技术领域
本发明涉及一种大豆11S球蛋白盐酸胍变性处理后稀释复性的方法，属于蛋白质的复性技术领域。
背景技术
蛋白质在热、高压以及外加一些化学试剂等处理条件下会发生变性现象，从而导致部分生物活性的丧失，对于可逆变性蛋白来说，当其变性程度较小时，如若将变性因素除去或改变它们所处环境，这些变性蛋白能部分恢复甚至全部恢复其原来的构象及功能，目前研究蛋白质变性常用的方法有改变pH值、加热、外加变性剂(如盐酸胍、脲)等，常用来进行复性研究的蛋白质结构较为简单，常见的有牛血清白蛋白、溶菌酶、碱性磷酸酶等。而对于大豆蛋白复性现象鲜有人研究，因此，提供一种大豆11S球蛋白盐酸胍变性处理后稀释复性的方法是十分必要的。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种操作简单，效率高的大豆11S球蛋白盐酸胍变性后稀释复性的方法。
一种大豆11S球蛋白盐酸胍变性处理后稀释复性的方法，该方法包括以下步骤：
步骤一，将大豆11S球蛋白进行冷冻干燥处理，获得大豆11S球蛋白粉；
步骤二，将步骤一处理后的大豆11S球蛋白粉使用盐酸胍溶液进行变性处理，获得变性蛋白溶液；
步骤三，将变性蛋白溶液使用PBS缓冲液进行稀释，对变性蛋白溶液进行复性处理，获得复性蛋白液。
进一步地，步骤一中冷冻干燥处理条件为：处理温度为-45℃，处理时间为24h。
进一步地，步骤二中盐酸胍溶液的浓度为8mol/L。
进一步地，步骤二中获得变性蛋白溶液的浓度为1mg/mL～20mg/mL。
进一步地，步骤二中变性处理条件为：将大豆11S球蛋白粉和盐酸胍溶液混合，磁力搅拌30min后，25℃下放置8h。
进一步地，步骤三中PBS缓冲液为0.01mol/L，pH值为7.0的磷酸盐缓冲液。
进一步地，步骤三获得的复性蛋白液中盐酸胍的浓度为0.4～8mol/L。
进一步地，步骤三获得的复性蛋白液中蛋白质浓度为1mg/mL。
进一步地，步骤三中复性处理条件为：将变性蛋白溶液和PBS缓冲液混合，磁力搅拌30min后，25℃下放置12h。
进一步地，步骤三中获得的复性蛋白液的黏度为87mPa.s。
本发明具有以下有益效果：本发明采用盐酸胍对大豆11S球蛋白进行变性处理，经PBS缓冲溶液稀释复性后，部分二级结构三级结构得以恢复，并且其黏度大大提高，这一方法简单稳定，对于提高大豆蛋白的利用价值意义重大，对于大豆蛋白胶粘剂的研制和开发利用提供支持和帮助。
附图说明
图1为实施例1至实施例7制备的含有不同盐酸胍浓度的复性蛋白液中大豆11S球蛋白的二级结构；
图2为实施例1至实施例7制备的含有不同盐酸胍浓度的复性蛋白液中大豆11S球蛋白的三级结构；
图3为实施例1至实施例7制备的含有不同盐酸胍浓度的复性蛋白液的黏度。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
实施例1：
步骤一：大豆磨碎过筛，脱脂，提取大豆11S球蛋白后进行冷冻干燥。
步骤二：将冷冻干燥后的大豆11S蛋白粉用8M的盐酸胍进行变性处理，磁力搅拌30min，25℃下放置8小时，得到完全变性态蛋白溶液，其中盐酸胍浓度为8M，大豆蛋白的浓度为1mg/mL。
对获得的完全变性态蛋白溶液采用圆二色谱法进行二级结构、三级结构的检测，粒度仪进行粒径的检测，黏度仪对黏度进行检测，结果如图1、图2、图3和表1所示。
实施例2：
步骤一：大豆磨碎过筛，脱脂，提取大豆11S球蛋白后进行冷冻干燥。
步骤二：将冷冻干燥后的大豆11S蛋白粉用8M的盐酸胍进行变性处理，磁力搅拌30min，25℃下放置8小时，得到变性蛋白溶液，其中大豆蛋白的浓度为2mg/mL。
步骤三：将变性蛋白溶液用0.01M，pH7.0的PBS缓冲液进行稀释，使得变性剂盐酸胍的浓度降低获得复性蛋白液，其中盐酸胍浓度降低为4M，蛋白质浓度为1mg/mL，磁力搅拌30min，复性温度为25℃，时间为12h。
对获得的复性蛋白液，采用圆二色谱法进行二级结构、三级结构的检测，粒度仪进行粒径的检测，黏度仪对黏度进行检测，结果如图1、图2、图3和表1所示。
实施例3：
步骤一：大豆磨碎过筛，脱脂，提取大豆11S球蛋白后进行冷冻干燥。
步骤二：将冷冻干燥后的大豆11S蛋白粉用8M的盐酸胍进行变性处理，磁力搅拌30min，25℃下放置8小时，得到变性蛋白溶液，其中大豆蛋白的浓度为4mg/mL。
步骤三：将变性蛋白溶液用0.01M，pH7.0的PBS缓冲液进行稀释，使得变性剂盐酸胍浓度降低获得复性蛋白液，其中盐酸胍变性剂浓度降低为2M，蛋白质浓度为1mg/mL，磁力搅拌30min，复性温度为25℃，时间为12h。
对获得的复性蛋白液，采用圆二色谱法进行二级结构、三级结构的检测，粒度仪进行粒径的检测，黏度仪对黏度进行检测，结果如图1、图2、图3和表1所示。
实施例4：
步骤一：大豆磨碎过筛，脱脂，提取大豆11S球蛋白后进行冷冻干燥。
步骤二：将冷冻干燥后的大豆11S蛋白粉用8M的盐酸胍进行变性处理，磁力搅拌30min，25℃下放置8小时，得到变性蛋白溶液，其中大豆蛋白的浓度为8mg/mL。
步骤三：将变性蛋白溶液用0.01M，pH7.0的PBS缓冲液进行稀释，使得变性剂盐酸胍浓度降低获得复性蛋白液，其中变性剂盐酸胍浓度降低为1M，蛋白质浓度为1mg/mL，磁力搅拌30min，复性温度为25℃，时间为12h。
对获得的复性蛋白液，采用圆二色谱法进行二级结构、三级结构的检测，粒度仪进行粒径的检测，黏度仪对黏度进行检测，结果如图1、图2、图3和表1所示。
实施例5：
步骤一：大豆磨碎过筛，脱脂，提取大豆11S球蛋白后进行冷冻干燥。
步骤二：将冷冻干燥后的大豆11S蛋白粉用8M的盐酸胍进行变性处理，磁力搅拌30min，25℃下放置8小时，得到变性蛋白溶液，其中大豆蛋白的浓度为10mg/mL。
步骤三：将变性蛋白溶液用0.01M，pH7.0的PBS缓冲液进行稀释，使得变性剂盐酸胍浓度降低获得复性蛋白液，其中变性剂盐酸胍浓度降低为0.8M，蛋白质浓度为1mg/mL，磁力搅拌30min，复性温度为25℃，时间为12h。
对获得的复性蛋白液，采用圆二色谱法进行二级结构、三级结构的检测，粒度仪进行粒径的检测，黏度仪对黏度进行检测，结果如图1、图2、图3和表1所示。
实施例6：
步骤一：大豆磨碎过筛，脱脂，提取大豆11S球蛋白后进行冷冻干燥。
步骤二：将冷冻干燥后的大豆11S蛋白粉用8M的盐酸胍进行变性处理，磁力搅拌30min，25℃下放置8小时，得到变性蛋白溶液，其中大豆蛋白的浓度为20mg/mL。
步骤三：将变性蛋白溶液用0.01M，pH7.0的PBS缓冲液进行稀释，使得变性剂盐酸胍浓度降低获得复性蛋白液，其中变性剂盐酸胍浓度降低为0.4M，蛋白质浓度为1mg/mL，磁力搅拌30min，复性温度为25℃，时间为12h。
对获得的复性蛋白液，采用圆二色谱法进行二级结构、三级结构的检测，粒度仪进行粒径的检测，黏度仪对黏度进行检测，结果如图1、图2、图3和表1所示。
实施例7：
步骤一：大豆磨碎过筛，脱脂，提取大豆11S球蛋白后进行冷冻干燥。
步骤二：将冷冻干燥后的大豆11S蛋白粉用0.01M，pH7.0的PBS缓冲液进行溶解，蛋白质浓度为1mg/mL，盐酸胍浓度为0M，磁力搅拌30min，获得天然态蛋白溶液。
对获得的天然态蛋白溶液，采用圆二色谱法进行二级结构、三级结构的检测，粒度仪进行粒径的检测，黏度仪对黏度进行检测，结果如图1、图2、图3和表1所示。
结果分析：
表1数据如下所示：
表1
由表1可知，天然态的11S粒径大小在67.32nm，经8M GuHCl变性后，粒径增大到201.3nm；由图1可看出此时蛋白质已失去其三级结构，图2显示此时蛋白质的二级结构几乎完全丧失，这是因为GuHCl可以与蛋白质中的各种极性氨基酸的侧链以及肽键中的羰基和亚氨基形成氢键，从而改变天然蛋白质内部的氢键结构，使肽链松散。
变性后的11S经磷酸盐缓冲溶液进行稀释，由粒径的实验结果我们不难看出，随着GuHCl浓度的降低，蛋白质粒径均逐渐减小，向天然态接近，近紫外结果显示盐酸胍的浓度降低到1M时，在284nm处的正峰开始逐渐增高，随着磷酸盐缓冲溶液的加入，GuHCl的浓度不断降低，当其浓度为0.4M时，在284nm处的正峰已经很接近天然态；远紫外结果表明随着变性剂浓度的降低，蛋白质光谱中的负峰开始向更低波长移动，当盐酸胍的浓度降低到0.4时，变化不再明显，此时，蛋白质的部分β-折叠、α-螺旋逐渐恢复，蛋白质的结构变得更加有序，向天然态逐渐靠近，但是与天然态相比，仍有部分二级结构缺失。这是因为通过稀释，展开的蛋白质肽链因所处环境中变性剂浓度降低，而发生复性。
由图3我们可以看出，当盐酸胍的稀释浓度为4M时，此时粘度最高，达到了87mPa.s，这是由于这是由于表面电荷的增加，分子间斥力的增加以及蛋白质的分子结构松散所致，而一般胶粘剂的粘度范围在85～115mPa.s。因此，在工业生产中可以考虑将其应用在胶粘剂等方面。
机译： 大豆7S球蛋白和11S球蛋白的分级分离及其生产方法
机译： 大豆7S球蛋白和11S球蛋白的分级分离及其生产方法
机译： 7 11大豆7球蛋白和11球蛋白的馏分及其制备方法
