,D.G.et al.Enzymatic assembly of DNAmolecules up to several hundred kilobases.Nat.Methods 6,343–345(2009).)，得到pPcpl-GFP载体并转入大肠杆菌进行测序验证，测序用引物包括正向测序引物(SEQ IN NO:5，GGCGACACGGAAATGTTGAATAC)和反向测序引物(SEQ IN NO:6，CCTTTGAGTGAGCTGATACCGC)，从而得到重组载体，见图2A。

2.集胞藻的载体转化

将上述构建的重组载体以三亲结合的方法转入集胞藻中，转化方法可参见现有技术(Elhai,J.&Wolk,C.P.Conjugal transfer of DNA to cyanobacteria.MethodsEnzymol.167,747–754(1988).)，提取转化子的基因组作为模板进行PCR扩增以及测序验证。在获得包含目标序列的蓝细菌转化子命名为SyPcpl菌株，可以进行后继的实验操作。

实施例2

SyPcpl菌株的后继处理

将SyPcpl菌株生长于标准BG11培养基中，该培养基含有较高浓度的磷酸盐浓度(PO4

表1标准BG11培养基的配方

表2表1中其它微量元素组成成分

。

在配制1升的无磷和低磷BG11培养基分别用K

表3无磷或低磷BG11培养基中K

在不同的时间段取样利用不同的技术进行荧光信号的检测(图2B)。所用的检测方法包括荧光共聚焦细胞观察、GFP蛋白抗体western杂交技术、以及酶标仪的荧光检测技术(Jin,H.,Kim,R.&Bhaya,D.Deciphering proteolysis pathways for the error-proneDNA polymerase in cyanobacteria.Environ.Microbiol.doi.org/10.1111/1462-2920.14911,(2020).)。

结果见图3。在图3中分别从群体细胞荧光蛋白积累量(图3A)、Western杂交蛋白积累量(图3B)、以及单个细胞的荧光蛋白(图3C)水平等多个层面检测了GFP荧光蛋白在不同磷浓度条件下的表达水平。从检测结果可以得到结论，SyPcpl菌株在无磷(0μM)及低磷(2.3μM)浓度下均可以表达较强的GFP荧光报告基因，即所述分子元件在此条件下处于激活的状态。而在较高磷浓度(230μM)的条件下所述分子元件则处于抑制状态，所以没有检测到任何的GFP绿色荧光蛋白。

通过进一步对SyPcpl菌株的细胞外磷酸盐浓度的感受进行了精细的量化分析。将细胞按图2B中的方法处理后，将其悬浮于不同磷酸盐浓度梯度的培养基(图3)中进行培养。观察到当细胞外磷原子的浓度≥115μM时，所述分子元件将处于彻底关闭的状态(强度为0)；当磷原子浓度为57.5μM时，分子元件处于半开状态(强度约为50％，该强度是对比图4A中荧光强度在57.5μM浓度时大约的数值为250左右与菌体在11.2和2.3μM浓度时大约的数值为500左右所得)。而当环境中的磷原子浓度≤23μM时，分子元件将彻底激活(强度将达到100％)。本发明首次定义了磷操纵元件于细胞外磷酸盐浓度之间的线性关系，并为进一步更好的利用该元件进行后继工程改造提供了宝贵的理论基础及指导。

实施例3

Pho Boxes中的三个结构域(Pho box1，Pho box2和Pho box3)对DNA的结合及活性功能都较为重要，进一步对该研究的分子元件中的三个核心结构域的功能进行了鉴定。针对三个结构域分别构建了不同的结构域突变载体(图5A)，并将其转入集胞藻中进行检测。按照实施例1的方法分别将pPcplB1片段(Pho box1区域突变片段，SEQ ID NO:7)、pPcplB2片段(Pho box2区域突变片段，SEQ ID NO:8)、pPcplB3片段(Pho box3区域突变片段，SEQID NO:2)和pPcplB1&3片段(Pho box1和Pho box3区域均突变片段，SEQ ID NO:9)插入载体中，构建重组载体，将构建的重组载体分别转入集胞藻中，经验证得到4株重组集胞藻藻株。采用实施例2的方法检测各重组集胞藻的细胞群体荧光信号。

鉴定结果显示，Pho box1和Pho box2是所述分子元件感受外界磷酸盐浓度变化所必须的基本元件，它们中任意一个的缺失都会导致分子元件彻底失去感受外界磷酸盐浓度变化的能力。而Pho box3则不是该分子元件感受外界磷酸盐浓度变化所必须的(图5B)。研究发现，虽然Pho box3对维持该研究中分子元件感受外界磷酸盐浓度变化并不必要，但是它却在维持该分子元件在菌体中表现出正常活性非常关键，它的缺失使得菌体对外界磷酸盐浓度变化反应强度过大(图5C)。这一功能在生物学进化上对于防止了菌体在磷酸盐缺失条件下对磷酸盐吸收利用功能基因的过度表达，从而使目标蛋白过量积累，即给菌体造成了额外的代谢负担，也造成了菌体本身能源的浪费。

所构建的Pho box3突变分子元件(pPcplB3)在蓝细菌中表现出比野生型分子元件(pPcpl)灵敏度更高的磷酸盐检测能力。分析原理是Pho boxes的三个结构域可能与应答操纵元件SphR有着不同的结合方式，在起始分子元件的表达上起着不同的作用。其中Phobox1和Pho box2可能结合在SphR的同侧，起着正向的促进作用；而Pho box3却通过回旋的方式结合在SphR的异侧，从而能够减缓SphR起始转录的效率，使分子元件的表达强度能够控制在一个合适的范围。当将Pho box3突变后，其失去了与SphR结合和控制转录起始效率的能力，从而使得pPcplB3分子元件应答强度提高(图5D)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京林业大学

<120> 一种对外界环境中可利用磷酸盐浓度变化发生感应的分子元件及其突变分子元件和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 332

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tagctttcgc taaggatgat ttctggctcc tccggtgaaa gggctctggg ggactgccaa 60

gagaggcccg agatcacagc agcagccata agggtttggc agaaaaccaa tcgagattat 120

tagcaggata gcagagcaag ctctcccagg ggtacctcca agagcgccct ccaggccaaa 180

gccagtttcg agaagccatt gagaagtcct gctgcccagg ccagcaaagc ttaacttggt 240

tttaacttca gtatcaggcc aatctgctaa gtttgttacc ggttttcccg ccgtgaggta 300

gcttatgcgt aaaggagaag aacttttcac tg 332

<210> 2

<211> 332

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tagctttcgc taaggatgat ttctggctcc tccggtgaaa gggctctggg ggactgccaa 60

gagaggcccg agatcacagc agcagccata agggtttggc agaaaaccaa tcgagattat 120

tagcaggata gcagagcaag ctctcccagg ggtacctcca agagcgccct ccaggccaaa 180

gccagtttcg agaagccatt gagaagtcct gctgcccagg ccagcaaagc ttaacttggt 240

tttaacttca gtgccgggcc aatctgctaa gtttgttacc ggttttcccg ccgtgaggta 300

gcttatgcgt aaaggagaag aacttttcac tg 332

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgtaaaggag aagaactttt cac 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccttgccctt ttttgccgga c 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggcgacacgg aaatgttgaa tac 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctttgagtg agctgatacc gc 22

<210> 7

<211> 332

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tagctttcgc taaggatgat ttctggctcc tccggtgaaa gggctctggg ggactgccaa 60

gagaggcccg agatcacagc agcagccata agggtttggc agaaaaccaa tcgagattat 120

tagcaggata gcagagcaag ctctcccagg ggtacctcca agagcgccct ccaggccaaa 180

gccagtttcg agaagccatt gagaagtcct gctgcccagg ccagcaaagc ccggcttggt 240

tttaacttca gtatcaggcc aatctgctaa gtttgttacc ggttttcccg ccgtgaggta 300

gcttatgcgt aaaggagaag aacttttcac tg 332

<210> 8

<211> 332

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tagctttcgc taaggatgat ttctggctcc tccggtgaaa gggctctggg ggactgccaa 60

gagaggcccg agatcacagc agcagccata agggtttggc agaaaaccaa tcgagattat 120

tagcaggata gcagagcaag ctctcccagg ggtacctcca agagcgccct ccaggccaaa 180

gccagtttcg agaagccatt gagaagtcct gctgcccagg ccagcaaagc ttaacttggt 240

tccggcttca gtatcaggcc aatctgctaa gtttgttacc ggttttcccg ccgtgaggta 300

gcttatgcgt aaaggagaag aacttttcac tg 332

<210> 9

<211> 332

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tagctttcgc taaggatgat ttctggctcc tccggtgaaa gggctctggg ggactgccaa 60

gagaggcccg agatcacagc agcagccata agggtttggc agaaaaccaa tcgagattat 120

tagcaggata gcagagcaag ctctcccagg ggtacctcca agagcgccct ccaggccaaa 180

gccagtttcg agaagccatt gagaagtcct gctgcccagg ccagcaaagc ccggcttggt 240

tttaacttca gtgccgggcc aatctgctaa gtttgttacc ggttttcccg ccgtgaggta 300

gcttatgcgt aaaggagaag aacttttcac tg 332

<210> 10

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgcgtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180

gtcactactt tcggttatgg tgttcaatgc tttgcgagat acccagatca tatgaaacag 240

catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300

aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360

aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420

ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660

cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataataa 720