一种利用水稻内源序列抑制HSL1基因表达的RNAi植物表达载体及其应用

摘要

本发明涉及一种利用水稻内源序列抑制HSL1基因表达的RNAi植物表达载体及其应用，以及一种干扰植物HSL1(HIS1‑Like)基因表达的方法和获得除草剂显性敏感植物的方法。将本发明的RNAi植物表达载体转化水稻，能够成功抑制基因HSL1的表达，并将水稻从对除草剂具有抗性转变为敏感，使得转基因植株可以通过施用除草剂被清除，从而培育了一种除草剂显性敏感的水稻。该水稻在培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种利用水稻内源序列类似HPPD抑制剂敏感型1基因HSL1(HIS1-Like基因)的植物干扰表达载体和其构建方法及应用。

背景技术

转基因技术在各种农作物领域的应用越来越广泛。然而转基因产品自诞生之日起产生的争议，至今仍甚嚣尘上。因此，转基因产品需要加以严格的控制和监管，防止转基因漂移污染其他品种甚至其他物种就显得尤为重要。因此，需要建立一种能够定向清除杂交种子或转基因植株的机制。培育获得除草剂敏感的不育系是解决问题的有效手段之一。

β-三酮类除草剂(b-Triketone herbicides,bTHs)是4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂，广泛应用于农业，可有效地防除多种阔叶杂草和禾本科杂草。呋喃磺草酮(Tefuryltrione,TFT)属三酮类除草剂之一，可抑制植物生长中不可或缺的色素合成，通过根、茎、幼芽、叶吸收并迅速传导，HPPD是目前最重要的除草剂作用靶标之一。HPPD抑制剂类除草剂是通过抑制植物体内生育酚及质体醌合成，导致类胡萝卜素生物合成受阻，最终使植物体内叶绿素破坏，导致叶片发白，最终枯萎死亡。HPPD抑制剂类除草剂作用机理独特，与当前市场主流药剂不存在交互抗性，所以可有效解决当前抗性恶性杂草问题。呋喃磺草酮是我国目前水稻田已获登记的四个HPPD抑制剂中对水稻最安全的HPPD抑制剂类除草剂。呋喃磺草酮通过杂草根、茎、幼芽和叶片均可吸收，可同时防控禾本科杂草和阔莎草。

水稻有6个HIS1-like基因(HSL)，且高度保守。5个HSL(1/2/4/5/6)位于Chr6以基因簇的方式存在。HSL所编码蛋白具有双链β螺旋折叠，是Fe(II)/2-酮戊二酸依赖型加氧酶蛋白的典型结构特征。进化分析表明，植物中的HSL基因可能拥有相似的功能。而研究表明，水稻OsHSL1具有对呋喃磺草酮TFT等β-三酮类除草剂的抗性。

因此，开发出一种能够有效显性抑制HSL1基因表达的技术手段，可为杂交水稻制种、培育转基因新品种、防止转基因逃逸等方面提供有效管控方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够有效的影响HSL1(HIS1-Like)基因表达的植物表达载体及其构建方法。

为达到以上目的，本发明第一方面提供一种抑制HSL1(HIS1-Like)基因表达的RNAi植物表达载体，含有发卡结构表达盒，其中所述发卡结构表达盒含有由SEQ ID No.1-3所示的DNA片段所形成的发卡结构。

SEQ ID No.1所示的DNA片段为基于HSL1编码框的正向DNA片段，长度为220bp；SEQID No.3所示的DNA片段基于HSL1编码框且与SEQ ID No.1所示的DNA片段反向互补，长度为220bp；SEQ ID No.2为来自水稻Zinc finger基因的内含子序列(Rice intron)。

SEQ ID No.1-3所示的DNA片段按照从上游到下游的方向依次排列。该发夹表达盒可在转化的植物细胞中转录形成发卡式的二级结构，SEQ ID No.2所示的DNA片段形成发卡的“环”，SEQ ID No.1和3所示的DNA片段互补形成发卡的“茎”。

发卡结构表达盒还包括位于发卡结构上游的植物组成型启动子或植物组织特异性启动子，以及，位于发卡结构下游的终止子。

其中，发卡结构表达盒的启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、Rubisco小亚基启动子、Cab启动子、CAMV 35S启动子或Actin启动子；优选的，当启动子为水稻或玉米的Ubi启动子时，能够取得非常强的干扰HSL1基因表达的效果。

所述终止子包括：NOS终止子，Ubi终止子等在植物中可以终止基因转录的DNA序列。优选的，所述终止子为NOS终止子。

本发明提供的RNAi植物表达载体还包括选择标记表达盒，所述选择标记表达盒含有启动子、标记基因和终止子，其中所述启动子为水稻或玉米的Ubi启动子，CAMV35S启动子或Actin启动子，优选的，当启动子为CAMV 35S启动子时，能够取得良好的驱动选择标记基因在植物中超量表达的效果。所述终止子为NOS终止子或Ubi终止子，优选为NOS终止子。

标记基因为可产生颜色变化的酶的基因(如GUS基因、荧光素酶基因等)、荧光标记基因(如荧光蛋白基因)、抗生素标记基因(可供筛选的抗生素标记如潮霉素、庆大霉素、卡那霉素基因)、除草剂筛选标记基因(如抗草甘膦基因、抗双草醚基因等)或抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因等)。特别优选的，所述标记基因为潮霉素基因。

用于RNAi植物表达载体构建的中间载体和具有选择标记基因的RNAi表达载体，工程菌及包含HSL1i-1茎环结构的细胞、愈伤组织、转基因苗、种子等均属于本发明的保护范围。

本发明的第二方面提供一种RNAi植物表达载体的构建方法，包括：将SEQ IDNo.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pTCK303的SacⅠ和BamHⅠ位点间，得到RNAi植物表达载体pTCK303-HSL1i-1。

具体的，所述方法可以按照以下步骤进行：

(1)设计3对引物，分别扩增SEQ ID No.1-3所示的DNA片段其中相邻的两个片段上下游引物5’端均有15个左右核苷酸序列与片段或载体相应连接位置重复，以便利用GibsonAssembly重组连接。

HSL1i-1-F:ATCGGGGAAATTCGAGCTcATGGCTGACGAGTCATGGAG

HSL1i-1-Rv1:GATTTTCAAGAAGCCCCAATTCTGCAGA

HSL1i-1-F2:GGGGCTTCTTGAAAATCTCGAAACAGCCGTGT

HSL1i-1-Rv2:GGGCTTCTGGTAAGTTACTACAAACCTTTTTGTATTTATGTTCC

HSL1i-1-F3:TAACTTACCAGAAGCCCCAATTCTGCAGA

HSL1i-1-Rv:CTGCAGGTCGACTCTAGAGgatccATGGCTGACGAGTCATGGAG

(2)RNAi植物表达载体的构建与转化

以水稻cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增HSL1i-1基因片段1，即SEQ IDNo.1。扩增体系及程序如下：

程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环,72℃再延伸5min；16℃结束。

以水稻cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增HSL1i-1基因片段3，即SEQ IDNo.3。扩增体系及程序如下：

程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环,72℃再延伸5min；16℃结束。

以水稻DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增HSL1i-1基因片段2，即SEQ IDNo.2。扩增体系及程序如下：

程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环,72℃再延伸5min；16℃结束。

获得PCR产物片段，回收后，分别命名为HSL1i-1-1(SEQ ID No.1所示序列)、HSL1i-1-2(SEQ ID No.2所示序列)及HSL1i-1-3(SEQ ID No.3所示序列)。用SacI+BamHI酶切植物双元转化载体pTCK303，将目的片段HSL1i-1-1、HSL1i-1-2及HSL1i-1-3直接连入经酶切的pTCK303质粒，获得载体pTCK303-HSL1i-1，RNAi植物表达载体pTCK303-HSL1i-1具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

本发明第三方面提供一种干扰HSL1基因表达的方法，使用上述RNAi植物表达载体转化植物，干扰植物HSL1基因表达。具体步骤如下：

(1)构建RNAi植物表达载体：将SEQ ID No.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pTCK303的SacⅠ和BamHⅠ位点间，得到RNAi植物表达载体pTCK303-HSL1i-1；

(2)转化：将pTCK303-HSL1i-1导入农杆菌EHA105菌株，并转化愈伤组织，将转化后的愈伤组织进行诱导分化获得除草剂显性敏感植物，其中，除草剂可以为β-三酮类除草剂；植物为水稻，优选的，所述植物为转基因水稻株系。

本发明所述的β-三酮类除草剂包括但不限于呋喃磺草酮。本发明的实施例中，验证发现筛选呋喃磺草酮敏感转基因株系的最低浓度为14.2mg/L的呋喃磺草酮。

本发明第四方面还提供上述RNAi植物表达载体在干扰植物HSL1(HIS1-Like)基因表达制备除草剂显性敏感植物中的应用。

本发明的RNAi植物表达载体可通过农杆菌介导遗传转化法、基因枪法、花粉管通道法等常规生物学方法转化植物细胞或组织。

优选的，将pTCK303-HSL1i-1导入农杆菌EHA105菌株，并转化愈伤组织。所述愈伤组织可以为花药诱导的愈伤组织、成熟胚诱导的愈伤组织、幼胚诱导的愈伤组织、幼穗诱导的愈伤组织。

本发明第五方面提供了所述RNAi植物表达载体在培育转基因新品种、杂交水稻制种或防止转基因逃逸中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明基于RNAi技术，通过筛选构建了一个针对水稻HSL1基因的植物双元转基因载体，该载体可高效的抑制HSL1基因，且其序列完全为水稻内源序列，可有效消除公众对于外源基因转基因引起的风险和担忧。将该载体转化水稻，成功抑制了HSL1基因的表达，并将水稻从对β-三酮类除草剂具有抗性转变为敏感，从而培育了一种对β-三酮类除草剂显性敏感的水稻。使得转基因植株可以通过施用除草剂的方式被清除。该水稻在培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有非常重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明HSL1i-1-1和HSL1i-1-3，2个目的片段扩增回收电泳图；其中1-6泳道为HSL1i-1-1目的片段；8-13泳道为HSL1i-1-3目的片段。

图2为本发明HSL1i-1-2目的片段扩增回收电泳图。

图3为本发明pTCK303骨架载体酶切回收电泳图；图中CK为pTCK303骨架载体作为对照；1-5泳道为Sac I/BamH I双酶切pTCK303骨架载体。

图4为本发明pTCK303-HSL1i-1载体经SacⅠ和BamHⅠ酶切的电泳图；图中CK为pTCK303-HSL1i-1单克隆重组质粒；泳道1-3分别为酶切的单克隆重组质粒，M为marker，所切出的片段大小904bp，包括目的片段的正向、反向互补序列及水稻内含子序列。

图5为本发明转基因株系潮霉素抗性基因PCR检测电泳图；泳道1阴性对照(中花11非转基因植株)；泳道2，阳性对照DNA；泳道3，阳性对照(pTCK303-HSL1i-1质粒)；泳道4-11，转基因株系(其中泳道9、10、11为转基因阴性株系)；M，Marker。

图6为本发明pTCK303-HSL1i-1转基因T0代三叶期幼苗叶片对21.5mg/L呋喃磺草酮溶液敏感度测试；图中WT为ZH11非转基因植株，1-2、3-2、9-2为敏感株系；D0为喷施前；D7和D14为喷施后7天和14天记录。

图7为本发明对比例1中使用不同环序列替换SEQ ID No.2序列后，构建RNAi载体后转基因苗喷施1290mg/L以上浓度呋喃磺草酮14d结果；图中箭头所指为敏感株系。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1菌株、质粒的获得及PCR引物的合成

(1)菌株和质粒

作为骨架载体的植物双元转化载体pTCK303包含潮霉素抗性基因、玉米Ubi启动子及NOS终止子。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株为DH5α；农杆菌(Agrobacterimtumefacieus)菌株为EHA105。

(2)PCR引物序列

设计3对引物，分别扩增SEQ ID No.1-3所示的DNA片段其中相邻的两个片段上下游引物5’端均有15个左右核苷酸序列与片段或载体相应连接位置重复，以便利用GibsonAssembly重组连接。

HSL1i-1-F:ATCGGGGAAATTCGAGCTcATGGCTGACGAGTCATGGAG

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实施例2 RNAi植物表达载体的构建与转化

(1)为了构建HSL1(HIS1-Like)基因的干扰载体，以水稻cDNA为模板，利用实施例1的引物进行PCR扩增HSL1i-1基因片段1和3。扩增体系及程序如下：

程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环，72℃再延伸5min；16℃结束。

程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环，72℃再延伸5min；16℃结束。

(2)以水稻DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增HSL1i-1基因片段2。扩增体系及程序如下：

程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环，72℃再延伸5min；16℃结束。

经琼脂糖凝胶电泳后，利用E.Z.N.A.

SacI+BamHI双酶切反应体系如下：

(3)2x Lightening Cloning Kit连接试剂盒

连接程序：50℃30min。

连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，重组质粒经SacⅠ和BamHⅠ双酶切，目的片段大小符合预期(见图4)，并将重组子送测序验证正确，即以水稻Zinc finger基因内含子(Rice intron)为环，构建的HSL1i-1RNAi载体，将此载体命名为pTCK303-HSL1i-1。

实施例3农杆菌转化水稻及转基因植株鉴定

将pTCK303-HSL1i-1重组质粒导入农杆菌EHA105菌株，并转化粳稻中花11愈伤组织，经潮霉素抗性筛选，分化，生根获得再生转基因株系8株，通过PCR鉴定转基因植株中转入的潮霉素抗性基因，结果见图5，PCR阳性植株5株，将阳性植株移栽至泥土中，成活5株。

实施例4水稻β-三酮类除草剂呋喃磺草酮敏感与抗性转基因株系的获得

为了检测所设计干扰载体片段在转基因植株中的效果，用商品名为垦多(含18％呋喃磺草酮)除草剂母液(拜耳作物科学(中国)有限公司，批号PH8000076)配制14.2mg/L-860mg/L呋喃磺草酮溶液，喷施实施例3获得的pTCK303-HSL1i-1转基因T0代三叶期幼苗叶片，喷后连续观察。

呋喃磺草酮21.5mg/L喷施HSL1i-1转基因5个株系，喷施后7d，部分株系叶尖开始发黄；喷施后14d，有3个株系出现叶缘干枯，叶尖不规则失绿且发黄卷曲，属于高度敏感株系(图6)；有2个株系喷施前后叶片反应不明显，属于抗性株系。

进一步使用低浓度呋喃磺草酮14.2mg/L喷施HSL1i-1转基因7个株系，喷施后14d，有2个株系出现叶片发白至枯萎，属于高度敏感株系；有1个株系出现叶片发白至叶尖枯黄，属于中敏感株系；有4个株系出现个别叶尖枯黄，属于低敏感或不敏感株系。

以上结果表明，本发明成功获得了除草剂显性敏感的转基因材料。

对比例1

为测试不同茎环对干扰效率的影响，将SEQ ID No.2内含子序列缩短至300bp后(见SEQ ID No.11)，构建载体并转化中花11获得转基因株系。

对上述转基因株系分别喷施浓度21.5mg/L-860mg/L呋喃磺草酮，结果发现转基因株系表现出较高的抗性，均存活无敏感株系。当对转基因株系喷施1290mg/L以上浓度呋喃磺草酮才有敏感表型，且敏感株系比例低，表明使用SEQ ID No.11设计的OsHSL1i对HSL1基因的干扰效率较差。使用SEQ ID No.11设计的OsHSL1i转基因株系T0代3-5叶期幼苗对1290mg/L以上浓度呋喃磺草酮14d测试结果见图7。

对比例2

进一步将SEQ ID No.2内含子序列缩短至240bp后(见SEQ ID No.12)，构建载体并转化中花11获得转基因株系。对上述转基因株系分别喷施高浓度呋喃磺草酮，结果发现转基因株系也表现出较高的抗性，其结果与对比例1中类似，表明按照此方法设计茎环的OsHSL1i对HSL1基因的干扰效率较差。

除了上述2个对比例，本发明在研究过程中，针对OsHSL1基因内含子序列选择了全内含子序列、以及OsHSL1基因内含子序列中不同截短大小的序列期望与SEQ ID No.1和3所示的DNA片段形成发卡结构，但发现这些内含子序列所示的DNA片段无法形成发卡的“环”或所形成茎环结构效率很差，进而使得它们在替换本发明SEQ ID No.2所示序列后，不能使SEQ ID No.1和3所示的DNA片段互补形成发卡的“茎”最终被顺利在体内形成双链短RNA。这充分说明了，本发明SEQ ID No.2内含子序列与SEQ ID No.1和3所示的DNA片段形成发卡结构，构建得到的植物表达载体，能够很好地抑制HSL1基因，干扰效率高，使转基因植株表现出对β-三酮类除草剂表现出显著的敏感性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 一种利用水稻内源序列抑制HSL1基因表达的RNAi植物表达载体及其应用

<130> KHP201117369.0

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 220

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctgacg agtcatggag gacgccggcg atagtgcaag agctggcggc ggccggcgtc 60

gaggagccac cgagtcggta cgtgcttggg gagaaagacc gttctgacga gctggtcgcc 120

gccgagctgc cggagcccat ccccgtcgtt gatctcagcc ggctagccgg cgccgacgag 180

gctgccaagc tcagggcggc tctgcagaat tggggcttct 220

<210> 2

<211> 478

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgaaaatctc gaaacagccg tgtcatagtc aatcattagg tgttatagga acaatcaaag 60

gttttttcaa gtgttaatct tcatactaat atatacagtg ggtactcttt atctactgcc 120

gtggaactgt catatttgat tatgaaattt tagctctaga aaatatttga tcatcaatgt 180

caagacttta tgaccttgca aaatacattt cctaattgag aacagggtaa aattatgaac 240

tatgcctctg aaccttcata cacaggcagc acattttttg ttgtaaaatt catcttaata 300

tcagcggaaa gactggacca gagaaagaaa aagttaagac aggcatatac tcttgatcct 360

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gagaacacaa ataattgtca ctggaacata aatacaaaaa ggtttgtagt aacttacc 478

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<211> 220

<212> DNA

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<210> 4

<211> 14988

<212> DNA

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<400> 4

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gaattacagg tgaccagctc gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc 2100

ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac 2160

gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg 2220

attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac 2280

taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcgggaatt aaactatcag 2340

tgtttgacag gatatattgg cgggtaaacc taagagaaaa gagcgtttat tagaataacg 2400

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cccccgccct accctcaccc cggcacagat cgcgcacgcc cgcgagctga tcgaccagga 3180

aggccgcacc gtgaaagagg cggctgcact gcttggcgtg catcgctcga ccctgtaccg 3240

cgcacttgag cgcagcgagg aagtgacgcc caccgaggcc aggcggcgcg gtgccttccg 3300

tgaggacgca ttgaccgagg ccgacgccct ggcggccgcc gagaatgaac gccaagagga 3360

acaagcatga aaccgcacca ggacggccag gacgaaccgt ttttcattac cgaagagatc 3420

gaggcggaga tgatcgcggc cgggtacgtg ttcgagccgc ccgcgcacgt ctcaaccgtg 3480

cggctgcatg aaatcctggc cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg gccggccagc 3540

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agcttgcgtc atgcggtcgc tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca aatacgcaag 3660

gggaacgcat gaaggttatc gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc aagacgacca 3720

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ccgatcccca gggcagtgcc cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa ccgctaaccg 3840

ttgtcggcat cgaccgcccg acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc cggcgcgact 3900

tcgtagtgat cgacggagcg ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg atcaaggcag 3960

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tggtggagct ggttaagcag cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa gcggcctttg 4080

tcgtgtcgcg ggcgatcaaa ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag gcgctggccg 4140

ggtacgagct gcccattctt gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac ccaggcactg 4200

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aggcgctggc cgctgaaatt aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta aagagaaaat 4320

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aacgttggcc agcctggcag acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc agttgccggc 4440

ggaggatcac accaagctga agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca ttaccgagct 4500

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cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 6840

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ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 7260

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ccgatatcct ccctgatcga ccggacgcag aaggcaatgt cataccactt gtccgccctg 7560

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acaggcagct ttccttccag ccatagcatc atgtcctttt cccgttccac atcataggtg 8040

gtccctttat accggctgtc cgtcattttt aaatataggt tttcattttc tcccaccagc 8100

ttatatacct tagcaggaga cattccttcc gtatctttta cgcagcggta tttttcgatc 8160

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tacagtattt aaagataccc caagaagcta attataacaa gacgaactcc aattcactgt 8280

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