一种具有毛囊再生功能的人体外分泌腺干细胞提取方法

摘要

本公开公开一种具有毛囊再生功能的人体外分泌腺干细胞提取方法,其特征在于，包括以下步骤：取人类外分泌腺组织，冲洗，剪碎；剪碎的组织用一型胶原酶将外分泌腺组织消化；收集消化细胞，得到单细胞悬液；培养细胞；得到细胞悬液，按细胞悬液∶分离液体积比为2∶1的比例将细胞悬液加入到所述的干细胞分离液中；离心机离心；吸取富含有核细胞的中间细胞层；将获取的单个核细胞加入到含10％小牛血清的高糖DMEM培养基中，连续培养；用浓度为10μg/ml的纤连蛋白溶液筛选干细胞，该方法提取的细胞量大、存活率高、更易于在培养瓶内贴壁、细胞活性好。

说明书

技术领域

本公开属于生物细胞领域，具体涉及一种具有毛囊再生功能的人体外分泌腺干细胞提取方法。

背景技术

分泌腺有内分泌腺和外分泌腺两大类,两者之间的区别主要在于内分泌腺无排泄管，腺细胞排列缺乏极性，多聚集成团块状或索状。内分泌腺分泌的分泌物称激素。其分泌物直接进入细胞周围的血管和淋巴，由血液和淋巴输送到各组织或器官中。而外分泌腺有排泄管，称腺导管，其分泌物通过腺导管输送到相应的组织或器官发挥其调节作用；

目前以人体外分泌腺干细胞提取方法主要为机械酶解法和传统灌洗法两种。机械酶解法虽然能获取数量较多的细胞，但其中的人体外分泌腺干细胞含量较低，同时很难避免胎盘中母源性细胞的干扰。传统灌洗法整个提取过程操作繁复、耗时长、成本高，提取出来的细胞活率相对较低。

发明内容

针对现有技术的不足，本公开的目的在于提供一种具有毛囊再生功能的人体外分泌腺干细胞提取方法，解决了现有技术中人体外分泌腺干细胞在提取过程中细胞活性不稳定，细胞存活率低、细胞数低的问题。

本公开的目的可以通过以下技术方案实现：

一种具有毛囊再生功能的人体外分泌腺干细胞提取方法,包括以下步骤：

1)取人类外分泌腺组织，冲洗，剪碎；

2)剪碎的组织用一型胶原酶将外分泌腺组织消化；

3)收集消化细胞，得到单细胞悬液；

4)培养细胞，传代5次；

5)将培养细胞加入磷酸盐缓冲液PBS中轻匀，得到细胞悬液，按细胞悬液∶分离液体积比为2∶1的比例将细胞悬液加入到所述的干细胞分离液中；

6)常温离心机中以1500r/min进行密度梯度离心15分钟；

7)小心吸取富含有核细胞的中间细胞层；

8)将获取的单个核细胞加入到含10％小牛血清的高糖DMEM培养基中，接种于培养瓶内中，在37℃、5％CO2孵育箱连续培养；

9)用浓度为10μg/ml的纤连蛋白溶液筛选干细胞。

进一步地，所述分离液按重量份数包括以下组分：

泛影葡胺：3-8份，

羟甲基纤维素：3-10份，

氯化铯：0.01-1.0份，

聚蔗糖：0.01-10份；

聚乙二醇:0.01-8份

将上述成分混合，加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液配成所述的干细胞分离液的浓缩液；将所述的浓缩液用0.01mol/L磷酸盐缓冲液稀释至所需的比重，比重范围为1.090-1.120g/ml。

进一步地，所述人类外分泌腺组织，采用无菌PBS反复冲洗人类外分泌腺组织直至其无血液。

进一步地，述筛选的方法是，用纤连蛋白PBS溶液覆盖容器底部，4℃放置，12小时后吸去液体，用人间充质干细胞完全培养基清洗容器，吸去培养基，得到融合率已达80％的第五代细胞制得的单细胞悬液，将单细胞悬液放入纤连蛋白铺被的容器中，37℃恒温，30分钟后吸去液体，再加入人间充质干细胞完全培养基，附着在铺被有纤连蛋白的容器底部的细胞即为人体外分泌腺干细胞。

进一步地，所述人体外分泌腺干细胞置于-196℃的液氮中进行保存。

进一步地，所述培养是将单细胞悬液在37℃二氧化碳浓度5％条件下，人间充质干细胞完全培养基培养，至细胞融合达70～80％后，传代五次。

进一步地，所述传代的每次传代的方法是：

(1)细胞清洗：将待传代的人体外分泌腺干细胞在无菌环境下取出，用缓冲液润洗2～4次；

(2)细胞分割：人体外分泌腺干细胞分为多份小块；

(3)接种：加入人体充质干细胞完全培养基终止消化，离心5分钟，弃上清液；

(4)培养：立即用无菌透明胶带封闭，放入温度为36～38℃，湿度为60～80％的培养箱中继续孵育。

本公开的有益效果：

1、本公开解决了现有技术中人体外分泌腺干细胞在提取过程中细胞活性不稳定，细胞存活率低、细胞数低的问题。

附图说明

为了更清楚地说明本公开实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是人体外分泌腺干细胞细胞群丰富度；

具体实施方式

下面将结合本公开实施例中的附图，对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本公开中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本公开保护的范围。

实施例一：人体外分泌腺干细胞的分离；

包括以下步骤：

1)取人类外分泌腺组织，冲洗，剪碎；

2)剪碎的组织用一型胶原酶将外分泌腺组织消化；

3)收集消化细胞，得到单细胞悬液；

4)培养细胞，传代5次；

5)将培养细胞加入磷酸盐缓冲液PBS中轻匀，得到细胞悬液，按细胞悬液∶分离液体积比为2∶1的比例将细胞悬液加入到所述的干细胞分离液中；

6)常温离心机中以1500r/min进行密度梯度离心15分钟；

7)小心吸取富含有核细胞的中间细胞层；

8)将获取的单个核细胞加入到含10％小牛血清的高糖DMEM培养基中，接种于培养瓶内中，在37℃、5％CO2孵育箱连续培养；

9)用浓度为10μg/ml的纤连蛋白溶液筛选干细胞。

本实施例所述传代5次是将单细胞悬液在37℃二氧化碳浓度5％条件下，人间充质干细胞完全培养基培养，至细胞融合达70～80％后，传代五次。

本实施例的筛选的方法是，用纤连蛋白PBS溶液覆盖容器底部，4℃放置，12小时后吸去液体，用人间充质干细胞完全培养基清洗容器，吸去培养基，得到融合率已达80％的第五代细胞制得的单细胞悬液，将单细胞悬液放入纤连蛋白铺被的容器中，37℃恒温，30分钟后吸去液体，再加入人间充质干细胞完全培养基，附着在铺被有纤连蛋白的容器底部的细胞即为人体外分泌腺干细胞，将分离的人体外分泌腺干细胞置于-196℃的液氮中进行保存。

实施例二：干细胞分离液的配制

一、材料

1、泛影葡胺、羟甲基纤维素、氯化铯、聚蔗糖、聚乙二醇；

2、磷酸二氢钾，氢氧化钠

3、比重计(1.090-1.120)

二、方法

称取1、泛影葡胺：5g，羟甲基纤维素：3g，氯化铯：0.5g，聚蔗糖：3g；聚乙二醇:2g；将上述组分依次加入100ml的量筒中，加0.01mol/L磷酸盐缓冲液至100ml，即得干细胞分离液的浓缩液。用比重计测得其比重为1.105g/ml。

使用时，将上述干细胞分离液的浓缩液用0.01mol/L磷酸盐缓冲液稀释至所需的比重，即为工作液。

本实施例所用的上述原料，主要以最终比重为限量，至于各种的用于增加比重的添加原料如泛影葡胺、羟甲基纤维素、氯化铯、聚蔗糖等的比例可以不一样。对各组份的具体比例也不加限定。通常，各组分的用量是一个范围：泛影葡胺：3-8份，羟甲基纤维素：3-10份，氯化铯：0.01-1.0份，聚蔗糖：0.01-10份；聚乙二醇:0.01-8份。并且，对上述用于增加比重的原料也可不予以限定，还可增加其它原料(如淀粉、聚乙二醇等)用于增加比重。

表1不同配比对分离液效果实验数据

实施例三：人体外分泌腺干细胞的分离；

保持与实施例一的方法一致进行人体外分泌腺干细胞的分离，所述人类外分泌腺组织，采用无菌PBS反复冲洗人类外分泌腺组织直至其无血液，次数和培养基血液干细胞比例；

表2人体外分泌腺干细胞冲洗次数和培养基血液干细胞比例变化情况

实施例四：人体外分泌腺干细胞的分离；

包括以下步骤：

1)取人类外分泌腺组织，冲洗，剪碎；

2)剪碎的组织用一型胶原酶将外分泌腺组织消化；

3)收集消化细胞，得到单细胞悬液；

4)培养细胞，传代3次；

5)将培养细胞加入磷酸盐缓冲液PBS中轻匀，得到细胞悬液，按细胞悬液∶分离液体积比为2∶1的比例将细胞悬液加入到所述的干细胞分离液中；

6)常温离心机中以1500r/min进行密度梯度离心15分钟；

7)小心吸取富含有核细胞的中间细胞层；

8)将获取的单个核细胞加入到含10％小牛血清的高糖DMEM培养基中，接种于培养瓶内中，在37℃、5％CO2孵育箱连续培养；

9)用浓度为10μg/ml的纤连蛋白溶液筛选干细胞。

本实施例所述培养细胞，传代3次，每次传代的方法是：

(1)细胞清洗：将待传代的鸡人体外分泌腺干细胞在无菌环境下取出，用缓冲液润洗2～4次；

(2)细胞分割：人体外分泌腺干细胞分为多份小块；

(3)接种：加入人体充质干细胞完全培养基终止消化，离心5分钟，弃上清液；

(4)培养：立即用无菌透明胶带封闭，放入温度为36～38℃，湿度为60～80％的培养箱中继续孵育。

表3人体外分泌腺干细胞传代次数和细胞融合度的变化情况

工作原理

通过控制人类外分泌腺组织的冲洗次数，悬浮液分离方法，细胞传代的培养方式和分离方式来保证人体外分泌腺干细胞在提取过程中细胞活性稳定性和细胞存活率；

同时为人类外分泌腺干细胞的分离配置有专用分离液，通过对分离液成分含量的优化配比来保证人体外分泌腺干细胞在提取过程中细胞活性稳定性和细胞存活率。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本公开的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上显示和描述了本公开的基本原理、主要特征和本公开的优点。本行业的技术人员应该了解，本公开不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本公开的原理，在不脱离本公开精神和范围的前提下，本公开还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本公开范围内。