基于线粒体标记的眼斑水龟群体遗传多样性的评价方法

摘要

本发明公开了基于线粒体标记的眼斑水龟群体遗传多样性的评价方法，该方法包括以下步骤：提取眼斑水龟DNA，分别采用引物对12s‑F/12s‑R、CYTB‑F/CYTB‑R对线粒体12S rRNA基因、Cytb基因进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后对PCR产物进行纯化和测序，对测定的序列进行校正和比对分析，计算遗传多样性参数，构建系统发育树，对眼斑水龟遗传多样性进行评估。该方法能够减少取样过程中对动物造成的损伤，提高样品利用率，实现对濒危动物眼斑水龟群体遗传多样性的评估。

说明书

技术领域

本发明涉及动物保护领域，具体涉及基于线粒体标记的眼斑水龟群体遗传多样性的评价方法。

背景技术

眼斑水龟(Sacalia bealei)隶属于龟鳖目(Tesudines)、地龟科(Geoemydidae)、眼斑龟属(Sacalia)，是中国特有淡水龟类，分布于安徽、福建、江西、湖南、贵州、广东、广西、香港等省区。由于过度猎捕、非法贸易及栖息地破坏等原因，导致眼斑水龟野生种群数量锐减，被《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》(IUCN)评估为濒危物种，2019年11月26日，被《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)由附录Ⅲ提高至附录Ⅱ。如何科学保护眼斑水龟自然资源，已成为迫切需要解决的问题。

近年来，随着分子生物学技术的发展及其在保护生物学中的应用逐渐普及，运用分子标记对动物群体进行遗传多样性评估，从而制定合理的保护策略已经成为热门课题。选择合适的分子标记是濒危动物遗传多样性研究的关键问题。脊椎动物线粒体DNA具有分子结构简单、进化速率快、几乎不发生重组、母系遗传等特征，成为分子进化和群体遗传学研究的重要分子标记，特别适合用于种内或近缘种间的遗传学研究。在濒危动物的研究中，由于线粒体DNA呈环状结构，比起链状结构的核DNA更稳定，同等提取条件下不易降解，DNA得率更高，因此需要的样品量少，更容易实现微创取样、无创取样，可以避免取样过程中对濒危动物造成过多损伤。

发明内容

本发明的目的在于提供基于线粒体标记的眼斑水龟群体遗传多样性的评价方法，一般情况下，取样损伤大则最终获得基因序列的成功率高，取样损伤小则失败率高，本发明提供的方法能够在减少取样损伤的同时保证实验成功率，实现对濒危动物眼斑水龟群体遗传多样性的评估。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

基于线粒体标记的眼斑水龟群体遗传多样性的评价方法，包括以下步骤：提取眼斑水龟DNA，分别采用引物对12s-F/12s-R、CYTB-F/CYTB-R对线粒体12S rRNA基因、Cytb基因进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后对PCR产物进行纯化和测序，对测定的序列进行校正和比对分析，计算遗传多样性参数，构建系统发育树，对眼斑水龟遗传多样性进行评估。

优选，所述的基于线粒体标记的眼斑水龟群体遗传多样性的评价方法，包括以下步骤：

(1)样品采集：用棉签擦取眼斑水龟口腔上皮细胞，制成口腔拭子，将其冷冻保存；

(2)DNA提取：将含口腔脱落细胞口腔拭子的表面层剥离，加入PBS洗涤，然后加入拭子裂解液和蛋白酶K，混匀后，放至水浴中消化；离心取上清，加入NaCl，混匀后离心取上清；再加入氯仿、异戊醇混匀，离心取上清；加入预冷的异丙醇，混匀后冷冻存放，然后离心弃上清；加入冰乙醇洗涤DNA沉淀，然后室温晾干，加双蒸水溶解，冻存；

(3)PCR扩增及测序：以步骤(2)获得的DNA为模板，分别采用引物对12s-F/12s-R、CYTB-F/CYTB-R对线粒体12S rRNA基因、Cytb基因进行PCR扩增，随后用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后对PCR产物进行纯化和测序；

(4)测序结果分析：对测定的序列进行校正和比对分析，计算遗传多样性参数，构建系统发育树，对眼斑水龟遗传多样性进行评估。

所述的引物对12s-F/12s-R序列为：12s-F:5'-AAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3'和12s-R:5'-GAGGGTGACGGGCGGTGTGT-3'；所述的引物对CYTB-F/CYTB-R序列为：CYTB-F:5'-TGATCTTGAARAACCAYCGTTG-3'和CYTB-R:5'-GGTTTACAAGACCAATGCTT-3'。

所述的PCR扩增反应体系为：50ng/μL DNA模板1.0μL、5U/μL Taq Enzyme 0.2μL、10μmol/L正向引物1.0μL、10μmol/L反向引物1.0μL、10mmol/L dNTPs 1.0μL、10×Buffer5.0μL，补加ddH

所述的PCR扩增反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56/58℃退火30s，30次循环；72℃延伸60-90s；72℃延伸5min；16℃保存。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

本发明提供了一种基于线粒体标记的眼斑水龟群体遗传多样性的评价方法，该方法通过测定眼斑水龟线粒体的12S rRNA基因片段、Cytb基因片段，将测定的序列进行校正和比对分析，计算遗传多样性参数，构建系统发育树，对眼斑水龟遗传多样性进行评估，结果显示，30只眼斑水龟的线粒体12S rRNA基因片段人工校正后用于遗传多样性分析的有效序列长度为359bp，仅有3个变异位点，占位点总数的0.84％；30只眼斑水龟个体共有4种单倍型；30只眼斑水龟的线粒体Cytb基因片段人工校正后用于遗传多样性分析的有效序列长度为1077bp，含有16个变异位点，占位点总数的1.48％；30只眼斑水龟个体共有10种单倍型。综合两个线粒体基因的分析结果显示：测试群体中，濒危动物眼斑水龟遗传多样性低，但群体内仍有一定程度的个体差异，可以通过加强对其生存环境的保护，减少人为干扰来实现野生种群修复。本发明在30个个体中扩增的12S rRNA基因片段和Cytb基因片段全部测序成功，证明利用本发明的方法能够在减少取样过程中对动物造成的损伤的同时，保证最终序列获取的成功率，实现对濒危动物眼斑水龟群体遗传多样性的评估。

附图说明

图1为眼斑水龟12S rRNA基因片段的变异位点和单倍型。

图2为眼斑水龟cytb基因片段的变异位点和单倍型。

图3为眼斑水龟Cytb基因片段的系统发育树(NJ)。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

样本采集：试验用30只眼斑水龟样本采自广东惠州，分别使用无菌的口腔拭子在口腔里适当用力擦拭，将拭子放入含有样品保护剂的无菌离心管中，低温冷冻(-20℃～-80℃)保存，直至开始提取DNA。

DNA提取(DNA提取所用到的试剂原液或粉末均购自生工生物工程有限公司)：

1)样品的预处理：使用无菌的剪刀，将口腔拭子的表面层(含口腔脱落细胞)剥离，然后将剥离部分转移至一个新的1.5mL的无菌离心管中。添加PBS 0.7mL，震荡混匀，12000r/min离心5分钟，弃上清。

2)样品的裂解：加入400μL的拭子裂解液和15μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，混匀后，放至65℃的水浴中消化2小时，每30分钟上下颠倒混匀1次。

3)离心弃沉淀：12000r/min离心5分钟，转移上清至一个新的1.5mL的离心管。

4)第一次提取：加入200μL(约二分之一体积)的5mol/L的NaCl，上下颠倒混匀5分钟，12000r/min离心5分钟，转移上清至一个新的1.5mL的离心管。

5)第二次提取：加入等体积的氯仿-异戊醇混合液(氯仿：异戊醇体积比为24:1)，上下颠倒混匀5分钟，12000r/min离心5分钟，转移上清至一个新的1.5mL的离心管。

6)DNA的沉淀：加入等体积预冷的异丙醇，上下颠倒混匀2分钟，放至-20℃静置30分钟，然后12000r/min离心10分钟，弃上清。

7)DNA的洗涤：加入700μL的75％的冰乙醇，上下颠倒混匀2分钟，然后12000r/min离心10分钟，弃上清。

8)DNA的干燥：将含DNA的离心管口朝下放在室温晾干。

9)DNA的溶解：将每份样品中加入50μL的ddH

PCR扩增及测序：以上述提取获得的DNA为模板，采用引物对12s-F:5'-AAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3'和12s-R:5'-GAGGGTGACGGGCGGTGTGT-3'对所用样本的线粒体12S rRNA基因片段进行扩增。采用引物对CYTB-F:5'-TGATCTTGAARAACCAYCGTTG-3'和CYTB-R:5'-GGTTTACAAGACCAATGCTT-3'对所用样本的线粒体Cytb基因片段进行扩增。采用50uL反应体系进行PCR扩增，反应体系如表1所示，PCR扩增程序如表2所示。

表1.PCR反应体系

表2.PCR反应程序

PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳检测后，进行纯化和测序。

结果分析：测序结果用MEGA6软件进行分析，首先去除序列两端不准确的部分，然后对双向测序的序列进行拼接，并根据测序峰图进行人工校对，以确保序列的准确性。对所有序列进行比对分析，计算单倍型数量、变异位点数目等遗传多样性参数，构建系统发育树，评估遗传多样性。

共测序获得30只眼斑水龟的线粒体12S rRNA基因片段，人工校正后用于遗传多样性分析的有效序列长度为359bp，仅有3个变异位点，分别位于序列171、182、186bp的位置，占位点总数的0.84％；30只眼斑水龟个体共有4种单倍型，变异位点和单倍型具体信息如图1。

共测序获得30只眼斑水龟的线粒体Cytb基因片段，人工校正后用于遗传多样性分析的有效序列长度为1077bp，含有16个变异位点，分别位于序列103、170、181、196、364、407、530、531、688、713、829、850、862、1027、1033、1063bp的位置，占位点总数的1.48％；30只眼斑水龟个体共有10种单倍型，变异位点和单倍型具体信息如图2，该图2中删去了变异位点之间的相同碱基。基于Cytb基因片段构建的系统发育树如图3。

综合两个线粒体基因的分析结果，濒危动物眼斑水龟群体遗传多样性低，但群体内仍有一定程度的个体差异，可以通过加强对其生存环境的保护，减少人为干扰来实现野生种群修复。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。