技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及Reticulon 4(RTN4)家族成员RTN4B即Nogo-B抑制剂在制备治疗糖脂代谢紊乱药物中的用途和治疗糖脂代谢紊乱的药物。
背景技术
糖、脂代谢作为人体能量供给主要来源，在生命活动中居于必要地位，但随着居民生活水平提高而导致糖脂代谢紊乱相关疾病极为常见，一般来说糖脂代谢紊乱会导致高脂血症、糖尿病、脂肪肝、肥胖、动脉硬化性心脑血管病等系列疾病，长期糖、脂水平异常会对全身脏器产生损害而导致其功能的逐渐减退，是患者致病、致残、致死的重要原因。
目前用于降糖的药物有：二甲双胍，它是治疗2型糖尿病的一线药物。它的作用是降低肝脏中的葡萄糖生成，提高身体对胰岛素的敏感性，从而使身体更有效地利用胰岛素(Hunter RW,Hughey CC,Lantier L,Sundelin EI,Peggie M,Zeqiraj E,et al.Metforminreduces liver glucose production by inhibition of fructose-1-6-bisphosphatase.Nat Med 2018；24:1395-1406；Foretz M,Guigas B,ViolletB.Understanding the glucoregulatory mechanisms of metformin in type 2diabetes mellitus.Nat Rev Endocrinol 2019；15:569-589)。磺酰脲类药物可以帮助身体分泌更多的胰岛素，可能的副作用包括低血糖和体重增加(Douros A,Dell'Aniello S,Yu OHY,Filion KB,Azoulay L,Suissa S.Sulfonylureas as second line drugs intype 2 diabetes and the risk of cardiovascular and hypoglycaemic events:population based cohort study.BMJ 2018；362:k2693；Tahrani AA,Barnett AH,BaileyCJ.Pharmacology and therapeutic implications of current drugs for type 2diabetes mellitus.Nat Rev Endocrinol 2016；12:566-592)。噻唑烷二酮类药物使人体组织对胰岛素更加敏感，因而也用于2型糖尿病治疗，但是副作用较大(Soccio RE,ChenER,Lazar MA.Thiazolidinediones and the promise of insulin sensitization intype 2 diabetes.Cell Metab 2014；20:573-591)。DPP-4抑制剂有助于降低血糖水平，但效果一般，它们不会导致体重增加，但可能会导致关节疼痛，增加患动脉粥样硬化的风险(Inagaki N,Onouchi H,Sano H,Funao N,Kuroda S,Kaku K.SYR-472,a novel once-weekly dipeptidyl peptidase-4(DPP-4)inhibitor,in type 2 diabetes mellitus:aphase 2,randomised,double-blind,placebo-controlled trial.Lancet DiabetesEndocrinol 2014；2:125-132；Ou SM,Shih CJ,Chao PW,Chu H,Kuo SC,Lee YJ,etal.Effects on clinical outcomes of adding dipeptidyl peptidase-4 inhibitorsversus sulfonylureas to metformin therapy in patients with type 2 diabetesmellitus.Ann Intern Med 2015；163:663-672)。GLP-1受体激动剂，它可以减缓消化，帮助降低血糖水平，可能的副作用包括恶心、增加胰腺炎的发生风险(Frias JP,Nauck MA,VanJ,Kutner ME,Cui X,Benson C,et al.Efficacy and safety of LY3298176,a noveldual GIP and GLP-1 receptor agonist,in patients with type 2diabetes:arandomised,placebo-controlled and active comparator-controlled phase 2trial.Lancet 2018；392:2180-2193)。SGLT2抑制剂阻止肾脏将糖重新吸收到血液中，副作用可能包括生殖器霉菌感染、尿路感染、低血压和糖尿病酮症酸中毒的高风险(FiorettoP,Zambon A,Rossato M,Busetto L,Vettor R.SGLT2 Inhibitors and the DiabeticKidney.Diabetes Care 2016；39 Suppl 2:S165-171；Fitchett D.A safety update onsodium glucose co-transporter 2 inhibitors.Diabetes Obes Metab 2019；21 Suppl2:34-42)。胰岛素是较为理想的治疗糖尿病的手段，可能的副作用是低血糖(FrierBM.Hypoglycaemia in diabetes mellitus:epidemiology and clinicalimplications.Nat Rev Endocrinol 2014；10:711-722)。
降脂的药物有降低低密度脂蛋白-胆固醇和降甘油三酯类。降低低密度脂蛋白-胆固醇的有他汀类药物，它阻断肝脏产生胆固醇，加快肝脏从血液中清除胆固醇，但是他汀对很多人群无效(Liu A,Wu Q,Guo J,Ares I,Rodriguez JL,Martinez-Larranaga MR,etal.Statins:Adverse reactions,oxidative stress and metabolicinteractions.Pharmacol Ther 2019；195:54-84；Goldberg AC,Leiter LA,Stroes ESG,Baum SJ,Hanselman JC,Bloedon LT,et al.Effect of bempedoic acid vs placeboadded to maximally tolerated statins on low-density lipoprotein cholesterolin patients at high risk for cardiovascular disease:The CLEAR WisdomRandomized Clinical Trial.JAMA 2019；322:1780-1788)。胆固醇吸收抑制剂，例如ezetimibe通过限制对饮食胆固醇的吸收来帮助降低血液胆固醇(Bruckert E,Giral P,Tellier P.Perspectives in cholesterol-lowering therapy:the role of ezetimibe,a new selective inhibitor of intestinal cholesterol absorption.Circulation2003；107:3124-3128)。PCSK9抑制剂的新型药物可以帮助肝脏吸收、代谢更多的低密度脂蛋白胆固醇，从而降低血液中胆固醇的循环量(Della Badia LA,Elshourbagy NA,MousaSA.Targeting PCSK9 as a promising new mechanism for lowering low-densitylipoprotein cholesterol.Pharmacol Ther 2016；164:183-194)。这类药物主要是PCSK9单克隆抗体，例如Alirocumab(Praluent,Robinson JG,Rosenson RS,Farnier M,etal.Safety of very low low-density lipoprotein cholesterol levels withalirocumab:pooled data from randomized trials.J Am Coll Cardiol 2017；69:471-82)和evolocumab(repata,Sabatine MS,Giugliano RP,Wiviott SD,Raal FJ,Blom DJ,Robinson J,Ballantyne CM,Somaratne R,Legg J,Wasserman SM,Scott R,Koren MJ,Stein EA；Open-Label Study of Long-Term Evaluation against LDL Cholesterol(OSLER)Investigators.Efficacy and safety of evolocumab in reducing lipids andcardiovascular events.N Engl J Med.2015；372:1500-9)。PCSK9抑制剂可能用于那些有导致LDL水平非常高的遗传疾病的人群，或者对他汀类药物或其他胆固醇药物不耐受的冠心病患者(Costet P.Molecular pathways and agents for lowering LDL-cholesterolin addition to statins.Pharmacol Ther 2010；126:263-278；Giugliano RP,PedersenTR,Park JG,De Ferrari GM,Gaciong ZA,Ceska R,et al.Clinical efficacy andsafety of achieving very low LDL-cholesterol concentrations with the PCSK9inhibitor evolocumab:a prespecified secondary analysis of the FOURIERtrial.Lancet 2017；390:1962-1971)。
降甘油三酯的有贝特类药物，例如非诺贝特(TriCor，Fenoglide等)和Gemfrobzil(Lopid)可降低肝脏产生极低密度脂蛋白(VLDL)胆固醇(极低密度脂蛋白胆固醇主要含有甘油三酯)，并加快血液中甘油三酯的清除。但是贝特类药物和他汀联合会增加他汀类药物副作用的风险(McKeage K,Keating GM.Fenofibrate:a review of its use indyslipidaemia.Drugs 2011；71:1917-1946；Tirkkonen T,Ryynanen A,Vahlberg T,Irjala K,Klaukka T,Huupponen R,et al.Frequency and clinical relevance of druginteractions with lovastatin and simvastatin:an observational databasestudy.Drug Saf 2008；31:231-240)。烟酸限制了肝脏产生低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白胆固醇的能力，但是烟酸并没有提供比他汀类药物更多的益处，烟酸也与肝脏损伤和中风有关(Ooi EM,Watts GF,Chan DC,Pang J,Tenneti VS,Hamilton SJ,et al.Effects ofextended-release niacin on the postprandial metabolism of Lp(a)and ApoB-100-containing lipoproteins in statin-treated men with type 2 diabetesmellitus.Arterioscler Thromb Vasc Biol 2015；35:2686-2693；Durham SH,CovingtonEW,Clemmons KJ.Hepatotoxicity upon using niacin to pass a drug test:A casereport.J Am Pharm Assoc(2003)2018；58:564-567；Teo KK,Goldstein LB,Chaitman BR,Grant S,Weintraub WS,Anderson DC,et al.Extended-release niacin therapy andrisk of ischemic stroke in patients with cardiovascular disease:theAtherothrombosis Intervention in Metabolic Syndrome with low HDL/HighTriglycerides:Impact on Global Health Outcome(AIM-HIGH)trial.Stroke 2013；44:2688-2693)。
因此，目前糖脂代谢紊乱仍局限在控制血糖、血脂等传统手段，无法针对糖脂转化的过程发挥作用。碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrate response elementbinding protein,ChREBP)是一个在糖脂代谢过程中发挥重要作用的转录因子，但是单纯的抑制或者激活该分子并不能起到改善糖脂代谢的作用，而是需要根据病理过程的变化调节该分子才能够起到改善效果。
网状蛋白4(reticulon 4,RTN4)也称为Nogo蛋白，定位于内质网并与内质网管膜增生及膜弯曲相关。Nogo蛋白家族包括Nogo-A、B、C三种亚型。Nogo-B也是血液循环中可以检测到的唯一亚型，并主要由肝脏合成、分泌。肝脏中Nogo-B表达与酒精性肝病和肝纤维化发生有一定关联性，但直接针对Nogo-B和糖脂代谢紊乱治疗研究并未见报道。
发明内容
本发明人通过研究发现RTN4B(Nogo-B)抑制剂在生理状态下刺激ChREBP实现良性的脂肪积累，而在糖脂代谢紊乱病理状态下(即摄入过多碳水化合物导致机体代谢异常，以肝脏损伤为主要标志)抑制ChREBP，从而避免脂质的过度积累造成机体损伤。目前没有发现有类似依据生理、病理状态改善糖脂代谢的靶点或者药物。因此，基于RTN4B(Nogo-B)基因表达水平和蛋白水平与糖脂代谢紊乱存在着高度关联进而完成本发明。
基于此，本发明首先提供了Nogo-B抑制剂在制备治疗糖脂代谢紊乱药物中的应用。
优选地，所述RTN4B(Nogo-B)抑制剂为降低RTN4B(Nogo-B)mRNA水平和/或RTN4B(Nogo-B)蛋白水平和/或Nogo-B蛋白功能的抑制剂。
现有可以降低RTN4B(Nogo-B)mRNA水平和/或RTN4B(Nogo-B)蛋白水平的材料均可以作为本发明所述的RTN4B(Nogo-B)抑制剂，如：RTN4B(Nogo-B)反义寡核苷酸、RTN4B(Nogo-B)小干扰RNA(siRNA)、RTN4B(Nogo-B)短发夹RNA(shRNA)、RTN4B(Nogo-B)单克隆抗体、RTN4B(Nogo-B)小分子抑制剂、靶向Nogo-B进行基因编辑的核酸分子和RTN4B(Nogo-B)疫苗。
优选地，所述Nogo-B抑制剂是靶向Nogo-B进行基因编辑的核酸分子，进一步包括用于基因编辑操作的试剂。进一步地，其中所述基因编辑的靶标DNA是Nogo-B基因的外显子2和外显子8。在一个具体实施方式中，所述针对靶标DNA的寡聚核苷酸序列分别为：GTATCTCCTCTTGCGAGGG,GATGTCCAGATATAGCTTAGGGG,GATGATGGTCTCGCCCTTGG或AGTTAATGCTGGCCTCAGAAGG。
另外优选地，所述Nogo-B抑制剂Nogo-B单克隆抗体，更具体的是小鼠/兔源性/人源化抗人Nogo-B抗体。
再一方面优选地，所述Nogo-B抑制剂是小干扰RNA，具体是3对如下序列的小干扰RNA：第一对：GGAUCUCAUUGUAGUCAUATT和UAUGACUACAAUGAGAUCCTT；第二对:GCAGUGUUGAUGUGGGUAUUUTT和AAAUACCCACAUCAACACUGCTT；或第三对：CACAUAAACUAGGAAGAGATT和UCUCUUCCUAGUUUAUGUGTT。
其中，所述糖脂代谢紊乱是指高脂血症、糖尿病、脂肪肝、肥胖或动脉硬化性心脑血管病。
本发明提供了一种治疗糖脂代谢紊乱的药物，所述药物中包含了上述的RTN4B(Nogo-B)抑制剂。
具体地，所述Nogo-B抑制剂为降低Nogo-B mRNA水平和/或Nogo-B蛋白水平的抑制剂。更具体的，所述Nogo-B抑制剂包括Nogo-B反义寡核苷酸、Nogo-B小干扰RNA、Nogo-B短发夹RNA、Nogo-B单克隆抗体、Nogo-B小分子抑制剂、靶向Nogo-B进行基因编辑的核酸分子和Nogo-B疫苗中的至少一种。
优选地，所述Nogo-B抑制剂是靶向Nogo-B进行基因编辑的核酸分子，进一步包括用于基因编辑操作的试剂。进一步地，其中所述基因编辑的靶标DNA是Nogo-B基因的外显子2和外显子8。在一个具体实施方式中，所述针对靶标DNA的寡聚核苷酸序列分别为：GTATCTCCTCTTGCGAGGG,GATGTCCAGATATAGCTTAGGGG,GATGATGGTCTCGCCCTTGG,AGTTAATGCTGGCCTCAGAAGG。或者，所述Nogo-B抑制剂是Nogo-B单克隆抗体，更具体的是小鼠/兔源性/人源化抗人Nogo-B抗体。
本发明还提供一种用于糖脂代谢紊乱辅助诊断、病程分析、疗效判定、预后评估的试剂盒，所述试剂盒中可包含小鼠/兔源性/人源化抗人Nogo-B抗体、兔或羊抗小鼠/羊抗兔抗体、3,3,5,5-四甲基联苯胺。
此外，本发明还提供通过基因编辑预防糖脂代谢紊乱的方法，即采用基因编辑的方式制备转基因动物。进一步地，其中所述基因编辑是CRISPR/Cas9编辑技术，优选地，其靶标DNA是Nogo-B基因的外显子2和外显子8。在一个具体实施方式中，所述针对靶标DNA的寡聚核苷酸序列分别为：GTATCTCCTCTTGCGAGGG,GATGTCCAGATATAGCTTAGGGG,GATGATGGTCTCGCCCTTGG或AGTTAATGCTGGCCTCAGAAGG。
或者优选地，所述Nogo-B抑制剂是小干扰RNA，具体是3对如下序列的小干扰RNA：第一对：GGAUCUCAUUGUAGUCAUATT和UAUGACUACAAUGAGAUCCTT；第二对:GCAGUGUUGAUGUGGGUAUUUTT和AAAUACCCACAUCAACACUGCTT；或第三对：CACAUAAACUAGGAAGAGATT和UCUCUUCCUAGUUUAUGUGTT。
综上，本发明可以作为糖脂代谢紊乱的一个重要的新治疗靶点。通过本发明的揭示可进一步制备包含RTN4B(Nogo-B)抑制剂的单体或复方糖脂代谢紊乱治疗药物，用于治疗各类型糖脂代谢紊乱相关疾病，从而为糖脂代谢病提供了一种新的治疗选择。
附图说明
图1为糖脂代谢紊乱病人(patients)和健康对照正常病人(healthy control)血清中Nogo-B蛋白表达水平对照图。
图2为采用CRISPR/Cas9技术抑制Nogo-B表达的小鼠和正常小鼠在食用普通食物或者高果糖食物2周后肝脏组织切片图。
图3为采用CRISPR/Cas9技术抑制Nogo-B表达的小鼠和正常小鼠在食用普通食物或者高果糖食物2周后血清中表征肝功能的酶活性检测结果。
图4Nogo-B敲除小鼠鉴定结果。其中1号条带为正常小鼠即野生型小鼠，缩写为WT小鼠，2-8号条带为采用CRISPR/Cas9技术抑制Nogo-B表达的小鼠，缩写为Nogo-B
图5A为采用CRISPR/Cas9技术抑制Nogo-B表达的小鼠和正常小鼠食用普通食物或者高葡萄糖食物10周的模式图，其中，正常小鼠食用正常食物组命名为WT-NC、采用CRISPR/Cas9技术抑制Nogo-B表达小鼠食用正常食物组命名为Nogo-B-NC组，正常小鼠食用高葡萄糖食物组命名为WT-HGD、采用CRISPR/Cas9技术抑制Nogo-B表达小鼠食用高葡萄糖食物组命名为Nogo-B-HGD。
图5B显示食用正常食物的两组(WT-NC和Nogo-B-NC)体重增长结果(左侧)；食用高葡萄糖食物的两组(WT-HGD和Nogo-B-HGD)体重增长结果(右侧)。
图5C显示四组小鼠进食量结果，因版面限制，图中Nogo代表Nogo-B。
图6为采用CRISPR/Cas9技术抑制Nogo-B表达的小鼠和正常小鼠食用普通食物或者高葡萄糖食物9周后对小鼠进行葡萄糖耐受(GTT)和10周后进行胰岛素耐受(ITT)实验的结果，因版面限制，图中Nogo代表Nogo-B。
图7为采用CRISPR/Cas9技术抑制Nogo-B表达的小鼠和正常小鼠食用普通食物或者高葡萄糖食物11周后血清中表征肝功能的酶活性检测结果。
图8为采用尾静脉注射siRNA技术，注射靶向抑制肝脏Nogo-B表达的siRNA即si-Nogo-B组小鼠和注射对照siRNA即si-Ctrl对照组小鼠安乐死后取肝脏组织，随后用Western blot方法检测小鼠肝脏中Nogo-B的表达水平，因版面限制，图中Nogo代表Nogo-B。
图9为采用siRNA技术抑制肝脏Nogo-B表达的小鼠和对照小鼠(提前食用普通食物或者高果糖食物2周后注射siRNA)，检测小鼠空腹血糖和非空腹血糖水平以及肝脏甘油三酯(TG)含量。
图10为采用siRNA技术抑制肝脏Nogo-B表达的小鼠和对照小鼠(提前食用普通食物或者高果糖食物2周后注射siRNA)血清中表征肝功能的酶活性和血清TG水平检测结果。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：糖脂代谢紊乱病人血清中Nogo-B的高表达研究
将糖脂代谢紊乱病人血清和健康志愿者血清分装后不做病人和志愿者区分，仅标明序号，由不知道序号所代表分组意义的专门工作人员用试剂盒检测Nogo-B水平。其中，健康志愿者检测数量为17，糖脂代谢紊乱病人检测数量为12，所采用ELISA试剂盒购自武汉Cusabio(CSB-EL020572HU)公司。检测后结果显示糖脂代谢紊乱病人血清中Nogo-B蛋白表达水平(90.78±8.424pg/mL)明显高于健康对照(49.27±2.949pg/mL)，显著性差异p<0.001(图1)。
实施例2：抑制小鼠Nogo-B表达对食用高果糖食物小鼠的研究
采用CRISPR/Cas9技术抑制小鼠Nogo-B表达，将该类小鼠与正常小鼠分别各分为两组，其中一组继续食用正常食物(即Nogo-B-NC组或WT-NC组)，另外一组食用高果糖食物(即Nogo-B-HFrD组或WT-HFrD组)，高果糖食物中含有70％果糖。2周后取肝脏组织切片分析，结果如图2所示：正常小鼠食用高果糖食物组(WT-HFrD)肝脏组织发生损伤，表现为肝脏组织中出现明显的脂质大空泡和肝细胞膨胀(hepatocyte ballooning)，而抑制Nogo-B表达小鼠食用高果糖食物组(Nogo-B-HFrD)基本不引起损伤。此外，图中WT-NC和Nogo-B-NC分别为CRISPR/Cas9技术抑制Nogo-B表达小鼠组和正常小鼠组正常饮食情况下的肝脏切片，显示抑制小鼠Nogo-B表达对肝脏没有影响。
上述小鼠取血清行肝功能的酶活性分析，结果如图3所示。其中显示：正常小鼠食用高果糖食物组(WT-HFrD)肝损伤指标碱性磷酸酶ALP、谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST显著升高(WT-HFrD vs.WT-NC)；而抑制Nogo-B表达小鼠食用高果糖食物组(Nogo-B-HFrD)这些指标基本没有变化，说明高果糖食物基本不引起损伤(Nogo-B-HFrD vs.Nogo-B-NC)。此外，图3中WT-NC和Nogo-B-NC分别为CRISPR/Cas9技术抑制Nogo-B表达小鼠组和正常小鼠组正常饮食情况下的肝功能酶活性分析，显示抑制Nogo-B表达对小鼠肝功能酶活性没有影响(Nogo-B-NC vs.WT-NC)。
其中，CRISPR/Cas9技术抑制小鼠Nogo-B表达具体操作如下：
1)载体的设计、构建和纯化：使用麻省理工学院的CRISPR Design工具(http://crispr.mit.edu/)，依据Score的高低设计一对长度为20bp的针对靶标DNA的寡聚核苷酸链序列用于制备sgRNA，并在该靶区域设计引物用于后续小鼠的基因鉴定。
其中靶标DNA是Nogo-B基因的外显子2和外显子8，所设计的四条针对靶标DNA的寡聚核苷酸序列分别为：GTATCTCCTCTTGCGA GGG,GATGTCCAGATATAGCTTAG GGG,GATGATGGTCTCGCCCT TGG,AGTTAATGCTGGCCTCAGA AGG，在U6启动子作用下靶向靶标DNA，进行靶基因的敲除。
将合成后的2条单链寡聚核苷酸sgRNA序列退火(95℃5min后自然降至室温)形成双链DNA，在T
2)体外转录：sgRNA的表达载体经Dra I酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中作为模板用于体外转录，并依照MEGAshortscript Kit(Ambion,AM1354)试剂盒体外经T7 RNA聚合酶合成sgRNA；
3)Cas9/sgRNA的显微注射：将转录好的sgRNA和Cas9混合并调整注射浓度，使用TE2000U显微注射仪将混合物显微注射到C57BL/6实验小鼠受精卵的细胞质中，再将受精卵移植到假孕的C57BL/6母鼠子宫中，等待F0代小鼠出生；
4)F0小鼠的鉴定：在F0代小鼠出生后5-7天时，采用剪脚趾法标记小鼠，并将剪取的鼠尾组织经酚氯仿法提取DNA，依据上述实验1)中在靶区域设计的引物进行鉴定，其中Nogo-B敲除小鼠鉴定采用到两对引物，序列如下，1#引物：2260Rtn4-gtF4：CATGCCTGGGTTATGGAGACCT,2260Rtn4-gtR4:CCGTAACCAAGGGAGTGTCCC；2#引物：2260Rtn4-delgtF2:AGGTGCCCTTATTGCTTCCA,2260Rtn4-delgtR2:TTGTGAGAGACCACATCGGTG。其中1#引物在野生型(WT)小鼠中PCR产物过大(38kb)，因此电泳图中看不到条带，在敲除(Nogo-B
5)F0代小鼠的可遗传性检测：将PCR以及测序正确的F0代小鼠与野生型C57BL/6小鼠进行交配，产生F1代小鼠，依据F0代小鼠的鉴定方法对F1代小鼠进行鉴定，获得的阳性F1代杂合子小鼠即可稳定遗传。采用F4代之后的小鼠进行实验。
实施例3：抑制小鼠Nogo-B表达对食用高葡萄糖食物小鼠的研究
除高果糖损伤外，长时间过量摄入葡萄糖也造成糖脂代谢紊乱、进而导致损伤，因此我们设计了这一实施例。其中，CRISPR/Cas9技术抑制小鼠Nogo-B表达，具体操作同实施例2中所描述的过程。
采用CRISPR/Cas9技术(靶标是外显子2和外显子8，在基因组和转录组上分别表现为37kb和2824bp的缺失)抑制小鼠Nogo-B表达，将该类小鼠与正常小鼠分别各分为两组，其中一组继续食用普通食物(即Nogo-B-NC组或WT-NC组)，另外一组食用高葡萄糖食物(即Nogo-B-HGD组或WT-HGD组)，高葡萄糖食物货号和来源为Cat#:MD17120502,BIOPIKE,Shanghai,China。在小鼠食用高葡萄糖食物第9周行葡萄糖耐受实验(GTT)，第10周行胰岛素耐受实验(ITT)，第11周结束实验，取血清进行肝功能酶活性分析。
图5A为采用CRISPR/Cas9技术抑制Nogo-B表达小鼠组和正常小鼠组食用正常食物或者高葡萄糖食物的模式图，正常小鼠食用正常食物组命名为WT-NC、采用CRISPR/Cas9技术抑制Nogo-B表达小鼠食用正常食物组命名为Nogo-B-NC组，正常小鼠食用高葡萄糖食物组命名为WT-HGD、采用CRISPR/Cas9技术抑制Nogo-B表达小鼠食用高葡萄糖食物组命名为Nogo-B-HGD。从实验开始到结束每周记录小鼠体重和进食量，图5B结果显示食用正常食物的两组(WT-NC和Nogo-B-NC)体重增长无差异，但是WT-HGD组小鼠体重从第5周开始增长加快，Nogo-B-HGD组无体重增长加快现象。图5C结果显示Nogo-B-HGD组小鼠进食量增加，表明小鼠的体重变化与进食量无关。
图6为采用CRISPR/Cas9技术抑制Nogo-B表达小鼠组和正常小鼠组食用正常食物或者高葡萄糖食物9周后对小鼠进行葡萄糖耐受(GTT)、10周后进行胰岛素耐受(ITT)实验，图6结果显示正常小鼠食用高葡萄糖食物组(WT-HGD)胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性降低，而抑制Nogo-B表达小鼠食用高葡萄糖食物组(Nogo-B-HGD)未发生胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性降低的现象。
图7为采用CRISPR/Cas9技术抑制Nogo-B表达小鼠组和正常小鼠组食用正常食物或者高葡萄糖食物11周后肝功能酶活性检测结果，如图所示正常小鼠食用高葡萄糖食物糖组(WT-HGD)肝脏组织发生损伤，碱性磷酸酶ALP、谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST升高；而抑制Nogo-B表达小鼠食用高葡萄糖食物组(Nogo-B-HGD)这些指标基本不变，说明高葡萄糖食物在抑制Nogo-B表达小鼠中基本不引起肝脏损伤，图中WT-NC和Nogo-B-NC分别为CRISPR/Cas9技术抑制Nogo-B表达小鼠组和正常小鼠组正常饮食情况下的肝功能酶活性分析，同样显示抑制Nogo-B表达对小鼠肝功能酶活性没有影响。
因此，图5至7结果显示在喂食正常食物的两组小鼠中，它们的体重和GTT/ITT均无显著性差别，而正常小鼠食用高葡萄糖食物组(WT-HGD)发生糖耐量异常和胰岛素耐量异常，同时肝脏组织发生损伤，碱性磷酸酶ALP、谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST升高，而抑制Nogo-B表达小鼠食用高葡萄糖食物组(Nogo-B-HGD)糖耐量和胰岛素耐量实验结果与食用普通食物小鼠组结果相似，且肝脏也未出现损伤。
实施例4：通过小干扰RNA敲减Nogo-B同样抑制HFrD引起的肝损伤的研究
肝脏是糖脂代谢的核心器官，靶向肝脏更具有特异性，实施例2和3采用CRISPR/Cas9技术抑制Nogo-B为系统性Nogo-B表达缺失，为了验证特异性抑制肝脏Nogo-B表达的作用，我们对小鼠进行了小干扰RNA实验。
本实施例中采用的序列为：si-Ctrl,UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT,ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT；si-Nogo-B,GGAUCUCAUUGUAGUCAUATT,UAUGACUACAAUGAGAUCCTT。
在C57BL/6小鼠食用高果糖食物两周后，将上述si-Ctrl两条序列和si-Nogo-B两条序列分别进行退火操作之后，采用Engreen转染试剂并严格按照说明书要求，用上述小干扰RNA序列对小鼠进行尾静脉注射、从而对肝脏Nogo-B特异性敲减。注射siRNA 12小时后对小鼠进行饥饿处理10小时，之后测量小鼠空腹血糖，再恢复高果糖食物喂食8小时后测量小鼠血糖，持续高果糖食物喂食18小时后，即在注射siRNA 48小时对小鼠进行安乐死，收集血清等进行后续实验。
如图8所示结果，将四组小鼠分别命名为Ctrl-NC，KD-NC，Ctrl-HFrD，KD-HFrD，分别表示对照小鼠喂食普通食物(Ctrl-NC)，Nogo-B敲减小鼠喂食普通食物(KD-NC)，对照小鼠喂食高果糖食物(Ctrl-HFrD)，Nogo-B敲减小鼠喂食高果糖食物(KD-HFrD)。图8结果显示在蛋白水平上，si-Nogo-B组(注射靶向抑制Nogo-B表达的小干扰RNA组)肝脏Nogo-B的蛋白表达量相比于si-Ctrl组(注射对照小干扰RNA组)减少了约50％，表明Nogo-B敲减效率达50％左右，证明敲减成功。
图9为采用si-RNA技术抑制肝脏Nogo-B表达小鼠组和对照小鼠组(提前食用高果糖食物2周后注射si-RNA)的空腹血糖和非空腹血糖水平以及肝脏甘油三酯(TG)含量检测结果。如图所示，与食用普通食物相比，高果糖食物再喂食引起对照组小鼠组(Ctrl-HFrD)血糖升高、肝脏TG水平升高(Ctrl-HFrD vs.Ctrl-NC)，而抑制Nogo-B表达小鼠组在高果糖食物再喂食条件下(KD-HFrD)其血糖和肝脏TG水平与食用普通食物的对应小鼠相近(KD-HFrD vs.KD-NC)，图中KD-NC和Ctrl-NC两组的结果分别为si-RNA尾静脉注射技术抑制肝脏Nogo-B表达小鼠组和对照小鼠组在食用正常食物情况下的血糖水平和肝脏TG水平，显示抑制小鼠肝脏Nogo-B表达对血糖水平没有影响，但是轻度增加肝脏TG水平，这种增加属于良性范畴，因为各项生化指标正常(见图10)。Nogo-B敲减抑制HFrD引起的肝脏TG水平的过度上升。
此外，图10为采用si-RNA技术抑制肝脏Nogo-B表达小鼠组和对照小鼠组(提前食用高果糖食物2周后注射si-RNA)肝功能酶活性和血清TG水平的分析结果，如图所示对照组小鼠食用高果糖食物组(Ctrl-HFrD)肝脏组织发生损伤，碱性磷酸酶ALP、谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST升高，伴随着血清TG水平升高。而抑制肝脏Nogo-B表达食用高果糖食物糖小鼠组(KD-HFrD)基本不存在损伤，同时避免了血清中TG水平的上升。图中Ctrl-NC和KD-NC分别为si-RNA尾静脉注射技术抑制Nogo-B表达小鼠组和对照组小鼠正常饮食情况下的肝功能酶活性和血清TG水平的分析结果，显示抑制小鼠肝脏Nogo-B表达对肝功能酶活性和血清TG没有影响。因此，图10中结果表明：与实施例2和3一致，Nogo-B的敲减同样抑制HFrD引起的肝损伤(血清ALP，ALT和AST水平反映肝损伤程度)的发生，并且可以拮抗血清中TG含量的过度升高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 合肥工业大学
<120> Nogo-B抑制剂在制备治疗糖脂代谢紊乱药物中的应用和治疗糖脂代谢紊乱的药物
<130> 2020.08.07
<150> CN201910742795.6
<151> 2019-08-13
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtatctcctc ttgcgaggg 19
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatgtccaga tatagcttag ggg 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatgatggtc tcgcccttgg 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agttaatgct ggcctcagaa gg 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggaucucauu guagucauat t 21
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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uaugacuaca augagaucct t 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcaguguuga uguggguauu utt 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaauacccac aucaacacug ctt 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA/RNA
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cacauaaacu aggaagagat t 21
<210> 10
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ucucuuccua guuuaugugt t 21
机译： 含糖，糖胺衍生物和糖脂代谢紊乱的治疗，包含与活性成分相同的糖脂代谢
机译： 含糖，糖胺衍生物和糖脂代谢紊乱的治疗，包含与活性成分相同的糖脂代谢
机译： 含糖，糖胺衍生物和糖脂代谢紊乱的治疗，包含与活性成分相同的糖脂代谢
