同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒

摘要

本发明涉及PCR检测技术领域，尤其涉及同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒。本发明提供的引物探针组合中，包括针对甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒的特异性引物、探针。该引物和探针具有良好的特异性，结合real time PCR检测方法，能够实现对FluA/FluB/RSV的快速、准确、灵敏的鉴定。实验表明，本发明的引物探针的检测FluA/FluB/RSV的最低检测限均为25copies/ml。并且，该试剂具有良好的稳定性，2～8℃保存3、6、9、12个月的试剂都可以实现对样品的稳定检测。

说明书

技术领域

本发明涉及PCR检测技术领域，尤其涉及同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒。

背景技术

呼吸道感染是人类最常见的疾病之一，造成呼吸道感染的主要原因是各种呼吸道病毒以及一些细菌、支原体、衣原体。其中，甲型流感病毒(influenza A virus)、乙型流感病毒(influenza B virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)为临床较常见且重要的呼吸道病毒。呼吸道病毒引起的感染症状和流行性感冒特点相似，而引起的疫情及对社会造成的危害程度却不相同，由于很难仅靠临床症状确定真正的病原体，因此快速有效的鉴定呼吸道病原体种类，对于制定治疗和用药方案以及疫情防控均具有重要意义。

在现有技术中，分离培养是呼吸道病毒检测的“金标准”，但该方法操作复杂，耗时长，不适合用于早期诊断。抗体检测虽然操作简便，但其灵敏度和特异性变化较大，容易出现假阳性和假阴性。以核酸为基础的PCR(聚合酶链式反应)是一种用于特定核酸片段的扩增放大技术，该技术广泛应用于基因检测和病原体检测，具有灵敏度高，特异性好，简便，快捷等特点，对生物和医学研究及临床诊断具有重大意义。但现有技术中的荧光PCR检测，因引物特异性等方面的原因，很难实现对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒的多重检测。并且，现有技术中的检测试剂保存条件非常严苛(为-20℃)，对运输条件要求高，且冻融次数少(小于3次)，导致检测成本高。且针对FluA/FluB/RSV鉴定的基因片段的选择和引物探针的涉及存在不合理的现象，导致多数检测试剂无法实现准确、快速、灵敏的检测。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒，该试剂盒具有良好的灵敏性、特异性，且试剂的可以于2～8℃稳定性保存。

本发明提供的引物探针组合，其包括：

甲型流感病毒的正向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示；

甲型流感病毒的反向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:2所示；

甲型流感病毒的探针，其核酸序列如SEQ ID NO:3所示；

乙型流感病毒的正向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:4所示；

乙型流感病毒的反向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:5所示；

乙型流感病毒的探针，其核酸序列如SEQ ID NO:6所示；

呼吸道合胞病毒的正向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:7所示；

呼吸道合胞病毒的反向引物1，其核酸序列如SEQ ID NO:8所示；

呼吸道合胞病毒的反向引物2，其核酸序列如SEQ ID NO:9所示；

呼吸道合胞病毒的探针，其核酸序列如SEQ ID NO:10所示。

本发明所述的引物探针组合，可以用于对样品中的甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒进行定性或定量检测。本发明中，SEQ ID NO.1～2所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:14所示；该片段为甲型流感病毒的保守序列M基因。如SEQ ID NO.4～5所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:15所示。该片段为乙型流感病毒的nuclear exportprotein(NEP)基因。如SEQ ID NO.7～9所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:16所示。该片段为呼吸道合胞病毒的保守序列并经过NCBI多序列比对。

本发明还提供了同时检测检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒，其包括含有本发明所述引物探针组合的反应液。

一些实施例中，所述反应液中还包括内标的引物和探针；所述内标的序列为SEQID NO:17。本发明中，所述内标采用18S rRNA基因，针对其中SEQ ID NO:17所示的核苷酸片段设计引物和探针。其中，内标的正向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:11所示；内标的反向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:12所示；内标的探针，其核酸序列如SEQ ID NO:13所示。

本发明提供的引物和探针均具有良好的特异性，互相不发生交叉反应。从而能够在一个反应体系中，同时检测多个靶标，具有良好的准确性、特异性和灵敏度，并且能够节约成本。由于本发明采用了特异性较高的探针应用于该试剂盒，可以对未知样本中的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸进行快速检测，为诊断甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸提供可靠的实验依据，解决了现有试剂盒效率低、特异性差和灵敏度低的技术问题。

一些实施例中，

如SEQ ID NO.3所示探针的5’端连接FAM荧光基团；

如SEQ ID NO.6所示探针的5’端连接ROX荧光基团；

如SEQ ID NO.10所示探针的5’端连接CY5荧光基团；

如SEQ ID NO.13所示探针的5’端连接HEX荧光基团。

一些实施例中，所述反应液中还包括：Tricine、KOAc、Tween20、DMSO、dNTPs、Tth酶、醋酸锰和水。

本发明中，所述反应液中的Tricine、KOAc、Tween20、DMSO、dNTPs、Tth酶、醋酸锰，可以以溶液形式分别独立存在，也可以混合形成反应液共同存在，在该反应液存储的过程中，可以包括或不包括引物和探针。一些实施例中，所述反应液中的Tricine、KOAc、Tween20、DMSO、dNTPs、Tth酶、醋酸锰，以溶液形式分别独立存在，其中，Tricine的浓度为1M/L、KOAc的浓度为10M/L、10％的Tween20、100％的DMSO、dNTPs的浓度为10mM、Tth酶的浓度为5u/ul、醋酸锰的浓度为50mM。

本发明所述的试剂盒中，还包括核酸提取及纯化试剂(安图生物，豫郑械备20180037号)。

一些实施例中，本发明所述的试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；所述阴性质控品为无菌水；所述阳性质控品为人工合成的浓度1×10

本发明还提供了一种非诊断目的同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的方法，其以本发明所述的试剂盒对样品进行检测，根据荧光信号判断样品是否存在甲型流感病毒、乙型流感病毒或呼吸道合胞病毒。

本发明中，所述的检测方法为real-time PCR法，根据报告的Ct值判断样品是否存在甲型流感病毒、乙型流感病毒或呼吸道合胞病毒。所述根据Ct值判断包括：

SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10所示探针通道无荧光值，且SEQ IDNO.13所示探针通道的CT值≤35，报告检测结果为阴性；

SEQ ID NO.3、所示探针通道的CT值≤40，报告为甲型流感病毒阳性；

SEQ ID NO.6、所示探针通道的CT值≤40，报告为乙型流感病毒阳性；

SEQ ID NO.10、所示探针通道的CT值≤40，报告为呼吸道合胞病毒阳性；

SEQ ID NO.3所示探针通道CT值皆≥40，但SEQ ID NO.13所示探针通道CT值≤35，报告甲型流感病毒样本浓度低于检测下限；SEQ ID NO.6所示探针通道CT值皆≥40，但SEQID NO.13所示探针通道CT值≤35，报告乙型流感病毒样本浓度低于检测下限；SEQ IDNO.10所示探针通道CT值皆≥40，但SEQ ID NO.13所示探针通道CT值≤35，报告呼吸道合胞病毒样本浓度低于检测下限；

当SEQ ID NO.13所示探针通道CT值≥35，出现阴性对照有CT值或呈典型S扩增曲线、阳性对照无CT值或无扩增曲线两种情况中的任一种时，该检测结果无效，应查找并排除原因，并重复试验。

本发明中，所述样品为咽拭子、鼻拭子或环境样品。

所述扩增的体系包括：25μL反应液和5μL样品提取物；

所述反应液包括：

本发明所述方法中，所述扩增的程序包括：

本发明提供的引物探针组合中，包括针对甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒的特异性引物、探针。该引物和探针具有良好的特异性，结合real time PCR检测方法，能够实现对FluA/FluB/RSV的快速、准确、灵敏的鉴定。实验表明，本发明的引物探针的检测FluA/FluB/RSV的最低检测限均为25copies/ml。并且，该试剂具有良好的稳定性，2～8℃保存3、6、9、12个月的试剂都可以实现对样品的稳定检测。

附图说明

图1示甲型流感病毒线性扩增图；

图2示乙型流感病毒线性扩增图；

图3示呼吸道合胞病毒线性扩增图。

具体实施方式

本发明提供了同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒的制备

试剂盒中的引物、探针序列如下表1所示：

表1引物、探针序列

试剂盒中还包括：Tricine的浓度为1M/L、KOAc的浓度为10M/L、10％的Tween20、100％的DMSO、dNTPs的浓度为10mM、Tth酶的浓度为5U/ul、醋酸锰的浓度为50mM。试剂盒还包括阴性对照(无菌水)和阳性对照(人工合成的浓度1×10

实施例2本发明试剂盒的检测方法

本发明的检测方法为Realtime RT-PCR，Real Time RT-PCR反应过程为(1)逆转录，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cDNA，时间和长度取决于靶核酸长度及碱基组成，预变性的温度一般为42℃～60℃，时间和长度取决于靶核酸长度及碱基组成，预变性的温度一般为90℃～105℃，时间一般为10～20min。(2)预变性，时间和长度取决于靶核酸长度及碱基组成，预变性的温度一般为90℃～105℃，时间一般为2～10min，预变性的目的为使双链核酸序列彻底分离为单链；(3)变性，温度一般为91℃～105℃，时间一般为10s～35s；(4)退火，使各引物退火至甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒或内标质控核酸的靶序列上。退火的温度通常为40℃～60℃，退火的时间可以是10s～60s(5)延伸，引物与模板结合，开始合成新的DNA双链，延伸温度一般为40℃～80℃，延伸时间可以是10s～1min。

每个检测体系的组成如表2：

荧光检测通道选择：(1)选择FAM通道(ReporTer：FAM，QuenCher：none)，检测甲型流感病毒；(2)选择ROX通道(ReporTer：ROX，QuenCher：none)，检测乙型流感病毒；(3)选择CY5通道(ReporTer：CY5，QuenCher：none)，检测呼吸道合胞病毒；(4)选择HEX通道，检测内标；(5)参比荧光(PAssive ReferenCe)设置为none。荧光定量实时反应条件如下表3所示。

表3：荧光定量实时PCR反应条件

反应结束后，仪器自动保存结果，利用仪器自带的软件进行自动分析或手动调节基线的开始值、结束值以及阂值线值进行分析，然后记录样本CT值和定值结果。具体测试结果分析如下：

SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10所示探针通道无荧光值，且SEQ IDNO.13所示探针通道的CT值≤35，报告检测结果为阴性；

SEQ ID NO.3、所示探针通道的CT值≤40，报告为甲型流感病毒阳性；

SEQ ID NO.6、所示探针通道的CT值≤40，报告为乙型流感病毒阳性；

SEQ ID NO.10、所示探针通道的CT值≤40，报告为呼吸道合胞病毒阳性；

SEQ ID NO.3所示探针通道CT值皆≥40，但SEQ ID NO.13所示探针通道CT值≤35，报告甲型流感病毒样本浓度低于检测下限；SEQ ID NO.6所示探针通道CT值皆≥40，但SEQID NO.13所示探针通道CT值≤35，报告乙型流感病毒样本浓度低于检测下限；SEQ IDNO.10所示探针通道CT值皆≥40，但SEQ ID NO.13所示探针通道CT值≤35，报告呼吸道合胞病毒样本浓度低于检测下限；

当SEQ ID NO.13所示探针通道CT值≥35，出现阴性对照有CT值或呈典型S扩增曲线、阳性对照无CT值或无扩增曲线两种情况中的任一种时，该检测结果无效，应查找并排除原因，并重复试验。

实施例3本发明试剂盒的可行性试验

1.最低检测限(LOD)试验

(1)甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制：通过采用实施例1的方法制备甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测。

(2)样本提取

将管中5个不同浓度的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒样本,利用核酸提取及纯化试剂(安图生物，豫郑械备20180037号)批号为：20190527。进行核酸的纯化。

(3)样本检测

将25μl处理好的标本上清加入到甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂反应管中，每个浓度20个复孔，同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照，按照实施例2中检测方法进行检测。

(4)结果分析

通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂各浓度梯度的样本进行检测，表明本检测方法的检测灵敏度(LOD)甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒均为25copies/ml。具体数据表4，表5、表6。

表4：甲型流感病毒检测限确认

表5：乙型流感病毒检测限确认

表6:呼吸道合胞病毒检测限确认

2、试剂线性灵敏度验证

(1)实验样本

取6份不同浓度的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒样本(浓度分别为2.5×10

(2)结果分析

通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂各浓度梯度的样本进行检测，具体数据图1，图2、图3。

3、与其它疾病的交叉反应情况

(1)甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制，通过采用实施例1的方法制备甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂。

(2)交叉病原体样本提取：将管中含有麻疹病毒，腮腺炎病毒，风疹病毒，金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌，铜绿假单胞菌，人副流感病毒4型病原体，白色念珠菌，巨细胞病毒，单纯疱疹病毒1型，EB病毒，百日咳杆菌，杰氏棒杆菌，流感嗜血杆菌，嗜肺军团菌，卡他莫拉菌，脑膜炎奈瑟菌，肺炎链球菌，化脓性链球菌，表皮葡萄球菌，唾液链球菌，肺炎克雷伯菌，肺炎支原体，肺炎衣原体的咽拭子洗脱液用移液器混匀,利用索莱宝生物科技有限公司的RNA病毒基因组提取试剂盒进行核酸RNA的纯化。

(3)样本检测:将25μl处理好的标本上清加入到甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测反应管中，同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照，提取的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒作为阳性对照试验，按照实例2中检测方法进行检测。

(4)结果分析：通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒以外的其它病原体进行检测，结果表明：本发明试剂盒对甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒阳性对照为阳性，阴性对照为阴性，麻疹病毒，腮腺炎病毒，风疹病毒，金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌，铜绿假单胞菌，人副流感病毒4型病原体，白色念珠菌，巨细胞病毒，单纯疱疹病毒1型，EB病毒，百日咳杆菌，杰氏棒杆菌，流感嗜血杆菌，嗜肺军团菌，卡他莫拉菌，脑膜炎奈瑟菌，肺炎链球菌，化脓性链球菌，表皮葡萄球菌，唾液链球菌，肺炎克雷伯菌，肺炎支原体，肺炎衣原体病原体感染样本无交叉反应，表明其具有高特异性，具体结果如表7。

表7：交叉反应实验

4、对潜在外源物质的抗干扰性

(1)甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制：通过采用实施例1的方法制备甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制。

(2)样本处理

选取甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒高值和低值两个浓度值。甲型流感病毒两个浓度值分别为1×10

(3)结果分析

干扰判断：干扰率小于项目所在行标允许的正确度偏倚(设定为10％)，即可判断为通过。

干扰率计算公式：(干扰样本浓度-对照样本浓度)/对照样本浓度×100％。

试验表明，当样本中含有利巴韦林、氯化钠、地塞米松、盐酸组胺、盐酸组胺、奥司他韦、莫匹罗星、妥布霉素等常见的抗病毒药物时，本发明试剂盒的检测灵敏度不会受到明显干扰，具体见表8。

表8：外源物质的抗干扰性实验

5、对潜在内源物质的抗干扰性

(1)甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制：通过采用实施例1的方法制备甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制。

(2)样本处理

选取甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒高值和低值两个浓度值。甲型流感病毒两个浓度值分别为1×10

(3)结果分析

干扰判断：干扰率％小于项目所在行标允许的正确度偏倚(设定为10％)，即可判断为通过。

干扰率计算公式：(干扰样本浓度-对照样本浓度)/对照样本浓度×100％。

试验表明，当样本中含有200mg/dL血红蛋白、3000mg/dL甘油三酯、20mg/dL胆红素等内源性干扰物质时，本发明试剂盒的检测灵敏度不会受到明显干扰，具体见表9。

表9：内源物质的抗干扰性实验

实施例4本发明试剂盒的2-8℃稳定性考核

1.加速稳定性试验

(1)甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制：通过采用实施例1的方法制备甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测。

(2)样本提取

将管中检出限浓度的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒人咽拭子洗脱液用移液器混匀,利用索莱宝生物科技有限公司的RNA病毒基因组提取试剂盒进行核酸RNA的纯化。

(3)样本检测

将25μl处理好的标本上清加入到45℃加速7、10、14天的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂反应管中，每个型别2个复孔，同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照，按照实施例2中检测方法进行检测。

(4)结果分析

通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对2-8℃运输7天45℃加速7、10、14天的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂进行检测，具体数据表10。

表10：加速稳定性试验

2.实时稳定性试验

(1)甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制：通过采用实施例1的方法制备甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测。

(2)样本提取

将管中检出限浓度的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒人咽拭子洗脱液用移液器混匀,利用索莱宝生物科技有限公司的RNA病毒基因组提取试剂盒进行核酸RNA的纯化。

(3)样本检测

将25μl处理好的标本上清加入到2-8℃运输7天2-8℃保存3、6、9、12个月的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂反应管中，每个型别2个复孔，同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照，按照实施例2中检测方法进行检测。

(4)结果分析

通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对2-8℃保存3、6、9、12个月的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂进行检测，具体数据表11。

表11：实时稳定性试验

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 郑州安图生物工程股份有限公司

<120> 同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒

<130> MP2019802

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cttctaaccg aggthgaaac g 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaggtgacag gatyggtctt gt 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccmtcaggcc ccctcaaagc cga 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcctcaactc actcttcgag cg 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccaatttggt caagagcacc g 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccaattcgag cagctgaaac tgcgg 25

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcaaatatg gaaacatacg tga 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatgcaggat catcgtcttt ttc 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatgcgggat catcatcttt ttc 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cacgaaggct ccacatacac agc 23

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggttgcaaag ctgaaactta aa 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agtcaaatta agccgcaggc 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttgacggaag ggcaccacca gg 22

<210> 14

<211> 157

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cttctaaccg aagtcgaaac gtacgttctc tctatcgtcc cgtcaggccc cctcaaagcc 60

gagatcgcgc agagactgga agatgtcttt gcagggaaga acacagatct tgaggctctc 120

atggaatggc taaagacaag accaatcctg tcacctc 157

<210> 15

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atcctcaact cactcttcga gcgtctcaat gaaggacatt caaagccaat tcgagcagct 60

gaaactgcgg tgggagtctt atcccaattt ggtcaagagc accga 105

<210> 16

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggcaaatatg gaaacatacg tgaataaact tcacgagggc tccacataca cagctgctgt 60

tcaatacaat gtcctagaaa aagacgatga tcctgcatc 99

<210> 17

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtatggttgc aaagctgaaa cttaaaggaa ttgacggaag ggcaccacca ggagtggagc 60

ctgcggctta atttgactca aca 83