原位和异位异种心脏、肾脏、肺或肝脏移植后延长存活的组合物

摘要

本发明涉及延长灵长目动物的存活的方法，该灵长目动物在生命支持技术中被移植了来自异种哺乳动物的基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏，并且本发明涉及用于在延长灵长目动物的存活的方法中使用的组合物，该灵长目动物在生命支持技术中已经被移植了来自异种哺乳动物的基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏。本发明还涉及一种活的灵长目动物，其心脏、肾脏、肺或肝脏分别由来自异种哺乳动物的、移植的、基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏功能性替代。最后，本发明涉及一种基因修饰的哺乳动物和一种异种器官移植物的供体生物体及其生产方法。

说明书

技术领域

本发明涉及用于在生命支持技术(life supporting technique)中延长被移植了来自异种哺乳动物的基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏的灵长目动物的存活的方法，以及在生命支持技术中延长已经被移植了来自异种哺乳动物的基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏的灵长目动物的存活的方法中使用的组合物。本发明还涉及一种活的灵长目动物，其心脏、肾脏、肺或肝脏由移植的、来自异种哺乳动物的基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏功能性(functionally)替代。最后，本发明涉及的一种基因修饰的哺乳动物和一种异种器官移植物的供体生物体及其生产方法。

背景技术

异体器官捐赠的替代方案是必要的。为了将基因修饰的猪心引入临床，在过去已经建立了某些高水平的实验先决条件，这些实验先决条件在过去的25年中没有人能够满足。我们在这里描述了用于成功生命支持的异种心脏移植的方法和组合物。这些方法和组合物也适用于生命支持的异种肾脏、肺和肝脏移植。

心脏置换仍然是终末期患者的首选治疗。但是目前对器官的需求超过其供应(参见参考文献1,2,3)。机械辅助设备以心脏移植前的过渡治疗(bridge-to-transplantation)或者终末治疗(destination)模式作为替代方案(参见参考文献4)；然而，严重的方法相关事件，如流血、血栓或传动系(drive-line)感染限制了机械辅助设备的长期成功。基因修饰(gm)的猪到狒狒跳动(pig-to-baboon beating)中的中位存活为298天(最长为945天)，但是，非工作腹部异位心脏移植模型(非生命支持)证明了不一致器官(discordant organ)的长期免疫学接受的可能性，从而应用了安全的免疫抑制(IS；参见参考文献5)。然而，在临床使用之前，国际心肺移植学会(ISHLT)咨询委员会指南中要求，在至少三分之二的连续实验中，在生命支持(优选原位，但也可以是在胸内异位技术中)位置上要有至少3个月的良好移植体功能(graft function)(参见参考文献6)，这是过去25年中没有实现的结果(参见参考文献7)。实际上，甚至认为原位异种手术在非人类的灵长目动物中是不可能的。

发明内容

本发明通过提供以下描述的实施方式来满足上述需求并解决本领域中的上述问题。

本发明人发现，当来自例如猪的异种供体生物体的基因修饰的心脏被移植至受体灵长目动物中时，移植的心脏会过度生长，最终导致受体灵长目动物的死亡。令人惊讶的是，发明人发现，通过应用一种新的移植方法和/或通过向受体施用mTOR抑制剂/抗高血压剂组合物，可以显著延长受体灵长目动物的存活。特别地，发明人惊讶地发现，尤其是，以下方式改善受体的存活：

·通过非缺血性保存(non-ischemic preservation)来保存来自供体生物体的心脏，直到移植。

·在移植后，向受体施用一种或多种抗高血压剂。哺乳动物，例如猪，具有+/-80mmHg的收缩压，而灵长目动物，例如狒狒，具有+/-120mmHg的收缩压。本发明人发现，抗高血压治疗(anti-hypertensive treatment)减小了灵长目动物的较高值，否则会引起心肌肥大(过度生长)。基于这些发现，发明人发现，一种或多种抗高血压剂的施用防止受体生物体中供体心脏的过度生长。

·在移植后向受体施用mTOR抑制剂。本发明人惊讶地发现，mTOR抑制剂不仅仅是免疫抑制剂，而且还是例如猪的哺乳动物体中生长激素的强抑制剂。因此，mTOR抑制剂的施用也防止受体生物体中供体心脏的过度生长。

·在移植后早期减少作为免疫抑制维持疗法(immunosuppressive maintenancetherapy)的一部分施用给受体的糖皮质激素的剂量。发明人惊讶地发现，糖皮质激素的早期戒断也防止受体生物体中供体心脏的过度生长。

在肾脏和肺移植之后，也观察到了移植后受体中供体器官过度生长的现象(参见参考文献15)。具有这类移植的受体将患上相应的绝症。因此，本发明中描述的方法(特别是在移植后向受体施用一种或多种抗高血压剂、在移植后向受体施用mTOR抑制剂、以及在移植后早期减少作为免疫抑制维持疗法的一部分施用给受体的糖皮质激素的剂量)对于任何异种器官移植都是有用的，包括肾脏移植、肺移植和肝脏移植。

因此，本发明通过提供在以下项目中描述的优选实施方式，提供了用于延长被移植了来自异种哺乳动物的心脏、肾脏、肺或肝脏的灵长目动物的存活的方法，以及在延长已经被移植了来自异种哺乳动物的心脏、肾脏、肺或肝脏的灵长目动物的存活的方法中使用的组合物。本发明通过提供在以下项目中描述的优选实施方式，还提供了一种活的灵长目动物，其心脏、肾脏、肺或肝脏由移植的、来自异种哺乳动物的基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏功能性替代。

1.一种延长受体生物体的存活的方法，该受体生物体被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏，其中，该方法包括以下步骤的全部或子集(subset)：

(i)根据给药方案向受体生物体施用免疫抑制诱导疗法，其中该给药方案包括移植前一种或多种免疫抑制剂的施用；

(ii)手术提取来自供体生物体的心脏、肾脏、肺或肝脏，并通过非缺血性保存分别保存手术提取的心脏、肾脏、肺或肝脏，直至移植；

(iii)将手术提取的、保存的供体生物体的心脏、肾脏、肺或肝脏移植到受体生物体中，以使其分别功能性替代受体生物体的心脏、肾脏、肺或肝脏；

(iv)根据给药方案向受体生物体施用免疫抑制维持疗法，其中该给药方案包括移植后一种或多种免疫抑制剂的施用，并且其中该给药方案包括移植后1天内糖皮质激素的首次施用；

(v)根据给药方案向受体生物体施用抗炎疗法，其中该给药方案包括移植后一种或多种抗炎剂的施用；

(vi)根据给药方案向受体生物体施用一种或多种抗高血压剂，其中该给药方案包括移植后一种或多种抗高血压剂的施用；

(vii)根据给药方案向受体生物体施用mTOR抑制剂，其中该给药方案包括移植后mTOR抑制剂的施用；以及

(viii)在移植后5天内，将根据步骤(iv)的给药方案施用给受体生物体的糖皮质激素的剂量(mg/kg/天)减少至少5倍，优选减少至少10倍；

其中，供体生物体为哺乳动物；并且

其中，受体生物体为灵长目动物。

根据第1项的上述方法可以只包括步骤(vi)和(vii)，但其优选地包括步骤(ii)、(iii)、(iv)、(vi)、(vii)和(viii)，并且其最优选地包括全部步骤(i)到(viii)。

2.第1项的方法，其中该方法用于防止心脏、肾脏、肺或肝脏过度生长。

3.第1项或第2项的方法，其中步骤(iii)的功能性替代为原位替代。

4.第1-3项中任一项的方法，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏具有以下基因修饰：

a)α-1,3-半乳糖基转移酶(galactosyltransferase)基因的纯合敲除(homozygous knock-out)；

b)人CD46基因的插入；以及

c)人血栓调节蛋白(thrombomodulin)基因的插入。

5.第1-3项中任一项的方法，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏具有以下基因修饰：

a)α-1,3-半乳糖基转移酶基因、CMAH基因和B4GALNT2基因的纯合敲除；以及

b)人CD46基因、人CD55基因、人CD59基因、血红素氧合酶(hemeoxygenase)1基因和A20基因的插入。

6.第5项的方法，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏额外地具有以下基因修饰：

c)LEA基因或PDL-1基因的插入。

7.第6项的方法，其中LEA基因是如SEQ ID NO:1中所示的LEA29Y。

8.第4-7项中任一项的方法，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏额外地具有以下基因修饰：

d)编码人α1,2-岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase)的序列的插入。

9.第1-8项中任一项的方法，其中供体生物体属于猪科(family Suidae)，优选其中供体生物体属于猪属(genus Sus)，更优选其中供体生物体属于野猪种(speciesS.scrofa)，最优选其中供体生物体属于家猪亚种(subspecies S.s.domesticus)。

10.第1-9项中任一项的方法，其中供体生物体属于野猪种。

11.第1-10项中任一项的方法，其中供体生物体为具有德国长白猪/大白猪杂交遗传背景(German Landrace/Large White cross-bred genetic background)的猪、杜洛克(Duroc)猪、

12.第1-11项中任一项的方法，其中受体生物体属于猴科(familyCercopithecidae)，优选其中受体生物体属于狒狒属(genus Papio)，更优选其中受体生物体属于东非狒狒种(species Papio Anubis)或阿拉伯狒狒种(species PapioHamadryas)，最优选其中受体生物体属于东非狒狒种。

13.第1-11项中任一项的方法，其中受体生物体属于人科(family Homonidae)，优选其中受体生物体属于人属(genus Homo)，更优选其中受体生物体是人。

14.第1-13项中任一项的方法，其中受体生物体的存活被延长至移植后超过40天、至移植后超过50天、至移植后超过60天、至移植后超过70天、至移植后超过80天、或至移植后超过90天；优选其中受体生物体的存活被延长至移植后超过50天，更优选至移植后超过70天，并且最优选至移植后超过90天。

15.第1-14项中任一项的方法，其中步骤(i)的免疫抑制诱导疗法的给药方案包括施用选自以下列表的一种或多种免疫抑制剂：抗CD20抗体、抗胸腺细胞球蛋白(anti-thymocyte globulin,ATG)和抗CD40抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab(pasylated Fab)；优选其中该给药方案包括施用全部上述免疫抑制剂。

16.第1-15项中任一项的方法，其中步骤(ii)中的非缺血性保存是非缺血性心脏、肾脏、肺或肝脏灌注。

17.第1-16项中任一项的方法，其中步骤(iv)的免疫抑制维持疗法的给药方案包括在糖皮质激素首次施用的当天、糖皮质激素以9mg/kg/天至11mg/kg/天的剂量的施用。

18.第1-17项中任一项的方法，其中步骤(iv)的免疫抑制维持疗法的给药方案包括施用糖皮质激素和选自以下列表的一种或多种免疫抑制剂：抗CD20抗体、抗CD40抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab、和霉酚酸酯(mycophenolate-mofetil,MMF)；优选其中该给药方案包括施用全部上述免疫抑制剂。

19.第1-18项中任一项的方法，其中步骤(v)的抗炎疗法的给药方案包括施用选自以下列表的一种或多种抗炎剂：白介素6(IL-6)受体抗体、肿瘤坏死因子α(TNFα)抑制剂和白介素1(IL-1)受体拮抗剂；优选其中该给药方案包括施用全部上述抗炎剂。

20.第1-19项中任一项的方法，其中在移植后10天内、根据步骤(iv)的给药方案施用给受体生物体的糖皮质激素的剂量(mg/kg/天)在步骤(viii)中减少至少10倍，优选减少至少20倍。

21.第1-20项中任一项的方法，其中步骤(vi)的给药方案包括施用选自以下列表的一种或多种抗高血压剂：利尿剂、钙通道阻断剂、血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、肾上腺素能受体拮抗剂、血管扩张剂(vasodilator)、肾素(renin)抑制剂、醛甾酮(aldosterone)受体拮抗剂、α-2肾上腺素能受体激动剂和内皮素(endothelin)受体阻断剂，优选其中该给药方案包括施用选自血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂和肾上腺素能受体拮抗剂的一种或多种抗高血压剂，更优选其中该给药方案包括施用依那普利(enalapril)和/或酒石酸美托洛尔(metoprololtartrate)，最优选其中该给药方案包括施用依那普利和酒石酸美托洛尔。

22.第1-21项中任一项的方法，其中步骤(vi)的给药方案包括移植后2天内一种或多种抗高血压剂的首次施用。

23.第1-22项中任一项的方法，其中施用步骤(vi)的抗高血压剂，使得受体生物体的平均动脉压保持在70至90mmHg的范围内，优选在75至85mmHg的范围内。

24.第1-23项中任一项的方法，其中步骤(vii)的给药方案包括施用选自以下列表的mTOR抑制剂：达托利塞(dactolisib)(BEZ235、NVP-BEZ235)、雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus))、依维莫司(everolimus)(RAD001)、AZD8055、替西罗莫司(temsirolimus)(CCI-779、NSC 683864)、SF2523、3BDO、PI-103、KU-0063794I、拓克尼布(torkinib)(PP242)、地磷莫司(ridaforolimus)(地弗莫司(deforolimus)、MK-8669)、沙帕替尼(sapanisertib)(INK128、MLN0128)、伏他利塞(voxtalisib)(SAR245409、XL765)类似物、托林(torin)1、奥米利塞(omipalisib)(GSK2126458、GSK458)、OSI-027、PF-04691502、阿哌利塞(apitolisib)(GDC-0980、RG7422)、GSK1059615、吉达利塞(gedatolisib)(PF-05212384、PKI-587)、WYE-354、维妥舍替(vistusertib)(AZD2014)、托林2、WYE-125132(WYE-132)、BGT226(NVP-BGT226)、帕罗米德(palomid)529(P529)、PP121、WYE-687、WAY-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、佐他莫司(zotarolimus)(ABT-578)、CZ415、MHY1485、伏他利塞(XL765、SAR245409)、大黄根酸(chrysophanic acid)和CC-223、LY3023414；优选其中该给药方案包括施用替西罗莫司。

25.第1-25项中任一项的方法，其中步骤(vii)的给药方案包括移植后10天内、优选移植后2到9天之间、更优选移植后4到7天之间mTOR抑制剂的首次施用。

26.第1-25项中任一项的方法，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏是基因修饰的心脏。

27.第1-25项中任一项的方法，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏是基因修饰的肾脏。

28.第1-25项中任一项的方法，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏是基因修饰的肺。

29.第1-25项中任一项的方法，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏是基因修饰的肝脏。

30.一种活的灵长目动物，其心脏、肾脏、肺或肝脏由移植的、来自异种哺乳动物的、分别基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏功能性替代，其中所述活的灵长目动物通过根据第1-29项中任一项的方法是可获得的(或获得)。

31.一种活的灵长目动物，其心脏、肾脏、肺或肝脏由移植的、来自异种哺乳动物的、分别基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏功能性替代，其中所述活的灵长目动物的心脏、肾脏、肺或肝脏在超过40天前、超过50天前、超过60天前、超过70天前、超过80天前、或超过90天前，优选超过50天前，更优选超过70天前，最优选超过90天前，已经被移植。

32.根据第31项的活的灵长目动物，其中所述活的灵长目动物是非人的活的灵长目动物。

33.根据第31项或第32项的活的灵长目动物，其中所述活的灵长目动物属于猴科，优选其中所述活的灵长目动物属于狒狒属，更优选其中所述活的灵长目动物属于东非狒狒种或阿拉伯狒狒种，最优选其中所述活的灵长目动物属于东非狒狒种。

34.根据第31-33项中任一项的活的灵长目动物，其中异种哺乳动物属于猪科，优选其中异种哺乳动物属于猪属，更优选其中异种哺乳动物属于野猪种，最优选其中异种哺乳动物属于家猪亚种。

35.根据第31-34项中任一项的活的灵长目动物，其中异种哺乳动物属于野猪种。

36.根据第31-35项中任一项的活的灵长目动物，其中异种哺乳动物为具有德国长白猪/大白猪杂交遗传背景的猪、杜洛克猪、

37.根据第31-36项中任一项的活的灵长目动物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏具有以下基因修饰：

a)α-1,3-半乳糖基转移酶基因的纯合敲除；

b)人CD46基因的插入；以及

c)人血栓调节蛋白基因的插入。

38.根据第31-36项中任一项的活的灵长目动物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏具有以下基因修饰：

a)α-1,3-半乳糖基转移酶基因、CMAH基因和B4GALNT2基因的纯合敲除；以及

b)人CD46基因、人CD55基因、人CD59基因、血红素氧合酶1基因和A20基因的插入。

39.根据第38项的活的灵长目动物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏额外地具有以下基因修饰：

c)LEA基因或PDL-1基因的插入。

40.根据第39项的活的灵长目动物，其中LEA基因是如SEQ ID NO:1中所示的LEA29Y。

41.根据第37-40项中任一项的活的灵长目动物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏额外地具有以下基因修饰：

d)编码人α1,2-岩藻糖基转移酶的序列的插入。

42.根据第31-41项中任一项的活的灵长目动物，其心脏由移植的基因修饰的心脏功能性替代。

43.根据第31-41项中任一项的活的灵长目动物，其肾脏由移植的基因修饰的肾脏功能性替代。

44.根据第31-41项中任一项的活的灵长目动物，其肺由移植的基因修饰的肺功能性替代。

45.根据第31-41项中任一项的活的灵长目动物，其肝脏由移植的基因修饰的肝脏功能性替代。

46.根据第42项的活的灵长目动物，其中所述活的灵长目动物的移植的心脏的左心室质量，等于或小于移植时同一心脏的左心室质量的150％，优选等于或小于移植时同一心脏的左心室质量的140％，更优选等于或小于移植时同一心脏的左心室质量的130％，甚至更优选等于或小于移植时同一心脏的左心室质量的120％，并且最优选等于或小于移植时同一心脏的左心室质量的110％。

47.根据第31-46项中任一项的活的灵长目动物，其中所述活的灵长目动物的血小板计数在150至300g/l之间，优选在170至250g/l之间，更优选在180至230g/l之间。

48.根据第31-47项中任一项的活的灵长目动物，其中所述活的灵长目动物的胆红素水平等于或小于1.2mg/dl，优选等于或小于1.0mg/dl，更优选等于或小于0.8mg/dl，最优选等于或小于0.6mg/dl。

49.根据第31-48项中任一项的活的灵长目动物，其中所述活的灵长目动物的肌钙蛋白(troponin)T(hs)水平等于或小于0.3ng/ml，优选等于或小于0.2ng/ml，更优选等于或小于0.1ng/ml，最优选等于或小于0.014ng/ml。

50.根据第31-49项中任一项的活的灵长目动物，其中所述活的灵长目动物的LDH水平等于或小于1500U/l，优选等于或小于1000U/l，更优选等于或小于700U/l，最优选等于或小于500U/l。

51.一种包括mTOR抑制剂的组合物，其在延长受体生物体的存活的方法中使用，该受体生物体已经被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏，其中供体生物体是哺乳动物，并且其中受体生物体是灵长目动物。

52.根据第51项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中组合物用于在防止心脏、肾脏、肺或肝脏过度生长的方法中使用。

53.根据第51或52项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中受体生物体已经被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏，使得其分别功能性替代受体生物体的心脏、肾脏、肺或肝脏。

54.根据第53项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中功能性替代为原位替代。

55.根据第51-54项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中供体生物体属于猪科，优选其中供体生物属于猪属，更优选其中供体生物属于野猪种，最优选其中供体生物属于家猪亚种。

56.根据第51-55项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中供体生物属于野猪种。

57.根据第51-56项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中供体生物体为具有德国长白猪/大白猪杂交遗传背景的猪、杜洛克猪、

58.根据第51-57项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中受体生物体属于猴科，优选其中受体生物体属于狒狒属，更优选其中受体生物体属于东非狒狒种或阿拉伯狒狒种，最优选其中受体生物体属于东非狒狒种。

59.根据第51-57项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中受体生物体属于人科，优选其中受体生物体属于人属，更优选其中受体生物体是人。

60.根据第51-59项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中受体生物体的存活被延长至移植后超过40天、至移植后超过50、至移植后超过60天、至移植后超过70天、至移植后超过80天、或至移植后超过90天；优选其中受体生物体的存活被延长至移植后超过50天，更优选至移植后超过70天，并且最优选至移植后超过90天。

61.根据第51-60项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏具有以下基因修饰：

a)α-1,3-半乳糖基转移酶基因的纯合敲除；

b)人CD46基因的插入；以及

c)人血栓调节蛋白基因的插入。

62.根据第51-60项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏具有以下基因修饰：

a)α-1,3-半乳糖基转移酶基因、CMAH基因和B4GALNT2基因的纯合敲除；以及

b)人CD46基因、人CD55基因、人CD59基因、血红素氧合酶1基因和A20基因的插入。

63.根据第62项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏额外地具有以下基因修饰：

c)LEA基因或PDL-1基因的插入。

64.根据第63项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中LEA基因是如SEQ IDNO:1中所示的LEA29Y。

65.根据第61-64项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏额外地具有以下基因修饰：

d)编码人α1,2-岩藻糖基转移酶的序列的插入。

66.根据第51-65项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中mTOR抑制剂选自以下列表：达托利塞(BEZ235、NVP-BEZ235)、雷帕霉素(西罗莫司)、依维莫司(RAD001)、AZD8055、替西罗莫司(CCI-779、NSC 683864)、SF2523、3BDO、PI-103、KU-0063794I、拓克尼布(PP242)、地磷莫司(地弗莫司、MK-8669)、沙帕替尼(INK128、MLN0128)、伏他利塞(SAR245409、XL765)类似物、托林1、奥米利塞(GSK2126458、GSK458)、OSI-027、PF-04691502、阿哌利塞(GDC-0980、RG7422)、GSK1059615、吉达利塞(PF-05212384、PKI-587)、WYE-354、维妥舍替(AZD2014)、托林2、WYE-125132(WYE-132)、BGT226(NVP-BGT226)、帕罗米德529(P529)、PP121、WYE-687、WAY-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、佐他莫司(ABT-578)、CZ415、MHY1485、伏他利塞(XL765、SAR245409)、大黄根酸和CC-223、LY3023414；优选其中mTOR抑制剂为替西罗莫司。

67.根据第51-66项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中该组合物根据给药方案施用，该给药方案包括移植后10天内、优选移植后2到9天之间、更优选移植后4到7天之间该组合物的首次施用。

68.根据第51-67项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中该组合物根据给药方案施用，该给药方案包括首次施用和随后的日常施用。

69.根据第51-68项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中受体生物体已经根据给药方案接受了免疫抑制诱导疗法，其中该给药方案已经包括了移植前一种或多种免疫抑制剂的施用。

70.根据第69项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中免疫抑制诱导疗法的给药方案已经包括了施用选自以下列表的一种或多种免疫抑制剂：抗CD20抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、和抗CD40抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab；优选其中该给药方案已经包括了施用全部上述免疫抑制剂。

71.根据第51-70项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中受体生物体根据给药方案接受免疫抑制维持疗法，其中该给药方案包括移植后一种或多种免疫抑制剂的施用，并且其中该给药方案包括在移植后1天内发生的糖皮质激素的首次施用。

72.根据第71项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中免疫抑制维持疗法的给药方案包括在糖皮质激素的首次施用的当天、糖皮质激素以9mg/kg/天至11mg/kg/天的剂量的施用。

73.根据第71或72项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中免疫抑制维持疗法的给药方案包括施用糖皮质激素和选自以下列表的一种或多种免疫抑制剂：抗CD20抗体、抗CD40抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab、和霉酚酸酯(MMF)；优选其中该给药方案包括施用糖皮质激素、抗CD40抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab、和霉酚酸酯(MMF)；最优选其中该给药方案包括施用糖皮质激素、抗CD20抗体、抗CD40抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab、和霉酚酸酯(MMF)。

74.根据第71-73项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中在移植后5天内、根据给药方案施用给受体生物体的糖皮质激素的剂量(mg/kg/天)已经减少了至少5倍，优选减少了至少10倍。

75.根据第51-74项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中受体生物体根据给药方案接受抗炎疗法。

76.根据第75项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中抗炎疗法的给药方案包括施用选自以下列表的一种或多种抗炎剂：IL-6受体抗体、TNFα抑制剂和IL-1受体拮抗剂；优选其中该给药方案包括施用全部上述抗炎剂。

77.根据第51-76项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中受体生物体根据给药方案接受抗高血压治疗。

78.根据第77项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中抗高血压治疗的给药方案包括施用选自以下列表的一种或多种抗高血压剂：利尿剂、钙通道阻断剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、肾上腺素能受体拮抗剂、血管扩张剂、肾素抑制剂、醛甾酮受体拮抗剂、α-2肾上腺素能受体激动剂和内皮素受体阻断剂，优选其中该给药方案包括施用选自血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂和肾上腺素能受体拮抗剂的一种或多种抗高血压剂，更优选其中该给药方案包括施用依那普利和/或酒石酸美托洛尔，最优选其中该给药方案包括施用依那普利和酒石酸美托洛尔。

79.根据第77或78项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中抗高血压治疗的给药方案包括移植后2天内一种或多种抗高血压剂的首次施用。

80.根据第77-79项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中施用抗高血压剂，使得受体生物体的平均动脉压保持在70至90mmHg的范围内，优选在75至85mmHg的范围内。

81.根据第51-80项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中在移植之前，来自异种供体生物体的心脏、肾脏、肺或肝脏已经通过非缺血性保存进行了保存。

82.根据第81项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中非缺血性保存是非缺血性心脏、肾脏、肺或肝脏灌注。

83.根据第51-82项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏是基因修饰的心脏。

84.根据第51-82项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏是基因修饰的肾脏。

85.根据第51-82项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏是基因修饰的肺。

86.根据第51-82项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏是基因修饰的肝脏。

87.一种包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其用于在延长受体生物体的存活的方法中使用，该受体生物体已经被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏，其中供体生物体是哺乳动物，并且其中受体生物体是灵长目动物。

88.根据第87项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中该组合物用于在防止心脏、肾脏、肺或肝脏过度生长的方法中使用。

89.根据第87或88项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中受体生物体已经被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏，使得其分别功能性替代该受体生物体的心脏、肾脏、肺或肝脏。

90.根据第89项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中功能性替代为原位替代。

91.根据第87-90项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中供体生物体属于猪科，优选其中供体生物体属于猪属，更优选其中供体生物体属于野猪种，最优选其中供体生物体属于家猪亚种。

92.根据第87-91项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中供体生物体属于野猪种。

93.根据第87-92项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中供体生物体为具有德国长白猪/大白猪杂交遗传背景的猪、杜洛克猪、

94.根据第87-93项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中受体生物体属于猴科，优选其中受体生物体属于狒狒属，更优选其中受体生物体属于东非狒狒种或阿拉伯狒狒种，最优选其中受体生物体属于东非狒狒种。

95.根据第87-93项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中受体生物体属于人科，优选其中受体生物体属于人属，更优选其中受体生物体是人。

96.根据第87-95项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中受体生物体的存活被延长至移植后超过40天、至移植后超过50天、至移植后超过60天、至移植后超过70天、至移植后超过80天、或至移植后超过90天；优选其中受体生物体的存活被延长至移植后超过50天，更优选至移植后超过70天，并且最优选至移植后超过90天。

97.根据第87-96项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏具有以下基因修饰：

a)α-1,3-半乳糖基转移酶基因的纯合敲除；

b)人CD46基因的插入；以及

c)人血栓调节蛋白基因的插入。

98.根据第87-96项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏具有以下基因修饰：

a)α-1,3-半乳糖基转移酶基因、CMAH基因和B4GALNT2基因的纯合敲除；以及

b)人CD46基因、人CD55基因、人CD59基因、血红素氧合酶1基因和A20基因的插入。

99.根据第98项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏额外地具有以下基因修饰：

c)LEA基因或PDL-1基因的插入。

100.根据第99项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中该LEA基因是如SEQ ID No:1中所示的LEA29Y。

101.根据第97-100项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏额外地具有以下基因修饰：

d)编码人α1,2-岩藻糖基转移酶的序列的插入。

102.根据第87-101项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中该抗高血压剂是选自以下列表的一种或多种药剂：利尿剂、钙通道阻断剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、肾上腺素能受体拮抗剂、血管扩张剂、肾素抑制剂、醛甾酮受体拮抗剂、α-2肾上腺素能受体激动剂和内皮素受体阻断剂，优选其中抗高血压剂选自血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂和肾上腺素能受体拮抗剂，更优选其中抗高血压剂为依那普利和/或酒石酸美托洛尔，最优选其中抗高血压剂为依那普利和酒石酸美托洛尔。

103.根据第87-102项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中该组合物根据给药方案施用，该给药方案包括移植后2天内该组合物的首次施用。

104.根据第87-103项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中施用该组合物，使得受体生物体的平均动脉压保持在70至90mmHg的范围内，优选在75至85mmHg的范围内。

105.根据第87-104项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中受体生物体已经根据给药方案接受了免疫抑制诱导疗法，其中该给药方案已经包括了移植前一种或多种免疫抑制剂的施用。

106.根据第105项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中免疫抑制诱导疗法的给药方案已经包括了施用选自以下列表的一种或多种免疫抑制剂：抗CD20抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、和抗CD40抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab；优选其中该给药方案已经包括了施用全部上述免疫抑制剂。

107.根据第87-106项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中受体生物体根据给药方案接受免疫抑制维持疗法，其中该给药方案包括移植后一种或多种免疫抑制剂的施用，并且其中该给药方案包括在移植后1天内发生的糖皮质激素的首次施用。

108.根据第107项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中免疫抑制维持疗法的给药方案包括在糖皮质激素的首次施用当天、糖皮质激素以9mg/kg/天至11mg/kg/天的剂量的施用。

109.根据第107或108项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中免疫抑制维持疗法的给药方案包括施用糖皮质激素和选自以下列表的一种或多种免疫抑制剂：抗CD20抗体、抗CD40抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab、和霉酚酸酯(MMF)；优选其中该给药方案包括施用糖皮质激素、抗CD40抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab、和霉酚酸酯(MMF)；最优选其中该给药方案包括施用糖皮质激素、抗CD20抗体、抗CD40抗体/抗CD40LPAS蛋白修饰的Fab、和霉酚酸酯(MMF)。

110.根据第107-109项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中在移植后5天内、根据给药方案施用给受体生物体的糖皮质激素的剂量(mg/kg/天)已经减少了至少5倍，优选减少了至少10倍。

111.根据第87-110项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中受体生物体根据给药方案接受抗炎疗法。

112.根据第111项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中抗炎疗法的给药方案包括施用选自以下列表的一种或多种抗炎剂：IL-6受体抗体、TNFα抑制剂和IL-1受体拮抗剂；优选其中该给药方案包括施用全部上述抗炎剂。

113.根据第87-112项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中受体生物体根据给药方案被施用mTOR抑制剂。

114.根据第113项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中mTOR抑制剂选自以下列表：达托利塞(BEZ235、NVP-BEZ235)、雷帕霉素(西罗莫司)、依维莫司(RAD001)、AZD8055、替西罗莫司(CCI-779、NSC 683864)、SF2523、3BDO、PI-103、KU-0063794I、拓克尼布(PP242)、地磷莫司(地弗莫司、MK-8669)、沙帕替尼(INK128、MLN0128)、伏他利塞(SAR245409、XL765)类似物、托林1、奥米利塞(GSK2126458、GSK458)、OSI-027、PF-04691502、阿哌利塞(GDC-0980、RG7422)、GSK1059615、吉达利塞(PF-05212384、PKI-587)、WYE-354、维妥舍替(AZD2014)、托林2、WYE-125132(WYE-132)、BGT226(NVP-BGT226)、帕罗米德529(P529)、PP121、WYE-687、WAY-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、佐他莫司(ABT-578)、CZ415、MHY1485、伏他利塞(XL765、SAR245409)、大黄根酸和CC-223、LY3023414；优选其中该mTOR抑制剂为替西罗莫司。

115.根据第113或114项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中该给药方案包括在移植后10天内、优选移植后2-9天之间、更优选移植后4-7天之间发生的mTOR抑制剂的首次施用。

116.根据第113-115项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中mTOR抑制剂根据给药方案施用，该给药方案包括首次施用和随后的每日施用。

117.根据第87-116项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中在移植之前，来自异种供体生物的心脏、肾脏、肺或肝脏已经通过非缺血性保存进行了保存。

118.根据第117项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中非缺血性保存是非缺血性心脏、肾脏、肺或肝脏灌注。

119.根据第87-118项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏是基因修饰的心脏。

120.根据第87-118项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏是基因修饰的肾脏。

121.根据第87-118项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏是基因修饰的肺。

122.根据第87-118项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏是基因修饰的肝脏。

将理解的是，第30-50项中的活的灵长目动物的特征和/或第51-122项的组合物的特征也可以应用于第1-29项的方法或该方法的受体。

如上所述，发明人惊讶地发现了，当根据本发明执行延长被移植基因修饰的心脏的受体生物体的存活的方法、和/或施用组合物时，心脏受体的存活显著延长。另外，当根据本发明执行方法和/或施用组合物时，被移植的心脏在受体中没有过度生长，并且没有观察到或者仅观察到小部分心脏相关的肉眼可见的(例如，在心室壁和腔的外观中)、显微镜的(例如，在心脏的免疫组织化学分析中)、功能的(例如在超声心动图中)或生化的(例如，在血液值中)异常现象(参见图1和图6，特别是下面图6的简要描述)。

在上面描述的延长受体生物体的存活的方法中，所述受体生物体被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏。类似地，上面描述的活的灵长目动物已经被移植了来自异种哺乳动物的基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏，并且上面描述的包括mTOR抑制剂/抗高血压剂的组合物，用于在延长受体生物体的存活的方法中使用，该受体生物体已经被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏。因此，本发明还提供了一种基因修饰的哺乳动物，在一个实施方式中，其可以用作这些基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏的异种供体生物体。该基因修饰的哺乳动物具有编码人补体调节蛋白的序列的插入、以及编码人血栓调节蛋白的序列的插入。这两个序列都被插入到内源性N-乙酰乳糖铵(acetyllactosaminide)α-1,3-半乳糖基转移酶基因座(locus)(在下文中也称为GGTA1基因座或α-1,3-半乳糖基转移酶基因基因座)，以便GGTA1基因座被打断并不再表达GGTA1。编码人补体调节蛋白的序列被插入，使得其表达在内源性GGTA1启动子的控制之下。这种设计尤其提供了以下优点：在单个基因座(例如，GGTA1基因座)处引入编码人补体调节蛋白的序列以及编码人血栓调节蛋白的序列，防止了在基因修饰的哺乳动物的繁育(breeding)期间这些基因的分离(segregation)。额外地，GGTA1基因座已知是转录活性位点，允许从安全港(safe harbor)充分转录。因此，本发明通过提供以下项目中描述的优选实施方式，提供了一种基因修饰的哺乳动物及其生产方法：

123.一种基因修饰的哺乳动物，其具有以下基因修饰：

a)编码人补体调节蛋白的序列的插入；以及

b)编码人血栓调节蛋白的序列的插入；

其中编码人补体调节蛋白的序列以及编码人血栓调节蛋白的序列在α-1,3-半乳糖基转移酶基因基因座处被插入，其中至少编码人补体调节蛋白的序列在α-1,3-半乳糖基转移酶基因的内源性启动子的控制下被表达；并且

其中，基因修饰的哺乳动物是非人的。

124.第123项的基因修饰的哺乳动物，其中编码人补体调节蛋白的序列和编码人血栓调节蛋白的序列都在α-1,3-半乳糖基转移酶基因的内源性启动子的控制下被表达。

125.第123项的基因修饰的哺乳动物，其中编码人补体调节蛋白的序列在α-1,3-半乳糖基转移酶基因的内源性启动子的控制下被表达，并且其中编码人血栓调节蛋白的序列在外源性启动子的控制下被表达。

126.第125项的基因修饰的哺乳动物，其中控制编码人血栓调节蛋白的序列的表达的外源性启动子是普遍活跃(ubiquitously active)的启动子。

127.第123-126项中任一项的基因修饰的哺乳动物，其中基因修饰的哺乳动物缺乏α-1,3-半乳糖基转移酶的表达。

128.第123-127项中任一项的基因修饰的哺乳动物，其中编码人补体调节蛋白的序列是编码人CD46、人CD55或人CD59的序列。

129.第123-128项中任一项的基因修饰的哺乳动物，其中编码人补体调节蛋白的序列是编码人CD46的序列。

130.第123-129项中任一项的基因修饰的哺乳动物，其中基因修饰的哺乳动物额外地具有以下基因修饰：

c)CMAH基因的纯合敲除；以及

d)B4GALNT2基因的纯合敲除。

131.第123-130项中任一项的基因修饰的哺乳动物，其中基因修饰的哺乳动物额外地具有以下基因修饰：

e)可选标记基因序列(selectable marker gene sequence)在编码人补体调节蛋白的序列和编码人血栓调节蛋白的序列之间的插入。

132.第131项的基因修饰的哺乳动物，其中可选标记基因序列位于loxP位点的侧面。

133.第123-132项中任一项的基因修饰的哺乳动物，其中基因修饰的哺乳动物额外地具有以下基因修饰：

f)编码人α1,2-岩藻糖基转移酶的序列的插入。

134.第123-133项中任一项的基因修饰的哺乳动物，其中基因修饰的哺乳动物具有一种或多种额外的基因修饰。

135.第134项的基因修饰的哺乳动物，其中一种或多种额外的基因修饰是一个或多个插入。

136.第133或135项的基因修饰的哺乳动物，其中一个或多个插入在α-1,3-半乳糖基转移酶基因基因座处。

137.第123-136项中任一项的基因修饰的哺乳动物，其中基因修饰的哺乳动物属于猪科，优选其中基因修饰的哺乳动物属于猪属，更优选其中基因修饰的哺乳动物属于野猪种，最优选其中基因修饰的哺乳动物属于家猪亚种。

138.第123-137项中任一项的基因修饰的哺乳动物，其中基因修饰的哺乳动物属于野猪种。

139.第123-138项中任一项的基因修饰的哺乳动物，其中基因修饰的哺乳动物为具有德国长白猪/大白猪杂交遗传背景的猪、杜洛克猪、Swabian-Hall猪、黑色迷你猪或奥克兰岛猪；优选其中供体哺乳动物为具有德国长白猪/大白猪杂交遗传背景的猪。

140.第123-139项中任一项的基因修饰的哺乳动物，其中基因修饰的哺乳动物没有猪内源性逆转录病毒C(porcine endogenous retrovirus C,PERV-C)。

141.第123-140项中任一项的基因修饰的哺乳动物，其中基因修饰的哺乳动物适合用作异种器官移植物的供体生物体。

142.一种来源于第123-141项中任一项的基因修饰的哺乳动物的器官。

143.一种来源于第123-141项中任一项的基因修饰的哺乳动物的心脏。

144.一种来源于第123-141项中任一项的基因修饰的哺乳动物的肾脏。

145.一种来源于第123-141项中任一项的基因修饰的哺乳动物的肺。

146.一种来源于第123-141项中任一项的基因修饰的哺乳动物的肝脏。

147.一种来源于第123-141项中任一项的基因修饰的哺乳动物的细胞。

148.第1-29项中任一项的方法，其中异种供体生物体为根据第123-141项中任一项的基因修饰的哺乳动物。

149.根据第30-50项中任一项的活的灵长目动物，其中异种哺乳动物为根据第123-141项中任一项的基因修饰的哺乳动物。

150.根据第51-86项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中异种供体生物体为根据第123-141项中任一项的基因修饰的哺乳动物。

151.根据第87-122项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中异种供体生物体为根据第123-141项中任一项的基因修饰的哺乳动物。

152.一种形成基因修饰的哺乳动物的方法，该方法包括以下步骤：

(a)在哺乳动物基因组的α-1,3-半乳糖基转移酶基因基因座处，插入编码人补体调节蛋白的序列以及编码人血栓调节蛋白的序列，以提供基因修饰的基因组；

(b)将该基因修饰的基因组引入到细胞中；以及

(c)使包括基因修饰的基因组的细胞成熟为基因修饰的哺乳动物；

其中基因修饰的哺乳动物是非人的。

153.第152项的方法，其中基因组是体细胞基因组，并且其中基因修饰的基因组通过体细胞核转移(somatic cell nuclear transfer)被引入到细胞中。

154.第152或153项的方法，其中编码人补体调节蛋白的序列是编码人CD46、人CD55或人CD59的序列。

155.第152-154项中任一项的方法，其中编码人补体调节蛋白的序列是编码人CD46的序列。

156.第152-155项中任一项的方法，其中编码人补体调节蛋白的序列和编码人血栓调节蛋白的序列位于插入到α-1,3-半乳糖基转移酶基因基因座中的单个表达载体(vector)上。

157.第156项的方法，其中插入到α-1,3-半乳糖基转移酶基因基因座中的表达载体额外地包括在编码人补体调节蛋白的序列和编码人血栓调节蛋白的序列之间的可选标记基因序列。

158.第157项的方法，其中可选标记基因序列位于loxP位点的侧面。

159.第152-158项中任一项的方法，其中编码人补体调节蛋白的序列以及编码人血栓调节蛋白的序列在α-1,3-半乳糖基转移酶基因基因座处插入，使得基因修饰的哺乳动物缺乏α-1,3-半乳糖基转移酶的表达。

160.第152-159项中任一项的方法，其中编码人补体调节蛋白的序列以及编码人血栓调节蛋白的序列在α-1,3-半乳糖基转移酶基因基因座处插入，使得至少编码人补体调节蛋白的序列在α-1,3-半乳糖基转移酶基因的内源性启动子的控制下被表达。

161.第152-160项中任一项的方法，其中编码人补体调节蛋白的序列以及编码人血栓调节蛋白的序列在α-1,3-半乳糖基转移酶基因基因座处插入，使得编码人补体调节蛋白的序列和编码人血栓调节蛋白的序列都在α-1,3-半乳糖基转移酶基因的内源性启动子的控制下被表达。

162.第152-160项中任一项的的方法，其中编码人补体调节蛋白的序列以及编码人血栓调节蛋白的序列在α-1,3-半乳糖基转移酶基因基因座处插入，使得编码人补体调节蛋白的序列在α-1,3-半乳糖基转移酶基因的内源性启动子的控制下被表达，并且编码人血栓调节蛋白的序列在外源性启动子的控制下被表达。

163.第162项的方法，其中外源性启动子是普遍活跃的启动子。

164.第152-163项中任一项的方法，其中该方法还包括在步骤(b)之前敲除哺乳动物基因组的CMAH和B4GALNT2基因。

165.第152-164项中任一项的方法，其中该方法还包括在步骤(b)之前将编码人α1,2-岩藻糖基转移酶的序列插入到哺乳动物基因中。

166.第165项的方法，其中编码人补体调节蛋白的序列、编码人血栓调节蛋白的序列和编码人α1,2-岩藻糖基转移酶的序列位于插入到α-1,3-半乳糖基转移酶基因基因座中的单个表达载体上。

167.第152-166项中任一项的方法，其中该方法还包括在步骤(b)之前将一种或多种额外的基因修饰引入到哺乳动物基因组中。

168.第167项的方法，其中一种或多种额外的基因修饰是一个或多个基因插入。

169.第168项的方法，其中编码人补体调节蛋白的序列、编码人血栓调节蛋白的序列和一种或多种额外的插入位于插入到α-1,3-半乳糖基转移酶基因基因座中的单个表达载体上。

170.第152-169项中任一项的方法，其中使用CRISPR/Cas9、ZFN或TALEN引入基因修饰。

171.第152-170项中任一项的方法，其中使用CRISPR/Cas9引入基因修饰。

172.第152-171项中任一项的方法，其中哺乳动物属于猪科，优选其中哺乳动物属于猪属，更优选其中哺乳动物属于野猪种，最优选其中哺乳动物属于家猪亚种。

173.第152-172项中任一项的方法，其中哺乳动物属于野猪种。

174.第152-173项中任一项的方法，其中哺乳动物为具有德国长白猪/大白猪杂交遗传背景的猪、杜洛克猪、Swabian-Hall猪、黑色迷你猪或奥克兰岛猪；优选其中哺乳动物为具有德国长白猪/大白猪杂交遗传背景的猪。

175.第152-174项中任一项的方法，其中哺乳动物没有猪内源性逆转录病毒C(PERV-C)。

176.第152-175项中任一项的方法，其中基因修饰的哺乳动物适合用作异种器官移植物的供体生物体。

177.一种通过第152-176项中任一项的方法可获得(或获得)的基因修饰的哺乳动物。

178.第1-29项中任一项的方法，其中异种供体生物体是根据第177项的基因修饰的哺乳动物。

179.根据第30-50项中任一项的活的灵长目动物，其中异种哺乳动物为根据第177项的基因修饰的哺乳动物。

180.根据第51-86项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中异种供体生物体为根据第177项的基因修饰的哺乳动物。

181.根据第87-122项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中异种供体生物体为根据第177项的基因修饰的哺乳动物。

当来自异种供体生物体(例如，来自猪)的基因修饰的器官被移植到受体生物体中(例如，到狒狒中)时，受体生物体中的器官过度生长是一个主要问题。根据本发明，器官过度生长通过治疗的组合来抵消：(i)减小受体(例如，狒狒)的血压以匹配供体(例如，猪)的较低水平；(ii)在早期逐渐减少可的松(cortisone)；和/或(iii)使用西罗莫司前药替西罗莫司以减轻心肌肥大(参照实施例1至4)。然而，本发明人已经发现，通过敲除生长激素受体(GHR)基因，也可以在基因上抵消猪的生长(及其器官的生长)。本发明人已经发现，与对照相比，GHR-KO(GHR敲除)的猪的体重降低了60％，并且大多数器官的重量按比例降低(参照实施例7)。此外，GHR-KO猪的血清胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)水平显著降低。值得注意的是，通过用IGF1处理GHR-KO猪，将有可能促进它们的生长(对于莱伦氏综合征(Laron syndrome)患者，如参考文献88、108、109和110中所示)。因此，通过用IGF1处理GHR-KO猪，可以随意地调节猪及其器官的尺寸。

鉴于上述情况，本发明人已经敲除了GT-KO/hCD46/hTM猪的GHR基因，该GT-KO/hCD46/hTM猪可用作异种移植到灵长目动物中的供体生物体(参照实施例7)。因此，本发明提供了作为合适的异种移植供体的GHR-KO哺乳动物(例如，猪)，并且可以通过用IGF1处理GHR-KO哺乳动物来调节它们的尺寸/器官尺寸。根据本发明，在异种移植中使用这类供体哺乳动物可以与本发明的上述药物治疗相配合以抵消器官过度生长。额外地，使用GHR-KO哺乳动物作为供体可以避免用mTOR抑制剂对受体的长期治疗。最后，对于需要相对小的供体器官的相对小尺寸的受体，能够根据受体的需要调节供体器官的尺寸可能是特别有用的。

因此，本发明通过提供以下项目中描述的优选实施方式，提供了一种异种器官移植物的供体生物体及其生产方法：

182.一种异种器官移植物的供体生物体，其中供体生物体具有以下基因修饰：

a)生长激素受体基因的纯合敲除；

并且其中供体生物体为非人的哺乳动物。

183.第182项的供体生物体，其中供体生物体额外地具有以下基因修饰：

b)α-1,3-半乳糖基转移酶基因的纯合敲除；

c)编码人CD46的序列的插入；以及

d)编码人血栓调节蛋白的序列的插入。

184.第182项的供体生物体，其中供体生物体额外地具有如下基因修饰：

b)α-1,3-半乳糖基转移酶基因、CMAH基因和B4GALNT2基因的纯合敲除；以及

c)编码人CD46的序列、编码人CD55的序列、编码人CD59的序列、编码血红素氧合酶1的序列、和编码A20的序列的插入。

185.第184项的供体生物体，其中编码血红素氧合酶1的序列编码人血红素氧合酶1，并且其中编码A20的序列编码人A20。

186.第184或185项的供体生物体，其中供体生物体额外地具有以下基因修饰：

d)编码LEA29Y或PD-L1的序列的插入。

187.第186项的供体生物体，其中编码LEA29Y的序列是在SEQ ID NO:1中所示的序列。

188.第186项的供体生物体，其中，编码PD-L1的序列编码人PD-L1。

189.第182-188项中任一项的供体生物体，其中供体生物体额外地具有以下基因修饰：

e)编码人α1,2-岩藻糖基转移酶的序列的插入。

190.第182-189项中任一项的供体生物体，其中供体生物体属于猪科，优选其中供体生物体属于猪属，更优选其中供体生物体属于野猪种，最优选其中供体生物体属于家猪亚种。

191.第182-190项中任一项的供体生物体，其中供体生物体属于野猪种。

192.第182-191项中任一项的供体生物体，其中供体生物体为具有德国长白猪/大白猪杂交遗传背景的猪、杜洛克猪、Swabian-Hall猪、黑色迷你猪或奥克兰岛猪；优选其中供体生物体为具有德国长白猪/大白猪杂交遗传背景的猪。

193.第182-192项中任一项的供体生物体，其中供体生物体没有猪内源性逆转录病毒C(PERV-C)。

194.第182-193项中任一项的供体生物体，其中供体生物体是根据第123-141项中任一项的基因修饰的生物体。

195.第1-29项中任一项的方法，其中异种供体生物体是根据第182-194项中任一项的供体生物体。

196.根据第30-50项中任一项的活的灵长目动物，其中异种哺乳动物是根据第182-194项中任一项的供体生物体。

197.根据第51-86项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中异种供体生物体是根据第182-194项中任一项的供体生物体。

198.根据第87-122项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中异种供体生物体是根据第182-194项中任一项的供体生物体。

199.一种形成异种器官移植物的供体生物体的方法，该方法包括以下步骤(i)：

(i)通过用IGF1处理该供体生物体，调节该供体生物体的尺寸；

其中该供体生物体具有以下基因修饰：

a)生长激素受体基因的纯合敲除；

并且其中该供体生物为非人的哺乳动物。

200.第199项的方法，其中在供体生物体出生后开始用IGF1的处理。

201.第199或200项的方法，其中供体生物体额外地具有以下基因修饰：

b)α-1,3-半乳糖基转移酶基因的纯合敲除；

c)编码人CD46的序列的插入；以及

d)编码人血栓调节蛋白的序列的插入。

202.第199或200项的方法，其中供体生物体额外地具有以下基因修饰：

b)α-1,3-半乳糖基转移酶基因、CMAH基因和B4GALNT2基因的纯合敲除；以及

c)编码人CD46的序列、编码人CD55的序列、编码人CD59的序列、编码血红素氧合酶1的序列和编码A20的序列的插入。

203.第202项的方法，其中编码血红素氧合酶1的序列编码人血红素氧合酶1，并且编码A20的序列编码人A20。

204.第202或203项的方法，其中供体生物体额外地具有以下基因修饰：

d)编码LEA29Y或PD-L1的序列的插入。

205.第204项的方法，其中编码LEA29Y的序列是在SEQ ID NO:1中所示的序列。

206.第204项的方法，其中，编码PD-L1的序列编码人PD-L1。

207.第199-206项中任一项的方法，其中供体生物体额外地具有以下基因修饰：

e)编码人α1,2-岩藻糖基转移酶的序列的插入。

208.第199-207项中任一项的方法，其中供体生物体属于猪科，优选其中供体生物体属于猪属，更优选其中供体生物体属于野猪种，最优选其中供体生物体属于家猪亚种。

209.第199-208项中任一项的方法，其中供体生物体属于野猪种。

210.第199-209项中任一项的方法，其中该供体生物体为具有德国长白猪/大白猪杂交遗传背景的猪、杜洛克猪、Swabian-Hall猪、黑色迷你猪或奥克兰岛猪；优选其中该供体生物体为具有德国长白猪/大白猪杂交遗传背景的猪。

211.第199-210项中任一项的方法，其中供体生物体没有猪内源性逆转录病毒C(PERV-C)。

212.第199-210项中任一项的方法，其中供体生物体为根据第123-141项中任一项的基因修饰的生物体。

213.一种异种器官移植物的供体生物体，其中供体生物体为根据第199-212项中任一项的方法可获得(或获得)的。

214.第1-29项中任一项的方法，其中异种供体生物体为根据第213项的供体生物体。

215.根据第30-50项中任一项的活的灵长目动物，其中异种哺乳动物为根据第213项的供体生物体。

216.根据第51-86项中任一项的所使用的包括mTOR抑制剂的组合物，其中异种供体生物体为根据第213项的供体生物体。

217.根据第87-122项中任一项的所使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，其中异种供体生物体为根据第213项的供体生物体。

附图说明

图1A-L，实施例2中报道的结果的说明：A，三个实验组(I，浅灰色点；II，深灰色虚线；III，黑线)的高敏心肌肌钙蛋白T，B，三个实验组(I，浅灰色点；II，深灰色虚线；III，黑线)的胆红素水平。与第I组(晶体心停搏液(crystalloid cardioplegia))和第II组(非缺血性心脏灌注)的动物形成对照，第III组(非缺血性心脏灌注、和心脏肥大治疗)的动物在整个实验中具有低水平的肌钙蛋白T和胆红素，表明正常的移植体和肝功能。C，第I、II和III组原位异种移植后的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)曲线；最长的实验在达到90天的研究终点后被选择性地终止；log-rank检验，p＝0.0236。D，如通过超声心动图估计的供体心脏的LV质量增加。第II组实验64的LV质量在40天后增至四倍，而实验67(第III组)的LV质量在90天后保持不变。对照心脏(实验64的供体同胞(donor sibling)，Co)在33天后增至三倍。E，实验57(第I组)的猪供体心脏在POD 30移出后的图像(左)、和作为对照的动物自己的心脏(右)的图像。在实验结束时，移植体达到其初始重量的230％；在移植当天，供体和受体心脏具有大致相同的尺寸。F，与E相同的心脏，福尔马林中保存以及组织取样后。在二尖瓣(mitral valve)下方约1厘米处横切；移植体的LV明显肥大，LV腔减小。G，实验67(第III组)的猪供体心脏在POD 90移出后的图像(左)、和动物自己的心脏(右)的图像。在二尖瓣下方约1厘米处横切。在实验结束时，LV壁厚增加很小，LV腔没有减小。H，POD 40时实验64的猪供体LV心肌(左)和受体肝脏(右)的HE染色。心肌：多灶性细胞坏死伴嗜酸性粒细胞增多(multifocal cell necroses with hypereosinophilia)，淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的中度间质浸润(moderate interstitial infiltrations)，小血管的偶发性血栓形成(sporadic thromboses of small vessels)；肝脏：多灶性小叶中心细胞空泡化和坏死(multifocal centrolobular cell vacuolizations and necroses)，多灶性病灶内出血(multifocal intralesional hemorrhages)。I，POD 90时实验67的猪供体LV心肌和受体肝脏的HE染色。心肌：非常偶发的淋巴细胞浸润(very sporadic infiltrations oflymphocytes)，多灶性小间质水肿(multifocal minor interstitial edema)；肝脏：肝细胞的小液泡变性(small vacuolar degeneration of hepatocytes)(脂质型)。J，假手术(sham operated)猪心脏(对照，左)、实验64(第II组，中)和67(第III组，右)的代表性心肌切片中显示的心肌细胞尺寸(WGA染色，比例尺＝50μm)。K，与假手术心脏(Co)相比，实验64中的心肌细胞横截面积增加，但实验67中的没有增加(数据以平均值±标准差(SD)表示；所示的p值，采用Holm-Sidak多重比较测试进行单向方差分析(ANOVA))。L，磷酸化的mTOR和PCNA的蛋白质印迹(心肌)，相较于对照(Co)，在用替西罗莫司的治疗后实验67中两者均出现下调。Co，对照；HE，苏木精-伊红(hematoxylin eosin)；LV，左心室；mTOR，雷帕霉素的机制性靶标；POD，术后天数；PCNA，增殖细胞核抗原；WGA，小麦胚芽凝集素(wheat germagglutinin)。

图2A-K：心肌组织中的免疫荧光染色(A-D)、它们的定量测量(E-I)和non-Gal抗体水平(J-K)。三个不同组的示例性染色：实验#57(第I组，上排)，#64(第II组，中排)和#67(第III组，下排)。IgM沉积(A，显示为绿色，在第I、II组中微弱，在第III组中不存在)，IgG沉积(B，在所有组中均不存在)；细胞核始终被DAPI(蓝色)染色，比例尺始终代表25μm。第I、II组的猪心肌组织中有C3b/c(红色)、C4b/c(绿色)(C)和纤维蛋白(绿色，D)的少许沉积，第III组中没有这样的发现。E-I，使用ImageJ测量荧光强度(每个n＝5)，并使用GraphPad Prism绘制相应的值。显示了三组：第I组(#57)；第II组(#60、63、64)和第III组(#66、67)。E，IgM。F，IgG。G，C3b/c。H，C4b/c。I，纤维蛋白；将C3b/c和C4b/c值与健康猪心脏中测量的对照(Co)的C3b/c和C4b/c值进行比较；条为平均±标准偏差。J和K，狒狒血浆中的non-Gal IgM和IgG抗体水平；结合至GT-KO/hCD46/hTM PAEC的抗体；将细胞在热灭活的狒狒血浆中温育，对IgG和IgM染色，并通过荧光激活细胞分选术(fluorescence-activated cell sorting,FACS)进行分析。值表示为平均荧光强度(MFI)。狒狒#46经历了其(胸内异位移植的)供体心脏的体液排斥(humural rejection)，该供体心脏作为阳性对照(灰色)；POD＝术后天数；Gal，α1,3-半乳糖基。

图3A-D：血液动力学数据，通过经肺热稀释(transpulmonary thermodilution)和术后儿茶酚胺支持(postoperative catecholamine support)测量。在麻醉诱导后(CPB前)和心肺转流术(cardiopulmonary bypass)终止后60分钟(CPB后)进行血液动力学测量。第一组(浅灰色)的供体心脏接受晶体心停搏液，第二组(深灰色)和第三组(黑色)的供体心脏通过连续的冷高渗灌注(cold hyperoncotic perfusion)保存；数据以带有中位值条(median bar)的散点图表示，并通过配对和非配对t检验分析显著性。CPB之前和CPB之后的A：SVI和B：CI。第I组中两个参数均减小，并且与第II和III组相比，CPB后两个参数在第I组心脏中均较低。C，CPB终止后60分钟儿茶酚胺的剂量，和D，术后血管加压和正性肌力支持(vasopressive and inotropic support)的持续时间。与第II和III组相比，第I组需要更多的去甲肾上腺素(noradrenaline,NOR)和肾上腺素(epinephrine,EPI)。第I组动物需要更长时间的肾上腺素的正性肌力支持。CI，心脏指数；CPB，心肺转流术；EPI，肾上腺素；SVI，每搏输出量指数(stroke volume index)；NOR，去甲肾上腺素。

图4A-C：从经胸超声心动图(transthoracic ehocardiographies)得出的、舒张(左)和收缩(右)期间LV尺寸的图形。A，实验64(第II组，存活40天)：POD 38时LV质量增加了303％，由于心肌肥大和减小的心室内腔，舒张和收缩功能大大受损。POD 1和POD 38时，LVFS为32％和14％。动物有心脏衰竭的迹象。这些发现与第I组和第II组的其他实验相似。B，实验67(第III组，存活90天)：与实验64形成对照，POD 82时LV质量仅增加了22％，保留了舒张和收缩功能。POD 1和POD 82时，LV FS为27％和34％。动物没有心脏衰竭的迹象。C，猪5157(对照，实验64的供体同胞)：POD 33时LV质量增加了187％，但保留了舒张和收缩功能。POD 1和POD 33时，LV FS为32％和41％。与移植的同胞心脏(实验64)相比，LV的尺寸生长较少，并且没有显示出心肌肥大或心脏衰竭。FS，缩短分数(fractional shortening)；LV，左心室；POD，术后天数。

图5A-B：LV质量(黑点)、血小板计数(深灰线)和相应的LDH值(浅灰色虚线)之间的相关性。A，受体64(第II组)POD 20左右，LV质量增加更明显，而血小板下降，LDH增加。B，这些发现与受体67(第III组)不同，受体67的LV质量保持稳定。LV，左心室；POD，术后天数。

图6A-B：心脏异种移植后猪移植体的经胸超声心动图中乳头肌短轴视图(midpapillary short axis view)(视频定格画面)。A，移植器官过度生长的实施例，实验64(第II组，POD 30)：LV肌壁增厚，心功能恶化；LV腔严重减小；壁运动减弱；有终末心脏衰竭的迹象；连续终末肝脏衰竭。这些发现与第I组和第II组的其他实验相似。B，实验67(第III组，POD 57)：与实验64形成对照，LV肌壁保持不变，LV和RV功能很好地保留；LV腔尺寸正常；泵功能几乎正常；没有心脏衰竭或肝脏衰竭迹象。RV，右心室；LV，左心室

图7：免疫抑制诱导和维持疗法的示例性给药方案、以及mTOR抑制剂施用的示例性给药方案的流程图。各时间线上的标记代表施用。甲基强的松龙(methylprednisolone)时间线标记下方的数字代表相应的剂量(mg/kg/天)。HTX，心脏移植；ATG，抗胸腺细胞球蛋白；i.v.，静脉内。

图8：抗炎疗法的示例性给药方案的流程图。HTX，心脏移植；i.v.，静脉内；s.c.，皮下。各时间线上的标记代表施用。

图9：抗高血压治疗的示例性给药方案的流程图。HTX，心脏移植；i.v.，静脉内。各时间线上的标记代表施用。

图10A-C:示例性心脏异种移植技术。A，原位心脏移植。受体心脏在心房水平被移除；升主动脉(ascending aorta)和肺动脉干(pulmonary trunk)被切断。然后相应地连接供体器官。B，胸内异位心脏移植。供体器官在右胸内被放置于受体心脏的右侧。有两个共同的心房，因为它们是端端吻合的(end-to-end anastomosed)。在升主动脉、肺动脉干(后者需要移植体介入)的水平，血量通过两个端侧连接(end-to-side connection)由两个心脏排出。两个器官非同步工作。两个器官的心输出量的份额取决于各自的前负荷(preload)，而前负荷又与两个心脏的部分周期有关。C，异位腹部移植(heterotopic abdominaltransplantation)。仅冠状动脉(通过腹主动脉)被灌注，冠状静脉血进入右心房，然后进入心室。它通过肺动脉干排出到下腔静脉。心脏在跳动，但不起作用。图改编自毛希丁(Mohiuddin),赖卡特(Reichart)等,2015年。

图11A-F:原位异种移植后的存活、实验室参数、尸检和组织学。A，第I组(浅灰色点；n＝5只动物)，第II组(深灰色虚线；n＝4只动物)和第III组(黑线；n＝5只动物)的卡普兰-迈耶生存曲线。双面log-rank检验，P＝0.0007。B，C，肌钙蛋白T(B)和胆红素(C)的血清浓度。D，动物9(第II组)、11和13(均为第III组)的异种移植心脏的左心室(LV)质量；注意在停用替西罗莫司后移植体生长增加(箭头)。E，心肌细胞横截面积的定量分析。数据为平均±s.d.，P值被示出，采用Holm-Sidak多重比较测试进行单向方差分析(ANOVA)(n＝3个生物学独立的样品，每个样品具有5-8个测量值)。F，与年龄匹配的对照样品相比，来自动物11和12的移植心脏的心肌的蛋白质印迹分析显示mTOR磷酸化(p-mTOR)降低。n＝2，第III组；n＝2，对照。

图12A-G:心肌组织中抗体、补体和纤维蛋白的定量评估，以及非半乳糖-α1,3-半乳糖异种反应性抗体的血清水平。A-E，荧光强度的定量评估(n＝9个生物学独立的样品，每个实验进行5-10次测量；代表性图像参见图2A-D)。示出了IgM(A)、IgG(B)、C3b/c(C)、C4b/c(D)和纤维蛋白(E)的原始整合密度(raw integrated density)。第I组(动物3)；第II组(动物6、8、9)；第III组(动物11-14)。将C3b/c和C4b/c值与在健康猪心脏中测量的对照的C3b/c和C4b/c值进行比较。数据为平均±s.d.。F，G，狒狒血浆中非半乳糖-α1,3-半乳糖异种反应性IgM和IgG抗体的水平；通过荧光激活细胞分选分析结合至α-半乳糖基转移酶敲除的猪主动脉内皮细胞的抗体，该猪主动脉内皮细胞表达人CD46和血栓调节蛋白。数值表达为平均荧光强度。动物6、9和10接受抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab，其他动物用抗CD40单克隆抗体处理。来自排斥异位胸内移植的猪心脏的狒狒的血浆，用作阳性对照。

图13A-D:血液动力学数据，通过经肺热稀释和术后儿茶酚胺支持测量。测量在麻醉诱导后(前)和CPB结束后60分钟(后)进行。第I组(浅灰色)的供体心脏接受晶体心停搏液，第II组(深灰色)和第III组(黑色)的供体心脏通过连续的冷高渗灌注保存；数据以平均±s.d.的散点图表示，个体以点表示；n＝14只动物，双侧配对和非配对t检验，P值如所示。A，每搏输出量指数。B，CPB前后的心脏指数。第I组中两个参数均减小，并且与第II和III组相比，CPB后两个参数在第I组中均较低。C，CPB终止后60分钟儿茶酚胺的剂量。D，术后血管加压和正性肌力支持的持续时间。与第II和III组相比，第I组动物需要更多的去甲肾上腺素和肾上腺素。第I组动物需要更长时间的肾上腺素的正性肌力支持。

图14A-B:额外的实验参数。A，B，第I组(图黑/白版本中的浅灰色点；图彩色版本中的黑线)、第II组(图黑/白版本中的深灰色虚线；图彩色版本中的红色线)和第III组(图黑/白版本中的黑线；图彩色版本中的洋红色线)动物中乳酸脱氢酶(A)和血小板计数(B)的血清浓度。在第I和II组实验结束时，血小板计数减少而LDH增加。第III组动物没有表现出这些改变。

图15A-B:死后心肌样本(specimen)的免疫组织化学。A，B，人膜辅因子蛋白(hCD46)(A)和人血栓调节蛋白(hTM)(B)在所有供体器官(1-14)中的表达均一致。比例尺，50μm。n＝14只GTKO/hCD46/hTM猪；n＝1只野生型猪(对照)。示出了来自所有动物的生物样品。

图16：由Revivicor提供的GGTA1-KO/hCD46转基因猪中hCD46转基因基因座的纳米孔测序显示，在鼠MHC启动子驱动的表达盒中至少存在两个人FUT1编码序列的整合子(integrant)。这两个整合子(右侧标记为1和2)可以通过侧翼hCD46转基因拷贝的定向清楚地区分。

图17：来自五只2岁雌性野生型猪的不同组织中的GGTA1、CMAH和B4GALNT2的平均转录本丰度(mean transcript abundance)。通过RNA测序进行表达谱分析。TPM(每百万的转录本；参见参考文献106)是用于比较样品内不同基因的表达水平的转录本丰度度量。TPM通过标准化每百万读长(read)来考虑文库的深度，并且还通过各数据点除以转录本以碱基数为单位的长度来控制基因的长度。

图18：供体猪的基因工程策略。GGTA1、CMAH和B4GALNT2基因将通过CRISPR/Cas9灭活。然后，具有无启动子hCD46迷你基因、floxed可选标记基因(SMG)和hTM表达盒的盒被插入到GGTA1基因座中，使得hCD46的表达由GGTA1调节序列驱动。可以通过与含有一个或多个额外转基因的工程BAC的Cre介导的盒式交换，插入额外的转基因。

图19：使用CRISPR/Cas技术生成GHR-缺陷性猪模型。GHR外显子3局部DNA序列。sgRNA结合位点由序列下的实线表示，前间区序列邻近基序(protospacer adjacentmotif,PAM)由序列下的虚线表示。1bp(创始(founder)#2529)或7bp(创始#2533)的插入(序列下的双线)导致读框(reading frame)的移位。WT＝野生型。

图20：使用CRISPR/Cas技术生成GHR缺陷性猪模型。配体免疫组织化学表明在GHR-KO猪中不存在功能性GHR(对照中为深色染色)。色原：DAB；复染色：迈尔氏苏木精明矾(Mayer’s hemalum)；尺＝10μm。

图21A-C:与对照猪相比，GHR-KO的血清IGF1、IGFBP和GH浓度。A，血清IGF1值的平均值和标准偏差(GHR-KO：n＝42；对照：n＝69)。B，GHR-KO(n＝10)和对照猪(n＝12)的血清中IGFBP3和IGFBP2的定量。图显示了中位值、第25和第75百分位数(方框)、以及极端值(延长线)。C，GH曲线下面积(AUC；6只雌性GHR-KO和5只雌性/1只雄性对照猪的平均值和标准偏差)。AU＝任意单位。*p<0.05；***p<0.001。

图22A-B:与对照猪相比，GHR-KO的体重增加和生长。A，6月龄的GHR-KO猪(前)和对照同窝仔猪(littermate)。B，体重增长。在12只GHR-KO和25只对照猪中测量参数。图B显示了针对组*年龄估计的最小二乘法平均值(LSMs)和LSMs的标准误差。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；ns＝不显著。

图23A-B:与对照猪相比，GHR-KO中不成比例的器官生长。GHR缺陷导致器官尺寸的成比例的和不成比例的降低。A，来自对照(左)和GHR-KO猪(右)的代表性器官。B，GHR-KO和对照猪在绝对器官重量和器官重量与体重比(相对器官重量)方面的相对差异。在9只GHR-KO和25只对照猪中测量这些参数，并针对2组估计最小二乘法平均值(LSMs)和LSMs的标准误差。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图24A-D:A，与对照猪相比，6月龄的GHR-KO的体成分(body composition)。DXA分析显示，GHR-KO猪的总体脂肪量显著更高(GHR-KO：n＝12；对照：n＝25；***p<0.001)。图A显示了针对2组估计的最小二乘法平均值(LSMs)和LSMs的标准误差。B-D，GHR-KO和对照猪的葡萄糖和脂质稳态参数的年龄依赖性变化。B，GHR-KO猪的短暂性青少年低血糖症(transient juvenile hypoglycemia)。与年龄匹配的对照相比，年轻的GHR-KO猪中(C)甘油三酯和(D)胆固醇的血清浓度明显更低，但随着年龄而正常化。每组和每个年龄级(age-class)调查至少6只动物。图B-D显示了针对组*年龄估计的最小二乘平均值(LSMs)和LSMs的标准误差。*p<0.05；**p<0.01。

图25：GHR-缺陷性GGTA1-KO、hCD46/hTBM转基因猪的生产。从GGTA1-KO、hCD46/hTBM转基因猪中分离原代细胞，并将其与Cas9表达质粒、和转录特异于猪GHR外显子3的向导RNA的质粒共转染。使用双等位基因的GHR突变细胞克隆进行体细胞核转移，并将克隆的胚胎转移到发情周期同步的受体母猪，从到导致小GHR缺陷性GGTA1-KO、hCD46/hTBM转基因猪的出生。

具体实施方式

除非下文另外定义，否则本发明中使用的术语应根据本领域技术人员已知的通用含义来理解。

在本发明中，术语“包括”和“由...组成”具有本领域已知的含义。任选地，在每次出现时，本发明中使用的术语“包括”可以被术语“由...组成”代替。

本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的通过引用以其整体并入本文中。

术语“异种”是根据其在本领域中已知的一般含义来使用的。因此，如本发明中使用的“异种供体”是作为与受体生物体不同的物种的成员(member)的供体。“异种移植”是其中从与受体生物体的物种不同的物种得到移植体的移植。

本文中使用的术语“过度生长”一般指的是对器官或组织功能有害的、器官或组织质量或体积的任何增加，特别是由于外源性因素(例如，由于空间限制的压缩)或者由于内源性因素(例如，由于微脉管循环不足导致的缺氧)。因此，当心脏、肾脏或肝脏以受体生物体相应器官的生理学范围内的重量被移植时，在本发明的一个实施方式中，术语“过度生长”意味着器官的重量已经增加到比生理学重量高出50％的重量。当肺以受体生物体的肺的生理学范围内的体积被移植时，在一个实施方式中，术语“过度生长”意味着肺的体积已经增加到比生理学体积大50％的体积。如本文中使用的在生理学范围内的重量或体积分别意味着与相应受体生物体的相应器官的生理学重量或体积的偏差不超过+/-20％、优选不超过+/-10％的重量或体积。技术人员基于公知常识可以针对任何给定的受体确定器官的生理学重量或体积。参考文献116和117给出了器官的示例性生理学重量和体积。在优选实施方式中，如本文中使用的术语“过度生长”意味着移植的器官(例如，心脏)的体积和重量在移植后约一个月内增加至三到四倍。

如本文中使用的术语“基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏”指的是细胞携带人工修饰的基因组的心脏/肾脏/肺/肝脏。不限于此，这样的人工修饰可以是例如外源性核酸的人工插入、和/或内源性核酸的删除。技术人员将知道多种用于引入这些基因修饰的方法以获得基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏。例如，突变可以被人工地引入到动物的生殖细胞系(germline)中，以便这些基因修饰的动物的所有细胞在其基因组中携带相应的变异。这些基因修饰的动物的心脏/肾脏/肺/肝脏将是根据本发明的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏。

如本文中使用的术语“免疫抑制诱导疗法”指的是在受体生物体被移植了移植体之前，施用给所述受体生物体的任何免疫抑制疗法。因此，在本发明中，术语“免疫抑制诱导疗法”指的是在心脏/肾脏/肺/肝脏移植之前施用给受体生物体的免疫抑制疗法。

如本文中使用的术语“免疫抑制维持疗法”指的是在受体生物体被移植了移植体之后，施用给所述受体生物体的任何免疫抑制疗法。因此，在本发明中，术语“免疫抑制维持疗法”指的是在心脏/肾脏/肺/肝脏移植之后施用给受体生物体的免疫抑制疗法。

如本文中使用的术语“非缺血性保存”指的是器官的体外保存，其中在所述保存期间，确保所述器官的细胞接受充足的氧供给、营养物质和激素。例如，在本发明的一个实施方式中，手术提取的心脏/肾脏/肺/肝脏的“非缺血性保存”通过“非缺血性心脏/肾脏/肺/肝脏灌注”进行。如本文中使用的，术语“非缺血性心脏/肾脏/肺/肝脏灌注”指的是体外心脏/肾脏/肺/肝脏保存，其中补充有营养物质和激素的载氧血液或载氧血液样流体，通过所述心脏/肾脏/肺/肝脏的血管被泵入，以便确保所述心脏/肾脏/肺/肝脏的细胞的充足氧供应和能量、激素需求。

如本文中使用的，术语通过移植的心脏/肾脏/肺/肝脏“功能性替代”心脏/肾脏/肺/肝脏，优选指的是原位替代，但也可以指的是异位支持，并且在移植的心脏的情况下，是胸内异位支持。如果该替代是原位替代，则该替代是其中移植的心脏/肾脏/肺/肝脏接管受体自身心脏/肾脏/肺/肝脏的功能的置换(replacement)。这样的功能性替代要求受体生物体的心脏/肾脏/肺/肝脏在移植前被移除，并且供体心脏/肾脏/肺/肝脏被放置在受体生物体的原位(即，天然)位置上。在移植的心脏的情况下，如果该替代是胸内异位支持，则该替代是为了支持受体的心脏，例如，在人的情况下，该受体的心脏是患病的(参照文献24，附图10B)。在异位胸内替代中，受体自身的心脏保持在原来的位置，而供体心脏在血液动力学上平行并向右连接；换句话说：供体器官支持(正如上面提到的)受体的心脏(例如，在临床的情况下，该受体的心脏将是终末期患病的)。如对技术人员将是显而易见的，移植的心脏的功能性参数(例如，心率、心输出量、射血分数(ejection fraction)、每搏输出量等)可能与受体自身心脏的功能性参数不相同。然而，如果移植的心脏的功能性参数在允许受体的存活的范围内，则认为该移植的心脏功能性替代受体的心脏。

如本文中使用的术语“抗炎疗法”是本领域已知的，并且指的是抗炎剂的施用。如对技术人员将是已知的，药剂的抗炎特性可以在硅胶(silico)中、体外和/或体内进行评估。例如，如果药剂降低或抑制、或者有望降低或抑制由异种蛋白质介导的促炎信号和/或如果药剂降低或抑制受试者的炎症，则所述药剂将被认为具有抗炎特性(并因此可以是抗炎剂)。

如本发明中定义的心脏/肾脏/肺/肝脏移植的时间点是移植的心脏/肾脏/肺/肝脏开始功能性替代受体生物体的心脏/肾脏/肺/肝脏的时间点。例如，如果糖皮质激素“移植后1天内”施用，这样的糖皮质激素的施用发生在一个时间段内，该时间段在移植的心脏/肾脏/肺/肝脏一开始功能性替代受体生物体的心脏/肾脏/肺/肝脏就开始，并在随后一天结束时结束。因此，如果在早晨进行移植，则时间段“移植后1天内”在随后一天结束时结束，即超过24小时后结束。类似地，例如“移植后2天到9天之间”或“移植后2到9天之间”或“移植后2到9天”的时间段在移植后第二天开始时开始并在移植后第9天结束时结束。如果说，施用发生在例如“移植后5天”，则指的是移植后第5天施用。

如本文中使用的术语“剂量(mg/kg/天)”指的是受试者的每千克(kg)体重和每天，施用给受试者的物质以毫克(mg)为单位的剂量。可以施用这样的剂量，例如以单次施用或以分布在一天内的多次施用，或者这样的剂量可以通过连续施用进行施用。当将剂量(mg/kg/天)减少特定倍数时，减少后的剂量通过首次施用的剂量除以所述倍数来进行计算。例如，如果糖皮质激素作为免疫抑制维持疗法的一部分以初始剂量为10mg/kg/天施用时，将该剂量减少到2mg/kg/天将代表减少5倍。

术语“平均动脉压”根据其在本领域的一般含义来使用，并且指的是单个心动周期内受试者动脉中的平均血压。技术人员将知道用于确定平均动脉压的多种方法。

如本文中使用的术语“内源性启动子”指的是在相应哺乳动物的基因组中天然存在的启动子。相反地，如本文中使用的术语“外源性启动子”指的是在相应哺乳动物的基因组中不是天然存在的启动子。

如本文中使用的术语“普遍活跃的启动子”指的是在多种组织和细胞类型中驱动基因表达的启动子。换句话说，当基因的表达由普遍活跃的启动子控制时，该表达不是组织特异性的。

如本文中使用的术语“心脏/肾脏/肺/肝脏”意味着选自由心脏、肾脏、肺和肝脏组成的组的一种或多种器官。在优选实施方式中，如本文中使用的术语“心脏/肾脏/肺/肝脏”意味着心脏、肾脏、肺或肝脏。

延长灵长目动物在心脏/肾脏/肺/肝脏移植后的存活的方法

本发明涉及一种延长受体生物体的存活的方法，该受体生物体被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏。尤其是，根据本发明的方法的下列各方面都有助于延长的受体生物体的存活：(1)在移植前将免疫抑制诱导疗法施用给受体。(2)通过非缺血性保存保存从供体生物体手术提取的心脏/肾脏/肺/肝脏，直到移植。(3)将免疫抑制维持疗法施用给受体生物体，该免疫抑制维持疗法包括移植后1天内糖皮质激素的首次施用，并且其中所述糖皮质激素的剂量(mg/kg/天)在移植后5天内减少至少5倍。(4)移植后将一种或多种抗高血压剂施用给受体生物体。(5)移植后将mTOR抑制剂施用给受体生物体。与被移植了来自异种供体生物体的心脏/肾脏/肺/肝脏但未根据本发明进行处理的受体生物体的存活相比，以上方面(单独或结合)延长被移植了来自异种供体生物体的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体的存活。在本发明的一个实施方式中，本发明的方法将受体生物体的存活延长至移植后超过40天、至移植后超过50天、至移植后超过60天、至移植后超过70天、至移植后超过80天、或至移植后超过90天。优选地，本发明的方法将受体生物体的存活延长至移植后超过50天，更优选地至移植后超过70天，并且最优选地至移植后超过90天。

在本发明中，受体生物体是灵长目动物，优选地受体生物体属于猴科，更优选地受体生物体属于狒狒属，甚至更优选地受体生物体属于东非狒狒种或阿拉伯狒狒种，最优选地受体生物体属于东非狒狒种。狒狒(狒狒属)可以用作用于心脏/肾脏/肺/肝脏移植到人的模型生物体。因此，在本发明的另一实施方式中，受体生物体属于人科，优选地受体生物体属于人属，更优选地受体生物体是人。在本发明的替代实施方式中，受体生物体属于猴科，优选地属于猕猴属(genus Macaca)，最优选地属于猕猴种(species M.mulatta)。

在本发明中，供体生物体是哺乳动物，优选地供体生物体属于猪科，更优选地供体生物体属于猪属，甚至更优选地供体生物体属于野猪种，并且最优选地供体生物体属于家猪亚种。优选地，供体生物体为具有德国长白猪/大白猪杂交遗传背景的猪、杜洛克猪、

当根据本发明移植心脏、肾脏或肝脏时，优选的是，供体生物体被选择成使得待移植器官的重量在受体生物体的相应器官的生理学范围内。如本文中使用的在生理学范围内的重量意味着器官的重量与相应受体生物体的器官的生理学重量的偏差不超过+/-20％，优选不超过+/-10％。当根据本发明移植肺时，优选的是，供体生物体被选择成使得肺的体积在受体生物体的肺的生理学范围内。如本文中使用的在生理学范围内的体积意味着肺的体积与相应受体生物体的肺的生理学体积的偏差不超过+/-20％，优选不超过+/-10％。技术人员基于公知常识可以针对任何给定的受体确定器官的生理学重量或体积。参考文献116和117给出了器官的示例性生理学重量和体积。如对技术人员将是显而易见的，生物体的体重可以作用其器官的重量和体积的指标。因此，在本发明的另一实施方式中，供体生物体的体重与受体生物体的体重的偏差不超过+/-20％，最好不超过+/-10％。

根据本发明的心脏/肾脏/肺/肝脏是基因修饰的，以便避免受体生物体的移植排斥。技术人员将知道取决于根据本发明的相应供体生物体和相应受体生物体的合适的基因修饰。在一个实施方式中，本发明的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏具有以下基因修饰：(1)α-1,3-半乳糖基转移酶基因的纯合敲除；(2)人CD46基因的插入；以及(3)人血栓调节蛋白基因的插入。当供体生物体属于猪科、并且受体生物体属于狒狒属时，基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏可任选地仅具有上述的基因修饰(1)，即α-1,3-半乳糖基转移酶基因的纯合敲除。当供体生物体属于猪科、并且受体生物体是人时，基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏优选地具有所有上述基因修饰(1)至(3)。在另一实施方式中，本发明的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏具有以下基因修饰：(1)α-1,3-半乳糖基转移酶基因、CMAH基因和B4GALNT2基因的纯合敲除；(2)人CD46基因、人CD55基因、人CD59基因、血红素氧合酶1基因和A20基因的插入；以及任选地(3)LEA基因或PDL-1(PD-L1、PDL1、CD274)基因的插入。该实施方式的基因修饰的细节可在参考文献23(以其整体并入本文中)中找到。在该实施方式中，血红素氧合酶1基因、A20基因、LEA基因以及PDL-1基因可以来自任何生物体，但是优选地它们分别是人血红素氧合酶1基因、人A20基因、人LEA基因以及人PDL-1基因。在上述实施方式中，当插入人CD46基因(huCD46)时，优选地表达根据从以下基因组的基因座/编码区域产生的任何转录本的转录本：GRCH38p7、NC_000001、区域207752038-207795516。更优选地，当插入人CD46基因时，从转基因表达盒表达以下转录本的至少之一：NM_002389、NM_172359、NM_172351、NM_153826、NM_172352、NM_172353、NM_172350以及NM_172361。在上述实施方式中，当插入人血栓调节蛋白基因(huTHBD、huTBM)时，优选地表达根据从以下基因组的基因座/编码区域产生的任何转录本的转录本：GRCH38p7、NC_000020、区域23045633-23049664。更优选地，当插入人血栓调节蛋白基因时，从转基因表达盒表达以下转录本：NM_000361。在上述实施方式中，当插入人CD55基因(huCD55)时，优选地表达根据从以下基因组的基因座/编码区域产生的任何转录本的转录本：GRCH38p7、NC_000001、区域207321472-207360966。更优选地，当插入人CD55基因时，从转基因表达盒表达以下转录本的至少之一：NM_001114752、NM_001300903、NM_001300904、NM_000574以及NM_001300902。在上述实施方式中，当插入人CD59基因(huCD59)时，优选地表达根据从以下基因组的基因座/编码区域产生的任何转录本的转录本：GRCH38p7、NC_000011、区域33703010-33736479。更优选地，当插入人CD59基因时，从转基因表达盒表达以下转录本的至少之一：NM_000611、NM_203331、NM_203329、NM_203330、NM001127227、NM_001127226、NM_001127225以及NM_001127223。在上述实施方式中，当插入人血红素氧合酶1基因(huHMOX1、huHO1)时，优选地表达根据从以下基因组的基因座/编码区域产生的任何转录本的转录本：GRCH38p7、NC_000022、区域35381067-35394214。更优选地，当插入人血红素氧合酶1基因时，从转基因表达盒表达以下转录本：NM_002133。在上述实施方式中，当插入人A20基因(huA20、huTNFAIP3)时，优选地表达根据从以下基因组的基因座/编码区域产生的任何转录本的转录本：GRCH38p7、NC_000006.12、区域137866317-137883314。更优选地，当插入人A20基因时，从转基因表达盒表达以下转录本的至少之一：NM_001270508；NM_001270507；NM_006290。如对本领域技术人员将是显而易见的，如本文中使用的术语“LEA基因”指的是人工CTLA4-Ig蛋白的合成序列编码，该CTLA4-Ig蛋白已经针对对CD80/CD86的高亲和力进行了优化。在上述实施方式中，当插入人LEA基因(即，序列)时，优选地例如从转基因表达盒，表达以下密码子优化的变体LEA29Y：

atgggggtactgctcacacagaggacgctgctcagtctggtccttgcactcctgtttccaagcatggcgagcatggcgatgcacgtggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtgagtatgcatctccaggcaaatatactgaggtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctacatgatggggaatgagttgaccttcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaaggactgagggccatggacacgggactctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacgagggcataggcaacggaacccagatttatgtaattgatccagaaccgtgcccagattctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgggtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(SEQ ID NO:1)。

在上述实施方式中，当插入人PDL-1基因(huPD-L1、huPDL1、huCD274)时，优选地表达根据从以下基因组的基因座/编码区域产生的任何转录本的转录本：GRCH38p7、NC_000009、区域5450503-5470567。更优选地，当插入人PDL-1基因时，从转基因表达盒表达以下转录本的至少之一：NM_014143；NM_001267706；NM_00134029。

如对本领域技术人员将是显而易见的，并且如从上面直接得出的，当提及根据本发明的“基因的插入”时，在优选实施方式中，没有插入整个基因。在该实施方式中，可以插入允许待表达的相应基因的转录本的任何序列(例如，在表达盒中)。

在可以与任何上述实施方式相结合的另一实施方式中，本发明的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏额外地具有编码人α1,2-岩藻糖基转移酶的序列的插入。优选地，人α1,2-岩藻糖基转移酶是从以下基因表达的蛋白：官方符号：FUT1；官方全名：岩藻糖基转移酶1(H血型)；主要来源：HGNC:HGNC:4012；参见相关：Ensembl：ENSG00000174951，MIM：211100。

在本发明中，当提及基因/序列的插入时，该插入可以是杂合或纯合插入。如对本领域技术人员将是显而易见的，如果杂合插入的表达水平不够高，则纯合插入是优选的。

优选地，根据本发明的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏是从基因修饰的供体生物体获得的，即从其生殖细胞系中携带相应基因修饰的供体生物体获得的。获得这样基因修饰的供体生物体(例如猪)的方法是本领域技术人员已知的(参见参考文献92、103、104和105，所有这些参考文献以其整体并入本文中)。作为常规技术的替代，基因修饰的猪也可以使用新技术获得，例如CRISPR/CAS 9，其可以提供改进的插入基因座。

根据本发明的免疫抑制诱导疗法、免疫抑制维持疗法、抗炎疗法、抗高血压剂以及mTOR抑制剂根据给药方案施用。各给药方案可以包括仅一种药物活性剂的施用，或数种药物活性剂的施用。如果给药方案包括数种药物活性剂的施用，则所述药剂可以在施用之前混合成单一组合物、或者可以分开施用。如果分开施用，则所述药物活性剂可以基本上同时(例如，同时地或连续地(consecutively))施用、或者可以在不同时间施用。此外，无论给药方案包括仅一种药物活性剂的施用还是数种药物活性剂的施用，各给药方案都可以包括各药物活性剂的单次施用、或各药物活性剂的多次施用。如果给药方案包括数种药物活性剂的施用，并且如果数种药物活性剂多次施用，则不同药物活性剂的施用之间的时间间隔可以不同。例如，如果给药方案包括药物活性剂A和药物活性剂B的多次施用，则药物活性剂A可以每天施用(或者在一天或数天的固定间隔之后)，而药物活性剂B可以每隔一天施用。在根据本发明的给药方案内，药物活性剂的任何首次施用都被称为“首次施用”。当然，这样的“首次施用”不排除在开始根据本发明的给药方案之前受试者已经被施用了相同的药物活性剂。

如对技术人员将是显而易见的，当本发明指的是在移植后给定的一天发生的药物活性剂的单次施用时，这种单次施用也可以被分成多次施用，只要这些多次施用发生在同一天即可。当然，如果针对这样的单次施用给出了剂量、并且该单次施用被分成了在同一天发生的多次施用，则多次施用的剂量需要加起来等于在本发明中指示的单次施用的剂量。如对技术人员将是显而易见的，施用也可以是持续施用(continuous administration)，其中药物活性剂贯穿全天地持续施用。如果针对这样的持续施用给出了剂量，则该剂量代表贯穿全天施用的累积剂量。如果持续施用发生在连续几天，则药物活性剂持续施用数天。

根据本发明的免疫抑制诱导疗法根据给药方案施用给受体生物体。所述给药方案包括移植前一种或多种免疫抑制剂的施用。可以根据免疫抑制诱导疗法的给药方案施用的示例性免疫抑制剂包括抗CD20抗体、抗胸腺细胞球蛋白、以及抗CD40抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的(PAS化的)Fab(抗原结合片段)。

在本发明的一个实施方式中，免疫抑制诱导疗法的给药方案包括抗CD20抗体的施用。在优选实施方式中，所述抗CD20抗体是从罗氏制药公司(Roche Pharma)AG(格伦察赫-维伦(Grenzach-Wyhlen)，德国)可商购的抗CD20抗体美罗华(Mabthera)。免疫抑制诱导疗法的给药方案可以包括抗CD20抗体的单次施用或多次施用。在优选实施方式中，给药方案包括抗CD20抗体的单次施用。更优选地，所述抗CD20抗体的单次施用发生在心脏/肾脏/肺/肝脏移植前5到9天之间，最优选所述单次施用发生在心脏/肾脏/肺/肝脏移植前7天。抗CD20抗体施用的优选剂量是每公斤体重19mg。根据该实施方式的所有其他方面，抗CD20抗体施用的优选途径是静脉内(i.v.)短期输注。

在本发明的另一实施方式中，免疫抑制诱导疗法的给药方案包括抗胸腺细胞球蛋白(ATG)的施用。在优选实施方式中，所述抗胸腺细胞球蛋白是从赛诺菲-安万特德国股份有限公司(Sanofi-Aventis Germany GmbH)(法兰克福，德国)可商购的抗胸腺细胞球蛋白即复宁(Thymoglobuline)。免疫抑制诱导疗法的给药方案可以包括抗胸腺细胞球蛋白的单次施用或多次施用。在优选实施方式中，给药方案包括抗胸腺细胞球蛋白的多次施用，在甚至更优选实施方式中，给药方案包括抗胸腺细胞球蛋白的两次施用。优选地，所述抗胸腺细胞球蛋白的两次施用分别地发生在心脏/肾脏/肺/肝脏移植前3天内，最优选发生在心脏/肾脏/肺/肝脏移植前1到2天。抗胸腺细胞球蛋白施用的优选剂量是每公斤体重50mg。在另一实施方式中，抗胸腺细胞球蛋白施用的优选剂量是每公斤体重5mg。根据该实施方式的所有其他方面，抗胸腺细胞球蛋白施用的优选途径是静脉内(i.v.)短期输注。

在本发明的另一实施方式中，免疫抑制诱导疗法的给药方案包括抗CD40抗体或抗CD40L PAS蛋白修饰的(PAS化的)Fab的施用。在优选实施方式中，所述抗CD40抗体是小鼠/恒河猴嵌合的IgG4克隆2C10R4，其从美国马萨诸塞州波士顿质量生物制剂(MassBiologicals)的NIH非人灵长目动物试剂资源(Nonhuman Primate Reagent Resource)可得到；由基斯赖曼(Keith Reimann)提供。在另一优选实施方式中，所述抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab是由瓦克化学(Wacker-Chemie)(布格豪森，德国)生产并由XL蛋白股份有限公司(弗赖辛，德国)纯化的人源化抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab，如宾德尔(Binder)&斯凯拉(Skerra)所述(参见参考文献9)。免疫抑制诱导疗法的给药方案可以包括抗CD40抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab的单次施用或多次施用。在优选实施方式中，给药方案包括抗CD40抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab的单次施用。更优选地，所述抗CD40抗体/抗CD40LPAS蛋白修饰的Fab的单次施用发生在心脏/肾脏/肺/肝脏移植前2天内，最优选所述单次施用发生在心脏/肾脏/肺/肝脏移植前1天。施用的优选剂量是每公斤体重50mg抗CD40抗体，或者每公斤体重20mg抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab。根据该实施方式的所有其他方面，抗CD40抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab施用的优选途径是静脉内(i.v.)短期输注。

在本发明的优选实施方式中，免疫抑制诱导疗法的给药方案包括抗CD20抗体、抗胸腺细胞球蛋白、和抗CD20抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的(PAS化)Fab的施用。在该优选实施方式中，优选的抗CD20抗体、优选的抗胸腺细胞球蛋白、和优选的抗CD40抗体/抗CD40LPAS蛋白修饰的Fab与上述相应实施方式中描述的相同。此外，在该优选实施方式中，优选的频率、优选的时间点、优选的剂量和优选的施用途径也与上述相应实施方式中描述的相同。根据本发明的免疫抑制诱导疗法的特别优选的给药方案如图7所绘。

根据本发明的从供体生物体手术提取心脏/肾脏/肺/肝脏如本领域技术人员所知地进行。随后，手术提取的心脏/肾脏/肺/肝脏通过非缺血性保存而保存，直至移植。非缺血性保存的持续时间优选短于24小时，更优选短于15小时，甚至更优选短于10小时，甚至更优选短于5小时，并且最优选短于4小时。优选地，所述非缺血性保存是非缺血性心脏/肾脏/肺/肝脏灌注，例如斯蒂恩(Steen)等人在参考文献10(以其整体合并于本文中)中所描述的非缺血心脏灌注。对于这样的非缺血性心脏灌注，可以在便携式体外心脏保存系统中、在8℃的温度下使用3.5L含氧的含白蛋白高渗性心停搏营养液，该营养液具有激素和红细胞，该便携式体外心脏保存系统由压力和流量控制的滚压泵、O

根据本发明的心脏/肾脏/肺/肝脏移植到受体生物中如本领域技术人员所知地执行。优选地，受体生物体接受麻醉和镇痛治疗，该麻醉和镇痛治疗可以包括施用氯胺酮盐酸盐(ketamine hydrochloride)、咪达唑仑(midazolam)、丙泊酚(propofol)、芬太尼(fentanyl)、七氟烷(sevoflurane)和/或安乃近(metamizole)，例如如参考文献11(以其整体合并于本文中)中所描述的。在优选实施方式中，应用如参考文献8中所述的沙姆韦(Shumway)和洛厄(Lower)技术进行心脏移植，参考文献8的全部内容合并于本文中。

在本发明的方法中，手术提取的、保存的供体生物体的心脏/肾脏/肺/肝脏被移植到受体生物体中，以便其功能性替代受体生物体的心脏/肾脏/肺/肝脏。这种功能性替代优选是原位替代，但是也可以是异位支持，并且在移植的心脏的情况下，是胸内异位支持。可以如实施例1描述的进行原位心脏替代。胸内异位心脏移植也是一种生命支持，并将是一种替代方案。简而言之：胸内异位心脏移植将受体的心脏留在原处，并在移植的异种器官失败的情况下作为备用——一种重要的策略，其至少可以在临床初步研究刚开始时应用(并且再次移植将是可能的)。胸内异位异种心脏移植可以使用基于C.N.巴纳德(Barnard)(参见参考文献24、25)开发的方法的技术(图10B)进行。该程序需要心肺机的支持。供体心脏(例如，猪心脏)被放置在受体(例如，狒狒)心脏的右侧，从而压缩部分右肺。植入开始于左心房和右心房的吻合。然后，二者的主动脉以端侧方式结合。最后，二者的肺动脉在介入移植体(interposition graft)的帮助下连接(参见图10B)。与收缩但不排出血液的腹部移植的心脏(参见图10C，免疫学模型)形成对照，胸内放置的移植物排出血液。手术后的超声心动图显示主动脉和二尖瓣的收缩和舒张运动、以及主动脉收缩压曲线与供体心电图(ECG)相关联。胸内异位程序后，供体心脏和受体心脏(在临床情况下可能功能受损)根据各自的心脏周期(它们的前负荷)贡献心输出量。胸内异位异种心脏移植将如参考文献25所述地进行。当然，参考文献25描述的胸内异位异种心脏移植优选地与根据本发明的非缺血性心脏保存、根据本发明施用免疫抑制诱导和维持疗法、根据本发明减少作为免疫抑制维持疗法的一部分施用的糖皮质激素的剂量、根据本发明施用抗炎疗法、根据本发明施用一种或多种抗高血压剂、和/或根据本发明施用mTOR抑制剂相结合。

根据本发明的免疫抑制维持疗法是根据给药方案施用给受体生物体。所述给药方案包括移植后一种或多种免疫抑制剂的施用，其中该给药方案包括移植后1天内、优选在移植当天糖皮质激素的首次施用。除糖皮质激素外，可以根据免疫抑制维持疗法的给药方案施用的示例性免疫抑制剂包括抗CD20抗体、霉酚酸酯、和抗CD40抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab。

根据本发明的免疫抑制维持疗法的给药方案任选地包括糖皮质激素的施用。糖皮质激素的首次施用发生在移植后1天内，优选在移植的当天。免疫抑制维持疗法的给药方案包括糖皮质激素的多次施用，优选地包括在首次施用后的每天一次的施用。首次施用当天的糖皮质激素的优选剂量为5mg/kg/天至15mg/kg/天，优选7mg/kg/天至13mg/kg/天，更优选9mg/kg/天至11mg/kg/天，最优选10mg/kg/天。免疫抑制维持疗法的给药方案包括在移植后5天内将施用给受体生物体的糖皮质激素的剂量(mg/kg/天)减少至少5倍，优选至少10倍。例如，如果首次施用当天的糖皮质激素的剂量是10mg/kg/天，则移植后第5天的最大剂量为2mg/kg/天，优选为1mg/kg/天。在优选实施方式中，在各个方面，免疫抑制维持疗法的给药方案包括移植后10天内将施用给受体生物体的糖皮质激素的剂量(mg/kg/天)减少至少10倍，优选至少20倍。在另一优选实施方式中，免疫抑制维持疗法的给药方案包括移植后20天内将施用给受体生物体的糖皮质激素的剂量(mg/kg/天)减少至少50倍，优选至少100倍。原则上，任何具有糖皮质激素效力的皮质类固醇(corticosteroid)均可用于本发明。然而，在优选实施方式中，糖皮质激素是皮质醇(cortisol)、可的松、强的松(prednisone)，泼尼松龙(prednisolone)、甲基强的松龙、地塞米松(dexamethasone)、倍他米松(betamethasone)或去炎松(triamcinolone)，优选地，糖皮质激素是泼尼松龙或甲基强的松龙，最优选地，糖皮质激素是甲基强的松龙。甲基强的松龙是可商购的，例如是赛诺菲-安万特德国股份有限公司(法兰克福，德国)的Urbasone solubile。根据该实施方式的所有其他方面，糖皮质激素施用的优选途径是静脉内(i.v.)推注(bolus injection)。

在本发明的一个实施方式中，免疫抑制维持疗法的给药方案包括抗CD20抗体的施用。如果抗CD20抗体已经作为在先免疫抑制诱导疗法的一部分施用，则作为免疫抑制维持疗法的一部分施用的抗CD20抗体，优选是与已经作为免疫抑制诱导疗法的一部分施用的相同的抗CD20抗体。在优选实施方式中，免疫抑制诱导疗法和免疫抑制维持疗法的抗CD20抗体是从罗氏制药公司(格伦察赫-维伦，德国)可商购的抗CD20抗体美罗华。免疫抑制维持疗法的给药方案可以包括抗CD20抗体的单次施用或多次施用。在优选实施方式中，给药方案包括抗CD20抗体的多次施用。更优选地，给药方案包括抗CD20抗体的2至4次施用，最优选地，给药方案包括抗CD20抗体的3次施用。在一个实施方式中，免疫抑制维持疗法的给药方案包括移植后1天内抗CD20抗体的施用，优选地，免疫抑制维持疗法的给药方案包括移植当天抗CD20抗体的施用。在另一实施方式中，如果给药方案包括抗CD20抗体的两次或更多次施用，则给药方案包括移植后1天内抗CD20抗体的施用、以及移植后6到8天之间抗CD20抗体的施用，优选地包括移植当天抗CD20抗体的施用、以及移植后7天抗CD20抗体的施用。在另一实施方式中，如果给药方案包括抗CD20抗体的三次或更多次施用，则给药方案包括移植后1天内抗CD20抗体的施用、移植后6到8天之间抗CD20抗体的施用、以及移植后13到15天之间抗CD抗体的施用，优选地包括移植当天抗CD20抗体的施用、移植后7天抗CD20抗体的施用、以及移植后14天抗CD20抗体的施用。抗CD20抗体施用的优选剂量是每公斤体重19mg。根据该实施方式的所有其他方面，抗CD20抗体施用的优选途径是静脉内(i.v.)短期输注。

在本发明的另一实施方式中，免疫抑制维持疗法的给药方案包括霉酚酸酯(MMF)的施用。在优选实施方式中，免疫抑制维持疗法的霉酚酸酯是从罗氏公司(巴塞尔，瑞士)可商购的霉酚酸酯骁悉(CellCept)。免疫抑制维持疗法的给药方案优选包括霉酚酸酯的多次施用，其中一次施用发生在移植后1天内，优选在移植当天。在优选实施方式中，免疫抑制维持疗法的给药方案包括移植后每天霉酚酸酯的一次施用。霉酚酸酯施用的优选剂量为每公斤体重40mg。甚至更优选地，将剂量调节至2-3μg/ml的谷浓度(trough level)。根据该实施方式的所有其他方面，霉酚酸酯施用的优选途径是持续静脉内(i.v.)输注。在优选实施方式中，当霉酚酸酯根据免疫抑制维持疗法的给药方案施用时，已经在移植之前额外地施用了霉酚酸酯，以便在移植时已经达到治疗药物水平。例如，可以在移植前施用一次或多次霉酚酸酯。优选地，在移植前施用多次霉酚酸酯，并且甚至更优选地，在移植前施用两次霉酚酸酯。优选地，所述霉酚酸酯的两次施用发生在移植前3天内，最优选地，所述霉酚酸酯的两次施用分别在心脏/肾脏/肺/肝脏移植前1到2天发生。优选的霉酚酸酯、霉酚酸酯施用的优选剂量和优选的施用途径如上文针对根据免疫抑制维持疗法给药方案的霉酚酸酯施用所描述的。

在本发明的另一实施方式中，免疫抑制维持疗法的给药方案包括抗CD40抗体或抗CD40L PAS蛋白修饰的(PAS化)Fab的施用。如果已经作为在先免疫抑制诱导疗法的一部分施用了抗CD40抗体或抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab，则作为免疫抑制维持疗法的一部分施用的抗CD40抗体或抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab，优选是与已经作为免疫抑制诱导疗法的一部分施用的相同的抗CD40抗体或抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab。在优选实施方式中，所述抗CD40抗体是小鼠/恒河猴嵌合IgG4克隆2C10R4，其从美国马萨诸塞州波士顿质量生物制剂的NIH非人灵长目动物试剂资源是可获得的；由基斯赖曼提供。在另一优选实施方式中，所述抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab是由瓦克化学(布格豪森，德国)生产并由XL蛋白有限公司(弗赖辛，德国)纯化的人源化抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab，如宾德尔&斯凯拉(参见参考文献9)所述。免疫抑制维持的给药方案优选包括抗CD40抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab的多次施用，其中一次施用发生在移植后1天内，优选在移植当天。在优选实施方式中，免疫抑制维持疗法的给药方案包括移植后1天内的一次施用、移植后8天内的四次施用、移植后15天内的六次施用、移植后20天内的七次施用以及随后的每6-8天施用。优选的施用剂量是每公斤体重50mg抗CD40抗体，或者每公斤体重20mg抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab。根据该实施方式的所有其他方面，抗CD40抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab施用的优选途径是静脉内(i.v.)短期输注。

在本发明的优选实施方式中，免疫抑制维持疗法的给药方案包括糖皮质激素、抗CD20抗体、霉酚酸酯、和抗CD40抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的(PAS化)Fab的施用。在该优选实施方式中，优选的糖皮质激素、优选的抗CD20抗体、优选的霉酚酸酯和优选的抗CD40抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab与上述相应实施方式中描述的相同。此外，在该优选实施方式中，优选的频率、优选的时间点、优选的剂量(或用量)和优选的施用途径也与上述相应实施方式中描述的相同。根据本发明的免疫抑制维持疗法的特别优选的给药方案如图7所绘。

根据本发明的抗炎疗法是根据给药方案施用给受体生物体的。所述给药方案包括移植后一种或多种抗炎剂的施用。可以根据抗炎疗法的给药方案施用的示例性抗炎剂包括IL-1受体拮抗剂、TNF-α(＝TNFa＝TNFα)抑制剂和IL-6受体抗体。在本发明中，抗炎疗法应该抵消典型的非特异性异种炎症反应，例如胸腔积液/心包积液(pleural pericardialeffusion)。

在本发明的一个实施方式中，抗炎疗法的给药方案包括IL-1受体拮抗剂的施用。在优选实施方式中，所述IL-1受体拮抗剂是从瑞典罕见病生物制药有限公司(SwedishOrphan Biovitrum GmbH)(马丁雷德，德国)可商购的IL-1受体拮抗剂阿那白滞素(Kineret)。在优选实施方式中，抗炎疗法的给药方案包括IL-1受体拮抗剂的多次施用，其中一次施用发生在移植后1天内，优选在移植当天。在更优选的实施方式中，抗炎疗法的给药方案包括IL-1受体拮抗剂的多次施用，其中一次施用发生在移植后1天内，优选在移植当天，并且其中一次施用发生在随后的每天。IL-1受体拮抗剂施用的优选剂量是每公斤体重1.3mg。根据该实施方式的其他所有方面，IL-1受体拮抗剂施用的优选途径是皮下(s.c.)或静脉内(i.v.)推注。

在本发明的另一实施方式中，抗炎疗法的给药方案包括TNF-α抑制剂的施用。在优选实施方式中，所述TNF-α抑制剂是从辉瑞制药有限公司(Pfizer Pharma GmbH)(柏林，德国)可商购的TNF-α抑制剂依那西普(Enbrel)。在优选实施方式中，抗炎疗法的给药方案包括TNF-α抑制剂的多次施用，其中一次施用发生在移植后1天内，优选在移植当天。在更优选的实施方式中，抗炎疗法的给药方案包括TNF-α抑制剂的多次施用，其中一次施用发生在移植后1天内、并且一次施用发生在此后的每6到8天，优选其中一次施用发生在移植当天并且一次施用发生在此后的每7天。TNF-α抑制剂施用的优选剂量为每公斤体重0.7mg。根据该实施方式的所有其他方面，TNF-α抑制剂施用的优选途径是皮下(s.c.)推注。

在本发明的另一实施方式中，抗炎疗法的给药方案包括IL-6受体抗体的施用。在优选实施方式中，所述IL-6受体抗体是从罗氏制药公司(格伦察赫-维伦，德国)可商购的IL-6受体抗体托珠单抗(RoActemra)。抗炎疗法的给药方案可以包括IL-6受体抗体的单次施用或多次施用。在优选实施方式中，抗炎疗法的给药方案包括IL-6受体抗体的多次施用，其中一次施用发生在移植后1天内，优选在移植当天。在更优选的实施方式中，抗炎疗法的给药方案包括IL-6受体抗体的多次施用，其中一次施用发生在移植后1天内、并且一次施用发生在此后的每20到40天，优选其中一次施用发生在移植当天、并且一次施用发生在此后的每25到35天。IL-6受体抗体施用的优选剂量是每公斤体重8mg。根据该实施方式的所有其他方面，IL-6受体抗体施用的优选途径是静脉内(i.v.)短期输注。

在本发明的优选实施方式中，抗炎疗法的给药方案包括IL-1受体拮抗剂、TNF-α抑制剂以及IL-6受体抗体的施用。在该优选实施方式中，优选的IL-1受体拮抗剂、优选的TNF-α抑制剂和优选的IL-6受体抗体与上述相应实施方式中描述的相同。此外，在该优选实施方式中，优选的频率、优选的时间点、优选的剂量和优选的施用途径也与上述相应实施方式中描述的相同。根据本发明的抗炎疗法的特别优选的给药方案如图8所绘。

根据本发明的一种或多种抗高血压剂根据给药方案施用给受体生物体。所述给药方案包括移植后一种或多种抗高血压剂的施用。可以根据抗炎疗法的给药方案施用的示例性抗高血压剂包括：利尿剂，例如髓袢利尿剂(loop diuretics)呋塞米(furosemide)和依他尼酸(ethacrynic acid)、噻嗪/类噻嗪利尿剂(thiazide/thiazide-like diuretics)氢氯噻嗪(hydrochlorothiazide)和吲达帕胺(indapamide)、以及保钾利尿剂(potassium-sparing diuretics)氨苯蝶啶(triamterene)和阿米洛利(amiloride)；钙通道阻断剂，例如二氢吡啶类(dihydropyridines)氨氯地平(amlodipine)和硝苯地平(nifedipine)、以及非二氢吡啶类维拉帕米(verapamil)和地尔硫卓(diltiazem)；血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，例如依那普利和雷米普利(ramipril)；血管紧张素II受体拮抗剂，例如缬沙坦(valsartan)和坎地沙坦(candesartan)；肾上腺素能受体拮抗剂，例如β阻断剂比索洛尔(bisoprolol)和美托洛尔、α阻断剂多沙唑嗪(doxazosin)和酚苄明(phenoxybenzamine)、以及混合的α/β阻断剂卡维地洛(carvedilol)和拉贝洛尔(labetalol)；血管扩张剂，例如硝普钠(sodium nitroprusside)和肼苯哒嗪(hydralazine)；肾素抑制剂，例如阿利吉仑(aliskiren)；醛甾酮受体拮抗剂，例如螺内酯(spironolactone)和依普利酮(eplerenone)；α-2肾上腺素能受体激动剂，例如可乐定(clonidine)和甲基多巴(methyldopa)；和内皮素受体阻断剂，例如波生坦(bosentan)。在优选实施方式中，给药方案包括一种或多种抗高血压剂的施用，该抗高血压剂选自血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂和肾上腺素能受体拮抗剂。优选地，一种或多种抗高血压剂的剂量被调节为使得受体生物体的平均动脉压保持在70-90mmHg的范围内，优选在75-85mmHg的范围内。甚至更优选地，剂量被调节为使得受体生物体的平均动脉压保持在70-90mmHg的范围内，优选在75-85mmHg的范围内，并且使得心率保持在80-120bpm的范围内，优选在90-110bpm的范围内。

在本发明的一个实施方式中，施用一种或多种抗高血压剂的给药方案包括血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂的施用。在优选实施方式中，所述血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂是依那普利。依那普利是可商购的，例如赫素制药集团(Hexal AG)(霍尔茨基兴，德国)的Enahexal。在优选实施方式中，施用一种或多种抗高血压剂的给药方案包括血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂的多次施用，其中一次施用发生在移植后2天内，优选在移植后1天内。在更优选的实施方式中，施用一种或多种抗高血压剂的给药方案包括血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂的多次施用，其中一次施用发生在移植后2天内，优选在移植后1天内，并且其中一次施用发生在随后的每天。根据该实施方式的所有其他方面，血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂施用的优选途径是静脉内(i.v.)施用。

在本发明的另一实施方式中，施用一种或多种抗高血压剂的给药方案包括肾上腺素能受体拮抗剂的施用。在优选实施方式中，所述肾上腺素能受体拮抗剂是酒石酸美托洛尔。酒石酸美托洛尔是可商购的，例如阿斯利康股份有限公司(AstraZeneca GmbH)(韦尔德，德国)的Beloc i.v.。在优选实施方式中，施用一种或多种抗高血压剂的给药方案包括肾上腺素能受体拮抗剂的多次施用，其中一次施用发生在移植后2天内，优选在移植后1天内。在更优选的实施方式中，施用一种或多种抗高血压剂的给药方案包括肾上腺素能受体拮抗剂的多次施用，其中一次施用发生在移植后2天内，优选在移植后1天内，并且其中一次施用发生在随后的每天。根据该实施方式的所有其他方面，肾上腺素能受体拮抗剂施用的优选途径是静脉内(i.v.)施用。

在本发明的优选实施方式中，施用一种或多种抗高血压剂的给药方案包括血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂和肾上腺素能受体拮抗剂的施用。在该优选实施方式中，优选的血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、和优选的肾上腺素能受体拮抗剂与上述相应实施方式中描述的相同。此外，在该优选实施方式中，优选的频率、优选的时间点和优选的施用途径也与上述相应实施方式中描述的相同。根据本发明的施用一种或多种抗高血压剂的特别优选的给药方案如图9所绘。根据本发明的抗高血压剂施用给受体生物体，从而将血压减少至供体(例如猪)生物体的(较低)水平。

根据本发明的mTOR抑制剂根据给药方案施用给受体生物体。所述给药方案包括移植后mTOR抑制剂的施用。可以根据施用mTOR抑制剂的给药方案施用的示例性mTOR抑制剂包括达托利塞(BEZ235、NVP-BEZ235)、雷帕霉素(西罗莫司)、依维莫司(RAD001)、AZD8055、替西罗莫司(CCI-779、NSC 683864)、SF2523、3BDO、PI-103、KU-0063794I、拓克尼布(PP242)、地磷莫司(地弗莫司、MK-8669)、沙帕替尼(INK128、MLN0128)、伏他利塞(SAR245409、XL765)类似物、托林1、奥米利塞(GSK2126458、GSK458)、OSI-027、PF-04691502、阿哌利塞(GDC-0980、RG7422)、GSK1059615、吉达利塞(PF-05212384、PKI-587)、WYE-354、维妥舍替(AZD2014)、托林2、WYE-125132(WYE-132)、BGT226(NVP-BGT226)、帕罗米德529(P529)、PP121、WYE-687、WAY-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、佐他莫司(ABT-578)、CZ415、MHY1485、伏他利塞(XL765、SAR245409)、大黄根酸和CC-223、LY3023414。在优选实施方式中，给药方案包括mTOR抑制剂替西罗莫司的施用。替西罗莫司可用于静脉内应用，例如辉瑞制药有限公司(柏林，德国)的驮瑞塞尔(Torisel)。替莫罗莫司可能具有长效作用(long-acting)，类似于抗CD40抗体/抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab。这是非人灵长目动物实验中的一种处理优势。根据本发明的mTOR抑制剂施用给受体生物体以抑制生长激素，以便抑制移植的心脏/肾脏/肺/肝脏的过度生长。

在优选实施方式中，施用mTOR抑制剂的给药方案包括mTOR抑制剂的多次施用，其中首次施用发生在移植后10天内，优选在移植后2到9天之间，更优选在移植后4到7天之间。在更优选的实施方式中，施用mTOR抑制剂的给药方案包括mTOR抑制剂的多次施用，其中首次施用发生在移植后10天内，优选在移植后2到9天之间，更优选在移植后4到7天之间，并且其中一次施用发生在随后的每天。如对技术人员将是显而易见的，mTOR抑制剂的首次施用的时间点取决于受体的总体状况(例如是否有心包积液/胸腔积液)。优选地，mTOR抑制剂施用的剂量被调节为5-10ng/ml雷帕霉素的谷浓度。根据该实施方式的所有其他方面，mTOR抑制剂施用的优选途径是静脉内(i.v.)短期输注。根据本发明的施用mTOR抑制剂的特别优选的给药方案如图7所绘。

在本发明的一个实施方式中，被移植来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体根据给药方案接受附加疗法。所述给药方案包括一种或多种药物活性剂的施用。可以根据附加疗法的给药方案施用的示例性药物活性剂包括乙酰水杨酸、普通肝素(unfractionated heparin)、C1酯酶抑制剂、更昔洛韦(ganciclovir)、头孢呋辛(cefuroxime)和倍他依泊汀(epoetin beta)。

在本发明的一个实施方式中，附加疗法的给药方案包括乙酰水杨酸的施用。在优选实施方式中，所述乙酰水杨酸是从拜耳医药保健有限公司(Bayer Vital GmbH)(勒沃库森，德国)可商购的乙酰水杨酸阿司匹林。附加疗法的给药方案优选地包括乙酰水杨酸的多次施用。在优选实施方式中，给药方案包括移植后每天的乙酰水杨酸施用。乙酰水杨酸施用的优选剂量为每公斤体重2mg。根据该实施方式的所有其他方面，乙酰水杨酸施用的优选途径是静脉内(i.v.)推注。在本发明中，乙酰水杨酸用作抗凝剂。

在本发明的另一实施方式中，附加疗法的给药方案包括普通肝素的施用。在优选实施方式中，所述普通肝素是从德国通益有限公司(ratiopharm GmbH)(乌尔姆，德国)可商购的普通肝素肝素钠25000德国通益(Heparin-Natrium-25000-ratiopharm)。附加疗法的给药方案优选包括普通肝素的多次施用，其中普通肝素的首次施用发生在移植后4到6天，优选在移植后5天。在更优选的实施方式中，附加疗法的给药方案包括普通肝素的多次施用，其中普通肝素的首次施用发生在移植后4到6天，优选在移植后5天，并且其中一次施用发生在随后的每天。普通肝素施用的优选剂量是每天每公斤体重480至960U。根据该实施方式的所有其他方面，普通肝素施用的优选途径是持续静脉内(i.v.)输注。因此，普通肝素优选地以每小时每公斤体重20-40U在一天24小时内持续施用。在本发明中，普通肝素用作抗凝剂。

在本发明的另一实施方式中，附加疗法的给药方案包括C1酯酶抑制剂的施用。在优选实施方式中，所述C1酯酶抑制剂是从德国杰特贝林生物制品有限公司(CSL BehringGmbH)(哈特斯海姆，德国)可商购的C1酯酶抑制剂Berinert。附加疗法的给药方案优选包括C1酯酶抑制剂的多次施用，其中首次施用发生在移植后1天内，优选在移植当天。在更优选实施方式中，附加疗法的给药方案包括C1酯酶抑制剂的多次施用，其中首次施用发生在移植后1天内，另一次施用发生在移植后6到8天之间，以及再一次施用发生在移植后13到15天之间。在最优选的实施方式中，附加疗法的给药方案包括C1酯酶抑制剂的多次施用，其中首次施用发生在移植当天，另一次施用发生在移植后7天，以及再一次施用发生在移植后14天。C1酯酶抑制剂施用的优选剂量为每公斤体重17.5U。根据该实施方式的所有其他方面，C1酯酶抑制剂施用的优选途径是静脉内(i.v.)短期输注。在本发明中，C1酯酶抑制剂用作补体抑制剂。

在本发明的另一实施方式中，附加疗法的给药方案包括更昔洛韦的施用。在优选实施方式中，所述更昔洛韦是从罗氏制药公司(格伦察赫-维伦，德国)可商购的更昔洛韦赛美维(Cymevene)。附加疗法的给药方案优选包括更昔洛韦的多次施用。在优选实施方式中，给药方案包括移植后每天的更昔洛韦施用。更昔洛韦施用的优选剂量为每公斤体重5mg。根据该实施方式的所有其他方面，更昔洛韦施用的优选途径是持续静脉内(i.v.)输注。在本发明中，更昔洛韦用于阻断灵长目动物巨环病毒(cyclomegalovirus)感染。

在本发明的另一实施方式中，附加疗法的给药方案包括头孢呋辛的施用。在优选实施方式中，所述头孢呋辛是从希克玛(Hikma)制药有限公司(马丁雷德，德国)可商购的头孢呋辛希克玛。附加疗法的给药方案优选包括头孢呋辛的多次施用。在优选实施方式中，给药方案包括移植后1天内的、优选在移植当天的头孢呋辛施用。在更优选的实施方式中，给药方案包括移植当天的头孢呋辛施用、以及随后每天直至(并且包括)移植后第5天的头孢呋辛施用。头孢呋辛施用的优选剂量为每公斤体重50mg。根据该实施方式的所有其他方面，头孢呋辛施用的优选途径是持续静脉内(i.v.)输注。在本发明中，头孢呋辛(头孢菌素)用作抵抗可能在手术期间感染的细菌感染的广泛抗生素预防(antibiotic prophylaxis)。

在本发明的另一实施方式中，附加疗法的给药方案包括倍他依泊汀的施用。在优选实施方式中，所述倍他依泊汀是从罗氏制药公司(格伦察赫-维伦，德国)可商购的倍他依泊汀NeoRecormon 5000IU。附加疗法的给药方案可以包括倍他依泊汀的单次施用或多次施用。在优选实施方式中，给药方案包括移植前6到8天的倍他依泊汀施用、以及移植前1天至移植后1天之间的倍他依泊汀施用。在更优选的实施方式中，给药方案包括移植前7天的倍他依泊汀施用、以及移植当天的倍他依泊汀施用。倍他依泊汀施用的优选剂量是2000U。根据该实施方式的其他所有方面，倍他依泊汀施用的优选途径是皮下(s.c.)或静脉内(i.v.)推注。在本发明中，促红细胞生成素(erythropoetin)用作刺激血红蛋白(Hemoglobulin)产生的激素(即，它可以抵消血液损失)。

在本发明的优选实施方式中，附加疗法的给药方案包括乙酰水杨酸、普通肝素、C1酯酶抑制剂、更昔洛韦、头孢呋辛和倍他依泊汀的施用。在该优选实施方式中，优选的乙酰水杨酸、优选的普通肝素、优选的C1酯酶抑制剂、优选的更昔洛韦、优选的头孢呋辛和优选的倍他依泊汀与上述相应实施方式描述的相同。此外，在该优选实施方式中，优选的频率、优选的时间点、优选的剂量和优选的施用途径也与上述相应实施方式描述的相同。

具有移植的心脏/肾脏/肺/肝脏的灵长目动物

本发明还涉及一种活的灵长目动物(例如，非人的活的灵长目动物)，其心脏/肾脏/肺/肝脏由来自异种哺乳动物的移植的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏功能性替代，其中，所述活的灵长目动物通过延长如上所述的心脏/肾脏/肺/肝脏移植以后灵长目动物的存活的方法是可获得的。

额外地，本发明涉及一种活的灵长目动物，其心脏/肾脏/肺/肝脏由来自异种哺乳动物的移植的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏功能性替代，其中所述活的灵长目动物的心脏/肾脏/肺/肝脏已经在超过40天前、超过50天前、超过60天前、超过70天前、超过80天前或超过90天前，优选在超过50天前，更优选在超过70天前，最优选在超过90天前被移植。

在一个实施方式中，活的灵长目动物属于猴科，优选属于狒狒属，更优选属于东非狒狒种或阿拉伯狒狒种，最优选属于东非狒狒种。在替代的实施方式中，活的灵长目动物属于猴科，优选属于猕猴属，最优选属于猕猴种。

在另一实施方式中，异种哺乳动物属于猪科，更优选属于猪属，甚至更优选属于野猪种，并且最优选属于家猪亚种。优选地，异种哺乳动物是具有德国长白猪/大白猪杂交遗传背景的猪、杜洛克猪、

根据本发明的心脏/肾脏/肺/肝脏是基因修饰的，从而避免活的灵长目动物的移植排斥。技术人员将知道取决于根据本发明的相应供体生物体和相应活的灵长目动物的合适的基因修饰。在一个实施方式中，活的灵长目动物的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏具有以下基因修饰：(1)α-1,3-半乳糖基转移酶基因的纯合敲除；(2)人CD46基因的插入；以及(3)人血栓调节蛋白基因的插入。当供体生物体属于猪科、并且活的灵长目动物属于狒狒属时，基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏可以任选地仅具有上述基因修饰(1)，即α-1,3-半乳糖基转移酶基因的纯合敲除。在另一实施方式中，活的灵长目动物的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏具有以下基因修饰：(1)α-1,3-半乳糖基转移酶基因、CMAH基因和B4GALNT2基因的纯合敲除；(2)人CD46基因、人CD55基因、人CD59基因、血红素氧合酶1基因和A20基因的插入；以及任选地(3)LEA基因或PDL-1(PD-L1、PDL1、CD274)基因的插入。该实施方式的基因修饰的细节可在参考文献23(以其整体并入本文中)中找到。在该实施方式中，血红素氧合酶1基因、A20基因、LEA基因以及PDL-1基因可以来自任何生物体，但是优选地它们分别是人血红素氧合酶1基因、人A20基因、人LEA基因以及人PDL-1基因。在上述实施方式中，当插入人CD46基因(huCD46)时，优选地表达根据以下基因组的基因座/编码区域产生的任何转录本的转录本：GRCH38p7、NC_000001、区域207752038-207795516。更优选地，当插入人CD46基因时，从转基因表达盒表达以下转录本的至少之一：NM_002389、NM_172359、NM_172351、NM_153826、NM_172352、NM_172353、NM_172350以及NM_172361。在上述实施方式中，当插入人血栓调节蛋白基因(huTHBD、huTBM)时，优选地表达根据以下基因组的基因座/编码区域产生的任何转录本的转录本：GRCH38p7、NC_000020、区域23045633-23049664。更优选地，当插入人血栓调节蛋白基因时，从转基因表达盒表达以下转录本：NM_000361。在上述实施方式中，当插入人CD55基因(huCD55)时，优选地表达根据以下基因组的基因座/编码区域产生的任何转录本的转录本：GRCH38p7、NC_000001、区域207321472-207360966。更优选地，当插入人CD55基因时，从转基因表达盒表达以下转录本的至少之一：NM_001114752、NM_001300903、NM_001300904、NM_000574以及NM_001300902。在上述实施方式中，当插入人CD59基因(huCD59)时，优选地表达根据以下基因组的基因座/编码区域产生的任何转录本的转录本：GRCH38p7、NC_000011、区域33703010-33736479。更优选地，当插入人CD59基因时，从转基因表达盒表达以下转录本的至少之一：NM_000611、NM_203331、NM_203329、NM_203330、NM001127227、NM_001127226、NM_001127225以及NM_001127223。在上述实施方式中，当插入人血红素氧合酶1基因(huHMOX1、huHO1)时，优选地表达根据以下基因组的基因座/编码区域产生的任何转录本的转录本：GRCH38p7、NC_000022、区域35381067-35394214。更优选地，当插入人血红素氧合酶1基因时，从转基因表达盒表达以下转录本：NM_002133。在上述实施方式中，当插入人A20基因(huA20、huTNFAIP3)时，优选地表达根据以下基因组的基因座/编码区域产生的任何转录本的转录本：GRCH38p7、NC_000006.12、区域137866317-137883314。更优选地，当插入人A20基因时，从转基因表达盒表达以下转录本的至少之一：NM_001270508；NM_001270507；NM_006290。如对本领域技术人员将是显而易见的，如本文中使用的术语“LEA基因”指的是人工CTLA4-Ig蛋白的合成序列编码，该CTLA4-Ig蛋白针对对CD80/CD86的高亲和力已经进行了优化。在上述实施方式中，当插入人LEA基因时，优选地例如从转基因表达盒，表达以下密码子优化的变体LEA29Y：

atgggggtactgctcacacagaggacgctgctcagtctggtccttgcactcctgtttccaagcatggcgagcatggcgatgcacgtggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtgagtatgcatctccaggcaaatatactgaggtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctacatgatggggaatgagttgaccttcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaaggactgagggccatggacacgggactctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacgagggcataggcaacggaacccagatttatgtaattgatccagaaccgtgcccagattctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatccccaccgtccccagcacctgaactcctggggggatcgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgggtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(SEQ ID NO:1)。

在上述实施方式中，当插入人PDL-1基因(huPD-L1、huPDL1、huCD274)时，优选表达根据以下基因组的基因座/编码区域产生的任何转录本的转录本：GRCH38p7、NC_000009、区域5450503-5470567。更优选地，当插入人PDL-1基因时，从转基因表达盒中表达以下转录本的至少之一：NM_014143；NM_001267706；NM_00134029。

如对本领域技术人员将是显而易见的，并且如从上面直接得出的，当提及根据本发明的“基因的插入”时，在优选实施方式中，没有插入整个基因。在该实施方式中，可以插入允许待表达的相应基因的转录本的任何序列(例如，在表达盒中)。

在可以与任何上述实施方式相结合的另一实施方式中，本发明的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏额外地具有编码人α1,2-岩藻糖基转移酶的序列的插入。优选地，人α1,2-岩藻糖基转移酶是从以下基因表达的蛋白：官方符号：FUT1；官方全名：岩藻糖基转移酶1(H血型)；主要来源：HGNC:HGNC:4012；参见相关：Ensembl：ENSG00000174951，MIM：211100。

在本发明中，当提及基因/序列的插入时，该插入可以是杂合或纯合插入。如对本领域技术人员将是显而易见的，如果杂合插入的表达水平不够高，则纯合插入是优选的。

优选地，根据本发明的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏是从基因修饰的供体生物体获得的，即从其生殖细胞系中携带相应基因修饰的供体生物体获得的。获得这样基因修饰的供体生物体(例如猪)的方法是本领域技术人员已知的。作为常规技术的替代，基因修饰的猪也可以使用新技术获得，例如CRISPR/CAS 9，其可以提供改进的插入基因座。

在具有移植的心脏的灵长目动物的一个实施方式中，根据本发明的活的灵长目动物的移植的心脏的左心室质量，等于或小于移植时同一心脏的左心室质量的150％。优选地，所述活的灵长目动物的移植的心脏的左心室质量，等于或小于移植时同一心脏的左心室质量的140％，更优选等于或小于移植时同一心脏的左心室重量的130％，甚至更优选等于或小于移植时同一心脏的左心室质量的120％，并且最优选等于或小于移植时同一心脏的左心室质量的110％。在该实施方式中，左心室(LV)质量、LV质量增加以及缩短分数(FS)被如下量化。定期在镇痛镇静(analgosedation)中进行经胸超声心动图，例如使用HPSonos 7500(惠普公司，帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国)；记录乳头肌短轴视图。在舒张末期和收缩末期，测量LV直径(LVEDD、LVESD)、舒张和收缩的室间隔(IVSd、IVSs)、后壁(posterior wall)厚度(PWd、PWs)；三次测量的平均值用于进一步的计算和可视化(Excel和PowerPoint，微软，雷德蒙德，华盛顿，美国)。使用以下公式1计算LV质量，使用以下公式2和3计算相对LV质量增加以及LV FS(参见参考文献11、12)。

(公式1)LV质量(g)＝0.8*(1.04([LVEDD+IVSd+PWd]

(公式2)LV质量增加(％)＝([LV质量

(公式3)FS(％)＝([LVEDD–LVESD]/LVEDD)*100

IVSd，舒张的室间隔厚度；IVSs，收缩的室间隔厚度；LVEDD，左心室舒张末期直径；LVESD，左心室收缩末期直径；PWd，舒张的后壁厚度；PWs，收缩的后壁厚度。

在一个实施方式中，根据本发明的具有移植的心脏/肾脏/肺/肝脏的灵长目动物的血小板计数在150-300g/l之间，优选在170-250g/l之间，更优选在180-230g/l之间。确定血小板计数的方法是本领域已知的。

在另一实施方式中，根据本发明的活的灵长目动物的胆红素水平等于或小于1.2mg/dl，优选等于或小于1.0mg/dl，更优选等于或小于0.8mg/dl，最优选等于或小于0.6mg/dl。确定胆红素水平的方法是本领域已知的。

在另一实施方式中，根据本发明的活的灵长目动物的肌钙蛋白T(hs)水平等于或小于0.3ng/ml，优选等于或小于0.2ng/ml，更优选等于或小于0.1ng/ml，最优选等于或小于0.014ng/ml。确定肌钙蛋白T(hs)水平的方法是本领域已知的。

在另一实施方式中，根据本发明的活的灵长目动物的LDH水平等于或小于1500U/l，优选等于或小于1000U/l，更优选等于或小于700U/l，最优选等于或小于500U/l。确定LDH水平的方法是本领域已知的。

用于在延长心脏/肾脏/肺/肝移植后灵长目动物的存活的方法中使用的mTOR抑制剂组合物

额外地，本发明涉及一种用于在延长受体生物体的存活的方法中使用的包括mTOR抑制剂的组合物，该受体生物体已经被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏，其中该供体生物体是哺乳动物，并且其中该受体生物体是灵长目动物。优选地，所述受体生物体已经被移植了基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏，使得其功能性替代受体生物体的心脏/肾脏/肺/肝脏。

由于其中使用包括mTOR抑制剂的组合物的方法类似于上述延长受体生物体的存活的方法，因此上述延长受体生物体的存活的方法的相应实施方式也是用于在延长受体生物体的存活的方法中使用的包括mTOR抑制剂的组合物的实施方式，反之亦然。特别地，供体生物体、受体生物体和基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏如上文针对延长受体生物体的存活的方法的相应实施方式所述。在另一优选实施方式中，其中使用mTOR抑制剂的方法将受体生物体的存活延长至移植后超过40天、至移植后超过50天、至移植后超过60天、至移植后超过70天、至移植后超过80天、或至移植后超过90天。优选地，其中使用mTOR抑制剂的方法将受体生物体的存活延长至移植后超过50天，更优选至移植后超过70天，并且最优选至移植后超过90天。

在一个实施方式中，根据本发明的包括mTOR抑制剂的组合物包括mTOR抑制剂，该mTOR抑制剂选自达托利塞(BEZ235、NVP-BEZ235)、雷帕霉素(西罗莫司)、依维莫司(RAD001)、AZD8055、替西罗莫司(CCI-779、NSC 683864)、SF2523、3BDO、PI-103、KU-0063794I、拓克尼布(PP242)、地磷莫司(地弗莫司、MK-8669)、沙帕替尼(INK128、MLN0128)、伏他利塞(SAR245409、XL765)类似物、托林1、奥米利塞(GSK2126458、GSK458)、OSI-027、PF-04691502、阿哌利塞(GDC-0980、RG7422)、GSK1059615、吉达利塞(PF-05212384、PKI-587)、WYE-354、维妥舍替(AZD2014)、托林2、WYE-125132(WYE-132)、BGT226(NVP-BGT226)、帕罗米德529(P529)、PP121、WYE-687、WAY-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、佐他莫司(ABT-578)、CZ415、MHY1485、伏他利塞(XL765、SAR245409)、大黄根酸和CC-223、LY3023414。在优选实施方式中，mTOR抑制剂是替西罗莫司。替西罗莫司是可商购的，例如辉瑞制药有限公司(柏林，德国)的驮瑞塞尔。如对本领域技术人员将是显而易见的，根据本发明的包括mTOR抑制剂的组合物可以额外地包括药学可接受载体和/或赋形剂。

优选地，根据本发明的包括mTOR抑制剂的组合物根据给药方案施用给受体生物体。更优选地，所述给药方案包括移植后组合物的施用。

在优选实施方式中，施用根据本发明的包括mTOR抑制剂的组合物的给药方案包括组合物的多次施用，其中首次施用发生在移植后10天内，优选在移植后2-9天之间，更优选在移植后4-7天之间。在更优选的实施方式中，施用包括mTOR抑制剂的组合物的给药方案包括组合物的多次施用，其中首次施用发生在移植后10天内，优选在移植后2-9天之间，更优选在4-7天之间，并且其中一次施用发生在随后的每天。如对技术人员将是显而易见的，mTOR抑制剂的首次施用的时间点取决于受体的总体状况(例如是否有心包积液/胸腔积液)。优选地，包括mTOR抑制剂的组合物施用的剂量被调节为5-10ng/ml雷帕霉素的谷浓度。根据该实施方式的所有其他方面，施用的优选途径是静脉内(i.v.)短期输注。施用根据本发明的包括mTOR抑制剂的组合物的特别优选的给药方案如图7所绘。

在本发明的一个实施方式中，根据本发明的用于在延长受体生物体的存活的方法中使用的包括mTOR抑制剂的组合物，施用给已经根据给药方案接受了免疫抑制诱导疗法的受体生物体，和/或施用给正在根据相应给药方案接受免疫抑制维持疗法、抗炎疗法、抗高血压剂和/或附加疗法的受体生物体。考虑到本发明人已经发现，移植后将一种或多种抗高血压剂施用给受体、移植后将mTOR抑制剂施用给受体、以及移植后早期减少作为免疫抑制维持疗法的一部分施用的糖皮质激素的剂量防止受体生物体中供体心脏的过度生长，根据本发明的用于在延长受体生物体的存活的方法中使用的包括mTOR抑制剂的组合物，优选地施用给正在根据相应给药方案接受免疫抑制维持疗法和抗高血压剂的受体生物体。任何上述治疗的相应给药方案及其(优选)实施方式如上文针对延长受体生物体的存活的方法所述。如对技术人员将是显而易见的，如果受体生物体正在根据相应给药方案接受上述治疗之一，则所述给药方案中包括的首次施用已经发生。优选地，如果受体生物体正在根据给药方案接受免疫抑制维持疗法，并且如果所述给药方案包括在某段时间内将糖皮质激素的剂量(mg/kg/天)减少特定倍数，则这种减少已经发生。

在本发明的另一实施方式中，用于在延长受体生物体的存活的方法中使用的包括mTOR抑制剂的组合物施用给受体生物体，该受体生物体的来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏在移植前已经通过非缺血性保存、优选通过非缺血性心脏/肾脏/肺/肝脏灌注而保存，例如，如上文针对延长受体生物体的存活的方法所述。

用于在延长心脏/肾脏/肺/肝脏移植后灵长目动物的存活的方法中使用的抗高血压剂组合物

额外地，本发明涉及一种用于在延长受体生物体的存活的方法中使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，该受体生物体已经被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏，其中该供体生物体是哺乳动物，并且其中该受体生物体是灵长目动物。优选地，所述受体生物体已经被移植了基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏，使得其功能性替代受体生物体的心脏/肾脏/肺/肝脏。

由于其中使用包括一种或多种抗高血压剂的组合物的方法类似于上述延长受体生物体的存活的方法，因此上述延长受体生物体的存活的方法的相应实施方式也是用于在延长受体生物体的存活的方法中使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物的实施方式。特别地，供体生物体、受体生物体和基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏如上文针对延长受体生物体的存活的方法的相应实施方式所述。在另一优选实施方式中，其中使用一种或多种抗高血压剂的方法将受体生物体的存活延长至移植后超过40天、至移植后超过50天、至移植后超过60天、至移植后超过70天、至移植后超过80天、或至移植后超过90天。优选地，其中使用一种或多种抗高血压剂的方法将受体生物体的存活延长至移植后超过50天，更优选地至移植后超过70天，并且最优选地至移植后超过90天。

在一个实施方式中，根据本发明的包括一种或多种抗高血压剂的组合物包括一种或多种抗高血压剂，所述抗高血压剂选自：利尿剂，例如髓袢利尿剂呋塞米和依他尼酸、噻嗪/类噻嗪利尿剂氢氯噻嗪和吲达帕胺、以及保钾利尿剂氨苯蝶啶和阿米洛利；钙通道阻断剂，例如二氢吡啶类氨氯地平和硝苯地平、以及非二氢吡啶类维拉帕米和地尔硫卓；血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，例如依那普利和雷米普利；血管紧张素II受体拮抗剂，例如缬沙坦和坎地沙坦；肾上腺素能受体拮抗剂，例如β阻断剂比索洛尔和美托洛尔、α阻断剂多沙唑嗪和酚苄明、以及混合的α/β阻断剂卡维地洛和拉贝洛尔；血管扩张剂，例如硝普钠和肼苯哒嗪；肾素抑制剂，例如阿利吉仑；醛甾酮受体拮抗剂，例如螺内酯和依普利酮；α-2肾上腺素能受体激动剂，例如可乐定和甲基多巴；和内皮素受体阻断剂，例如波生坦。在优选实施方式中，包括一种或多种抗高血压剂的组合物包括选自血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂和肾上腺素能受体拮抗剂的一种或多种抗高血压剂。

在本发明的优选实施方式中，根据本发明的包括一种或多种抗高血压剂的组合物包括血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，优选依那普利。依那普利是可商购的，例如赫素制药集团(霍尔茨基兴，德国)的Enahexal。在本发明的另一优选实施方式中，根据本发明的包括一种或多种抗高血压剂的组合物包括肾上腺素能受体拮抗剂，优选酒石酸美托洛尔。酒石酸美托洛尔是可商购的，例如阿斯利康股份有限公司(韦尔德，德国)的Beloc i.v.。在另一优选实施方式中，根据本发明的包括一种或多种抗高血压剂的组合物包括：血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，优选是依那普利；以及肾上腺素能受体拮抗剂，优选酒石酸美托洛尔。

如对技术人员将是显而易见的，根据本发明的包括一种或多种抗高血压剂的组合物可以额外地包括药学可接受载体和/或赋形剂。

优选地，根据本发明的包括一种或多种抗高血压剂的组合物根据给药方案施用给受体生物体。更优选地，所述给药方案包括移植后组合物的施用。

在优选实施方式中，施用包括一种或多种抗高血压剂的组合物的给药方案包括组合物的多次施用，其中一次施用发生在移植后2天内，优选在移植后1天内。在更优选的实施方式中，施用包括一种或多种抗高血压剂的组合物的给药方案包括组合物的多次施用，其中一次施用发生在移植后2天内，优选在移植后1天内，并且其中一次施用发生在随后的每天。根据该实施方式的所有其他方面，施用包括一种或多种抗高血压剂的组合物的优选途径是静脉内(i.v.)施用。

优选地，包括一种或多种抗高血压剂的组合物的剂量被调节为使得受体生物体的平均动脉压保持在70-90mmHg的范围内，优选在75-85mmHg的范围内。甚至更优选地，剂量被调节为使得受体生物体的平均动脉压保持在70-90mmHg的范围内、优选在75-85mmHg的范围内，并且使得心率保持在80-120bpm的范围内、优选在90-110bpm的范围内。施用根据本发明的包括一种或多种抗高血压剂的组合物的特别优选的给药方案如图9所绘。

在本发明的一个实施方式中，用于在延长受体生物体的存活的方法中使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，施用给已经根据给药方案接受了免疫抑制诱导疗法的受体生物体，和/或施用给正在根据相应给药方案接受免疫抑制维持疗法、抗炎疗法、mTOR抑制剂和/或附加疗法的受体生物体。考虑到本发明人已经发现，移植后将一种或多种抗高血压剂施用给受体、移植后将mTOR抑制剂施用给受体、以及移植后早期减少作为免疫抑制维持疗法的一部分施用给受体的糖皮质激素的剂量防止受体生物体中供体心脏的过度生长，根据本发明的用于在延长受体生物体的存活的方法中使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，优选施用给正在根据相应给药方案接受免疫抑制维持疗法和mTOR抑制剂的受体生物体。任何上述治疗的相应给药方案及其(优选)实施方式如上文针对延长受体生物体的存活的方法所述。如对技术人员将是显而易见的，如果受体生物体正在根据相应给药方案接受上述治疗之一，则所述给药方案中包括的首次施用已经发生。优选地，如果受体生物体正在根据给药方案接受免疫抑制维持疗法，并且如果所述给药方案包括在某段时间内将糖皮质激素的剂量(mg/kg/天)减少特定倍数，则这种减少已经发生。

在本发明的另一实施方式中，用于在延长受体生物体的存活的方法中使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物施用给受体生物体，该受体生物体的来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏已经在移植前通过非缺血性保存、优选通过非缺血性心脏/肾脏/肺/肝脏灌注而保存，例如，如上文针对延长受体生物体的存活的方法所述。

防止或治疗心脏/肾脏/肺/肝脏衰竭的方法，通过这种方法获得的灵长目动物以及用于在这种方法中使用的组合物

本发明还涉及一种防止或治疗受体生物体中心脏/肾脏/肺/肝脏衰竭的方法，该受体生物体被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏，其中所述方法包括上文针对延长被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体的存活的方法所述的所有步骤和优选实施方式。

本发明还涉及一种活的灵长目动物，其心脏/肾脏/肺/肝脏由来自异种供体哺乳动物的移植的、基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏功能性替代，其中所述活的灵长目动物通过上述防止或治疗被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体中心脏/肾脏/肺/肝脏衰竭的方法是可获得的。所述活的灵长目动物及其优选实施方式，如上文针对通过延长被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体的存活的方法可获得的活的灵长目动物所述。

本发明还涉及一种用于在防止或治疗受体生物体中心脏/肾脏/肺/肝脏衰竭的方法中使用的包括mTOR抑制剂的组合物，该受体生物体已经被移植了来自异种供体生物的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏，其中该供体生物体是哺乳动物，并且其中该受体生物体是灵长目动物。所述包括mTOR抑制剂的组合物及其优选实施方式，如上文针对用于在延长被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体的存活的方法中使用的包括mTOR抑制剂的组合物所述。

本发明还涉及一种用于在防止或治疗受体生物体中心脏/肾脏/肺/肝脏衰竭的方法中使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，该受体生物体已经被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏，其中该供体生物体是哺乳动物，并且其中该受体生物体是灵长目动物。所述包括一种或多种抗高血压剂的组合物及其优选实施方式，如上文针对用于在延长被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体的存活的方法中使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物。

治疗被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体的方法，通过这种方法获得的灵长目动物和用于在这种方法中使用的组合物

本发明还涉及一种治疗受体生物体的方法，该受体生物体被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏，其中所述方法包括上文针对延长被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体的存活的方法所述的所有步骤和优选实施方式。

本发明还涉及一种活的灵长目动物，其心脏/肾脏/肺/肝脏由来自异种哺乳动物的移植的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏功能性替代，其中所述活的灵长目动物通过上述治疗被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体的方法是可获得的。所述活的灵长目动物及其优选实施方式如上文针对通过延长被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体的存活的方法可获得的活的灵长目动物所述。

本发明还涉及一种用于在治疗受体生物体的方法中使用的包括mTOR抑制剂的组合物，该受体生物体已经被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏，其中该供体生物体是哺乳动物，并且其中该受体生物体是灵长目动物。所述包括mTOR抑制剂的组合物及其优选实施方式如上文针对用于在延长已经被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体的存活的方法中使用的包括mTOR抑制剂的组合物所述。

本发明还涉及一种用于在治疗受体生物体的方法中使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，该受体生物体已经被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏，其中该供体生物体是哺乳动物，并且其中该受体生物体是灵长目动物。所述包括一种或多种抗高血压剂的组合物及其优选实施方式如上文针对用于在延长已经被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体的存活的方法使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物所述。

防止被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体中心脏/肾脏/肺/肝脏过度生长的方法，通过这种方法获得的灵长目动物和用于在这种方法中使用的组合物

当来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏被移植到受体生物体中时，受体生物体中移植的心脏/肾脏/肺/肝脏的过度生长是一个主要问题。过度生长指的是对器官或组织功能有害的、器官或组织质量或体积的任何增加，特别是由于外源性因素(例如，由于空间限制的压缩)或者由于内源性因素(例如，由于微脉管循环不足导致的缺氧)。在一个实施方式中，心脏过度生长意味着移植的心脏的体积和重量在移植后约一个月内增加至三到四倍。周围的解剖结构、受体的胸部最终限制了这种扩张。结果，心脏功能严重受限；血液流动受限、受阻、积压(backlogged)、充血(congested)。因为肝脏在血液动力学上是心脏下方(后面)的第一个器官，因此肝脏功能首先受损。受体屈从于终末的心脏和肝脏功能障碍。过度生长的原因是哺乳动物的心脏(例如，猪心脏)在供体中快速生长(意味着，与可能在移植时约20kg的快速生长的全身成比例地)。波士顿哈佛(Boston Harvard)小组在肾脏和肺移植后也观察到了这种现象，并称其为“内在生长”(心脏在身体发育时必须迅速生长；即使移植到灵长目动物的体内，心脏也不会停止生长；参见参考文献15)。

本发明人已经发现，特别是移植后将一种或多种抗高血压剂施用给受体，移植后将mTOR抑制剂施用给受体、以及移植后早期快速减少作为免疫抑制维持疗法的一部分施用给受体的糖皮质激素的剂量防止受体生物体中供体心脏的过度生长(参见，例如图5和6)。因此，本发明还涉及一种防止被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体中心脏/肾脏/肺/肝脏过度生长的方法，其中所述方法包括上文针对延长被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体的存活的方法所述的所有步骤和优选实施方式。

本发明还涉及一种活的灵长目动物，其心脏/肾脏/肺/肝脏由来自异种哺乳动物的移植的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏功能性替代，其中所述活的灵长目动物通过上述防止被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体中心脏/肾脏/肺/肝脏过度生长的方法是可获得的。所述活的灵长目动物及其优选实施方式如上文针对通过延长被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体的存活的方法可获得的活的灵长目动物所述。

本发明还涉及一种用于在防止受体生物体中心脏/肾脏/肺/肝脏过度生长的方法中使用的包括mTOR抑制剂的组合物，该受体生物体已经被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏，其中该供体生物体是哺乳动物，并且其中该受体生物体是灵长目动物。所述包括mTOR抑制剂的组合物及其优选实施方式如上文针对用于在延长已经被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体的存活的方法中使用的包括mTOR抑制剂的组合物所述。

本发明还涉及一种用于在防止受体生物体中心脏/肾脏/肺/肝脏过度生长的方法中使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物，该受体生物体已经被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏，其中该供体生物体是哺乳动物，并且其中该受体生物体是灵长目动物。所述包括一种或多种抗高血压剂的组合物及其优选实施方式如上文针对用于在延长已经被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏的受体生物体的存活的方法中使用的包括一种或多种抗高血压剂的组合物所述。

本发明对其他器官的异种移植的适用性

如上所述，波士顿哈佛小组在肾脏和肺移植后也观察到了受体中供体器官过度生长的现象(参见参考文献15)。这些移植的受体将患上相应的绝症。因此，本发明中描述的方法(特别是移植后将一种或多种抗高血压剂施用给受体、移植后将mTOR抑制剂施用给受体、以及移植后早期减少作为免疫抑制维持疗法的一部分施用给受体的糖皮质激素的剂量)对任何异种器官移植，包括肾脏移植、肺移植和肝脏移植都是有用的。例如，所提出的技术也应在临床前肾脏、肺(以及肝脏)移植后的恒河猴中起作用(参见参考文献15)。

基因修饰的哺乳动物及其生产方法

牲畜物种的基因工程和基因组编辑的重大进展已将其用途扩展到生物医学应用，其中最引人注目的是：为转化医学(translational medicine)量身定制的大型动物模型；用于异种移植的猪细胞、组织和器官；以及在转基因大型动物中药物蛋白的生产。新发现从基础研究到临床应用的转化是一个漫长的、通常效率低下且成本高昂的过程。合适的动物模型对于转化研究的成功至关重要。尽管啮齿动物模型被广泛使用，但是它们通常不能准确地代表人类疾病。因此，需要更接近地模仿人体解剖学和生理学方面的额外的动物模型。已经产生了几种基因工程的猪模型，相较于现有的啮齿动物模型，其中许多模型更接近地代表了人类疾病机制和表型。此外，猪是用于异种移植的最有希望的供体物种。因为需要多种基因修饰来防止免疫排斥、克服异种器官的生理学不相容性、以及消除潜在的风险因素例如猪内源性逆转录病毒(PERV)，因此基因组编辑正在加快该领域的进展。最后但并非最不重要的一点是，尽管市场上只有很少的此类产品，但作为生产药物蛋白的生物反应器的大型动物物种的基因工程仍然是一个感兴趣的选择。总之，基因工程化的大型动物在生物医学中发挥着越来越重要的作用。对于所有应用领域，一致且可靠的转基因表达对于基因工程化的猪的价值至关重要。本发明提供了具有一致且可靠的转基因表达的基因修饰的哺乳动物。

在本文所述的延长受体生物体的存活的方法中，所述受体生物体被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏。类似地，上述活的灵长目动物已经被移植了来自异种哺乳动物的基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏，并且上述包括mTOR抑制剂/抗高血压剂的组合物用于在延长已经被移植了来自异种供体生物体的基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏的受体生物体的存活的方法中使用。在一个实施方式中，本文提供的具有一致且可靠的转基因表达的基因修饰的哺乳动物可以用作该基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏的异种供体生物体。

随机插入到基因组中的转基因的表达在很大程度上取决于邻近染色质的环境。这些所谓的位置效应导致不同转基因系(transgenic line)之间的可变转基因表达，并且通常导致一个系内的不一致表达。避免随机转基因插入的这些缺点的策略是将表达盒靶向放置到具有开放配置(configuration)并确保稳定转基因表达的所谓“安全港”基因座中。最突出的例子是小鼠中的Rosa26基因座，该基因座也已在猪中发现并使用(参见参考文献27)。本发明提供了GGTA1基因座，作为可靠的转基因表达的有利安全港。尤其是，这提供了以下优点：

i)GGTA1在多种组织和细胞类型中被高度表达，最重要的是在内皮细胞中：在猪的内皮野生型细胞中，CMAH的转录水平与B4GALNT2的转录水平相似，而GGTA1的转录水平高约5倍(也参考实施例6)；

ii)GGTA1对于正常发育是不必要的，如缺乏GGTA1的人类和旧大陆猴(Old Worldmonkeys)、以及GGTA1基因敲除猪的多系所证明的；

iii)使用靶向核酸酶的GGTA1的突变是非常有效的，甚至是在注射到卵母细胞中后(参见参考文献28)；

iv)为了生产用于异种移植的供体猪，无论如何，优选地灭活GGTA1，从而避免猪到灵长目动物异种移植体的超急性排斥；以及

v)异种保护性转基因到GGTA1基因座的靶向整合防止它们在繁育期间的分离。

鉴于以上所述，本发明提供了一种基因修饰的哺乳动物，其中转基因在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(GGTA1)基因座处被插入，并且其中转基因的至少之一在α-1,3-半乳糖基转移酶基因的内源启动子的控制下表达。

超过40种不同的基因修饰已经被引入猪中，以防止异种移植体的免疫排斥、克服生理学不相容性并且降低传播人畜共患病(zoonotic)病原体的风险(参见参考文献29)。可以通过“组合工程(combineering)”和基因堆叠，即在单个基因组的基因座处随机或靶向放置多个表达盒，来克服结合多个转基因以使实际的动物繁育成为可能、避免独立整合位点的分离的挑战(参见参考文献23、30)。因此，本发明提供了一种基因修饰的哺乳动物，其中多个转基因在相同基因座处、即在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(GGTA1)基因座处被插入。

在GGTA1基因座处插入转基因破坏了GGTA1基因，并因此废止了α-1,3-半乳糖基转移酶的表达。在根据本发明移植的基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏中，GGTA1的破坏是优选的，因为它有助于避免异种移植体的超急性排斥。猪到灵长目动物异种移植体的超急性排斥通过预先形成的抗体与特异性异种抗原的结合引发。由于异种移植体上的调节剂与受体的效应器分子之间的物种不相容性，补体系统的随后的激活无法控制(在参考文献31中综述的)。主要的异种抗原是半乳糖-α1,3-半乳糖(αGal)，其通过N-乙酰乳糖铵α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)合成。这种酶在人类和旧大陆猴中是有缺陷的，因此αGal是不存在的。与肠道中细菌αGal表位的免疫原性接触导致人类和旧大陆猴在生命早期产生抗αGal抗体。

插入到GGTA1基因座中的转基因是人补体调节蛋白转基因(即，编码人补体调节蛋白的序列)和人血栓调节蛋白转基因(即，编码人血栓调节蛋白的序列)。人补体调节蛋白在转基因供体哺乳动物(例如，猪)中的表达是满足需要的，从而克服哺乳动物(例如，猪)到灵长目动物异种移植体的超急性排斥。人补体调节蛋白减弱了补体激活并且显著地延长了哺乳动物(例如，猪)到灵长目动物异种移植体的存活(在参考文献29中综述的)。根据本发明的示例性人补体调节蛋白是CD46(膜辅蛋白；MCP)、CD55(补体衰变加速因子，DAF)和CD59(膜反应性溶解抑制物，MIRL)。根据本发明的特别优选的人补体调节蛋白是CD46。然而，根据本发明的基因修饰的哺乳动物也可以具有全部插入到GGTA1基因座中的CD46、CD55和CD59。

在临床前哺乳动物(例如，猪)到非人灵长目动物异种移植中，凝血调节异常和止血功能障碍是常见的并发症(在参考文献32中综述的)。临床表现的范围从急性危及生命的消耗性凝血病伴血小板减少和出血，到导致异种移植体损失的血栓性微血管病。提出的病因包括炎症，血管损伤，先天的、体液的和细胞的免疫应答，尤其是哺乳动物(例如，猪)和灵长目动物凝血调节剂之间的分子不相容性(参见参考文献33)。人血栓调节蛋白(hTM)是一种关键的内皮抗凝血/抗血栓形成蛋白，可通过供体哺乳动物(例如，猪)的基因工程进行补充。猪TM结合人凝血酶，但对人蛋白C的激活来说是一个差的辅因子(参见参考文献34)。为了克服这个问题，可以在不同的启动子下生产表达人TM的转基因哺乳动物系(例如，猪)：CMV(参见参考文献35)、CAGGS(参见参考文献36)、人ICAM(参见参考文献5)以及猪THBD(参见参考文献37)。在异位腹部移植到狒狒中进行适当的免疫抑制(用抗胸腺细胞球蛋白和抗CD20抗体诱导，用霉酚酸酯和大剂量的抗CD40(2C10R4)抗体维持)后，具有后者hTM表达载体的GGTA1敲除的hCD46转基因猪心脏存活超过900天(参见参考文献5)。

根据本发明的基因修饰的哺乳动物可以具有额外的基因修饰。在一个实施方式中，根据本发明的基因修饰的哺乳动物额外地具有CMAH和B4GALNT2基因的纯合敲除。胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(Cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acidhydroxylase，CMAH)合成N-乙酰神经氨酸(Neu5Gc，也称为Flanganutziu-Deicher抗原)，猪β-1,4-N-乙酰-半乳糖胺基转移酶2(B4GALNT2)生成Sd(a)样聚糖。两者都是其他突出的异种抗原(在参考文献38中综述的)。与仅缺乏GGTA1和CMAH的细胞相比，来自GGTA1/CMAH/B4GALNT2缺陷性猪的细胞显示出降低的人IgM和IgG结合。

在另一实施方式中，根据本发明的基因修饰的哺乳动物额外地具有编码血红素氧合酶1(优选人血红素氧合酶1)的序列的插入和编码A20(优选人类A20)的序列的插入。优选地，这些插入也在GGTA1基因座处。

在另一实施方式中，根据本发明的基因修饰的哺乳动物额外地具有编码LEA29Y或PD-L1(优选人PD-L1)的序列的插入。优选地，这些插入也在GGTA1基因座处。在另一实施方式中，根据本发明的基因修饰的哺乳动物额外地具有编码人α1,2-岩藻糖基转移酶的序列的插入。优选地，这些插入也在GGTA1基因座处。

在根据本发明的基因修饰的哺乳动物中，编码人补体调节蛋白的序列以及编码人血栓调节蛋白的序列在α-1,3-半乳糖基转移酶基因基因座处被插入，使得至少编码人补体调节蛋白的序列在α-1,3-半乳糖基转移酶基因的内源性启动子的控制下表达。如上所述，GGTA1在多种组织和细胞类型中被高度表达，最重要的是在内皮细胞中被表达。因此，将编码人补体调节蛋白的序列插入到GGTA1基因座中使得其在α-1,3-半乳糖基转移酶基因的内源性启动子的控制下表达，确保了人补体调节蛋白被高度表达。

在根据本发明的基因修饰的哺乳动物的另一实施方式中，编码人补体调节蛋白的序列和编码人血栓调节蛋白的序列都被插入，使得它们在α-1,3-半乳糖基转移酶基因的内源性启动子的控制下表达，从而使这两个基因在多种组织和细胞类型中都被高度表达。人补体调节蛋白和人血栓调节蛋白在多种组织和细胞类型中的表达，确保了根据本发明的基因修饰的哺乳动物可以用作各种器官，即基因修饰的心脏、肾脏、肺或肝脏中的每一种，的异种供体生物体。

在根据本发明的基因修饰的哺乳动物的替代的实施方式中，编码人补体调节蛋白的序列在α-1,3-半乳糖基转移酶基因的内源性启动子的控制下被表达，并且编码人血栓调节蛋白的序列在猪THBD启动子或外源性启动子的控制下被表达。例如，外源性启动子可以是CMV启动子、CAGGS启动子或人ICAM启动子。优选地，这种外源性启动子是普遍活跃的启动子，即在多种组织和细胞类型中被表达的启动子。再次，编码人血栓调节蛋白的序列在多种组织和细胞类型中的表达，确保了根据本发明的基因修饰的哺乳动物可以用作各种器官的异种供体生物体。

在根据本发明的基因修饰的哺乳动物的另一实施方式中，基因修饰的哺乳动物额外地具有可选标记基因序列在编码人补体调节蛋白的序列和编码人血栓调节蛋白的序列之间的插入。优选地，该可选标记基因序列位于loxP位点的侧面。这确保了来自基因修饰的哺乳动物的细胞可以被分离并用于额外的表达载体的靶向整合。可以通过与含有一个或多个额外转基因的工程细菌人工染色体(BAC)的Cre介导的盒式交换，插入额外的表达载体(参见图18)。

在根据本发明的基因修饰的哺乳动物的另一实施方式中，基因修饰的哺乳动物属于猪科，优选属于猪属，更优选属于野猪种，并且最优选属于家猪亚种。在根据本发明的基因修饰的哺乳动物的优选实施方式中，基因修饰的哺乳动物属于野猪种。

在根据本发明的基因修饰的哺乳动物的另一实施方式中，基因修饰的哺乳动物为具有德国长白猪/大白猪杂交遗传背景的猪、杜洛克猪、

在根据本发明的基因修饰的哺乳动物的另一实施方式中，基因修饰的哺乳动物(例如，猪)没有猪内源性逆转录病毒C(PERV-C)。猪内源性逆转录病毒(PERV)无法轻易消除，因为它们被整合到猪基因组中，因此构成了最难以控制的风险来源(在参考文献39中综述的)。PERV-A和PERV-B能够感染某些人类肿瘤细胞，并且能够在较小程度上感染人类原代细胞(primary cell)。PERV-C仅感染猪细胞，但是带有PERV-A的重组体可以感染人类细胞，并且具有高复制率的特征。由于并非所有猪都存在PERV-C，因此有可能鉴定并选择没有PERV-C的动物作为潜在供体。特别是在根据本发明的基因修饰的哺乳动物(例如，猪)用作待移植到灵长目动物中的器官的异种供体生物体时，这是优选的。

本发明还提供了一种形成基因修饰的哺乳动物的方法，该哺乳动物可以用作移植到灵长目动物中的器官的异种供体生物体。该方法包括：在哺乳动物基因组的α-1,3-半乳糖基转移酶基因基因座处插入编码人补体调节蛋白的序列和编码人血栓调节蛋白的序列，以提供基因修饰的基因组；将基因修饰的基因组引入到细胞中；以及使包括基因修饰的基因组的细胞成熟为基因修饰的哺乳动物。优选地，该基因组是体细胞基因组，并且基因修饰的基因组通过体细胞核转移引入到细胞中(有关如何获得这种基因修饰的哺乳动物的详细信息，例如参见参考文献92，其全部内容并入本文中)。

在根据本发明的形成基因修饰的哺乳动物的方法的一个实施方式中，编码人补体调节蛋白的序列和编码人血栓调节蛋白的序列位于插入到α-1,3-半乳糖基转移酶基因基因座中的单个表达载体上。优选地，插入到α-1,3-半乳糖基转移酶基因基因座中的表达载体额外地包括在编码人补体调节蛋白的序列和编码人血栓调节蛋白的序列之间的可选标记基因序列。如技术人员将已知的，该标记基因序列允许选择包括基因修饰的基因组的细胞。

在根据本发明的形成基因修饰的哺乳动物的方法的另一实施方式中，该方法还包括插入编码人α1,2-岩藻糖基转移酶的序列，和/或将一种或多种额外的基因修饰引入到哺乳动物基因组中。当这些基因修饰为插入时，优选地序列在GGTA1基因座处被插入。甚至更优选地，根据本发明，待插入的序列，与编码人补体调节蛋白的序列和编码人血栓调节蛋白的序列一起，位于被插入到α-1,3-半乳糖基转移酶基因基因座中的单个表达载体上。

在根据本发明的形成基因修饰的哺乳动物的方法的优选实施方式中，利用CRISPR/Cas9引入基因修饰。CRISPR/Cas9允许基因组内基因的靶向插入和/或删除。替代地，可以使用锌指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFN)或转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)引入基因修饰。在参考文献107中描述了这些技术的使用，其全部内容并入本文中。

上文针对根据本发明的基因修饰的哺乳动物描述的实施方式也适用于根据本发明的形成基因修饰的哺乳动物的方法，细节上作必要修改。特别地，在根据本发明的形成基因修饰的哺乳动物的方法的优选实施方式中，哺乳动物属于野猪种。

对于根据本发明的基因修饰的哺乳动物和根据本发明的形成基因修饰的哺乳动物的方法，与上述插入到基因修饰的哺乳动物中的序列有关的细节，可在与根据本发明的延长心脏/肾脏/肺/肝脏移植后灵长目动物的存活的方法有关的部分中、以及与根据本发明的具有移植的心脏/肾脏/肺/肝脏的灵长目动物有关的部分中找到。特别地，在插入这些部分中描述的基因时优选表达的转录本也是在将相应的序列插入到根据本发明的基因修饰的哺乳动物中时优选表达的转录本。

在根据本发明的基因修饰的哺乳动物的一个实施方式中，基因修饰的哺乳动物具有一种或多种额外的基因修饰。类似的，在根据本发明的形成基因修饰的哺乳动物的方法的一个实施方式中，该方法还包括引入一种或多种额外的基因修饰。当基因修饰的哺乳动物被期望用作用于异种移植的基因修饰器官的异种供体生物体时，这些一种或多种额外的基因修饰优选自：(1)克服哺乳动物(例如，猪)到灵长目动物异种移植体的超急性和急性血管排斥的基因修饰；(2)克服哺乳动物(例如，猪)到灵长目动物异种移植体的细胞排斥的基因修饰；(3)克服凝血调节异常和炎症的基因修饰；和/或(4)减少人畜共患病风险的基因修饰。在优选实施方式中，当这些基因修饰代表基因插入时，它们在GGTA1基因座处。根据本发明的以上几组潜在的基因修饰在下文中被描述，特别是关于猪到灵长目动物异种移植。任何这些基因修饰可以是根据本发明的一种或多种额外的基因修饰：

(1)克服猪到灵长目动物异种移植体的超急性和急性血管排斥的基因修饰

猪到灵长目动物异种移植体的超急性排斥通过预先形成的抗体与特异性异种抗原的结合引发。由于异种移植体上的调节剂与受体的效应器分子之间的物种不相容性，补体系统的随后的激活无法控制(在参考文献31中综述的)。主要的异种抗原是半乳糖-α1,3-半乳糖(αGal)，其通过N-乙酰乳糖铵α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)合成。这种酶在人类和旧大陆猴中是有缺陷的，因此αGal是不存在的。与肠道中细菌aGal表位的免疫原性接触导致人类和旧大陆猴在生命早期产生抗aGal抗体。其他突出的异种抗原是通过胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)合成的N-乙酰神经氨酸(Neu5Gc，也称为Flanganutziu-Deicher抗原)、以及由猪β-1,4-N-乙酰-半乳糖胺基转移酶2(B4GALNT2)形成的Sd(a)样聚糖(在参考文献38中综述的)。克服猪到灵长目动物异种移植体的超急性排斥的第一步是单独或组合地表达人补体调节蛋白的转基因供体猪的生产，人补体调节蛋白例如CD46(膜辅蛋白；MCP)、CD55(补体衰变加速因子补体，DAF)、CD59(膜反应性溶解抑制物，MIRL)。参考文献113对CD46转基因猪进行了表征。这些转基因供体猪减弱了补体激活并且显著地延长了猪到灵长目动物异种移植体的存活(在参考文献29中综述的)。血管化的(vascularised)猪到灵长目动物移植体的长期存活的主要步骤是猪GGTA1基因的灭活。在首次发表GGTA1(以及因此而导致的αGal)缺陷性猪(参见参考文献40)之后，最初通过基因靶向(在参考文献41中综述的)、随后通过基因编辑(例如，参见参考文献42)生产了多个GGTA1敲除猪系。为了移除Neu5Gc异种抗原，缺乏CMAH的猪被生产(参见参考文献43)并与GGTA1缺陷相结合(参见参考文献44-46)。猪B4GALNT2基因也被灭活以消除Sd(a)样异种抗原(参见参考文献47)。作者表明，与仅缺乏GGTA1和CMAH的细胞相比，来自GGTA1/CMAH/B4GALNT2缺陷性猪的细胞显示出降低的人IgM和IgG结合。

(2)克服猪到灵长目动物异种移植体的细胞排斥的基因修饰

细胞免疫系统的先天性和适应性成分都有助于异种移植体排斥(在参考文献48中综述的)。组织和实体器官异种移植体的免疫细胞浸润开始于中性粒细胞，然后是巨噬细胞和T细胞(在参考文献49中综述的)。另外，自然杀伤(natural killer，NK)细胞可直接以及通过抗体依赖性细胞毒性来诱导移植体(参见参考文献50)和裂解猪细胞(在参考文献51中综述的)中的内皮细胞活化。

非人灵长目动物中的细胞异种移植体，如猪胰岛，主要被CD4+T细胞排斥。CD4+T细胞的激活可以通过灵长目动物T细胞受体与猪细胞的SLA 1类和2类分子的直接结合诱导，或者通过表达具有经加工异种抗原的MHC的受体的抗原递呈细胞(APC)间接诱导(在参考文献49中综述的)。除这种T细胞受体介导的信号之外，T细胞激活还受到共刺激信号的调节，该共刺激信号可能—取决于其性质—诱发并放大有效的免疫应答，或表现出抑制性致耐受性功能(inhibitory tolerogenic function)。在异种移植的情况下，研究最好的T细胞共刺激信号复合物是CD80/CD86-CD28和CD40-CD154，CD28和CD154(＝CD40L)定位在T细胞上，而CD80/CD86和CD40定位在APC上。CD80/CD86-CD28共刺激途径可通过用CTLA4-lg(阿巴西普

表达人TNF相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)(参见参考文献56、57)、人FAS配体(FASL)(参见参考文献58)、以及HLA-E/β2-微球蛋白的转基因猪也已经被生产以防止细胞排斥。根据NK细胞上CD94/NKG2A的表达水平，HLA-E/β2-微球蛋白猪的细胞被有效地保护免受人NK细胞介导的细胞毒性(参见参考文献51)。为了控制巨噬细胞活性，人CD47已经在猪细胞上被表达，以激活(人)单核细胞/巨噬细胞上的“不要吃我信号”受体SIRPα，并抑制吞噬活性(在参考文献29中综述的)。

(3)克服凝血调节异常和炎症的基因修饰

在临床前猪到非人灵长目动物异种移植中，凝血调节异常和止血功能障碍是常见的并发症(在参考文献32中综述的)。临床表现的范围从急性危及生命的消耗性凝血病伴血小板减少和出血，到导致异种移植体损失的血栓性微血管病。提出的病因包括炎症，血管损伤，先天的、体液的和细胞的免疫应答，尤其是猪和灵长目动物的凝血调节剂之间的分子不相容性(在参考文献33中综述的)。

已经通过供体猪的基因工程修饰/补充的关键的内皮抗凝血/抗血栓形成蛋白，包括人血栓调节蛋白(hTM)、内皮蛋白C受体(EPCR)、组织因子途径抑制物(TFPI)、以及核苷三磷酸二磷酸水解酶1(ENTPD1，别名CD39)(在参考文献33中综述的)。

猪TM结合人凝血酶，但对人蛋白C的激活来说是一个差的辅因子(参见参考文献34)。为了克服这个问题，已经在不同的启动子下生产了表达人TM的转基因猪品系：CMV(参见参考文献35)、CAGGS(参见参考文献36)、人ICAM(参见参考文献5)以及猪THBD(参见参考文献37)。在异位腹部移植到狒狒中进行适当的免疫抑制(用抗胸腺细胞球蛋白和抗CD20抗体诱导，用霉酚酸酯和大剂量的抗CD40(2C10R4)抗体维持)后，具有后者hTM表达载体的GGTA1敲除的hCD46转基因猪心脏存活超过900天(参见参见参考文献5)。

EPCR结合蛋白C、并将其呈递给THBD/凝血酶复合物进行激活，从而增强了激活的蛋白C的生成(参见参考文献59)。人EPCR在猪主动脉内皮细胞中的表达几乎与人THBD一样有效地降低了人血小板聚集(参见参考文献60)。作者得出结论，人EPCR的转基因表达可以增强猪THBD的作用，但与人THBD共表达时，其效果甚至更大。与人TFPI相比，猪TFPI是人TF/VIIa因子的不太有效的抑制剂(在参考文献33中综述的)。最近的一项研究表明，库尼茨结构域(Kunitz domain)1对于猪TFPI和人组织因子(TF)之间的物种不相容性至关重要，并且凝血可以被人TFPI转染的猪骨髓间充质细胞抑制(参见参考文献61)。为了克服这种不相容性，已经生产了表达人TFPI的转基因猪(参见参考文献62、63)。

CD39将ATP和ADP快速水解为AMP。AMP被胞外-5'-核苷酸酶(ecto-5'-nucleotidase，CD73)水解为腺苷，一种抗血栓形成的以及心血管保护的介质。在鼠H-2Kb启动子控制下表达人CD39的转基因猪在心肌缺血/再灌注损伤后表现出降低的梗死面积(参见参考文献64)。随后，在非人灵长目动物中、在异种移植实验中测试了基因多样修饰的猪(包括人CD39的表达)的肾脏(参见参考文献65、66)以及胰岛(参见参考文献67)。然而，人CD39的特异性作用在其他基因修饰中无法区分。

通过siRNA介导的敲低(knockdown)已经降低了促凝性TF的表达(参见参考文献68)。通过删除猪脱唾液酸糖蛋白受体(ASGR)，可以部分地克服猪肝脏灌注过程中人血小板的异常吞噬(参见参考文献69)。除靶向异种移植中凝血功能障碍的修饰之外，也已经生产了表达抗细胞凋亡和抗炎症蛋白的转基因猪，该抗细胞凋亡和抗炎症蛋白例如人肿瘤坏死因子-α-诱导蛋白3(A20)(参见参考文献70)和人血红素氧合酶-1(HO-1)(参见参考文献71)。

(4)减少人畜共患病风险的基因修饰

猪细胞、组织或器官的异种移植携带将猪微生物传播给人类受体和诱发人畜共患疾病的风险(参见参考文献72、73)。在极少数情况下，同种移植与诸如人免疫缺陷和狂犬病病毒的病原微生物的传播有关。然而，异种移植物作为先进疗法医药产品(ATMP)受到严格的管理，并且受制于最高级别的安全要求，因此实际上将来可能比同种移植体更加安全(参见参考文献74)。尽管各种各样的细菌、病毒、寄生虫和真菌构成了理论上的风险，但对不同猪群的综合研究表明，猪中发现的微生物的实际数量是有限的，例如(参见参考文献26、75)。目前尚无个体猪中微生物的完整图片，并且其在很大程度上取决于所用的测试方法，但是不太可能会鉴定出许多新的病原体。一个原因是人类与猪共存了上千年，其次是大多数猪供体是在SPF或近SPF条件下生产的，从而防止了来自第三物种的感染。然而，对推定的人畜共患微生物的筛查和无菌测试是强制性的。

猪内源性逆转录病毒(PERV)无法轻易消除，因为它们被整合到猪的基因组中，因此构成了最难以控制的风险来源(在参考文献39中综述的)。PERV-A和PERV-B能够感染某些人类肿瘤细胞，并且能够在较小程度上感染人类原代细胞。PERV-C仅感染猪细胞，但是带有PERV-A的重组体可以感染人类细胞，并且具有高复制率的特征。由于并非所有猪都存在PERV-C，因此有可能鉴定并且选择没有PERV-C的动物作为潜在供体。迄今为止，尽管进行了许多研究，包括用超过200名患者进行的猪胰岛的首次临床试验，但尚未有PERV体内传播的记录。在许多移植到非人灵长目动物中的猪细胞和器官的临床前试验中也没有记录PERV传播(在参考文献39中综述的)。然而，在几乎所有的临床异种移植试验中，均未应用免疫抑制并且仅移植了少量细胞。动物异种移植和PERV感染实验涉及没有完全功能性PERV受体(receptor)的受体物种(recipient species)，例如非人灵长目动物或大鼠。因此，关于体内PERV感染性的数据被认为是不完整的。

防止PERV传播的策略包括：(i)选择具有PERV-A和PERV-B低表达的无PERV-C的动物(参见参考文献23)；(ii)基于中和抗体的疫苗(有关评述，参见参考文献76)；以及(iii)通过PERV特异性siRNA长期降低PERV表达(例如，参考文献77、78)。一篇论文报道了使用CRISPR/Cas9系统同时灭活永生猪肾脏细胞系(PK15)中多达62种前病毒(参见参考文献79)。可以用原代猪细胞复制这种方法，从而生产健康的无PERV的动物(参见参考文献80；在参考文献81、82中评述的)。

异种器官移植物的供体生物体及其生产方法

当来自异种供体生物体(例如，来自猪)的基因修饰的器官被移植到受体生物体中(例如，到狒狒中)时，受体生物体中的器官过度生长是一个主要的问题。根据本发明，器官过度生长通过治疗的组合来抵消：(i)减小受体(例如，狒狒)的血压以匹配供体(例如，猪)的较低水平；(ii)在早期逐渐减少可的松；和/或(iii)使用西罗莫司前药替西罗莫司以减轻心肌肥大(参照实施例1-4)。然而，本发明人已经发现，通过敲除生长激素受体(GHR)基因，也可以在基因上抵消猪的生长(及其器官的生长)(参照实施例7)。本发明人已经发现，与对照相比，GHR-KO(GHR敲除)的猪的体重降低了60％，并且大多数器官的重量按比例降低。此外，GHR-KO猪的血清胰岛素样生长因子1(IGF1)水平显著降低。值得注意的是，通过用IGF1处理GHR-KO猪，将有可能促进它们的生长(对于莱伦氏综合征患者，如参考文献88、108、109和110所示)。因此，通过IGF1处理GHR-KO猪，可以随意地调节猪及其器官的尺寸。

鉴于上述情况，本发明人已经敲除了GT-KO/hCD46/hTM猪的GHR基因，该GT-KO/hCD46/hTM猪可用作异种移植到灵长目动物中的供体生物体(参照实施例7)。因此，本发明提供了作为合适的异种移植供体的GHR-KO哺乳动物(例如，猪)，并且可以通过用IGF1处理GHR-KO哺乳动物来调节它们的尺寸/器官尺寸。根据本发明，在异种移植中使用这类供体哺乳动物可以与本发明的上述药物治疗相配合以抵消器官过度生长。额外地，使用GHR-KO哺乳动物作为供体可以避免用mTOR抑制剂对受体的长期治疗。最后，对于需要相对小的供体器官的相对小尺寸的受体，能够根据受体的需要调节供体器官的尺寸可能是特别有用的。

因此，本发明提供了异种器官移植物的供体生物体，其中供体生物体具有生长激素受体基因的纯合敲除，并且其中供体生物体是哺乳动物。这种供体生物体可以如实施例7所述地获得。

在根据本发明的异种器官移植物的供体生物体的一个实施方式中，供体生物体额外地具有α-1,3-半乳糖基转移酶基因的纯合敲除，编码人CD46的序列的插入、以及编码人血栓调节蛋白的序列的插入。在替代的实施方式中，供体生物体额外地具有α-1,3-半乳糖基转移酶、CMAH和B4GALNT2基因的纯合敲除，以及编码人CD46的序列、编码人CD55的序列、编码人CD59的序列、编码血红素氧合酶1(优选人血红素氧合酶1)的序列和编码A20(优选人A20)的序列的插入。在后一个实施方式中，供体生物体可额外地具有编码LEA29Y或PD-L1、优选人PD-L1的序列的插入。与可插入到根据本发明的异种器官移植物的供体生物体中的上述序列有关的细节，可在与根据本发明的延长心脏/肾脏/肺/肝脏移植后灵长目动物的存活的方法有关的部分中、以及与根据本发明的具有移植的心脏/肾脏/肺/肝脏的灵长目动物有关的部分中找到。特别地，在本发明中，在插入这些部分中描述的基因时优选表达的转录本也是在将相应的序列插入到根据本发明的异种器官移植物的供体生物体中时优选表达的转录本。

在根据本发明的异种器官移植物的供体生物体的另一实施方式中，供体生物体可以具有一种或多种额外的基因修饰。与这些一种或多种额外的基因修饰有关的细节，可在“基因修饰的哺乳动物及其生产方法”的部分中找到。这些一种或多种额外的基因修饰之一可以是编码人α1,2-岩藻糖基转移酶的序列的插入。优选地，人α1,2-岩藻糖基转移酶是从以下基因表达的蛋白：官方符号：FUT1；官方全名：岩藻糖基转移酶1(H血型)；主要来源：HGNC:HGNC:4012；参见相关：Ensembl：ENSG00000174951，MIM：211100。

在根据本发明的异种器官移植物的供体生物体的另一实施方式中，供体生物体属于猪科，优选属于猪属，更优选属于野猪种，最优选属于家猪亚种。在优选实施方式中，供体生物体属于野猪种。在进一步实施方式中，供体生物体是具有德国长白猪/大白猪杂交遗传背景的猪、杜洛克猪、Swabian-Hall

如上所述，根据本发明的异种器官移植物的供体生物体也可以是根据本发明的基因修饰的生物体。

本发明还提供一种形成异种器官移植物的供体生物体的方法，其包括通过用IGF1处理供体生物体来调节供体生物体的尺寸的步骤；其中供体生物体具有生长激素受体基因的纯合敲除，并且其中供体生物体是非人哺乳动物。优选地，在供体生物体出生后开始用IGF1的处理。对于人，建议rhIGF-1的起始剂量为0.04mg/kg，每天两次皮下注射。应定期增加剂量，以达到0.12mg/kg的维持剂量，每天两次，耐受约2-3个月。剂量小于0.12mg/kg/天的长期治疗可能导致生长应答(growth response)欠佳。对于根据本发明的非人供体哺乳动物，类似的给药方案可能是合适的。

针对根据本发明的异种器官移植物的生物体描述的实施方式也适用于形成根据本发明的异种器官移植物的供体生物体的方法，细节上作必要修改。

如对本领域技术人员将是显而易见的，对于本发明的所有实施方案，当提及编码蛋白的序列的插入时，优选地插入该序列以使该蛋白得以表达，例如通过作为表达盒的一部分插入该序列，该表达盒额外地包括调节序列。根据本发明，这种序列的插入也可以称为转基因的插入。

如对技术人员将是显而易见的，当本文中提及根据本发明的基因或序列在供体器官或供体生物体中的插入时，必须确保由这些基因或序列编码的蛋白与相应的受体生物体相容。因此，在可以与本发明的所有其他实施方式组合的一个实施方式中，插入的基因或序列可以从与受体生物体相同的物种得到。然后，插入的基因或序列与受体生物体的相应基因的高序列同源性将确保相容性。根据本发明，供体生物体为哺乳动物，受体生物体为灵长目动物。因为具有人基因或序列的插入的供体器官被认为甚至与非人灵长目动物受体是相容的(参见实施例1-4)，在一个实施方案中，根据本发明的插入的基因或序列分别是人基因或人序列。在该实施方式中，受体生物体也可以是人。

在下文中，本发明将举例说明，但不限于此。

实施例

实施例1：材料和方法

在本发明的后续实验中使用了下列材料和方法。

七头具有杂交遗传背景的幼猪(德国长白猪/大白猪，血型O)用作心脏异种移植的供体。所有器官对1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GT-KO)是纯合的，对hCD46/血栓调节蛋白(hTM)是转基因的(Revivicor，布莱克斯堡，弗吉尼亚州，美国；和分子动物繁育与生物技术研究所，基因中心，兽医学院，路德维希-马克西米利安斯大学，慕尼黑，德国)。死后通过免疫组织化学证实了hCD46/hTM表达的定位和稳定性(图15)。在移植前7天，通过超声心动图评估了供体心脏功能和是否存在瓣膜缺损。七只雄性圈养的狒狒(东非狒狒，血型B和AB)被用作受体。

该研究得到了地方当局和上巴伐利亚行政区政府的批准。所有动物均按照《实验动物的护理和使用指南》(美国国立卫生研究院和国家法律)处理。

对狒狒的术前用药由盐酸氯胺酮6-10mg/kg(凯塔维

正中胸骨切开术和肝素化(500IU/kg)后，将小套管插入到升主动脉中，然后通过套管远端将其钳住。在第I组中，在4℃下用单剂量为20ml/kg的晶体心停搏液对心脏进行心脏麻痹：56、58和59号实验接受了康斯特(Custodiol)HTK溶液(弗朗茨科勒博士化学有限公司(Dr.F.

如Steen等人描述地(参见参考文献10)，在便携式体外心脏保存系统中、在8℃的温度下使用3.5L含氧的含白蛋白高深性心停搏营养液，来保存第II组和第III组的心脏，该营养液具有激素和红细胞，该便携式体外心脏保存系统由压力控制和流量控制的滚压泵、O

主动脉钳住后，心脏被灌注600ml保存介质，然后切离并移入心脏保存系统中。大的套管可以被引入到升主动脉中，并且使二尖瓣暂时地不能防止左心室扩张；上腔静脉可以被阻塞，但是下腔静脉、肺动脉以及肺静脉保持打开以自由排出灌注液。心脏被浸没在填充有冷灌注介质的储存器中，并且通过已经放置的主动脉套管，开始顺行性冠状动脉灌注。灌注压力被精确地调节在20mmHg。植入期间，心脏每20分钟间歇地被灌注2分钟。

受体的胸腔在中线处被打开。给予普通肝素(500IU/kg；肝素钠25000德国通益，德国通益有限责任公司，乌尔姆，德国)，使用腔静脉和升主动脉连接心肺机。开始心肺转流术并冷却受体(第I组为30℃，第II和III组为34℃)。钳住升主动脉后，在心房的水平切离受体的心脏，切开两条大血管。使用沙姆韦和洛厄的技术移植猪供体心脏(参见参考文献8)。

无线遥测发射器(数据科学国际(Data Sciences International)，圣保罗，明尼苏达州，美国)被植入第5肋和第6肋之间的右锁骨中线的皮下袋(subcutaneous pouch)中。将压力探头插入到主动脉和左心室的顶端中，将ECG导线放置在右心室壁中。

免疫抑制基于毛希丁的方案(参见参考文献5；有些变化在下文中示出)，用C1酯酶抑制剂代替眼镜蛇毒因子进行补体抑制。诱导由抗CD20抗体(美罗华；罗氏制药公司，格伦察赫-维伦，德国)、ATG(即复宁，赛诺菲-安万特德国股份有限公司，法兰克福，德国)、以及抗CD40抗体(小鼠/恒河猴嵌合IgG4克隆2C10R4，NIH非人灵长目动物试剂资源，质量生物制剂，波士顿，马萨诸塞州，美国；经由基斯赖曼提供)或人源化抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab(生产：瓦克化学，布格豪森，德国；纯化：XL蛋白股份有限公司，弗赖辛，德国；经由阿恩斯凯拉(Arne Skerra)提供，参见参考文献9)中的任一者组成。维持免疫抑制由霉酚酸酯(骁悉，罗氏公司，巴塞尔，瑞士；谷浓度2-3μg/ml)、抗CD40抗体或抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab中的任一者、甲基强的松龙(Urbasone solubile，赛诺菲-安万特德国股份有限公司，法兰克福，德国)组成。抗炎疗法包括IL-6受体抗体(托珠单抗，罗氏制药公司，格伦察赫-维伦，德国)、TNFa抑制剂(依那西普，辉瑞制药有限公司，柏林，德国)以及Il-1受体拮抗剂(阿那白滞素，瑞典罕见病生物制药有限公司，马丁雷德，德国)。附加疗法：乙酰水杨酸(阿司匹林，拜耳医药保健有限公司，勒沃库森，德国)、普通肝素(肝素钠25000德国通益，德国通益有限责任公司，乌尔姆，德国)、C1酯酶抑制剂(Berinert，德国杰特贝林生物制品有限公司，哈特斯海姆，德国)、更昔洛韦(赛美维，罗氏制药公司，格伦察赫-维伦，德国)、头孢呋辛(头孢呋辛希克玛，希克玛制药有限公司，马丁雷德，德国)以及倍他依泊汀(NeoRecormon 5000IU，罗氏制药公司，格伦察赫-维伦，德国)。

从10mg/kg/d开始，在第I组和第II组中，甲基强的松龙每10天逐渐减少1mg/kg；在第III组中，甲基强的松龙在19天内逐渐减少至0.1mg/kg。同样在第III组中，替西罗莫司(驮瑞塞尔，辉瑞制药有限公司，柏林，德国)被加入到维持免疫抑制，以每日静脉内短期输注施用，旨在雷帕霉素的谷浓度为5-10ng/ml。第III组也接受了用依那普利(Enahexal，赫素制药集团，霍尔茨基兴，德国)和酒石酸美托洛尔(Beloc i.v.，阿斯利康股份有限公司，韦尔德，德国)的持续静脉内抗高血压药物治疗，旨在平均动脉压为80mmHg以及心律为100bpm。

全身麻醉诱导后，将中心静脉导管(箭牌国际，雷丁，宾夕法尼亚，美国)插入左颈静脉中，并将动脉导管(Thermodilution Pulsiocath；脉冲医疗系统(Pulsion MedicalSystems)，慕尼黑，德国)插入右股动脉中。心输出量和每搏输出量通过经肺热稀释法评估，并使用公式0.083*kg

使用HP Sonos 7500(惠普公司，帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国)，定期在镇痛镇静中进行经胸超声心动图检查；记录乳头肌短轴视图。在舒张末期和收缩末期，测量LV直径(LVEDD，LVESD)、舒张和收缩的室间隔(IVSd，IVSs)、后壁厚度(PWd，PWs)；三次测量的平均值用于进一步的计算和可视化(Excel和PowerPoint，微软，雷德蒙德，华盛顿，美国)。

使用公式(1)计算LV质量，使用公式(2)和(3)计算相对LV质量增加以及LV FS(参见参考文献11、12)。

(公式1)LV质量(g)＝0.8*(1.04([LVEDD+IVSd+PWd]

(公式2)LV质量增加(％)＝([LV质量

(公式3)FS(％)＝([LVEDD–LVESD]/LVEDD)*100

在慕尼黑州立大学的兽医病理学研究所和病理学研究所进行尸检和组织学检查。将标本固定在福尔马林中，包埋在石蜡和塑料中，切片并用苏木精-伊红(HE)染色。

使用标准的组织学技术生成冷冻切片(8μm)。心肌细胞尺寸被量化为截面积。用Alexafluor647缀合的麦胚凝集素(Alexafluor647-conjugated wheat germ agglutinin)(生命技术)和核染料DAPI(生命技术)对左心室的8μm厚心脏切片进行染色。使用Leica TCSSP8共焦显微镜以10倍和63倍物镜采集图像；应用ImageJ软件确定一个切片中心肌细胞的平均截面积(每个切片200-300个细胞，每个心脏5-7个切片)。

将心肌组织活检包埋在Tissue-Tek(Sakura Finetek，祖特尔乌德，荷兰)中，并在-80℃下冷冻保存。为了进行免疫荧光染色，切割5μm厚冷冻切片，风干30-60分钟，并在-20℃下保存直至进一步的分析。将冷冻切片用冰冷的丙酮固定，并使用一步直接或两步间接免疫荧光技术进行水合和染色。使用下列抗体：兔抗人C3b/c(达科(Dako)，格洛斯楚普，丹麦)、兔抗人C4b/c-FITC(达科)、山羊抗猪IgM(AbD Serotec，赫拉克勒斯，加利福尼亚，美国)、山羊抗猪IgG-FITC(南方生物科技，伯明翰，美国)。二抗(secondary antibody)是驴抗山羊IgG-Alexa 488(赛默飞世尔科学，马萨诸塞州，美国)、绵羊抗兔Cy3(西格玛-奥德里奇(Segma-Aldrich)，圣路易斯，密苏里州，美国)。使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)(DAPI；勃林格(Boehringer)，罗氏诊断，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)进行核染色。使用荧光显微镜(DM14000B；莱卡(Leica)，韦茨拉尔，德国)对载玻片进行分析。使用Image J软件1.50i版(https://imagej.nih.gov/ij/)对未处理的TIFF(标记图像文件格式)图像进行荧光强度的量化。所有照片均在相同条件下拍摄，以允许荧光强度的正确量化和比较。

按照阿西姆萨德(Azimzadeh)等人发表的共识方案，通过流式细胞术测量抗非Gal狒狒IgM和IgG抗体的血浆水平(参见参考文献14)。简而言之，获得了GT-KO/hCD46/hTM猪主动脉内皮细胞(PAEC)，并以2×10

对于蛋白提取，将心脏样品在Laemmli提取缓冲液中进行均质处理，然后通过二喹啉甲酸(BCA，默克公司，达姆施塔特，德国)蛋白分析估计蛋白含量。通过10％SDS-PAGE分离20μg的总蛋白，然后通过电印迹转移至聚偏氟乙烯(PDVF)膜(密理博(Millipore)，比勒利卡，美国)。膜在含有0.1％吐温-20的Tris缓冲盐溶液(默克)(TBS-T)中洗涤，并在室温下在5％w/v无脂奶粉(Roth，卡尔斯鲁厄，德国)中封闭1h。然后，膜在TBS-T中再次洗涤，并在4℃下在具有适当一抗(primary antibody)的5％w/v BSA(Roth)中温育过夜。使用下列抗体：兔抗人pmTOR(#5536；细胞信号(Cell Signaling)，法兰克福，德国)和小鼠抗人PCNA(#2586；细胞信号)。洗涤后，膜在室温下与具有辣根过氧化物酶标记的二抗的5％w/v无脂奶粉中温育1h。使用增强的化学发光检测试剂(ECL先进蛋白质印迹检测试剂盒，通用电气医疗，慕尼黑，德国)和适当的X射线胶片(通用电气医疗)检测结合的抗体。检测后，将膜剥离(洗脱缓冲液：2％SDS，62.5mM Tris/HCl，pH 6.7和100mMβ-巯基乙醇，在70℃下，30分钟)，并与适当二抗温育。SDS-PAGE，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。

对于存活数据，绘制卡普兰-迈耶曲线，并使用Mantel-Cox对数秩检验确定组之间的显著性差异。对于血液动力学数据，使用如所示的未配对和配对的Student’s t-检验确定统计学显著性；数据以单次测量表示，以条作为组中位值。对于组织化学分析，使用了Holm-Sidak多重比较的单向方差分析来确定统计学显著性；数据以平均值±s.d.表示。P<0.05被认为是显著的。s.d.，标准偏差。

gm(GTKO/hCD46/hTM)猪到狒狒心脏移植实验是采用临床批准的“沙姆韦”原位技术进行的(参见参考文献8)。研究的所有受体都接受了IS，如毛希丁或多或少地描述的(参见参考文献5)：诱导疗法包括抗CD20、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)以及抗CD40或我们自己的抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab(参见参考文献9)。维持疗法由抗CD40或抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab、MMF以及逐渐减少的甲基强的松龙(MP)组成(见表1；还显示了额外的医疗(medicaltreatment)；C1酯酶抑制剂代替了眼镜蛇毒因子)。

11个实验细分为3组(见表2)；第I组(n＝5)用2种临床批准的晶体溶液保存供体器官(4℃的康斯特HTK，Belzer′s UW，一次给予每一个；然后将猪心脏(血型O)保存在填充有溶液的塑料袋中，以及冰块中的袋子中；静态保存)；在第II组(n＝4)和第III组(n＝2)中，将切离的心脏立即通过固定在升主动脉中的套管，在8℃下用压力控制的滚压泵灌注。离开供体器官的缺氧血(deoxygenated blood)被收集在储存器中，然后经过氧合器(非缺血性保存)。在左右心房吻合期间，肺动脉缝合线，灌注间歇地持续；仅当两个主动脉残端(stumps)连接时才停止灌注。

11只圈养的狒狒(东非狒狒，血型B和AB)用作受体。受体的术后治疗在其他地方有描述(参见参考文献11)。

第I组的结果(用晶体溶液进行静态冷保存)如下：尽管缺血时间保持尽可能短(123±7分钟)，但幸存者分别为1天3次、3天和28天1次。在后一种情况下(用Belzer’s UW-溶液进行心脏保存)，超声心动图显示有限的舒张泵功能(LV心肌增厚，LV腔减少，从而舒张充盈；图6A；图3；图1E，图1F)合并终末期肝脏衰竭(表3，图1B，图1H)；与此相反，4个短期幸存者在中断心肺转流术(CPB)后总是处于严重的收缩期左心衰竭，需要大剂量静脉内的儿茶酚胺(图3，图1A-C)。但是，所有4个都戒断了CPB，其中3个已拔管。

在以下第II组和第III组中，开始如实施例1中所述的器官灌注(非缺血性心脏保存；灌注时间分别为196±44min和224±45min)。随后，两组的所有狒狒都容易地戒断了CPB，儿茶酚胺含量低(图3)。然而，第II组的所有3只长期幸存者(18、27和40天，4天的实验为技术失败)都死于舒张泵衰竭合并终末期肝病，与第I组的单只28天幸存者所描述的结果相似(图6A；表3；图1A，图1B，图1H)。

在各实验结束之前，第II组动物最重要的生化血清测量的数据如表3所示：胆红素升高，肝脏酶如AST也升高；凝血酶原(prothrombin)比率和胆碱酯酶(cholinesterase)减少；肌钙蛋白T高于正常范围。(图1A，图1B描绘了在终止实验前肌钙蛋白和胆红素水平的急剧增加)。乳酸脱氢酶水平升高，血小板计数降低。尸检时，供体心脏增大-与植入时的重量相比，第I组和第II组中的过度生长平均为259％。事实上，移植物似乎受到周围的纵隔结构的挤压。左心室壁和右心室壁的直径增大，左心室腔减小(图4A；参见参考文献12、13)。值得注意的是图4C，它描绘了移植体64的供体的同胞心脏的尺寸：同时安乐死，其外部心脏直径几乎相同。

第II组移植物的心肌组织学显示肥大细胞(图1E，图1F，图1J，图1K)。中心静脉周围有丰富的肝细胞坏死(图1H)。

相反，所有刚刚描述的病理结果在第III组受体中都不存在，第III组受体具有抗高血压治疗(与狒狒相比，猪的收缩压低，平均为80mmHg对120mmHg)、早期糖皮质激素戒断和额外的替西罗莫司药物治疗。值得注意的是尸检时的心肌外观：90天结束时，超声心动图正常(图6B)。尸检时，心室壁几乎正常，腔尺寸未受损；供体心脏和受体肝脏的组织学结果也正常(表3；图1G，图1I，图1J，图1K，图1L；图4B)。

图2总结了所有长期幸存者的免疫应答。第II组的移植体未显示出明显的体液排斥迹象，而轻微的改变可能归因于所述的心脏功能的死亡前局限性(preterminallimitation)；第III组未见病理免疫-组织化学结果。在两组中，非Gal抗体的血浆测量(参见参考文献14)均未显示出高于已经存在的低水平的增加。

除上述实验外，如针对第III组狒狒所述，并且根据实施例1的材料和方法，另一只狒狒被移植了心脏。该狒狒存活了90天，并且术后结果和测量与上面描述的第67号实验相同。

综上所述，本文提出的实验行为最终证明了(第III组)，生命支持(原位)异种心脏移植可以应用(前)临床标准，并部分满足ISHLT指南的要求(参见参考文献6)。

以下内容有助于成功：

·采用毛希丁的基本IS(参见参考文献5)，该方法有效地省略了细胞排斥以及最重要的体液排斥；在第II组中看到的明显的血栓性微血管病迹象(血小板减少，LDH增加)，可以用器官的过分生长、以及由于血管新生不足而显然不能匹配其供应的细胞肥大的能量需求增加来解释(针对其他器官已在前面描述了(参见参考文献15)，图5)。然而，做了几个重要的改变：抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab似乎和抗CD40一样有效(图2)。已经加入了抗炎疗法。糖皮质激素逐渐减少得更快，加入替西罗莫司，最后给予抗高血压治疗。

·非缺血性猪心脏保存的引入(参见参考文献10)。与第II组和第III组相反，第I组供体器官具有静态的心肌保存，用于临床同种程序。在静态心肌保存下，术后即刻的心输出量低(图3A)，需要大量的儿茶酚胺(图3B)。所产生的高早期死亡率在过去25年与文献的发现相符，这些发现描述了40％-60％的范围(参见参考文献7)。该现象被称为“围手术期心脏异种移植体功能障碍”(参见参考文献16)，且与早期心脏手术所知的心脏顿抑明显相似；它不类似于超急性排斥。

第II、III组中的非缺血性保存技术甚至取得了临床可接受结果：与基线相比时，由于心输出量保持不变，所有7个受体都很容易脱离CPB。也已经报道了异种肾脏和肺移植后的限制性移植体过度生长(参见参考文献15)。作者用内在因素解释了这种现象(这意味着，猪器官的“过度生长”是预先确定的)，而不是因为外在刺激(通过受体的各种生长激素)。这一论断得到了目前观察的支持，直到实验64结束时非移植的同胞心脏的尺寸几乎相同地增加(图4C)。

·通过降低狒狒的血压以匹配低的猪水平，首次成功地抵消了过度生长。糖皮质激素在早期逐渐减少，因为该药物已被描述在生命早期会引起肥厚型心肌病(参见参考文献17)。最后，已知西罗莫司化合物通过抑制两种mTOR激酶来控制所有细胞生长的复杂网络(参见参考文献18)。有临床证据表明，心肌肥大得到减轻，舒张泵功能得到改善(参见参考文献19、20)；罕见的遗传性过度生长综合征在人类中得到治疗(参见参考文献21)。在我们的案例中，选择了替西罗莫司并减轻了心肌肥大，省去了LV腔的闭塞。

综上所述，本发明首次表明在艰难(difficult)gm猪到狒狒模型中原位异种心脏移植是可行的。似乎有可能实现ISHLT指南的所有要求(参见参考文献6)。可以解决安全问题(参见参考文献22)。

扩展了第III组的研究方案，旨在六个月的移植体存活(参见参考文献115)。综合结果显示在下表4和图11-15中。表4中给出的结果包括以上实施例2中所述的实验结果，其中表3中的第57、60、63、64、66和67号实验分别对应于表4中的实验3、6、8、9、10和11。表4的实验12对应于以上实施例2的最后一段中提到的额外的实验，并且表4的实验13和14是旨在六个月的移植体存活而扩展了第III组研究方案的额外的实验。图11-15所示的数据基于表4所示的所有实验结果。

扩展研究的综合结果证实了实施例2的结果：总而言之，在219±30min的心脏灌注时间之后，与第II组相比，第III组的所有五只动物都很容易脱离CPB(图13)。第III组中没有受体表现出PCXD；四周后，所有受体均达到稳定状态，心脏功能良好。一只受体(实验10)出现了由胸淋巴管阻塞所致的顽固性胸腔积液，因此在51天后被安乐死。根据研究方案，两只受体(实验11和12)健康良好地生活了三个月直到安乐死(图11A)。在这三只受体中，超声心动图显示左心室质量没有增加(图11D)；移植体功能保持正常，没有舒张期功能障碍的迹象(图4B)。在整个实验中，心脏和肝脏功能的生化参数以及LDH水平和血小板计数均正常或仅有轻微变化(表4，图11B，图11C和图14A，图14B)，与正常组织学一致(图1I)。左心室心肌的组织学检查未见肥大的迹象(图1J和图11E)，并且心肌的蛋白质印迹分析显示mTOR的磷酸化水平低于非移植的年龄匹配的对照心脏(图11F)。与第II组相似，第III组没有体液移植体排斥的迹象(图12和图2A-D)。

第III组的最后两只受体(实验13和14)被允许在良好的一般条件下存活195天和182天，血小板计数、或血清LDH和胆红素水平没有重大变化(图11A，图11C和图14A，图14B)。在第175天和第161天中断静脉内替西罗莫司治疗。直到该点，收缩和舒张心脏功能都是正常的。此后，在两只受体中都观察到心脏移植体的生长增加(图11D)，强调了mTOR抑制在原位异种心脏异种移植模型中的重要性。与第II组中观察到的变化相似，较小的受体13出现了舒张功能障碍的迹象，这与肌钙蛋白T的血清水平升高和充血性肝脏损伤的开始有关(血清ALT和AST水平增加，凝血酶原比率和胆碱酯酶减少)；血小板计数保持在正常范围内(表4，图11B，图11C和图14A，图14B)。组织学证实肝脏充血，并显示多灶性心肌坏死，无免疫细胞浸润或血栓性微血管病迹象。在必须与动物13同时被安乐死的较大受体14中，心脏过度生长的后果是最小的。

以上结果证实了实施例2的结果和实施例3中所述的结论。在非人灵长目动物中生命支持的猪心脏实现了一致(consistent)存活至少三个月，满足国际心脏和肺移植学会的咨询报告所建议的启动临床异种移植试验的临床前功效要求(参见参考文献6)。两个步骤有助于成功。首先，非缺血性猪心脏保存被发现对异种移植心脏的存活很重要。用晶体溶液(用于临床同种程序)进行缺血性静态心肌保存的第I组的异种移植心脏，在五分之四的病例中显示了PCXD，因此需要更大剂量的儿茶酚胺。该现象显然与“心脏顿抑”相似，自心脏手术早期以来就已经知道该现象的发生，且该现象的发生并不代表超急性排斥(参见参考文献7)。相比之下，在第II组和第III组(通过灌注非缺血性猪心脏保存)(参见参考文献10)中，所有9只受体都很容易脱离CPB，因为它们的心输出量与基线相比保持不变。即使按照临床标准，这些组取得的短期结果也非常好。第二步是防止不利的异种移植体过度生长。先前的猪到狒狒肾脏和肺移植实验表明，相比于来自受体的刺激，例如生长激素，移植体的生长更多地取决于内在因素(参见参考文献15)。在我们第II组受体中，大量的心脏肥大显示了更复杂的情况。值得注意的是，在同一时间段内，该组中的移植心脏比同胞的非移植心脏具有大62％的增重(图4C)。在第III组中，通过治疗的组合成功地抵消了心脏过度生长：(i)减少狒狒的血压以匹配低的猪水平；(ii)在早期逐渐减少可的松—可的松可在人类早期生命中引起肥厚型心肌病(参见参考文献83)；以及(iii)使用西罗莫司前药替西罗莫司来减轻心肌肥大。已知西罗莫司化合物通过抑制两种mTOR激酶来控制细胞生长的复杂网络(参见参考文献84)。有临床证据表明，西罗莫司治疗可减轻心肌肥大并改善舒张泵功能(参见参考文献19、20)，以及在人类中减轻罕见的遗传性过度生长综合征(参见参考文献21)。除了人血栓调节蛋白在移植体中的表达的影响外(参见参考文献5、37)，通过降低胶原诱导性血小板聚集和通过减稳在剪切应力条件下形成的血小板聚集物，替西罗莫司治疗可以进一步防止血栓性微血管病变的形成(参见参考文献85)。总而言之，这项研究表明，在最相关的临床前模型中，一致的长期生命支持的原位异种心脏移植是可行的，从而有助于异种心脏移植的临床转移。

动物

实验于2015年2月至2018年8月之间进行。14头具有杂交遗传背景的幼猪(德国长白猪/大白猪，血型O)用作心脏异种移植的供体。所有器官对α1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)是纯合的，对人CD46(hCD46)和人血栓调节蛋白(hTM)是杂合转基因的(参见参考文献37)(Revivicor和分子动物繁育与生物技术研究所)。死后通过免疫组织化学证实了hCD46和hTM表达的定位和稳定性(图15)。在移植前7天，通过超声心动图评估了供体心脏功能和是否存在瓣膜缺损。14只雄性圈养的狒狒(东非狒狒，血型B和AB)被用作受体(德国灵长目动物中心)。

该研究得到了地方当局和上巴伐利亚行政区政府的批准。所有动物均按照《实验动物的护理和使用指南》(美国国立卫生研究院和德国法律)处理。

麻醉和镇痛

狒狒通过肌肉注射盐酸氯胺酮6-8mg kg

供体心脏的移出和保存

猪通过盐酸氯胺酮10-20mg kg

正中胸骨切开术和肝素化(500IU kg

在第II组和第III组中，如先前描述地(参见参考文献10)，在便携式体外心脏保存系统中、在8℃的温度下使用3.5l含氧的含白蛋白高渗性心停搏营养液，来保存心脏，该营养液具有激素和红细胞，该便携式体外心脏保存系统由压力控制和流量控制的滚压泵、O

主动脉钳住后，心脏被灌注600ml保存介质，然后切离并移入心脏保存系统中。大的套管可以被引入到升主动脉中，并且使二尖瓣暂时地不能防止左心室扩张；上腔静脉被结扎；但是下腔静脉、肺动脉以及肺静脉保持打开以自由排出灌注液。心脏被浸没在填充有冷灌注介质的储存器中，并且通过已经放置的主动脉套管，开始顺行性冠状动脉灌注。灌注压力被精确地调节在20mm Hg。植入期间，心脏每15分钟间歇地被灌注2分钟。

移植技术

受体的胸腔在中线处被打开。给予普通肝素(500IU kg

无线遥测发射器(数据科学国际)被植入第5肋和第6肋之间的右锁骨中线的皮下袋中。将压力探头插入到升主动脉和左心室的顶端中，将心电图导线放置在右心室壁中。

免疫抑制方案、抗炎及附加疗法。

免疫抑制基于先前公开的方案(参见参考文献5)，用C1酯酶抑制剂代替眼镜蛇毒因子进行补体抑制(表5)。诱导由抗CD20抗体(美罗华；罗氏制药)、ATG(即复宁，赛诺菲-安万特)、以及抗CD40单克隆抗体(小鼠/恒河猴嵌合IgG4克隆2C10R4，NIH非人灵长目动物试剂资源，质量生物制剂，经由基斯赖曼提供；动物1-3、5、7、8、11-14)或人源化抗CD40L PAS蛋白修饰的Fab(XL蛋白和瓦克化学；动物4、6、9、10)中的任一者组成。维持免疫抑制由霉酚酸酯(骁悉，罗氏公司；谷浓度2-3μg ml

在第I组和第II组中，甲基强的松龙从每天10mg kg

血液动力学测量

全身麻醉诱导后，将中心静脉导管(箭牌国际)插入左颈静脉中，并将动脉导管(Thermodilution Pulsiocath；脉冲医疗系统)插入右股动脉中。心输出量和每搏输出量通过经肺热稀释法评估，并使用公式0.083×B

左心室质量、左心室质量增加和缩短分数的量化

使用HP Sonos 7500(惠普)和Siemens Acuson X300(西门子)，定期在镇痛镇静中进行经胸超声心动图检查；记录乳头肌短轴视图。测量了左心室舒张末期直径(LVEDD)和左心室收缩末期直径(LVESD)、舒张末期的室间隔厚度(IVSd)和舒张末期的后壁厚度(PWd)；三次测量的平均值用于进一步的计算和可视化(Excel和PowerPoint，微软)。

根据先前公开的方法(参见参考文献13、12)，使用公式(1)计算左心室质量，使用公式(2)和(3)计算相对的左心室质量增加以及左心室(LV)缩短分数(FS)。

LV质量(g)＝0.8(1.04([LVEDD+IVSd+PWd)

LV质量增加(％)＝((LV质量

FS(％)＝((LVEDD-LVESD)/LVEDD)×100 (3)

尸检和组织学

在兽医病理学研究所和病理学研究所进行尸检和组织学检查。将标本固定在福尔马林中，包埋在石蜡和塑料中，切片并用苏木精和伊红染色。

组织化学分析

使用标准的组织学技术生成冷冻切片(8μm)。心肌细胞尺寸被量化为截面积。用Alexa Fluor647缀合的麦胚凝集素(生命技术)和核染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，生命技术)对左心室的8μm厚心脏切片进行染色。使用Leica TCS SP8共焦显微镜以63倍物镜采集图像；使用SMASH软件(MATLAB，https://de.mathworks.com/products/matlab.html)以确定一个切片中心肌细胞的平均截面积(每个切片200-300个细胞，每个心脏5-8个切片)。

免疫荧光染色

将心肌组织活检包埋在Tissue-Tek(Sakura Finetek)中，并在-80℃下冷冻保存。为了进行免疫荧光染色，切割5μ冻冷冻切片，风干30-60分钟，并在-20℃下保存直至进一步的分析。将冷冻切片用冰冷的丙酮固定，使用一步直接或两步间接免疫荧光技术进行水合和染色。使用下列抗体：兔抗人C3b/c(达科)、兔抗人C4b/c-FITC(达科)、山羊抗猪IgM(AbDSerotec)、山羊抗猪IgG-FITC(南方生物科技)以及兔抗人纤维蛋白原-FITC(达科)。二抗是驴抗山羊IgG-Alexa 488(赛默飞世尔科学)、绵羊抗兔Cy3(西格玛-奥德里奇)。使用DAPI(勃林格，罗氏诊断)进行核染色。使用荧光显微镜(DM14000B；莱卡)对载玻片进行分析。每个标记物随机获得5-10个免疫荧光图片，对未处理的TIFF图像使用ImageJ软件，1.50i版(https://imagej.nih.gov/ij/)来量化荧光强度。所有照片均在相同条件下拍摄，以允许荧光强度的正确量化和比较。

非半乳糖-α1,3-半乳糖抗体水平的评估

按照先前发表的共识方案(参见参考文献14)，通过流式细胞术测量非半乳糖-α1,3-半乳糖狒狒IgM和IgG抗体的血浆水平。简而言之，收集了GTKO/hCD46/hTM猪主动脉内皮细胞，并以2×106细胞/ml悬浮在染色缓冲液(含有1％BSA的PBS)中。将血浆样品在56℃下加热灭活30分钟，然后在染色缓冲液中以1:20进行稀释。猪主动脉内皮细胞与稀释的狒狒血浆在4℃下温育45分钟。然后用冷染色缓冲液洗涤细胞，并将细胞与山羊抗人IgM-RPE(南方生物科技)或山羊抗人IgG-FITC(赛默飞世尔)一起在4℃下温育30分钟。在用冷染色缓冲液重新洗涤后，细胞在PBS中重悬浮，在FACS LSRII(BD生物科学)上获得荧光，并使用FlowJo分析软件进行分析，以检测FITC通道中或RPE通道中的平均荧光强度(MFI)。然后使用Prism 7(Graphpad软件)绘制数据。

蛋白质印迹分析

对于蛋白提取，将心脏样品在Laemmli样品缓冲液中进行均质处理，然后使用二喹啉甲酸(BCA，默克公司)蛋白分析估计蛋白含量。然后，通过10％SDS–PAGE分离20μg的总蛋白，并且通过电印迹转移至PDVF膜(密理博)。膜在含有0.1％吐温-20的Tris缓冲盐溶液(默克)(TBS-T)中洗涤，并在室温下在5％w/v无脂奶粉(Roth)中封闭1h。然后，膜在TBS-T中再次洗涤，并在4℃下在具有适当一抗的5％w/v BSA(Roth)中温育过夜。使用下列抗体：兔抗人p-mTOR(5536；细胞信号)、兔抗人mTOR(2983；细胞信号)以及兔抗人GAPDH(2118；细胞信号)。洗涤后，膜在室温下与具有辣根过氧化物酶标记的二抗(山羊抗兔IgG；7074；细胞信号)的5％w/v无脂奶粉中温育1h。使用增强的化学发光检测试剂(ECL先进蛋白质印迹检测试剂盒，通用电气医疗)和适当的X射线胶片(通用电气医疗)检测结合的抗体。检测后，将膜在70℃下剥离(2％SDS，62.5mM Tris-HCl，pH 6.7和100mMβ-巯基乙醇)30分钟，并与适当二抗温育。

免疫组织化学染色

心肌组织用4％福尔马林固定过夜，石蜡包埋，并切割3μm切片并干燥。分别地，对于hCD46，热诱导抗原修复在靶标修复溶液(Target Retrieval solution)(S1699，达科)中、在沸水浴中进行20min，对于hTM，热诱导抗原修复在pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液中、在蒸锅中进行45min。使用以下一抗进行免疫组织化学：小鼠抗人CD46单克隆抗体(HM2103，Hycult生物技术)和小鼠抗人血栓调节蛋白单克隆抗体(sc-13164，圣克鲁兹)。二抗是生物素化的AffiniPure山羊抗小鼠IgG(115-065-146，杰克逊免疫研究(JacksonImmunoResearch))。使用3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐二水合物(DAB)(棕色)观察免疫反应性。用苏木精明矾(蓝色)完成核复染(nuclear counterstaining)。

统计分析

对于存活数据，绘制卡普兰-迈耶曲线，并使用Mantel-Cox对数秩检验确定组之间的显著性差异。对于血液动力学数据，使用如所示的未配对和配对的Student’s t-检验确定统计学显著性；数据以单次测量表示，以条作为组平均值±s.d.。对于组织化学分析，使用了Holm-Sidak的多重比较的单向方差分析来确定统计学显著性；数据为平均值±s.d.；P<0.05被认为是显著的。没有使用统计学方法来预先确定样品尺寸。实验不是随机的，研究者在实验和结果评估期间对分配不是设盲的(blinded)。

免疫抑制方案、抗炎和附加疗法的综合概述以及相应的剂量和时间间隔

实施例5：基因修饰猪中人α1,2-岩藻糖基转移酶基因的识别

如上所述，实施例1-4中使用的供体猪对α1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GT-KO)是纯合的，对hCD46/血栓调节蛋白(hTM)是转基因的(Revivicor，布莱克斯堡，弗吉尼亚州，美国；和分子动物繁育与生物技术研究所，基因中心，兽医学院，路德维希-马克西米利安斯大学，慕尼黑，德国)。当对转基因猪的基因组进行纳米孔测序时，出乎意料地发现，在多个hCD46小基因拷贝的阵列中，基因组含有额外的转基因的两个拷贝，即人α1,2-岩藻糖基转移酶基因的两个拷贝(图16)。在本发明的异种供体生物体的基因修饰的心脏/肾脏/肺/肝脏中，人α1,2-岩藻糖基转移酶的表达可能有助于避免移植到灵长目动物后的异种移植体排斥(也参见参考文献112)。

实施例6：用于心脏异种移植的基因修饰猪的产生

心脏移植仍然是终末期心脏衰竭患者的首选治疗，但是对捐赠的人体器官的需求远远超过供应，并且迫切需要替代方案。在具有三重修饰的供体心脏(GTKO/hCD46/hTM)的狒狒的异位腹部异种移植(参见参考文献5)和生命支持的原位心脏异种移植(参见实施例1-4)中，已经取得了显著的进展。GTKO/hCD46背景由Revivicor公司，布莱克斯堡，弗吉尼亚供应；由猪THBD基因启动子控制的hTM转基因被加入(参见参考文献37)。然而，这个遗传背景并非没有PERV-C，hCD46转基因基因座的结构尚未阐明，hTM转基因位于不同的整合位点，使通过繁育(breeding)进行的动物的繁殖(propagation)复杂化。因此，将在无PERV-C背景下重新建立GTKO/hCD46/hTM猪，额外地将敲除CMAH和B4GALNT2基因。

为了重新建立GTKO/hCD46/hTM猪，将实行以下策略：随机插入到基因组中的转基因的表达在很大程度上取决于邻近染色质的环境。这些所谓的位置效应导致不同转基因系之间的可变转基因表达，并且通常导致一个系内的不一致表达。避免随机转基因插入的这些缺点的策略是将表达盒靶向放置到具有开放构型并确保稳定转基因表达的所谓“安全港”基因座中。

因此，首先识别了有利的安全港。在猪内皮野生型细胞中发现，CMAH的转录水平与B4GALNT2的转录水平相似，而GGTA1的转录水平高约5倍。此外，在猪心脏中发现，GGTA1的表达比CMAH或B4GALNT2的表达高20至30倍(图17)。同样对于猪肝脏和脂肪组织，发现GGTA1的表达高于CMAH或B4GALNT2的表达(图17)。因此，发现GGTA1在多种组织和细胞类型中被高度表达，最重要的是在内皮细胞中被表达，使其成为转基因放置的有利安全港。几种异种保护性转基因到该安全港中的靶向整合，还防止了它们在繁育期间的分离。

因此，为了重新建立GTKO/hCD46/hTM猪，将使用CRISPR/Cas技术在无PERV-C仔猪的雄性和雌性细胞中灭活GGTA1、CMAH和B4GALNT2基因。hCD46小基因将置于内源性猪GGTA1启动子的控制下，然后是loxP位点侧面的可选标记基因、以及带有猪THBD启动子的hTM表达盒。雄性和雌性的原代肾脏细胞将通过该基因修饰碱基集(basic set)而建立，并且仔猪将通过核转移而产生并通过繁育而繁殖。通过与细菌人工染色体(BAC)载体的Cre驱动的盒式交换，可以将其他修饰添加到该基因座，该细菌人工染色体(BAC)载体通过重组工程进行改造以携带一种或多种额外的表达盒(图18)。所需基因修饰的存在将通过PCR评估。将通过RT-PCR和免疫荧光分析进行对单细胞克隆的表达研究。

实施例7：猪生长激素受体(GHR)基因的敲除，以调节异种移植器官的尺寸

当异种供体生物体(例如，猪)的基因修饰的器官被移植到受体生物体(例如，狒狒)中时，受体生物体中的器官过度生长是一个主要的问题。因为异种移植猪器官的生长控制不仅在临床前猪到狒狒移植实验中很重要，而且对于临床移植研究也很重要，因此寻求了一种遗传方法来一步降低猪的尺寸。这样避免了用mTOR抑制剂，例如用雷帕霉素，对受体进行长期治疗。

人生长激素受体(GHR)基因的功能缺失突变会导致特征是生长迟缓和肥胖的莱伦氏综合征，但会降低癌症和糖尿病的发生率，并增加寿命(参见参考文献89)。因此，首先测试了GHR敲除对野生型猪的背景的影响(参见参考文献86)。设计了CRISPR/Cas9系统，并将其注射到猪受精卵中，以突变GHR基因的外显子3。将两只在GHR外显子3中插入1-bp或7-bp的杂合创始(founder)母猪(GHR+/-)(导致读框移位；图19)与野生型公猪(德国长白猪)交配，以获得杂合F1猪，其杂交以产生GHR-/-(KO)猪。GHR-KO猪缺乏GHR(图20)，并且具有明显降低的血清胰岛素样生长因子1(IGF1)水平(图21A)以及降低的IGF结合蛋白3(IGFBP3)活性，但是具有增加的IGFBP2水平(图21B)。与对照猪相比，血清GH浓度显著升高(图21C)。GHR-KO猪具有正常的出生体重。生长迟缓在五周龄时变得明显。在六月龄时，与对照相比，GHR-KO猪的体重降低了60％(图22A，图22B)。GHR-KO猪的大多数器官重量与体重成比例地降低(图23A，图23B)。然而，肝脏、肾脏和心脏的重量不成比例地降低，而相对的大脑重量几乎增加了一倍(图23A，图23B)。GHR-KO猪的总体脂相对于体重的百分比显著增加(图24A)，并表现出短暂的幼年低血糖症(图24B)伴血清甘油三酯和胆固醇水平减少(图24C，图24D)。对成年禁食猪的肝脏中胰岛素受体相关信号的分析显示，IRS1和PI3K的磷酸化增加。与GHR的缺失一致，STAT5的磷酸化显著降低(参见参考文献86)。

GHR-/-公猪和GHR-/-母猪的交配产仔6只健康的GHR-/-仔猪，其出生体重(808±103g)小于(p<0.001)杂合父母的GHR-/-后代(1331±298g)。前者的体重在约16周龄时就追上了后者(8.2±1.6kg相对于7.3±1.9kg；p＝0.36)。

因为GHR缺陷对野生型猪的背景没有不利影响，因此GHR-KO突变也被引入到成功进行心脏异种移植的GGTA1-KO、hCD46/hTBM转基因背景中(图25)。第一批仔猪出生并显示出与野生型背景下的GHR-KO猪相同程度的生长迟缓。具体而言，两只9月龄的GHR-KO、GGTA1-KO、hCD46/hTBM转基因猪的体重为70.3kg和73.4kg。野生型猪三个月前就具有这样的体重。循环IGF1水平为23.5±0.7ng/mL，相比之下，仅GHR-KO的猪为33.8±1.5ng/mL(平均值±SD)以及野生型对照为215.5±141.2ng/mL。

以上可能对临床异种移植具有重要意义，因为

i)对于许多患者来说，农场猪的器官太大了；

ii)具有更合适的器官尺寸的迷你猪，具有高载量的猪内源性逆转录病毒(PERVs)(参见参考文献87)；

iii)GHR-KO猪及其器官的尺寸可以通过用重组胰岛素样生长因子1(IGF1)的处理进行调节(在参考文献88中综述的)，以适应受体的需要；以及

iv)GHR缺陷已被证明对细胞和组织的抗逆性是有益的(参见参考文献89)，最终导致异种移植体寿命的增加。

关于上面的第iii)方面，需要指出的是，当GHR-KO猪及其器官的尺寸被调节到适应受体生物体的需求时，有益的尺寸效应在GHR缺陷的器官被移植到IGF1完整异种受体中时将不会消失。这是因为GHR缺陷的供体猪可以在更大的年龄(超出其生长曲线的最陡峭阶段)时使用。此外，局部产生的IGF1对器官生长比肝脏衍生的循环IGF1更重要(参见参考文献114)。因此，根据本发明，可以通过用IGF1处理供体猪将GHR缺陷的器官的尺寸调节至受体的需求。

使用CRISPR/Cas产生野生型背景的GHR突变猪

该研究中的所有动物程序均由负责的动物福利机构(Regierung vonOberbayern；许可55.2-1-54-2532-70-12)批准，并且根据德国动物福利法和关于保护用于科学目的的动物的第2010/63/EU号指令进行。

对于使用特异于外显子3序列5′-TTCATGCCACTGGACAGATG-3′(SEQ ID NO：8)的单导向RNA(sgRNA)的CRISPR/Cas辅助的GHR基因中断(gene disruption)，如之前所述，相应的寡核苷酸被克隆到pEX-A-U6-gRNA载体中(参见参考文献90)。使用Ambion MaxiscriptSP6试剂盒(赛默飞世尔科学)在体外转录Cas9 mRNA和sgRNA。

如先前所述的，猪受精卵(德国长白猪背景)在体外被产生(参见参考文献91)，并且在体外受精8.5-9.5h后将Cas9 mRNA(50ng/μL)和sgRNA(100ng/μL)注射到它们的细胞质中。通过口服施用4mL烯丙孕素(Altrenogest)(

使用Wizard DNA提取试剂盒(普洛麦格(promega))从仔猪的尾尖分离基因组DNA。通过对GHR外显子3PCR产物进行测序来检测GHR突变，该GHR外显子3PCR产物是使用引物GHR_Fw 5′-acc gct ctg aag ctg tga cc-3′(SEQ ID NO：9)以及GHR_Rv 5′-cac cct cagata ctc tca tgc-3′(SEQ ID NO:10)获得的。基于检测到的突变，建立了Xcml限制片段长度多态性测定(restriction fragment length polymorphism assay)，对于野生型GHR产生了203bp和441bp的片段，而对于突变的GHR序列产生了644bp的单个片段。

将两只具有不同移码突变(frame shift mutation)的雌性创始动物与野生型公猪交配，以产生杂合的F1后代。将同一创始的杂合后代进行杂交以获得具有相应的GHR突变的纯合动物(GHR-KO)。

GGTA1-KO、hCD46/h TBM转基因背景的GHR突变猪的产生

该研究中的所有动物程序均有负责的动物福利机构(Regierung vonOberbayern；许可55.2-1-54-2532-70-12)批准，并且根据德国动物福利法和关于保护用于科学目的的动物的第2010/63/EU号指令进行。

原代细胞从雌性GGTA1-KO、hCD46/hTBM转基因猪中分离。使用特异于猪GHR外显子3的Cas9表达质粒(CMV-Cas9；参见参考文献111)以及转录ttcatgccactggacaGAtgGGG(SEQID NO:11)gRNA(在PAM下面划线)的质粒，将细胞共转染。产生单细胞克隆；用引物对5′-gcacacttcagatgctacctaa(SEQ ID NO：12)以及5′-cacatgctcaccctcagatac(SEQ ID NO：13)扩增猪GHR基因的PCR产物；使用引物5′-accgctctgaagctgtgacc(SEQ ID NO:14)和5′-caggagaccagagaccttatct(SEQ ID NO:15)，进行PCR产物的桑格(Sanger)测序，并通过双向桑格测序分析移码突变。携带有害突变的双等位基因群(constellation)(ctggacagatggggt(SEQ ID NO：16)/ctggacagatggggt(SEQ ID NO:16)→ctgTCC-Atggggt(SEQ ID NO:17)/ctggacag---gggt(SEQ ID NO:18))的细胞克隆被用于体细胞核转移。

通过口服施用4mL烯丙孕素(

使用Wizard DNA提取试剂盒(普洛麦格)从仔猪的尾尖分离基因组DNA。通过对GHR外显子3PCR产物进行测序来检测GHR突变，该GHR外显子3PCR产物是使用引物GHR_Fw 5′-acc gct ctg aag ctg tga cc-3′(SEQ ID NO：9)以及GHR_Rv 5′-cac cct cag ata ctctca tgc-3′(SEQ ID NO:10)获得的。基于检测到的突变，建立了Xcml限制片段长度多态性测定，对于野生型GHR产生了203bp和441bp的片段，而对于突变的GHR序列产生了644bp的单个片段。

出生了四只雌性GTKO.hCD46.hTBM.GHRKO，并且通过桑格测序确认了携带相应的突变基因群。四只仔猪中的两只在产后第一天死亡，另外两只仔猪长到成年，没有临床问题。

猪GHR的配体免疫染色(仅野生型背景)

将GHR-KO和对照猪的肝脏和肾脏组织在4％福尔马林中固定过夜，并常规地包埋在石蜡中。将石蜡切片脱蜡，并分别地用Tris缓冲盐水(TBS)中的1％H

血液采集

在从颈静脉血液采集之前，动物被禁食过夜(16小时)。在室温下凝血30分钟后，通过在6℃下离心(1200×g)20分钟来分离血清，并且在-80℃下保存直至分析。为了分析GH分泌概况(profile)所需的重复取血样，将中心静脉导管(Argon Careflow

临床化学，激素测定，IGFBP配体印迹分析(仅野生型背景)

分别使用Cobas 311系统(日立)或AU480自动分析仪(贝克曼-库尔特(Beckman-Coulter))和来自罗氏诊断或贝克曼-库尔特的改良试剂，确定血清中的临床化学参数。通过ELISA测量与猪GH交叉反应的大鼠/小鼠GH(EZRMGH-45K；默克)的血清GH浓度。为了计算GH曲线下的面积，将低于测定的定量极限(<0.07ng/mL)的值任意设定为0.07ng/mL。通过酸化从IGFBP中分离IGF1并用过量的IGF2阻断IGF1结合位点后，通过RIA确定血清中的IGF1水平(参见参考文献94)。如先前所述(参见参考文献95)进行血清样品的IGFBP配体印迹分析，使用重组人IGFBP3(41/38kDa)、IGFBP2(32kDa)、IGFBP5(29kDa)以及IGFBP4(24kDa)的系列稀释进行定量。如先前所述(参见参考文献96)，使用物种特异性RIA(默克密理博)确定血浆胰岛素。立即使用Precision

生长参数和体成分

以每周间隔确定GHR-KO和对照猪的体重和体长(直立动物的鼻尖和尾根之间的距离)。相对体长通过体长除以体重的立方根来计算，以保持相同大小。因为并非所有动物都可以在完全相同的年龄时称重/测量，因此通过线性插值将原始数据调节为定义的年龄/时间点。

如前所述地使用双能X射线吸收法(DXA；Lunar iDXA，通用电气医疗)确定了6个月大的GHR-KO和对照猪的总体脂百分比(参见参考文献99)。另外，进行磁共振成像(MRI；Magnetom Open，西门子)(参见参考文献100)以使肌肉与脂肪的比例可视化，并将其确定为背最长肌面积除以其最后一根肋骨处上覆的背脂面积。

尸检(仅野生型背景)

在6月龄时，通过在麻醉下静脉注射

信号级联的免疫印迹分析(仅野生型背景)

如先前所述，通过蛋白质印迹分析评估肝脏中的GHR相关信号分子的浓度和磷酸化状态(参见参考文献102)。简而言之，肝脏组织样品在Laemmli提取缓冲液中均质处理，并通过二喹啉甲酸蛋白测定法测定蛋白含量。通过SDS-PAGE分离40微克的总蛋白，并通过电印迹转移至PDVF膜(密理博)。膜在含有0.1％吐温-20的TBS中洗涤，并在室温下用5％w/v无脂奶粉(Roth)中封闭1h。然后膜再次洗涤，并在4℃下在具有适当一抗的5％w/v BSA(Roth)溶液中温育过夜。附表1中列出了使用的抗体和浓度。洗涤后，将膜在具有二抗(驴抗兔；1:2000；通用电气医疗)的5％w/v无脂奶粉溶液中温育1小时。使用ECL先进蛋白质印迹检测试剂盒(通用电气医疗)和来自同一供应商的适当的胶片来检测结合的抗体。使用ImageQuant软件包(通用电气医疗)对谱带强度进行量化。

统计分析(仅野生型背景)

使用PROC MIXED(SAS 8.2)分别分析了体重和体长或相对体长的纵向数据，考虑了猪系(#2529；#2533)、组(GHR-KO；对照)、性别、年龄和组*年龄相互作用的影响。针对组*年龄计算最小二乘均值(LSMs)和LSM的标准误差(SE)，并使用Student's t-检验进行比较。使用PROC GLM(SAS 8.2)分析了葡萄糖稳态和血脂浓度的数据，考虑了组、性别、年龄和组*年龄相互作用的影响。针对组*年龄计算LSM和SE，并使用Student's t-检验进行比较。考虑组和性别的影响，使用PROC GLM分析了体成分、器官重量和临床化学数据。针对组计算LSM和SE，并使用Student's t-检验进行比较。使用曼-惠特尼(Mann-Whitney)U检验评估了GHR-KO与对照猪之间IGFBP配体印迹和蛋白质免疫印迹数据的显著差异。

工业实用性

本发明的方法、过程和产品在商业上是有用的。例如，根据本发明的组合物可出售以延长已经被移植了来自异种哺乳动物的心脏、肾脏、肺或肝脏的灵长目动物的存活。根据本发明的活的灵长目动物可用于发现新的组合物和/或治疗方案，以进一步延长已经被移植了异种心脏、肾脏、肺或肝脏的灵长目动物的存活。用于异种器官移植物的供体生物体可用于获得用于异种移植的器官。因此，本发明具有工业实用性。

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序列表

<110> 布鲁诺·瑞卡特

<120> 原位和异位异种心脏、肾脏、肺或肝脏移植后延长存活的方法和组合物

<130> 213 592

<150> EP 18 165 107.6

<151> 2018-03-29

<150> US 62/650,085

<151> 2018-03-29

<160> 18

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 1152

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化变体 LEA29Y

<400> 1

atgggggtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60

agcatggcga gcatggcgat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120

ggcatcgcca gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aatatactga ggtccgggtg 180

acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240

gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300

gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360

gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420

attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480

acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 540

ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600

gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660

cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc 720

gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780

aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840

gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900

ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960

gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020

ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080

tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140

ccgggtaaat ga 1152

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 猪

<220>

<223> GHR 野生型

<400> 2

tagagacttt ttcatgccac tggacagatg gggtccgtca cgg 43

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GHR 突变体 #2529

<400> 3

tagagacttt ttcatgccac tggacaggat ggggtccgtc acgg 44

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GHR 突变体 #2533

<400> 4

tagagacttt ttcatgccac tggacagggc atggatgggg tccgtcacgg 50

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 猪

<220>

<223> GHR 野生型

<400> 5

ctggacagat ggggt 15

<210> 6

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GHR 突变体

<400> 6

ctgtccatgg ggt 13

<210> 7

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GHR 突变体

<400> 7

ctggacaggg gt 12

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 猪

<220>

<223> GHR

<400> 8

ttcatgccac tggacagatg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

accgctctga agctgtgacc 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

caccctcaga tactctcatg c 21

<210> 11

<211> 23

<212> RNA

<213> 猪

<220>

<223> GHR

<400> 11

ttcatgccac tggacagatg ggg 23

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>引物

<400> 12

gcacacttca gatgctacct aa 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

cacatgctca ccctcagata c 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

accgctctga agctgtgacc 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>引物

<400> 15

caggagacca gagaccttat ct 22

<210> 16

<211> 15

<212> DNA

<213> 猪

<220>

<223> GHR

<400> 16

ctggacagat ggggt 15

<210> 17

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GHR 突变体

<400> 17

ctgtccatgg ggt 13

<210> 18

<211> 12

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> GHR 突变体

<400> 18

ctggacaggg gt 12