基于近红外碳量子点化学-光热协同治疗肿瘤的载药体系及其制备方法

摘要

本发明公开了一种基于近红外碳量子点的化学‑光热协同治疗肿瘤的载药体系，该载药体系包括纳米载体、化疗药物及靶向功能分子，所述化疗药物为顺铂衍生物，所述纳米载体为近红外碳量子点，所述靶向功能分子为具有pH响应电荷翻转特性的聚乙二醇复合纳米材料，所述载药体系由所述化疗药物与纳米载体偶联再与靶向功能分子络合制得。本发明在肿瘤治疗中能发挥化学治疗与光热治疗协同作用，能使裸瘤鼠内肿瘤完全消除，没有出现肿瘤复发和对机体毒副作用小，其治疗效果显著优于单独化学治疗或的光热治疗。本发明的化学‑光热协同治疗方案具有从肿瘤成像和药物追踪到抗肿瘤治疗的临床一体化应用潜力，在临床肿瘤高效治疗应用中具有巨大的前景。

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种生物医药技术领域，特别是涉及一种基于近红外碳量子点的化学-光热协同治疗肿瘤的载药体系及其制备方法。

【背景技术】

在过去十年里，癌症治疗诊断学即生物成像诊断和癌症治疗的结合，是一个为患者提供个性化的癌症治疗的新兴领域。在癌症治疗过程中，化学光热疗法被认为是最有效的方法之一，其中，光热治疗法引起的高热可增强化疗药物的细胞摄取和释放，甚至可抑制肿瘤的多种药物耐药性，而化学疗法是一种不受空间限制的连续治疗，可弥补光热疗法的不足。

要实现高效率的光热治疗法，光热试剂的选择是关键。现有的光热试剂主要有贵金属纳米材料和有机近红外发色团，其中，贵金属纳米材料存在成本高、潜在长期毒性及不可降解等缺陷，如用聚乙二醇-5000封装的金纳米壳被证明难以通过肾间隙排除体外；而现有的有机近红外发色团存在亲水性差、光稳定性差及长期毒性等缺陷。碳量子点(CQDs)是碳材料领域的一颗新星，由于其众多独特的内在特性，如近红外吸收，荧光寿命长，毒性低，良好的光稳定性和生物兼容性，引起了越来越多研究者的青睐。据报道，目前碳点已被用作光热疗法的光热试剂。另一方面，利用其优异的生物相容性，良好的水溶性和灵敏的荧光成像特性，已被作为成像引导的纳米载体，用于运输化疗药物、光敏剂和治疗基因等方面。红外发射荧光碳点(RCQDs)可为全色发射提供重要部件，在长波长光照射下可被激发并且对于运输药物和PTT具有更好的器官穿透深度，对于生物医学领域应用非常有利。

而高效的抗肿瘤药物则是化学疗法的关键。现有的抗肿瘤药物主要为顺铂(Pt(II))，但其存在自身毒副作用大，难以在肿瘤组织中富集和易于其他生物分子非特异性结合等缺陷。为了减少其毒副作用，研究者们使用其他的顺铂衍生物乐巴铂和奥沙利铂等进行治疗。但是，这些顺铂衍生物可能会出现药物负荷降低或抗肿瘤活性降低等现象。此外，作为肿瘤药物载体还应具备可控药物释放的能力。现有的药物传输载体通过简单物理吸附到纳米探针表面，当纳米探针进入生物体内后，有些荷载的药物分子在血液中就会快速地从纳米探针上释放，即在到达肿瘤部位前已经释放进入到血液中或者滞留在肿瘤部位的周围组织中，不能在肿瘤部位进行有效的聚集，影响治疗效果。

因此，如果能将碳基量子点作为载体，并选择高效的顺铂衍生物抗肿瘤药物及主动靶向运输释放药物的载体以制备出化学光热协同治疗肿瘤载药体系，则将具有广泛的应用前景。

【发明内容】

本发明旨在解决上述问题，而提供一种基于近红外碳量子点的化学光热协同治疗肿瘤载药体系。

本发明还提供了一种基于近红外碳量子点的化学光热协同治疗肿瘤载药体系的制备方法。

为实现本发明的目的，本发明提供了一种基于近红外碳量子点的化学-光热协同治疗肿瘤的载药体系，该载药体系包括纳米载体、化疗药物及靶向功能分子，所述化疗药物为顺铂衍生物，所述纳米载体为近红外发射荧光碳量子点，所述靶向功能分子为具有pH响应电荷翻转特性的聚乙二醇-壳聚糖聚合物，所述载药体系由所述化疗药物与纳米载体偶联再与靶向功能分子络合制得。

所述近红外碳量子点为氨基化的红外发射荧光碳量子点，所述碳量子点是以桂花籽皮为碳源制备而成。

所述靶向功能分子为聚乙二醇-壳聚糖-二甲基马来酸酐聚合物。

本发明还提供了一种基于近红外碳量子点的化学-光热协同治疗肿瘤的载药体系的制备方法，该方法包括如下步骤：

a、氨基化红外发射荧光碳量子点的制备

将桂花籽皮及无水乙醇置于反应容器中，在氮气保护下加热至100℃，搅拌后反应12h，将得到的反应产物冷却至室温，取上清液经过滤后，得到的滤液即为红外发射荧光碳量子点；再将红外发射荧光碳量子点与氨基-聚乙二醇-氨基的无水乙醇溶液于120℃下反应，取上清液经过滤后，滤液用透析膜纯化后即得到所述的氨基化红外发射荧光碳量子点，经旋蒸、干燥后得到固体样品，将固体样品存储于4℃下备用；

b、氨基化红外发射荧光碳量子点修饰顺铂衍生物

将顺铂衍生物、过氧化氢和1-(3-(二甲基氨基)丙基)-3-乙基二亚胺盐酸盐在室温下搅拌均匀，再加入所述的氨基化红外发射荧光碳量子点搅拌均匀，然后经透析、冷冻干燥后即得到修饰后的红外发射荧光碳量子点-顺铂衍生物；

c、靶向功能分子的合成

将壳聚糖与聚乙二醇的活性酯反应得到聚乙二醇-壳聚糖，再将聚乙二醇-壳聚糖溶于pH值为8.0的磷酸盐缓冲液中，然后加入二甲基马来酸酐，反应后得到靶向功能分子聚乙二醇-壳聚糖-二甲基马来酸酐聚合物；

d、聚乙二醇-壳聚糖-二甲基马来酸酐与红外发射荧光碳量子点-顺铂衍生物络合

将红外发射荧光碳量子点-顺铂衍生物溶液滴加到聚乙二醇-壳聚糖-二甲基马来酸酐溶液中，室温下搅拌，再经冷冻干燥后即得到所述的载药体系红外发射荧光碳量子点-顺铂衍生物/聚乙二醇-壳聚糖-二甲基马来酸酐。

步骤a中，所述每克桂花籽皮中加入2ml无水乙醇，所述上清液经0.22微米的有机滤膜过滤，所述透析膜的截留分子量为1000。

步骤b中，所述顺铂衍生物的合成方法为：将顺式二氯二氨合铂悬浮于水中，于50℃下加入双氧水，搅拌后冷却至室温，经旋蒸后将溶剂浓缩至2mL，将结晶洗涤过滤后得到中间体二氯化二羟基二氨合铂，将中间体真空干燥后和琥珀酸酐溶于二甲基甲酰胺中，室温搅拌后冷冻干燥，再将冷冻干燥后的固体进行洗涤，即得到所述的顺铂衍生物。

进一步地，所述顺式二氯二氨合铂与双氧水的重量比为1:1.05，所述中间体与琥珀酸酐的重量比为10:3。

步骤b中，所述透析膜的截留分子量为1kDa，所述透析时间为48h，所述修饰后的红外发射荧光碳量子点-顺铂衍生物中铂的负载量为8.8％。

步骤c中，所述反应体系的pH调节使用0.2mol的NaOH溶液调至pH8.5，产物用磷酸盐缓冲液透析后冻干。

步骤d中，所述红外发射荧光碳量子点-顺铂衍生物与聚乙二醇-壳聚糖-二甲基马来酸酐的重量比为2:5，所述载药体系存储于-20℃以下。

本发明的有益效果为：本发明以天然生物质–桂花籽皮通过溶剂热法获得了性能优异的红发射氮自掺杂碳量子点，具有易于表面功能化，良好的生物相容性，毒性低，较高的光热转换效率和在可见光到NIR光区域内具有较宽的吸收带等优点。基于该红外发射荧光碳量子点，成功设计了一种新型的pH响应电荷翻转药物释放的载药体系红外发射荧光碳量子点-顺铂衍生物/聚乙二醇-壳聚糖-二甲基马来酸酐，并将其应用于裸瘤鼠肿瘤的化学-光热协同高效治疗。本发明制得的红外发射荧光碳量子点-顺铂衍生物/聚乙二醇-壳聚糖-二甲基马来酸酐载药体系具有将Pt(IV)药物分子以稳定的形式运输以减少药物分子的提前降解，最终实现在肿瘤部位定点靶向释放出高毒性Pt(II)的功能，在肿瘤治疗中能发挥化学治疗与光热治疗协同作用，能使裸瘤鼠内肿瘤完全消除，没有出现肿瘤复发和对机体毒副作用小，其治疗效果显著优于单独化学治疗或的光热治疗。本发明的化学-光热协同治疗方案具有从肿瘤成像和药物追踪到抗肿瘤治疗的临床一体化应用潜力，在临床肿瘤高效治疗应用中具有巨大的前景。

【具体实施方式】

图1是本发明的顺铂衍生物的合成路线图。

图2是本发明的PEG-CS-DA合成路线图。

图3是本发明的RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA合成路线图。

图4是本发明的RCQDs(a)、RCQDs-Pt(IV)(b)和RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA(c)的FTIR光谱图。

图5是本发明的RCQDs-Pt(IV)紫外可见吸收图谱。

图6是本发明的RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA在不同条件下Zeta电位的变化图。

图7是本发明的GSH及pH值对RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA释放药物的影响图。

图8是本发明的T24细胞在不同条件下和RCQDs和RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA培养24h后的细胞存活率。

图9A是本发明在NIR激光照射下，PBS、Pt(II)、RCQDs和RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA水溶液随时间增加的温度变化曲线；9B是癌细胞与不同组合药物孵育后的染色CLSM图像，其中(a)PBS对照组，(b)NIR组，(c)20mg/mL RCQDs组，(d)20mg/mL RCQDs+NIR组，(e)105mg/mL RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA，(f)105mg/mL RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA+NIR组。

图10A是本发明药物运输活体成像与示踪：RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA肿瘤内(a)及静脉内(b)注射到裸瘤鼠中在不同时间段拍摄的活体荧光成像图；图10B是PBS(a)，RCQDs-Pt(IV)(b)和RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA(c)静脉内注射到裸瘤鼠中8h之后拍摄的活体荧光成像；图10C是注射PBS，Pt(II)、RCQDs和RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA到小鼠肿瘤部位，使用680nm激光(1.5W/cm

图11A是本发明的PBS±NIR组、Pt(II)±NIR组、RCQDs和RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA±NIR组裸鼠肿瘤的生长曲线；图11B是Pt(II)±NIR组、RCQDs±NIR组和RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA±NIR组治疗第14天后裸瘤鼠肿瘤的照片；图11C是各实验组治疗一周后具有代表性的裸瘤鼠照片；图11D是各实验组裸瘤鼠肿瘤组织切片的H&E染色结果(标尺为200μm)。

图12是本发明的PBS组(a)、RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA+NIR组(b)和Pt(II)组(c)裸瘤鼠主要器官的组织切片H&E染色结果(标尺为200μm)。

图13是本发明的不同实验组裸瘤鼠体重随时间的变化曲线。

【具体实施方式】

下列实施例是对本发明的进一步解释和补充，对本发明不构成任何限制。

实施例1

氨基化红外发射荧光碳量子点(RCQDs)的合成

将15g剪碎的桂花籽皮加入30mL无水乙醇，加到50mL圆底烧瓶中，采用氮气保护装置，混合均匀后密封，抽气，固定于加热套中加热至100℃，并搅拌反应12h，待反应产物溶液自然冷却至室温后，所得的上清液通过0.22μm的有机滤膜过滤。取滤液30mL于50mL烧杯中，加入0.2g的H

实施例2

顺铂衍生物(Pt(IV))的合成

将300.0mg Cis-Pt(NH

实施例3

氨基化红外发射荧光碳量子点修饰顺铂衍生物

将20mg Pt(IV)、3.5mg过氧化氢(NHS)和4.5mg 1-(3-(二甲基氨基)丙基)-3-乙基二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)在室温下在水中搅拌30min。然后，将40.0mg氨基化RCQDs加入上述溶液中，并将所得混合物再搅拌24h。通过使用的透析膜(MWCO：1kDa)将混合物放超纯水中透析48h，每隔3h更换一次超纯水，以除去未反应的化合物。在冷冻干燥后，即得到修饰后的红外发射荧光碳量子点-顺铂衍生物(RCQDs-Pt(IV))，将RCQDs-Pt(IV)置室温下储存以供进一步使用。通过ICP-MS测量，Pt的负载百分比为8.8％。

实施例4

聚乙二醇-壳聚糖-二甲基马来酸酐(PEG-CS-DA)的合成

将壳聚糖(CS)与聚乙二醇(PEG)的活性酯(PEG-NHS)反应获得PEG-CS。合成路线如图2所示，首先，将0.2g CS溶于20mL超纯水中，加入1.0g PEG-NHS磁力搅拌反应24h，通过超纯水透析后冻干得到PEG-CS。将0.2g PEG-CS溶于20mL pH8.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中，缓慢加入3倍摩尔量的甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯(DMMA)，反应得到PEG-CS-DA。反应体系的pH调节使用0.2mol的NaOH溶液调至pH8.5左右，室温下磁力搅拌8h，产物用PBS(pH8.0)透析后冻干。

实施例5

PEG-CS-DA与RCQDs-Pt(IV)络合

将60.0mL 1mg/mL的RCQDs-Pt(IV)溶液滴加到150.0mL1 mg/mL的PEG-CS-DA溶液中。将混合溶液在室温下搅拌过夜，然后冷冻干燥，得到的载药体系RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA，储存在-20℃下以备下一步实验使用。具体合成路线如图3所示。

实施例6

纳米材料的表征

通过FT-IR图谱用来表征RCQDs及其复合物的表面官能团，表征结构如图4(a)所示。由图4(a)可知，1055cm

因为RCQDs与Pt(IV)共价偶联是通过RCQDs上的氨基和Pt(IV)上的羧基发生典型的EDC/NHS酰胺化反应。在RCQDs上修饰Pt(IV)后，如图4(b)的FTIR光谱所示，RCQDs-Pt(IV)中C＝O和N-H的振动强度之间的相对比率与RCQDs的相对比率相比有所增加，这表明Pt(IV)已经成功修饰到RCQDs上，RCQDs-Pt(IV)和PEG-CS-DA结合之后的FTIR光谱图如图4(c)所示，可以看到，许多峰都有增强，表明RCQDs-Pt(IV)和PEG-CS-DA已成功结合。纳米粒子的滑动层与周围溶液环境的电势差叫Zeta电位，其反映了纳米粒子整体带电情况的平均值。经测量，所制备的氨基化RCQDs的Zeta电位为18.0mV，其带正电荷原因应该是其表面存在大量带正电的氨基。在RCQDs上加载Pt(IV)之后，测量其Zeta电位为10.7mV，Zeta电位降低是由于Pt(IV)与RCQDs共轭结合过程中，RCQDs上的一些带正电的氨基与Pt(IV)前药发生了偶联，故RCQDs-Pt(IV)的Zeta电位比原来RCQDs的Zeta电位要低，Zeta电位测量结果进一步表明Pt(IV)已经成功偶联到RCQDs上。如图5所示，RCQDs-Pt(IV)紫外可见吸收与RCQDs的相似，表明Pt(IV)共价偶联到RCQDs上并不影响RCQDs的紫外吸收光学性能，其在600至800nmNIR区域中还是显示有较强吸收，适合作为PTT试剂进行光热治疗。以硫酸奎宁为参比，通过计算得到RCQDs-Pt(IV)的QY为19.8％，揭示了其在生物成像应用中的可行性。

PEG-CS-DA是一种在pH响应刺激下可发生电荷翻转的PEG材料。在生理条件下(pH7.4)，负电荷的PEG-CS-DA可通过正负电荷的吸引对正电荷的RCQDs-Pt(IV)进行包覆，得到稳定存在的RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA。

通过EPR效应达到肿瘤组织后，在肿瘤弱酸性pH

实施例7

pH响应的体外药物释放研究

为了进一步研究RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA的pH及还原剂触发的Pt(II)药物分子释放特性，本发明在不同的pH值及还原剂条件下进行了药物分子释放实验。其中，药物分子释放实验的方法为：

将15.0mg RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA分别溶解于含有0mmol/L、5μmol/L和10mmol/L GSH的1.0mLPBS缓冲液(10mmol/L，pH7.4或6.8)中，并转移到个透析管(MWCO：1kDa)，随后用PBS缓冲液(69mL，pH 7.4或6.8，含0mmol/L，5μmol/L和5mmol/L GSH)在37℃的黑暗中透析。在在预先预定的时间点(0，1，2，4，6，8，10h)，移取一定释放体积的透析液，且取相同的量在原来的释放透析液中加入了新的缓冲溶液。在每个预定时间点，通过离心取出PBS缓冲液进行分析。通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)表征和检测确定PBS溶液中Pt的量。

从原理上推断，当RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA处于酸性环境时，该载药体系的PEG-CS-DA层会立即水解并释放出RCQDs-Pt(IV)，RCQDs-Pt(IV)在细胞内还原性物质比如谷胱甘肽(GSH)或者抗坏血酸等的作用下，Pt(IV)脱去两个轴向的衍生基团释放出Pt(II)。在本实施例中，生物体中普遍存在的谷胱甘肽(GSH)及肿瘤细胞外微环境(pH 6.8)及正常生理环境的pH值(pH 7.4)被选用作为影响因素来考察RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA的体外释放药物的行为。首先，向含有不同浓度的GSH(0、5μmol/L和5mmol/L)的PBS缓冲液(pH 7.4或6.8)中添加了15mg RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA，并分析了Pt(II)在10h内的药物释放曲线，如图7所示。药物分子释放实验结果如预期一致，由图7可知，在相同的时间内，GSH的浓度与pH对Pt(II)的释放速率影响较大，当GSH的浓度接近正常细胞外血浆中的浓度5μmol/L时，6h后在pH 6.8条件下只有20％左右的Pt(II)被释放出来，而在pH 7.4条件下释放率更低。而当GSH的浓度增加到5mmol/L时，此浓度与肿瘤细胞内部GSH的浓度相似，Pt(II)从RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA中的释放速率显著增加，经过6h，在pH 6.8条件下，几乎61％的Pt(II)药物可从载药体系中释放，当孵育10h后，Pt(II)药物的释放量已经超过了85％。而在pH7.4条件下，GSH的浓度为5μmol/L和5mmol/L时都仅有少量Pt(II)药物从载药体系中释放。实验结果表明，GSH还原剂浓度和pH值对载药体系RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA控制释放Pt(II)药物具有很大的影响。

RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA的这种对GSH浓度和pH值依赖性和敏感性的行为可以有效防止Pt(II)药物在血液循环过程中的流失，并具有定点自主靶向释放出大量Pt(II)药物到达肿瘤部位，避免药物在运输过程中提前释放，不仅可以增强肿瘤治疗功效，且在释放药物过程中降低其在全身机体的毒副作用。

实施例8

细胞毒性研究

1)、细胞培养及细胞毒性

在37℃时，将密度为1×10

升高肿瘤周围环境的温度，会使周围血管壁和肿瘤细胞膜的通透性增加，导致药物更容易进入肿瘤细胞，在光热治疗中，光热效应会增加化学药物Pt(II)的毒性。基于RCQDs在600至800nmNIR区域中有强吸收，即具有良好的光热效应。可以推测RCQDs的光热效应会增加RCQDs-Pt(IV)@PEG-CS-DA对肿瘤细胞的毒性，为此，本实施例对RCQDs-Pt(IV)@PEG-CS-DA的细胞毒性进行对照实验验证。MTT试验用于评估RCQDs和RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA的毒性。将T24细胞在密度为1×10

在实验中T24细胞分别与RCQDs和RCQDs-Pt(IV)@PEG-CS-DA共同孵育培养，并用近红外光(680nm，1.5W/cm

实施例9

载药体系的光热效应及体外协同治疗效果

由于RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA载药体系被设计用于化学-光热协同治疗，所以在试验中首先需要分别测定RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA在酸性环境下的光热效应。试验方法为：20μg RCQDs和105μg RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA(荷载等量的RCQDs)、155μg RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA溶于1mL的PBS(pH＝6.8)中，Pt(II)和PBS作为空白对照，分别置于1.5mL离心管中，然后调整680nm激光器(1.5W/cm

实验结果如图9所示，由图9A可知，PBS组和Pt(II)组的温度在每个测试时间点及激光照射下都没有出现明显的增加。然而，在0到5min之间，20μg/mL RCQDs、105μg/mLRCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA(荷载等量的RCQDs)和155μg/mL RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA实验组温度在激光照射过程中随着时间的增长而上升，5min时间的照射，温度就高达60℃左右，从实验结果可以看到，20μg/mL RCQDs和105μg/mL RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA(荷载等量的RCQDs)之间并没有出现较大的差异，这表明RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA和RCQDs的光热转换能力基本相同，此外，RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA溶液的光热效应还高度依赖于其浓度。上述实验结果表明，RCQDs修饰上Pt(IV)和PEG-CS-DA后并没有破坏RCQDs本身的光热效应，在近红外光的照射下RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA水解后也使得周围环境的温度显著升高。这意味着RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA在弱酸肿瘤环境中对肿瘤细胞的化学-光热联合治疗领域有巨大的潜力。

为了更直观观察RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA的体外定点治疗效果，我们还通过细胞染色实验考察了载药体系对癌细胞的光热毒性。我们设计了PBS组、近红外激光照射(NIR)组、RCQDs组、RCQDs+NIR组、RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA组RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA+NIR组进行实验，具体方法为：首先将A549细胞以1×10

实施例10

裸鼠肿瘤模型建立、活体成像及热成像实验

为了验证RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA在裸瘤鼠体内的肿瘤靶向运输和成像追踪能力，通过使用活体成像仪对不同处理的裸瘤鼠组进行成像分析。其中，BALB/c裸鼠(5-6周龄)购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，饲养在广西师范大学动物实验室。本实施例中所有裸鼠的使用符合当前的伦理考虑，且均遵守“护理和使用实验动物指南”中列出的指导方针。实验中是通过在裸鼠腹侧皮下注射T24细胞悬液建立皮下裸鼠肿瘤模型。首先将T24细胞以1×10

如图10A(a)所示，将RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA经肿瘤内注射处理的裸鼠，在肿瘤部位很快就能观察到明显而集中的荧光，在注射后4h达到峰值，且在48h内还可在肿瘤部位检测到较强红色荧光信号。图10A(b)所示在静脉内注射RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA后30min后可见近红外荧光信号主要集中在裸鼠肝脏部位，随着时间的推移，肿瘤部位的荧光信号逐渐增加，1h之后，就可以在肿瘤部位就观察到较弱的红色荧光信号，并在注射后10h达到峰值。而在肝脏部位在2h之后没有再观察到明显的荧光信号，这可能是虽然RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA会在肝脏部位短暂滞留，但是肝脏的中性环境并没有引起RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA对RCQDs和Pt(II)药物分子的大量释放。结果表明RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA具有优异肿瘤靶向运输及荧光跟踪的能力。

为了进一步验证该电荷翻转RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA体系的肿瘤靶向运输能力，将PBS、RCQDs-Pt(IV)和RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA通过静脉内注射到裸瘤鼠体内，注射后8h之后，裸瘤鼠采用异氟烷麻醉后用活体成像系统观察肿瘤部位的荧光信号。如图10B所示，在注射RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA组裸瘤鼠肿瘤部位中检测到最强的荧光，而注射RCQDs-Pt(IV)组裸瘤鼠肿瘤部位显示较弱的荧光信号。表明正电性的RCQDs-Pt(IV)在体内运输过程中易被肝部捕获，无法全部被动靶向运输到肿瘤部位，而带负电荷的RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA在血液中，可以避免与血液成分的非特异性相互作用以达到延长循环时间的效果，通过EPR效应达到肿瘤组织时，肿瘤弱酸的环境使PEG-CS-DA层分解，实现电荷翻转使滞留在肿瘤部位的RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA逐渐释放所荷载的RCQDs和Pt(II)药物分子。以上裸瘤鼠的活体荧光成像结果表明，RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA具有增强在血液循环中药物的稳定性和提高了药物分子在肿瘤部位聚集能力、靶向运输能力及作为诊疗一体化实现生物荧光示踪的潜力。

我们还利用热成像研究了PBS、Pt(II)、RCQDs和RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA在活体内的光热效应。图10C显示了用680nm激光(1.5W/cm

实施例11

载药体系的体内化学-光热协同治疗肿瘤效果

为了进一步考察RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA的化学-光热协同治疗效果，本实施例设置8个实验组，每组进行加光照和不加光照的对照。实验选择植入2×10

图11A是各个实验组裸瘤鼠肿瘤的相对体积随时间变化的曲线。由图图11A可知，PBS组裸瘤鼠的肿瘤增长快速，然而，Pt(II)组的肿瘤生长只受到了轻微的抑制，原因是游离的Pt(II)不具有自主靶向，很难到达肿瘤部位发挥药效抑制肿瘤的增长。与之相比，RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA组(即单独的化学治疗组)裸瘤鼠的肿瘤体积也受到较明显的影响。因为RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA在正常生理环境下稳定，EPR效应可以实现药物的靶向运输，并不与在血液循环过程蛋白质等生物分子结合发生副反应，所以RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA组对肿瘤细胞有较好的化学治疗效果，但还是不能完全抑制肿瘤的生长。另一方面，RCQDs+NIR组(即单独的光热治疗组)裸鼠肿瘤体积在前4天变小，但后来又逐渐变大。可喜的是，RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA+NIR组裸鼠肿瘤在NIR激光照射后7天完全消失了，而且在后来的治疗时间里，没有再观察到肿瘤。图11B展示的是加和不加NIR照射各实验组裸鼠肿瘤在实验进行第14天的照片，肿瘤生长的趋势与图11A描述的曲线相符。实验表明单独的化学治疗与光热治疗均不能完全杀死肿瘤细胞，且会使肿瘤的发生复发。图11C是各实验组治疗一周后具有代表性的裸瘤鼠照片，可以看到RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA+NIR组裸鼠肿瘤在治疗一个星期后只留下一个黑色烧伤的疤。这是因为该电荷翻转载药治疗体系使药物分子在肿瘤组织部位靶向释放，实现对肿瘤靶向输送的同时对非治疗部位的副作用最小化，而光热效应会增加Pt(II)的毒性，能延长带负电的RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA在血液中循环时间；且高温下EPR效应增强，使得药物更易进入肿瘤细胞，促使药物在肿瘤部位有更多的积累；所以，电荷可翻转载药体系RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA+NIR组实现了靶向药物运输和释放，在治疗中能发挥化学治疗与光热治疗协同作用，完全可以完全消除裸瘤鼠肿瘤，提高了肿瘤治疗效果。

此外，为了评估经过化学-光热协同治疗后肿瘤组织的病理变化，各实验组的裸瘤鼠在NIR激光照射治疗后，肿瘤组织进行冰冻切片和H&E染色，采用光学显微镜进行了病理学的观察。方法为：在肿瘤生长监测实验完成后，麻醉后处死小鼠，取出肿瘤组织，然后用PBS缓冲液洗涤肿瘤三次，用3％的多聚甲醛固定，以进一步研究H&E染色。组织病理学实验根据实验室标准操作程序进行。在H&E染色后，使用光学显微镜观察病理切片并拍摄照片。

肿瘤组织H&E切片如图11D所示，可以明显地观察到，RCQDs+NIR和RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA±NIR组裸瘤鼠肿瘤细胞均出现大面积的断裂，尤其是RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA+NIR组，细胞核明显缩小，说明肿瘤细胞发生凋亡和坏死。相反，无NIR激光照射PBS、RCQDs组和Pt(II)对照组的细胞没有观察到明显的损伤，从切片中可以看到细胞仍然排列很紧密，还可以看到细胞核。因此，从病理学角度可以进一步证实，化学-光热协同治疗组对肿瘤组织细胞具有显著的杀伤效果，使肿瘤细胞发生凋亡和坏死，最终完全消除裸瘤鼠肿瘤，故使肿瘤治疗效果得到显著增强的提高。

实施例12

组织学分析

在考核pH响应电荷可翻转载药体系在化学-光热协同治疗效果的同时，也考察了该治疗体系对正常组织的毒副作用。本实验共分为3组，PBS组、Pt(II)组和RCQDs-Pt(IV)/PEG-CS-DA+NIR组。具体方法为：当肿瘤的大小达到约70mm

尽管通过以上实施例对本发明进行了揭示，但本发明的保护范围并不局限于此，在不偏离本发明构思的条件下，对以上各构件所做的变形、替换等均将落入本发明的权利要求范围内。