相关申请的交叉引用
本申请要求2018年6月8日提交的美国临时专利申请号62/763,299的权益，该美国临时专利申请以引用方式整体并入本文中。
背景技术
本文描述了核碱基、包含核碱基的聚合物单体以及包含核碱基的核酸及其类似物。本文还描述了核碱基、包含核碱基的聚合物单体以及包含核碱基的核酸及其类似物的使用方法。
对于大多数生物体来说，遗传信息以沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对(其中腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)配对且胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)配对)的形式编码在双链DNA中。取决于该遗传信息的哪组通过转录和翻译被解码，将确定发育程序和生理状态。开发可被定制设计成序列特异性地结合该遗传生物聚合物(DNA或RNA)的任何部分的分子，从而使得能够控制遗传信息的流动并评估和操作基因组的结构和功能，对于努力解开生命的分子基础的生物学和生物医学研究(包括用于生物学中的基础研究的分子工具)是重要的。这种努力对于治疗和检测遗传疾病的医学和治疗应用也是重要的。
寡核苷酸在其作为用于生物学中的基础研究的分子工具以及用于治疗和诊断应用的分子试剂(例如在遗传疾病的治疗和检测中)的用途方面是通用的。通常，寡核苷酸分子是单链DNA或RNA或其衍生物的短片段(长度为10-30个核苷酸)。它们可包括连接到腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)或尿苷(U)核碱基的糖磷酸二酯主链或其他主链。它们被设计成通过沃森-克里克碱基配对(其中A与T(或U)配对且C与G配对)结合至DNA或RNA靶标。寡核苷酸分子已被用于宽范围的应用中，包括例如核酸序列信息的查询、RNA结构的操作和基因表达的调控。许多这些应用的成功依赖于寡聚物以紧密和序列特异性的方式结合DNA或RNA靶的能力。对细胞内和体内基因靶向的另外要求包括酶促稳定性和细胞渗透性。
发明内容
提供一种基因识别试剂，其包含连接到核酸主链或核酸类似物主链的多个核碱基部分，其中至少一个核碱基部分是：
其中，X
还提供一种化合物，其包含连接到核碱基部分的核酸主链单体或核酸类似物主链单体，所述核碱基部分具有以下结构：
其中，X
附图说明
图1示出了(A)修饰的核碱基与修饰的核碱基(同源双链体)的氢键合相互作用、(B)天然的核碱基与天然的核碱基的氢键合相互作用、(C)修饰的核碱基与天然的核碱基(异源双链体)的氢键合相互作用。
图2是显示新设计的寡核苷酸分子在能够选择性地靶向RNA二级结构方面提供的独特优势的示意图。(A)尽管有(a'/a)序列互补性，但含有修饰的(u、c、a和g)核碱基的PNA寡聚物(手性或非手性)不可采用发夹结构，并且能够与其互补的茎-环RNA靶标杂交。(B)紧密结合的寡核苷酸分子(诸如LNA或yPNA)能够侵入茎-环结构，但其在治疗和诊断中的应用由于非特异性结合而构成了相当大的风险。(C)中等亲合力的寡核苷酸，即大多数寡核苷酸分子所落入的类别，由于缺乏结合自由能或由于形成动力学(发夹)陷阱(trap)而不能打开茎-环结构。
图3示意性地描绘了RNA(A)二级结构和(B)三级结构的示例，本文所述的寡核苷酸分子能够选择性地靶向这些结构，否则用现有核酸系统难以实现。
图4提供示例性核碱基的结构。
图5描绘核酸类似物的示例性核酸类似物残基，包括：硫代磷酸酯DNA(PS DNA)、α,β-受限核酸(α,β-CNA)、2’-甲氧基RNA、2’-氟RNA、二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)、锁核酸(LNA)、2′,4′-受限乙基核酸((S)-cEt)、2’,4’桥连核酸NC(N-H)(BNA-NC(N-H))、2’,4’桥连核酸NC(N-甲基)(BNA-NC(N-Me))、((S)-5’-C-甲基DNA(RNA))和5’-E-乙烯基膦酸酯核酸(E-VP)，其中R是H、OH、F、OMe或O(CH
图6提供用于所选核碱基的示例性合成方案。
图7提供用于所选细胞渗透性γPNA单体的示例性合成方案。
具体实施方式
除非另有明确说明，否则本申请中指定的各种范围中的数值的使用是以近似值来陈述，如同所陈述范围内的最小值和最大值两者之前都有词语“约”。以这种方式，可使用在所述范围之上和之下的轻微变化来实现与所述范围内的值基本上相同的结果。此外，除非另外指明，否则范围的公开意在作为包括最小值和最大值之间的每个值的连续范围。如本文所用，“一(a/an)”是指一或多。
如本文所用的术语“包含”是开放式的，并且可与“包括”、“含有”或“特征在于”同义。如本文所用，“包含”一个或多个所述要素或步骤的实施方案还包括但不限于“基本上由这些所述要素或步骤组成”和“由这些所述要素或步骤组成”的实施方案。
术语“聚合物组合物”是包含一种或多种聚合物的组合物。作为一类，“聚合物”包括但不限于均聚物、杂聚物、共聚物、嵌段聚合物、嵌段共聚物，并且可以是天然的，也可以是合成的。均聚物含有一种类型的构建单元或单体，而共聚物含有超过一种类型的单体。“寡聚物”是包含少量单体(诸如例如3到100个单体残基)的聚合物。因此，术语“聚合物”包括寡聚物。术语“核酸”和“核酸类似物”包括核酸以及核酸聚合物和寡聚物。
如果所述单体被掺入聚合物中，则该聚合物“包含”该单体或“衍生自”该单体。因此，聚合物所包含的掺入的单体与被掺入聚合物中之前的单体不同，原因至少在于某些连接基团被掺入聚合物主链中或某些基团在聚合过程中被去除。如果聚合物中存在特定类型的键连，则称该聚合物包含该键连。所掺入的单体是“残基”。当被掺入聚合物中时，核酸或核酸类似物的典型单体被称为核苷酸或核苷酸残基。
“部分”(多个“部分(moieties)”)是化学化合物的一部分，并且包括基团，诸如官能团。因此，核碱基部分是通过连接到另一化合物部分而被修饰的核碱基，所述另一化合物部分诸如聚合物单体，例如本文所述的核酸或核酸类似物单体，或聚合物，诸如本文所述的核酸或核酸类似物。
“烷基”是指包含1到约20个碳原子的直链、支链或环状烃基，例如且不限于C
“取代的烷基”是指在1个或更多个(例如，1、2、3、4、5或6个)位置处取代的烷基，所述取代基在任何可用原子处连接以产生具有如本文所述的取代的稳定化合物。“任选取代的烷基”是指烷基或取代的烷基。“卤素”、“卤化物”和“卤代”是指-F、-CI、-Br和/或-I。“亚烷基”和“取代的亚烷基”分别是指二价烷基和二价取代的烷基，包括但不限于亚乙基(-CH
“烯烃或烯基”是指包含2到约20个碳原子的直链、支链或环状烃基，诸如但不限于具有一个或多个(例如1、2、3、4或5个)碳-碳双键的C
“取代的烯烃”是指在1个或更多个(例如，1、2、3、4或5个位置)处取代的烯烃，所述取代基在任何可用原子处连接以产生具有如本文所述的取代的稳定化合物。“任选取代的烯烃”是指烯烃或取代的烯烃。同样，“亚烯基”是指二价烯烃。亚烯基的示例包括但不限于亚乙烯基(-CH＝CH-)以及其所有的立体异构形式和构象异构形式。“取代的亚烯基”指二价取代的烯烃。“任选取代的亚烯基”是指亚烯基或取代的亚烯基。
炔或“炔基”是指具有所示数目的碳原子和至少一个三键的直链、支链或环状不饱和烃。炔或炔基的三键可以是内部的或末端的。(C
术语“亚炔基”是指二价炔。亚炔基的示例包括但不限于亚乙炔基、亚丙炔基。“取代的亚炔基”指二价取代的炔烃。
术语“烷氧基”是指具有所示数目的碳原子的-O-烷基。醚或醚基包括烷氧基。例如，(C
术语“硫醚”是指其中烷基的一个或多个碳原子被-S-基团取代的(C
保护基团(例如，用于在本文所述化合物的合成期间保护胺)是本领域已知的，并且包括但不限于：9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、二苯甲氧基羰基(Bhoc)、苄氧基羰基(Cbz)、O-硝基藜芦氧基羰基(Nvoc)、苄基(Bn)、烯丙氧基羰基(alloc)、三苯甲基(Trt)、二甲氧基三苯甲基(DMT)、l-(4,4-二甲基-2,6-二氧杂亚环己基)乙基(Dde)、二硫杂琥珀酰基(Dts)、苯并噻唑-2-磺酰基(Bts)和单甲氧基三苯甲基(MMT)。
“芳基”，单独或组合是指芳族单环或二环环系，诸如苯基或萘基。“芳基”还包括任选地与环烷基环稠合的芳族环系。“取代的芳基”是独立地被一个或多个在任何可用原子处连接的取代基取代以产生稳定化合物的芳基，其中所述取代基如本文所述。取代基可以是例如烃基、烷基、烷氧基和卤素原子。“任选取代的芳基”是指芳基或被取代的芳基。芳氧基可以是例如被任何芳基(诸如苯氧基)取代的氧原子。芳基烷氧基可以是例如被任何芳烷基(诸如苄氧基)取代的氧原子。
“亚芳基”表示二价芳基并且“取代的亚芳基”是指二价取代的芳基。“任选取代的亚芳基”是指亚芳基或取代的亚芳基。
“杂原子”是指N、O、P和S。含有N或S原子的化合物可任选地氧化成对应的N-氧化物、亚砜或砜化合物。“杂取代的”是指在本文所述的任何实施方案中的有机化合物，其中一个或多个碳原子被N、O、P或S取代。
“环烷基”是指为饱和的、不饱和的或芳族的单环、二环、三环或多环的3-14元环系。环烷基可经由任何原子连接。环烷基还涵盖其中环烷基与芳基或杂芳基环稠合的稠环。环烷基的代表性示例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基和环己基。环烷基可未被取代或任选地被一个或多个如下文所述的取代基取代。“亚环烷基”是指二价环烷基。术语“任选取代的亚环烷基”是指被1、2或3个在任何可用的原子处连接以产生稳定化合物的取代基取代的亚环烷基，其中所述取代基如本文所述。
“羧基”或“羧酸基”是指具有所示数目的碳原子并以-C(O)OH基团封端、因此具有结构-R-C(O)OH的基团，其中R为包括直链烃、支链烃或环状烃的二价有机基团。这些的非限制性示例包括：C
“(C
例如，如本文所述，在较大的分子诸如核酸或核酸聚合物链中，部分诸如核碱基部分、官能团、含胍的基团或含PEG的基团“连接”到分子的其余部分，意味着它直接或通过惰性连接部分共价连接到分子的其余部分。“惰性”意指接头基本上不影响核酸或核酸类似物用于其预期用途的功能。惰性接头的非限制性示例包括例如具有小于15、10或6个碳原子的直链、支链和/或环状烃基或取代烃基部分，诸如亚烷基部分，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基，或芳基，并且所述部分任选地含有杂原子，诸如S原子(例如，硫醚)、N原子(叔胺)或O原子(例如，醚)，和/或连接键，诸如，例如且不限于酯、酰胺、氨基甲酸酯或碳酸酯键连。接头可作为间隔物，用于物理地或空间地分离分子的两个组分。
本文提供核酸和其类似物，统称为“基因识别试剂”，其例如在生理条件下，例如在生理盐水(0.9％wt NaCl)或另一种等渗溶液如Tris缓冲盐水或PBS中，在37℃下特异性结合核酸链。基因识别试剂包含多个核碱基部分，每个核碱基部分连接到核酸主链或核酸类似物主链单体残基，例如，在DNA或RNA的情况下，形成核苷或与磷酸基团形成核苷酸，并且形成包含至少两个核酸或核酸单体残基且因此包含至少两个核碱基部分的更大基因识别试剂的一部分。
在一个方面，基因识别试剂的所有核碱基是如本文所述的修饰的核碱基。在另一实施方案中，本文所述的基因识别试剂包含至少一种如本文所述的修饰的核碱基，其中其他核碱基是天然核碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)，或不同于那些修饰的碱基。
因此在一个方面，提供修饰的核碱基。可将那些核碱基掺入核酸单体或核酸类似物单体(例如，核苷酸)中，然后可将其掺入具有期望的核碱基序列的单体的寡聚物或聚合物中。下文提供修饰的核碱基的结构，并且包括：
其中，
X
X
X
X
Y是N或CH，
其中在(1)中，当X
此类核碱基的另外的示例包括荧光碱基：
任何、一些或所有前述核碱基可被掺入核苷酸单体和基因识别试剂中。
在一个方面，本文所述的基因识别试剂能够在包含基因识别试剂的靶序列的核酸模板上自组装。例如，第一基因识别试剂可与核酸模板的第一部分杂交。第二自组装基因识别试剂可与核酸模板的第二部分杂交，该第二部分与第一部分相邻。第一基因识别试剂和第二基因识别试剂可使用各种官能端基共价或非共价连接在一起以形成连续结构。基因识别试剂可包含通过接头与核酸主链或核酸类似物主链的第一末端连接的第一部分和通过接头与核酸主链或核酸类似物主链的第二末端连接的第二部分。第二部分可与第一部分相同。第二部分可与第一部分不同。在一个示例中，国际专利申请号PCT/US18/67096(以引用方式并入本文)公开了自组装基因识别试剂，所述自组装基因识别试剂在它们的末端包含芳基，当在靶序列(例如扩增的重复)上连续比对时，所述芳基进行π-堆叠以在单位基因识别试剂之间形成强的非共价键连，所述扩增的重复诸如TTC、TTCTTC、TCT、TCTTCT、CTT、CTTCTT、CCG、CCGCCG、CGC、CGCCGC、GCC、GCCGCC、CGG、CGGCGG、GCG、GCGGCG、GGC、GGCGGC、CTG、CTGCTG、TGC、TGCTGC、GCT、GCTGCT、CAG、CAGCAG、AGC、AGCAGC、GCA、GCAGCA、CAGG、CAGGCAGG、AGGC、AGGCAGGC、GGCA、GGCAGGCA、GCAG、GCAGGCAG、AGAAT、GAATA、AATAG、ATAGA、TAGAA、GGCCCC、GCCCCG、CCCCGG、CCCGGC、CCGGCC和CGGCCC。在自组装基因识别试剂的另一示例中，国际专利申请公开号WO 2014/169216(以引用方式整体并入本文中)描述了在还原环境中借助于末端硫酯基和巯基自组装和共价连接的基因识别试剂。当在靶序列上，例如在例如如上文所述包含扩增的重复的核酸上连续比对时，在单位自组装基因识别试剂之间形成共价键连。其他端基，诸如亲和结合配偶体或反应性基团，可连接到本文所述的基因识别试剂的末端，以使它们能够在互补核酸模板上自组装。
在一个实施方案中，本文提供包含核碱基和核酸主链或核酸类似物主链单体的化合物。在本公开的上下文中，“核苷酸”是指包含至少一个核碱基和主链元件(其在核酸如RNA或DNA中是核糖或脱氧核糖)的基因识别试剂的化合物或残基。核苷酸单体还包含允许在特定条件下聚合的反应性基团。在天然的DNA和RNA中，那些反应性基团是5'磷酸基和3'羟基。对于核酸和其类似物的化学合成，碱基和主链单体可含有修饰的基团，诸如封闭的胺，如本领域已知。“核苷酸残基”是指掺入寡核苷酸或多核苷酸中的单个核苷酸。同样，“核碱基残基”是指掺入核苷酸或核酸或其类似物中的核碱基。“基因识别试剂”一般是指核酸或核酸类似物，其包含能够通过协同碱基配对(例如沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对或沃森-克里克样(Watson-Crick-like)碱基配对)与核酸上的互补核酸序列杂交的核碱基序列(参见图1)。在本文所述的修饰的碱基之间不会发生分子内碱基配对，其中在天然核酸中通常会碱基配对的碱基之间存在空间冲突或不足的氢键合(图1，分图(A)(“图1(A)”))。如在图1(B)中可以看出，正常的碱基配对是不对称的，在A和T/U核碱基之间形成两个氢键，并且在G和C核碱基之间形成三个氢键。图1(C)描绘了使用本文所述的修饰的核碱基的显著益处，因为结合是对称的，在本文所述的修饰的核碱基的所有组合与它们的天然碱基配对配偶体之间形成两个氢键。碱基对的几乎相等的结合“重量”分布不仅极大地简化了探针设计(探针的结合强度极大地依赖于长度，而不是长度和序列组成)，而且它赋予了比天然核碱基所能实现的更大的针对碱基对错配的序列辨别力。
图2描绘了本文所述的修饰的核碱基的益处。图2(A)显示，尽管有(a'/a)序列互补性，但含有修饰的(u、c、a和g)核碱基的PNA寡聚物(手性或非手性)不可采用发夹结构，但能够与其互补的茎-环RNA靶标杂交。图2(B)显示紧密结合的寡核苷酸分子(诸如锁定的核酸(LNA)或PNA(例如，yPNA))能够侵入茎-环结构，其在治疗和诊断中的应用由于非特异性结合而构成了相当大的风险。图2(C)显示中等亲合力的寡核苷酸，即大多数寡核苷酸分子所落入的类别，由于缺乏结合自由能或由于形成动力学(发夹)陷阱而不能打开茎-环结构。
可选择性靶向的RNA二级和三级结构的示例示于图3中。潜在的治疗和诊断靶标包括RNA(编码和非编码)和DNA。
在多个方面，本文提供修饰的核碱基。核碱基是识别部分，其例如通过沃森-克里克或沃森-克里克样碱基配对通过氢键合例如特异性结合腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶中的一个或多个。“核碱基”包括主要(天然)核碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶，以及修饰的嘌呤和嘧啶碱基，诸如但不限于次黄嘌呤、呫吨、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。图4还描绘了核碱基的非限制性示例，包括单价核碱基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，其结合核酸或核酸类似物的一条链)和“钳(clamp)”核碱基，诸如“G-钳”，其以增强的强度结合互补核碱基。另外的嘌呤核碱基、嘌呤样核碱基、嘧啶核碱基和嘧啶样核碱基是本领域已知的，例如如美国专利号8,053,212、8,389,703和8,653,254中所公开的。二价核碱基在美国专利申请公开号2016/0083434A1和国际专利申请公开号WO/2018/058091(所有这些专利申请均以引入方式并入本文)中有进一步详细描述，并且结合两个而不是一个核碱基，因此可与匹配或错配的核酸形成复杂的三聚体结构。
在一个示例中，主链单体是核糖单磷酸、核糖二磷酸或核糖三磷酸，或脱氧核糖单磷酸、脱氧核糖二磷酸或脱氧核糖三磷酸，诸如核糖或脱氧核糖的5'单磷酸、二磷酸或三磷酸。主链单体包括结构“残基”组分，诸如RNA中的核糖，以及在将单体连接在一起时被修饰的任何活性基团，诸如核糖核苷酸的5'三磷酸基和3'羟基，当聚合成RNA时，它们被修饰而留下磷酸二酯键连。同样对于PNA，N-(2-氨基乙基)甘氨酸主链单体的C-末端羧基和N-末端胺活性基团在聚合期间缩合，留下肽(酰胺)键。在另一方面，活性基团是可用于亚磷酰胺寡聚物合成的亚磷酰胺基团，如本领域广泛已知的。核苷酸单体还任选地包含一个或多个如本领域已知的保护基团，诸如4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)，以及如本文所述的保护基团。制备合成基因识别试剂的许多另外的方法是已知的，并且取决于主链结构和碱基添加过程的特定化学性质。确定在接合核苷酸单体中利用哪些活性基团和在碱基中要保护哪些基团，以及在寡聚物的制备中所需的步骤完全在化学领域以及核酸和核酸类似物寡聚物合成的特定领域中的普通技术人员的能力范围内。
如本文所用的术语“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。核酸类似物包括例如且不限于(参见例如图5)：硫代磷酸酯DNA(PS DNA)、α,β-受限核酸(α,β-CNA)、2’-甲氧基RNA、2’-氟RNA、二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)、锁核酸(LNA)、2′,4′-受限乙基核酸((S)-cEt)、2’,4’桥连核酸NC(N-H)(BNA-NC(N-H))、2’,4’桥连核酸NC(N-甲基)(BNA-NC(N-Me))、((S)-5’-C-甲基DNA(RNA))和5’-E-乙烯基膦酸酯核酸(E-VP)(其中R是H、OH、F、OMe或O(CH
“肽核酸”是指DNA或RNA类似物或模拟物，其中DNA或RNA的糖磷酸二酯主链被N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元替代。在一个实施方案中，肽核酸具有以下结构：
其中n是1或更大，R
接头是化合物中将一个部分共价连接到另一部分的部分。它对整个化合物的活性(例如，在本发明的上下文中，基因识别试剂在其预期用途中操作的能力)不产生实质性的负面作用。除了用于共价连接两个部分之外，接头还可具有有益的作用，诸如在其所连接的部分的物理分离中，例如优化间隔以避免空间效应。接头还可起到一些附加的功能，诸如改变整个分子的疏水性/亲水性，以提供用于将附加部分连接到化合物的附加位点(例如，被保护基团保护的胺)，或使整个分子刚性化。接头通过任何适合的键连部分(“键连”)连接到化合物的其余部分，例如，通过碳-碳键、酯、硫酯、胺、醚、酰胺、碳酸酯或氨基甲酸酯键连连接到化合物的附加部分。接头可以是烃基，即仅包括碳和氢(例如1到10个亚甲基)，任选地包含一个或多个杂原子，例如N、O和/或S。在本发明的上下文中，在一个实施方案中，一种适合的接头是包含PEG基团-(O-CH
在另一实施方案中，PNA是伽玛(gamma)PNA(γPNA)，其为γ-修饰的N-(2-氨基乙基)甘氨酸单体的寡聚物或聚合物，其中上式(I)中的γ碳是手性中心，通常连接到γ碳的R
在各种实施方案中，主链例如在R
在其他实施方案中，主链例如在R
在其他实施方案中，R
“氨基酸侧链”是氨基酸的侧链。氨基酸具有结构：
掺入γPNA寡聚物或聚合物中的γPNA单体在本文中被称为“γPNA单体残基”，每个残基具有相同或不同的核碱基，诸如本文所述的修饰的核碱基，使得γPNA上的碱基顺序是它的“序列”，如同DNA或RNA一样。核酸或核酸类似物寡聚物或聚合物(诸如γPNA寡聚物或聚合物)中的核碱基序列通过协同键合结合核酸链中腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和/或尿嘧啶残基的互补序列，基本上如同双链DNA或RNA中互补碱基的沃森-克里克结合一样。“沃森-克里克-样”键合是指除G、A、T、C或U以外的核碱基的氢键合，诸如本文所示的二价碱基与G、A、T、C、U或其他核碱基的键合。
除非另外指明，否则本文所述的核酸和核酸类似物不是关于任何特定的碱基序列来描述的。本公开涉及修饰的核碱基、包含修饰的核碱基的组合物以及修饰的核碱基和含有那些核碱基的化合物的使用方法，并且本文所述的任何具体实施方案的有用性，尽管通常在每种情况下取决于具体序列，但是普遍适用的。连接到γPNA寡聚物主链的核碱基序列可通过沃森-克里克或沃森-克里克样氢键合与靶核酸或核酸类似物的互补核碱基序列杂交。普通技术人员将理解，本文所述的组合物和方法是序列非依赖性的，并且描述了包含二价核碱基的新颖的通用组合物和相关方法。
基因识别试剂可制备为小的寡核苷酸，并且可原位、体内、离体或体外组装，例如，如美国专利申请公开号2016/0083433A1中所述，该公开以引用方式整体并入本文。通过该方法，与较长序列(诸如三聚体)相比具有高细胞或组织渗透性的小低聚物可被转移到细胞中，且一旦与模板核酸杂交，所述低聚物可被组装为连续的较大序列。这同样可在体外或离体实现，例如，用于快速组装更长的序列以用于与靶核酸杂交。
在一个方面，在阵列上提供基因识别试剂。阵列特别可用于实现高通量测定，诸如遗传检测测定。如本文所用的术语“阵列”是指定位或连接于基底上的两个或更多个离散的、可鉴别的和/或可寻址的位置的试剂，例如本文所述的基因识别试剂。在一个方面，阵列是具有两个或多个离散的、可鉴别的反应室的装置，诸如但不限于96孔盘，其中进行包含所鉴别的组分的反应。在一个方面，将两种或更多种包含一种或多种如本文所述的二价核碱基的基因识别试剂以空间可寻址方式固定到基底上，使得每个单个的引物或探针位于基底上不同的和(可寻址的)可鉴别位置。一种或多种基因识别试剂共价连接到基底，或以其他方式结合或定位于阵列上的可寻址位置处。基底包括但不限于多孔板、硅芯片和珠粒。在一个方面，阵列包括两组或更多组珠粒，每个珠粒组具有可鉴别的标志物，诸如量子点或荧光标签，使得所述珠粒可使用例如但不限于流式细胞仪来单个地鉴别。在一个方面，阵列是包含两个或更多个孔的多孔板，所述孔具有用于结合特异性序列的所述基因识别试剂。因此，试剂，诸如探针和引物，可结合或以其他方式沉积到阵列上或阵列中，或以其他方式定位于阵列上的特定位置处。试剂可呈任何适合的形式，包括但不限于：在溶液中、干燥、冻干或玻璃化。当共价结合到基底(诸如琼脂糖珠粒或硅芯片)时，已知多种连接技术用于将化学部分(诸如基因识别试剂)结合到此类基底。
用于连接核酸、肽核酸和其他核酸类似物的接头和间隔物在化学和阵列领域是广泛已知的，因此在本文中不进行描述。作为非限制性示例，γPNA基因识别试剂含有反应性胺，所述反应性胺可与羧基官能琼脂糖珠粒、溴化氰官能琼脂糖珠粒、N-羟基琥珀酰亚胺酯官能琼脂糖珠粒、羰基二咪唑官能琼脂糖珠粒或醛官能琼脂糖珠粒反应，所述琼脂糖珠粒可从例如Thermo Fisher Scientific(Pierce Protein Biology Products)、Rockford、Illinois和多种其他来源获得。本文所述的基因识别试剂可以任何方式，用或不用接头，连接到基底。用于进行反应和用于读取阵列的装置是广泛已知和可获得的，并且用于分析阵列数据和/或从由患者样品获得的数据鉴别遗传风险因素的信息学和/或统计学软件或其他计算机实施的方法是本领域已知的。
本文所述的某些修饰的核碱基由于它们的环结构而展现荧光。这些组合物可用作荧光染料，或者固有荧光可用作探针，例如通过在原位测定中或在凝胶或印迹中结合靶序列，使得靶序列可被显现。
根据本发明的一个方面，提供了一种用于检测核酸中的靶序列的方法，其包括使如本文所述的基因识别试剂组合物与包含核酸的样品接触，以及检测基因识别试剂与核酸的结合。在一个方面，将基因识别试剂固定在基底上，例如阵列中，并使标记(例如，荧光标记或放射性标记)的核酸样品与固定的基因识别试剂接触，并且测量特异性结合到基因识别试剂的标记核酸的量。在一种变化形式中，基因识别试剂或包含基因识别试剂的靶序列的核酸结合到基底，并且包含基因识别试剂的靶序列的标记核酸或标记的基因识别试剂分别结合到固定的基因识别试剂或核酸以形成复合物。在一个方面，复合物的核酸包含部分靶序列，使得包含完整靶序列的核酸将与复合的核酸竞争基因识别试剂。然后将复合物暴露于核酸样品，并且可根据标准方法检测和定量来自复合物的结合标记物的损失，从而促进核酸样品中的核酸标志物的定量。这些仅仅是可用于检测或定量核酸样品中特定核酸的存在的大量可能的分析测定中的两种。
关于组合物(诸如本文所述的核酸或基因识别试剂)的“固定”意指连接到任何物理结构或化学组成的基底。通过可用于最终使用的背景下的任何方法来固定固定的组合物。通过共价或非共价方法固定该组合物，所述方法诸如通过胺基与接头或间隔物的共价键连，或通过非共价键合，包括范德华(Van der Waals)键合和/或氢键合。“标记物”是可用于检测或纯化包含标记物的分子或组合物的化学部分。标记物可以是例如但不限于放射性部分，诸如
在本发明的再一方面，提供分离和纯化含有靶序列的核酸的方法。在一个非限制性方面，将如本文所述的基因识别试剂固定在基底上，所述基底诸如珠粒(例如且不限于琼脂糖珠粒、含有用于分选的荧光标志物的珠粒或磁珠)、多孔基体、表面、管等。使核酸样品与固定的基因识别试剂接触，并且含有靶序列的核酸结合到基因识别试剂。然后洗涤结合的核酸以去除未结合的核酸，然后洗脱结合的核酸，并且可通过分子生物学领域广泛已知的任何可用的方法使其沉淀或以其他方式浓缩。
在又一方面，提供了试剂盒。试剂盒至少包括任何形式的容器，包括用于自动化核酸、核酸类似物或PNA合成的盒，其可包括一个或多个容器，所述容器为单个的和独立的、任选独立可寻址的隔室的形式，用于例如用于制备核酸和/或核酸类似物的自动序列制备装置中。容器可以是一次性使用的，或者含有足够的内容物以用于多次使用。试剂盒还可包括阵列。试剂盒可任选地包含一种或多种用于制备或使用本文所述任何实施方案中的基因识别试剂的另外试剂。试剂盒包括含有本文所述的任何形式的任何二价核碱基或根据本文所述的任何方面的单体或基因识别试剂的容器。不同的核碱基、单体或基因识别试剂通常被包装到单独的容器中，所述容器可以是盒中的单独的隔室。
在多个方面，化合物和基因识别试剂用于治疗目的，因此将那些化合物和基因识别试剂配制成药物产品、药物组合物或剂型，包括用于人和兽医用途的组合物，所述组合物包含治疗有效量的化合物或基因识别试剂和赋形剂，例如用于治疗递送(例如且不限于用于口服、局部、静脉内、肌内或皮下施用)的媒介物或稀释剂。组合物可以经典方式使用适于期望施用方式的固体或液体媒介物、稀释剂和添加剂配制。口服时，化合物可以片剂、胶囊、颗粒、粉末等形式施用。组合物任选地包含一种或多种如在药物、医学、兽医或生物学领域中广泛已知的另外的活性剂。本文所述的化合物可以任何有效的方式施用。递送途径的另外的示例包括但不限于：局部递送，例如，表皮递送、吸入递送、灌肠递送、眼递送、耳递送和鼻内递送；肠内递送，例如，口服递送，通过胃饲管或吞咽递送，和直肠递送；和胃肠外递送，诸如静脉内递送、动脉内递送、肌内递送、心内递送、皮下递送、骨内递送、皮内递送、鞘内递送、腹膜内递送、透皮递送、离子电渗递送、透粘膜递送、硬膜外递送和玻璃体内递送。根据广泛已知的可接受的药学程序制备治疗/药物组合物。
本文所述的任何化合物可被复合或以其他方式制成适合使用的组合物，诸如其中化合物或基因识别试剂为活性成分的药物剂型或药品。根据一个示例，本文所述的药物产品是口服片剂、胶囊、囊片、液体填充或凝胶填充的胶囊等。组合物可包含药学上可接受的载体或赋形剂。“赋形剂”是用作用于药物的活性成分的载体的无活性物质。尽管“无活性”，但赋形剂可促进和帮助增加药物产品中活性成分的递送、稳定性或生物利用度。有用的赋形剂的非限制性示例包括：如在药物/配混领域中可利用的抗粘着剂、粘合剂、流变改性剂、包衣、崩解剂、乳化剂、油、缓冲剂、盐、酸、碱、填充剂、稀释剂、溶剂、调味剂、着色剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、抗氧化剂、吸附剂、维生素、甜味剂等。
实施例-修饰的核碱基和细胞渗透性γPNA的合成
根据化学和有机合成领域已知的方法合成本文所述的化合物和基因识别试剂。图6和图7中提供了示例性合成方案。
以下编号的条款描述了本发明的非限制性实施方案和方面。
条款1：一种基因识别试剂，其包含连接到核酸主链或核酸类似物主链的多个核碱基部分，其中至少一个核碱基部分是：
其中，
X
X
X
X
Y是N或CH，
其中在(1)中，当X
条款2：根据条款1所述的基因识别试剂，其中所述至少一个核碱基部分是：
条款3：根据条款1所述的基因识别试剂，其中所述至少一个核碱基部分是：
条款4：根据条款1所述的基因识别试剂，其中所述至少一个核碱基部分是：
条款5：根据条款1所述的基因识别试剂，其中所述至少一个核碱基部分是：
条款6：根据条款1所述的基因识别试剂，其中所述至少一个核碱基部分是：
条款7：根据条款1所述的基因识别试剂，其中所述至少一个核碱基部分是：
条款8：根据条款1所述的基因识别试剂，其中所述至少一个核碱基部分是：
条款9：根据条款1-8中任一项所述的基因识别试剂，其中所述主链选自以下中的一种：DNA、RNA、肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯DNA(PS DNA)、α,β-受限核酸(α,β-CNA)、2’-甲氧基RNA、2’-氟RNA、锁核酸(LNA)、2′,4′-受限乙基核酸((S)-cEt)、2’,4’-桥连核酸NC(N-H)(BNA-NC(N-H))、2’,4’桥连核酸NC(N-甲基)(BNA-NC(N-Me))、2’-(R)-(S)-5’-C-甲基DNA或2’-R-5’-E-乙烯基膦酸酯核酸(E-VP)，其中R是H、OH、F、OMe或O(CH
条款10：根据条款1所述的基因识别试剂，其中所述主链是肽核酸(PNA)主链。
条款11：根据条款10所述的基因识别试剂，其中所述主链被聚乙二醇化，其中具有2到50个(-O-CH
条款12：根据条款10所述的基因识别试剂，其中所述主链包含一个或多个连接到所述主链的胍部分。
条款13：根据条款1所述的基因识别试剂，其中所述主链是γ肽核酸(γPNA)主链。
条款14：根据条款1所述的基因识别试剂，其中所述主链是包含残基
条款15：根据条款14所述的基因识别试剂，其中R
条款16：根据条款14或15所述的基因识别试剂，其中α-碳、β-碳或γ-碳是手性中心。
条款17：根据条款16所述的基因识别试剂，其中所述γ-碳是手性中心。
条款18：根据条款17所述的基因识别试剂，其中R
条款19：根据条款16所述的基因识别试剂，其中R
条款20：根据条款1-19中任一项所述的基因识别试剂，其包含连接到所述核酸主链或核酸类似物主链的端基，所述端基用于在核酸模板上自组装两种或更多种相邻的基因识别试剂。
条款21：根据条款20所述的基因识别试剂，其中所述端基是2到5个环稠合的多环芳族部分。
条款22：根据条款20所述的基因识别试剂，其中所述端基是巯基或硫酯基。
条款23：根据条款1-22中任一项所述的基因识别试剂，其中所述多个核碱基部分形成包含以下的序列：TTC、TTCTTC、TCT、TCTTCT、CTT、CTTCTT、CCG、CCGCCG、CGC、CGCCGC、GCC、GCCGCC、CGG、CGGCGG、GCG、GCGGCG、GGC、GGCGGC、CTG、CTGCTG、TGC、TGCTGC、GCT、GCTGCT、CAG、CAGCAG、AGC、AGCAGC、GCA、GCAGCA、CAGG、CAGGCAGG、AGGC、AGGCAGGC、GGCA、GGCAGGCA、GCAG、GCAGGCAG、AGAAT、GAATA、AATAG、ATAGA、TAGAA、GGCCCC、GCCCCG、CCCCGG、CCCGGC、CCGGCC和CGGCCC或前述中任一种的连续重复。
条款24：根据条款1-23中任一项所述的基因识别试剂，其中所述多个核碱基部分以与核酸的靶序列互补的序列布置。
条款25：根据条款1-24中任一项所述的基因识别试剂，其具有3到25个核碱基部分。
条款26：一种化合物，其包含连接到核碱基部分的核酸主链单体或核酸类似物主链单体，所述核碱基部分具有以下结构：
其中，
X
X
X
X
Y是N或CH，
其中在(I)中，当X
条款27：根据条款26所述的化合物，其中所述至少一个核碱基部分是：
条款28：根据条款26所述的化合物，其中所述至少一个核碱基部分是：
条款29：根据条款26所述的化合物，其中所述至少一个核碱基部分是：
条款30：根据条款26所述的化合物，其中所述至少一个核碱基部分是：
条款31：根据条款26-30中任一项所述的化合物，其中所述主链单体是DNA、RNA、肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯DNA(PS DNA)、α、β-受限核酸(α,β-CNA)、2’-甲氧基RNA、2’-氟RNA、锁核酸(LNA)、2′,4′-受限乙基核酸((S)-cEt)、2’,4’-桥连核酸NC(N-H)(BNA-NC(N-H))、2’,4’桥连核酸NC(N-甲基)(BNA-NC(N-Me))、2’-(R)-(S)-5’-C-甲基DNA或2’-R-5’-E-乙烯基膦酸酯核酸(E-VP)主链单体，其中R是H、OH、F、OMe或O(CH
条款32：根据条款26-31中任一项所述的化合物，其中所述主链单体是肽核酸(PNA)主链单体。
条款33：根据条款32所述的化合物，其中所述主链单体被聚乙二醇化，其中具有2到50个(-O-CH
条款34：根据条款32所述的化合物，其中所述主链包含一个或多个连接到所述主链的胍部分。
条款35：根据条款26所述的化合物，其中所述主链单体是γ肽核酸(γPNA)主链单体。
条款36：根据条款26所述的化合物，其中所述主链单体是具有结构
条款37：根据条款36所述的化合物，其中R
条款38：根据条款36或37所述的化合物，其中α-碳、β-碳或γ-碳是手性中心。
条款39：根据条款38所述的化合物，其中所述γ-碳是手性中心。
条款40：根据条款39所述的化合物，其中R
条款41：根据条款37所述的化合物，其中R
条款42：一种试剂盒，其包含在容器中的根据条款36-41中任一项所述的化合物。
条款43：根据条款42所述的试剂盒，其包含在单个分离的容器中的结合腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶以及尿嘧啶和胸腺嘧啶中的任一种或两种的单体。
条款44：一种试剂盒，其包含在容器中的根据条款1-25中任一项所述的基因识别试剂。
条款45：根据条款42-44中任一项所述的试剂盒，其中所述容器是用于自动化装置的盒中的一个或多个隔室。
条款46：一种阵列，其包含根据条款1-19中任一项所述的基因识别试剂。
条款47：一种检测核酸中的靶序列的方法，其包括使根据条款1-25中任一项所述的基因识别试剂与包含核酸的样品接触，以及检测所述基因识别试剂与核酸的结合。
条款48：一种分离和纯化含有靶序列的核酸的方法，其包括使核酸样品与根据条款1-29中任一项所述的基因识别试剂接触，将所述核酸样品与所述基因识别试剂分离，留下结合到所述基因识别试剂的任何核酸，以及将所述基因识别试剂与结合到所述基因识别试剂的任何核酸分离。
条款49：根据条款48所述的方法，其中将所述基因识别试剂固定在基底基底上，所述方法包括使核酸与所述基底接触，洗涤所述基底以从所述基底去除未结合的核酸，但留下结合到所述基底的结合的核酸，以及从所述基底洗脱所述结合的核酸。
条款50：一种组合物，其包含根据条款1-49中任一项所述的基因识别试剂或化合物和药学上可接受的赋形剂。
已参考某些示例性实施方案、可分散组合物和其用途描述了本发明。然而，本领域普通技术人员将认识到，可在不脱离本发明的精神和范围的前提下，对任何示例性实施方案作出各种替换、修改或组合。因此，本发明不受示例性实施方案的描述的限制，而是由如最初提交的所附权利要求来限制。
机译： 错配的碱基对检测分子和错配的碱基对检测方法，并使用
机译： 具有均匀H键合相互作用的修饰核碱基，同源和杂基本偏置和错配鉴别
机译： 具有均匀H键合相互作用的修饰核碱基，同源和杂基本偏置和错配鉴别
