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X连锁高IgM综合征的治疗性基因组编辑

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摘要

本文描述了用于治疗、抑制或缓解受试者中的X连锁高IgM综合征(X‑HIGM)的组合物、系统和方法，所述受试者已被鉴别或选择为将从治疗、抑制或缓解X‑HIGM的疗法中受益的受试者。该系统包含被配置用于共同递送以修饰内源性CD40LG基因座的载体供体构建体和核酸酶。

著录项

公开/公告号CN112312931A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-02-02

原文格式PDF
申请/专利权人西雅图儿童医院(DBA西雅图儿童研究所);
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申请/专利号CN201980042296.4
发明设计人戴维德·J·罗林斯;丹尼尔·汤姆森;伊拉姆·F·可汗;
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申请日2019-04-24
分类号A61K48/00(20060101);A61K35/17(20060101);C12N15/11(20060101);C12N9/22(20060101);
代理机构11290 北京信慧永光知识产权代理有限责任公司;
代理人王芬;杨国强
地址美国华盛顿州
入库时间 2023-06-19 09:44:49

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年4月27日提交的名称为“THERAPEUTIC GENOME EDITING IN X-LINKED HYPER IGM SYNDROME”的美国临时申请No.62/663485的优先权，将其以引用的方式在此明确地整体并入。

对序列表的引用

本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表作为标题为SCRI192WOSEQLIST的文件提供，创建于2019年4月16日，大小为约101kb。以引用的方式将电子格式的序列表中的信息明确地整体并入本文。

技术领域

本文提供的公开内容的方面大体上涉及基于核酸内切酶的基因编辑系统和方法。更具体而言，本文的替代方式涉及被配置为提供有效的同源介导的基因修复的核酸和载体、以及修复遗传缺陷(如X连锁高IgM综合征)的方法。

背景技术

X连锁高IgM综合征(X-HIGM)是由CD40LG基因的失活突变引起的隐性原发性免疫缺陷。患者缺乏类别转换(class-switched)的记忆B细胞和免疫球蛋白G、免疫球蛋白A和免疫球蛋白E(IgG、IgA和IgE)，使得他们易被反复感染和机会性感染(Allen,R.C.等，Science,1993.259(5097):p.990-993；Aruffo,A.等，Cell,1993.72(2):p.291-300；

基于核酸内切酶的系统已经迅速成为生物医药研究中重要的基因编辑工具，在各种培养的细胞和模式有机体系统中证明了它们在基因破坏(gene disruption)和/或基因靶向方面的应用。

用于基因编辑的基于核酸内切酶的系统允许科学家们以前所未有的精确度、效率和灵活性来编辑基因组。用于基因编辑的基于核酸内切酶的手段的实例包括含有(但不限于)锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶(如MegaTAL)和CRISPR/Cas9的系统。显然需要更多抑制和/或治疗X-HIGM的手段。

发明内容

本文提供的一些实施方式涉及用于X连锁高IgM综合征的治疗性基因组编辑的系统、方法和组合物。一些实施方式包括用于编辑细胞中的CD40LG基因的方法，该方法包括：(i)向所述细胞中引入编码向导RNA(gRNA)的多核苷酸，以及(ii)向所述细胞中引入模板多核苷酸。在一些实施方式中，gRNA包含与核苷酸序列SEQ ID NO：12具有至少95％同一性的核酸。在一些实施方式中，gRNA包含具有核苷酸序列SEQ ID NO：12的核酸。

在一些实施方式中，向细胞中引入编码gRNA的多核苷酸包括使细胞与包含CAS9蛋白和编码gRNA的多核苷酸的核糖核蛋白(RNP)接触。在一些实施方式中，CAS9蛋白和编码gRNA的多核苷酸具有0.1:1到1:10之间的比例。在一些实施方式中，CAS9蛋白和编码gRNA的多核苷酸具有1:1到1:5之间的比例。在一些实施方式中，CAS9蛋白和编码gRNA的多核苷酸具有约1:1.2的比例。

在一些实施方式中，模板多核苷酸至少编码CD40LG基因的一部分或其互补物(complement)。在一些实施方式中，模板多核苷酸至少编码野生型CD40LG基因的一部分或其互补物。在一些实施方式中，模板多核苷酸至少包含约1kb的CD40LG基因。在一些实施方式中，模板多核苷酸包含与核苷酸序列SEQ ID NO：15具有至少95％同一性的核酸。在一些实施方式中，模板多核苷酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：15。

在一些实施方式中，病毒载体包含模板多核苷酸。在一些实施方式中，载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方式中，载体是自互补AAV(self-complementary AAV，scAAV)载体。

在一些实施方式中，步骤(i)在步骤(ii)之前进行。在一些实施方式中，步骤(i)和步骤(ii)同时进行。在一些实施方式中，步骤(i)和/或步骤(ii)包括进行核转染。在一些实施方式中，进行核转染包括使用LONZA系统。在一些实施方式中，该系统包括使用方波脉冲。

一些实施方式还包括使细胞与IL-6接触。在一些实施方式中，IL-6具有约20ng/mL-500mg/mL的浓度或者20ng/mL-500mg/mL的浓度。在一些实施方式中，IL-6具有约50ng/mL-150mg/mL的浓度或者50ng/mL-150mg/mL的浓度。在一些实施方式中，IL-6具有约100mg/mL的浓度或100mg/mL的浓度。

在一些实施方式中，在SFEMII培养基中孵育细胞。

在一些实施方式中，细胞群包括所述细胞，所述群具有约1×10

一些实施方式还包括在进行步骤(i)和步骤(ii)之后对细胞群进行稀释。在一些实施方式中，在进行步骤(i)和步骤(ii)后约16小时或16小时对细胞群进行稀释。在一些实施方式中，将细胞群稀释至约250,000个细胞/mL或250,000个细胞/mL。

一些实施方式还包括使细胞与干细胞因子(SCF)、FMS样酪氨酸激酶-3(Flt-3)、血小板生成素(TPO)、TPO受体激动剂、UM171或stemregenin(SR1)接触。在一些实施方式中，TPO受体激动剂包括Eltrombopag。

在一些实施方式中，步骤(i)和/或步骤(ii)包括使细胞与HDM2蛋白接触。在一些实施方式中，HDM2蛋白具有约1nM-50nM的浓度或者1nM-50nM的浓度。在一些实施方式中，HDM2蛋白具有约6.25nM-25nM的浓度或者6.25nM-25nM的浓度。

在一些实施方式中，细胞与至少约1000MOI或1000MOI的AAV接触。在一些实施方式中，细胞与至少约2500MOI或2500MOI的AAV接触。

在一些实施方式中，细胞与至少约100μg/mL或100μg/mL的RNP接触。在一些实施方式中，细胞与至少约200μg/mL或200μg/mL的RNP接触。

在一些实施方式中，步骤(i)和/或步骤(ii)包括接触约1,000,000个细胞/20μL或1,000,000个细胞/20μL的核转染反应，其中，所述核转染反应包含gRNA和/或模板多核苷酸。在一些实施方式中，核转染反应以约1mL或1mL的体积进行。

在一些实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述细胞是人细胞。在一些实施方式中，所述细胞是原代细胞。在一些实施方式中，所述细胞是造血干细胞(HSC)。在一些实施方式中，所述细胞是T细胞或B细胞。在一些实施方式中，所述细胞是CD34+细胞。在一些实施方式中，所述细胞是离体的。

在一些实施方式中，CD40LG基因与核苷酸序列SEQ ID NO：13具有至少95％的同一性。

一些实施方式包括用于CD40LG基因的同源介导修复(HDR)的核酸。在一些实施方式中，该核酸包含：第一序列，所述第一序列编码CD40LG基因；第二序列，所述第二序列编码一个或多个向导RNA切割位点；以及第三序列，所述第三序列编码一个或多个核酸酶结合位点。在一些实施方式中，CD40LG基因包含以SEQ ID NO：13示出的核酸序列。在一些实施方式中，第二序列包含以SEQ ID NO：12示出的核酸序列。在一些实施方式中，所述一个或多个核酸酶结合位点包含正向和反向转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)结合位点。在一些实施方式中，所述一个或多个核酸结合位点是成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白9(Cas9)结合位点。在一些实施方式中，该核酸进一步包含一个或多个增强子元件。在一些实施方式中，该核酸进一步包含同源臂序列。在一些实施方式中，该核酸进一步包含编码启动子的核酸序列。

本文提供的一些实施方式涉及用于促进细胞中的CD40L蛋白表达的HDR的载体。在一些实施方式中，所述载体包含：第一序列，所述第一序列编码CD40LG基因；第二序列，所述第二序列编码一个或多个向导RNA切割位点；以及第三序列，所述第三序列编码一个或多个核酸酶结合位点。在一些实施方式中，CD40LG基因包含以SEQ ID NO：13示出的核酸序列。在一些实施方式中，第二序列包含以SEQ ID NO：12示出的核酸序列。在一些实施方式中，所述一个或多个核酸酶结合位点包含正向和反向转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)结合位点。在一些实施方式中，所述一个或多个核酸结合位点是成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白9(Cas9)结合位点。在一些实施方式中，所述载体进一步包含一个或多个增强子元件。在一些实施方式中，所述载体是腺相关病毒载体(AAV)。在一些实施方式中，所述载体是自互补AAV(scAAV)。在一些实施方式中，所述细胞是人细胞。在一些实施方式中，所述细胞是原代细胞。在一些实施方式中，所述细胞是自体细胞。在一些实施方式中，所述细胞是T细胞。在一些实施方式中，所述细胞是造血干细胞(HSC)。在一些实施方式中，所述细胞是CD34

本文提供的一些实施方式涉及用于促进细胞中的CD40L蛋白表达的HDR的系统。在一些实施方式中，所述系统包含如本文所述的载体和编码核酸酶的核酸。在一些实施方式中，所述核酸酶是TALEN核酸酶。在一些实施方式中，所述核酸酶是Cas核酸酶。在一些实施方式中，将所述载体和核酸配置用于向细胞共同递送。在一些实施方式中，向细胞的共同递送修饰内源性CD40LG基因座。在一些实施方式中，所述细胞是原代人造血细胞。

本文提供的一些实施方式涉及用于表达CD40L的细胞。在一些实施方式中，所述细胞包含核酸，所述核酸包含编码CD40LG基因的第一序列、编码启动子的第二序列、编码一个或多个向导RNA切割位点的第三序列、以及编码一个或多个核酸酶结合位点的第四序列。在一些实施方式中，核酸处于载体中。在一些实施方式中，载体是AAV。在一些实施方式中，所述AAV是scAAV。在一些实施方式中，所述细胞是人细胞。在一些实施方式中，所述细胞是原代细胞。在一些实施方式中，所述细胞是自体细胞。在一些实施方式中，所述细胞是T细胞。在一些实施方式中，所述细胞是HSC。在一些实施方式中，所述细胞是CD34

本文提供的一些实施方式涉及促进有需要的受试者中的CD40LG基因的HDR的方法。在一些实施方式中，该方法包括向受试者给予如本文所述的细胞或如本文所述的载体，以及向该受试者给予核酸酶。在一些实施方式中，核酸酶是TALEN核酸酶。在一些实施方式中，核酸酶是Cas核酸酶。在一些实施方式中，将核酸酶与细胞或与载体共同给予至受试者。在一些实施方式中，所述细胞来自受试者，并且其中，通过向所述细胞中引入如本文所述的核酸或如本文所述的载体来对所述细胞进行遗传修饰。在一些实施方式中，通过过继细胞转移进行给予。在一些实施方式中，所述细胞是人细胞。在一些实施方式中，所述细胞是原代细胞。在一些实施方式中，所述细胞是自体细胞。在一些实施方式中，所述细胞是T细胞。在一些实施方式中，所述细胞是HSC。在一些实施方式中，所述细胞是CD34

本文提供的一些实施方式涉及治疗、抑制或缓解有需要的受试者中的X连锁高IgM综合征(X-HIGM)、或者与X-HIGM有关的疾病症状的方法。在一些实施方式中，该方法包括向受试者给予如本文所述的细胞或如本文所述的载体，以及向受试者给予核酸酶。在一些实施方式中，该方法进一步包括将受试者鉴别为将从接受用于X-HIGM或者与X-HIGM相关的疾病症状的疗法中受益的受试者，和/或任选地测量所述受试者中的X-HIGM进展方面的改善或者与X-HIGM相关的疾病症状方面的改善。在一些实施方式中，核酸酶是TALEN核酸酶。在一些实施方式中，核酸酶是CRISPR/Cas核酸酶。在一些实施方式中，将核酸酶与细胞或与载体共同给予至受试者。在一些实施方式中，所述细胞来自受试者，其中，通过向所述细胞中引入如本文所述的核酸或如本文所述的载体来对所述细胞进行遗传修饰。在一些实施方式中，通过过继细胞转移进行给予。在一些实施方式中，所述细胞是人细胞。在一些实施方式中，所述细胞是原代细胞。在一些实施方式中，所述细胞是自体细胞。在一些实施方式中，所述细胞是T细胞。在一些实施方式中，所述细胞是HSC。在一些实施方式中，所述细胞是CD34

附图说明

图1是说明CD40LG基因中的突变引起正常-升高的IgM、低IgG和无IgE或IgA的示意图。X连锁高IgM(X-HIGM)患者遭受细菌感染/机会性感染以及间歇性中性粒细胞减少。

图2描绘了说明人CD40LG基因座的示意图，显示了相对于外显子和翻译起始位点的核糖核蛋白(RNP)识别位点，并且还描绘了具有无启动子的CD40L cDNA和嵌合3’UTR的AAV供体模板；阴影的虚线示出CD40LG同源的位置。还示出了Talen和CRISPR核酸酶位点以及具有1Kb CD40LG同源臂的AAV6供体模板。靶向构建体在5'UTR中包含缺失，使其不可被任一核酸酶切割。因为CD40LG基因座在造血干细胞(HSC)中沉默，MND启动子使得能够追踪编辑事件。

图3是CD34

图4A和图4B描述了有效编辑以在CD34

图5描绘了示出确认MND.GFP报告子(SEQ ID NO：14)的靶上整合的条形图。条形图表示使用通过ddPCR或FACS确定的CD34

图6A、图6B、图6C和图6D描绘了示出了在用于移植NSG小鼠的细胞上进行的甲基纤维素集落形成单位测定的结果的条形图。图6A示出了在甲基纤维素中铺板500个空白或经AAV+RNP处理的细胞后14天计数的总集落数(按类型)。图6B示出了按集落类型的总GFP

图7A、图7B、图7C、图7D、图7E、图7F描绘了对向培养基中添加IL-3和IL-6进行比较的代表性结果。代表性的FACS图描绘了在用AAV加RNP处理后24小时在包含60ng/mL IL-3(图7A)或100ng/mL IL-6(图7B)的培养基中生长的细胞。上排，从左至右：通过前向/侧向散射、CD34

图8描绘了说明AAV供体模板的示意图，所述模板包含侧接于人密码子优化的CD40L cDNA的相同的1kb同源臂、WPRE3元件和合成的聚腺苷酸化序列。

图9A和图9B描绘了在经编辑的细胞中cDNA的靶向整合的结果。图9A描绘了示出关于空白处理的细胞、单独的AAV处理的细胞、或AAV+RNP处理的细胞的编辑后48小时通过流式细胞术(FSC/SSC活细胞门控)测量的细胞活力的条形图。数据表示为平均值±SEM。图9B描绘了通过ddPCR确定的CD34

图10A和图10B描绘了示出向NSG小鼠中的输入移植的条形图。图10A示出了关于在体外维持的来自NSG植入实验的细胞亚群的编辑后2天(和移植后1天)测量的细胞活力。图10B示出了在体外维持的来自植入实验的细胞的HDR率(在第5天测量的GFP

图11描绘了用于从NSG骨髓和脾收获的细胞的示例门控策略。将淋巴细胞群和粒细胞群基于其大小(正向散射)和粒度(侧向散射)来进行区分。然后将这两个主要群分为由细胞类型特异性表面标志物的表达所定义的单独的谱系。示出了每种细胞类型内的GFP表达。对于脾样品，未分析粒细胞群和CD34

图12A、图12B、图12C、图12D、图12E描述了NSG小鼠的骨髓中经编辑的细胞植入的结果。图12A和图12B描绘了使用图11所示的门控策略而来的移植后16周从NSG小鼠的骨髓中收获的细胞的代表性流式图。图12A示出了从移植有未处理细胞的小鼠收获的骨髓。图12B示出了从移植有经2.5K MOI AAV+200μg/mL RNP处理的细胞的小鼠中收获的骨髓。上排，从左至右：hCD45:mCD45嵌合，人CD45门控的CD33

图13A、图13B、图13C、图13D、图13E、图13F、图13G描绘了示出小分子对NSG小鼠中经编辑的细胞的植入的影响的结果。图13A描绘了通过前向/侧向散射确定的编辑后48小时的细胞活力的条形图。数据表示为平均值±SEM。图13B示出了编辑后48小时的LT-HSC的百分比，表示为平均值±SEM。N＝2个供体，3重复。图13C描绘了在含有UM171和SR1的培养基中生长并用AAV加RNP处理的CD34

图14A、图14B、图14C、图14D描绘了经编辑的细胞在NSG小鼠的脾中的植入结果。图14A和图14B示出了移植后16周从NSG小鼠脾收获的细胞的代表性流式图。图14A的流式图来自移植有经空白处理的细胞的小鼠。上排，从左至右：hCD45:mCD45嵌合，以及人CD33

图15A、图15B、图15C、图15D、图15E示出了小分子UM171和SR1在体外的作用。图15A和图15B描绘了编辑LT-HSC后48小时的代表性流式图，其示出了在没有(图15A)或者有(图15B)UM171和SR1的情况下生长的细胞的染色和GFP表达。上排图，从左起：图上的数字表示前向/侧向散射定义的活细胞、在所有活细胞上门控的CD34

图16A、图16B、图16C、图16D、图16E、图16F、图16G显示了eltrombopag对经编辑的细胞的植入的影响。图16A示出了条形图，所述条形图描绘了关于经空白或1K MOI AAV+100μg/mL RNP处理的细胞的编辑后48小时的细胞活力，所述细胞在有或没有3μg/mLeltrombopag的情况下生长。示出的数据表示为平均值±SEM。图16B示出了在编辑后5天通过FACS测量的HDR率(％GFP

图17A和图17B描绘了编辑后培养时间对经编辑细胞的植入的影响。编辑后1天、2天或4天，将CD34

图18描绘了预刺激CD34+细胞48小时和72小时对从NSGW41受体小鼠的骨髓中回收的总人细胞的影响的比较。

图19描绘了预刺激CD34+细胞48小时和72小时对经编辑(GFP+)的细胞植入W41小鼠骨髓中的影响的比较。

图20描绘了预刺激CD34+细胞48小时和72小时对总人细胞植入W41小鼠脾中的影响的比较。

图21描绘了预刺激CD34+细胞48小时和72小时对经编辑(GFP+)的细胞植入NSGW41小鼠脾中的影响的比较。

图22描绘了示出使用方案A和方案B建立的体内实验研究设计的示意图。

图23描述了从移植有使用方案A(点)或方案B(正方形)培养的CD34+细胞的NSGW41小鼠的骨髓中回收的hCD45+细胞百分比的比较。

图24描述了从移植有使用方案A(点)或方案B(正方形)培养的CD34+细胞的NSGW41小鼠的骨髓中回收的总hCD45+细胞中GFP+百分比的比较。

图25描述了从植入有使用方案A(点)或方案B(正方形)培养的CD34+细胞的NSGW41小鼠的骨髓中回收的人CD45+细胞中CD19+细胞百分比的比较。

图26描绘了从移植有使用方案A(点)或方案B(正方形)培养的CD34+细胞的NSGW41小鼠的骨髓中回收的人CD19+细胞中GFP+细胞百分比的比较。

图27描绘了从植入有使用方案A(点)或方案B(正方形)培养的CD34+细胞的NSGW41小鼠的骨髓中回收的人CD45+细胞中CD33+细胞百分比的比较。

图28描述了从植入有使用方案A(点)或方案B(正方形)培养的CD34+细胞的NSGW41小鼠的骨髓中回收的人CD33+细胞中GFP+细胞百分比的比较。

图29描绘了移植后16周从NSGW41小鼠骨髓中收获的细胞的代表性流式图。上子图示出了从移植有空白未处理细胞的小鼠收获的骨髓：上排，从左至右：hCD45:mCD45嵌合、人CD45门控的CD33+和CD19+染色；下排，从左至右：hCD45+、CD33+和CD19+细胞中的GFP表达。下子图示出了从移植有经AAV加RNP处理的细胞的小鼠中收获的骨髓：上排，从左至右：hCD45:mCD45嵌合、人CD45门控的CD33+和CD19+染色；下排，从左至右：hCD45+、CD33+和CD19+细胞中的GFP表达。GFP+人细胞存在于所有造血谱系中，与具有CD40L基因座的HDR编辑的长期人HSC的持续植入相一致。

图30描绘了从移植有使用方案A(点)或方案B(正方形)培养的CD34+细胞的NSGW41小鼠的脾中回收的人CD45+细胞百分比的比较。

图31描绘了从移植有使用方案A(点)或方案B(正方形)培养的CD34+细胞的NSGW41小鼠的脾中回收的人CD45+细胞中的GFP+细胞百分比的比较。

图32描绘了在LONZA系统上使用各种核转染程序相对在NEON系统上进行电穿孔的细胞活力的比较。条形图示出了来自单个CD34+供体的数据。

图33描绘了在LONZA系统上使用各种核转染程序相对在NEON系统上进行电穿孔的HDR百分比(GFP表达)的比较。条形图示出了来自单个CD34+供体的数据。

图34描绘了从移植有使用方案A(点)或方案B(正方形)培养的CD34+细胞的NSGW41小鼠的脾中回收的人CD45+细胞中的CD19+细胞百分比的比较。

图35描绘了从移植有使用方案A(点)或方案B(正方形)培养的CD34+细胞的NSGW41小鼠的脾中回收的人CD19+细胞中的GFP+细胞百分比的比较。

图36描绘了从移植有使用方案A(点)或方案B(正方形)培养的CD34+细胞的NSGW41小鼠的脾中回收的人CD45+细胞中的CD33+细胞百分比的比较。

图37描绘了从移植有使用方案A(点)或方案B(正方形)培养的CD34+细胞的NSGW41小鼠的脾中回收的人CD33+细胞中的GFP+细胞百分比的比较。

图38描绘了移植后16周从NSGW41小鼠的脾中收获的细胞的代表性流式图。上子图示出了从移植有空白未处理细胞的小鼠收获的脾：上排，从左至右：hCD45:mCD45嵌合、人CD45门控的CD33+和CD19+染色；下排，从左至右：hCD45+、CD33+和CD19+细胞中的GFP表达。下子图示出了从移植有经AAV加RNP处理的细胞的小鼠收获的脾：上排，从左至右：hCD45:mCD45嵌合、人CD45门控的CD33+和CD19+染色；下排，从左至右：hCD45+、CD33+和CD19+细胞中的GFP表达。GFP+人细胞存在于所有造血谱系中，与这些细胞从具有CD40L基因座的HDR编辑的人HSC衍生而来相一致。

图39：描绘了从移植有使用方案A(点)或方案B(正方形)培养的CD34+细胞的NSGW41小鼠的骨髓中回收的人CD45+细胞中CD34+CD38low细胞百分比的比较。

图40描绘了从移植有使用方案A(点)或方案B(正方形)培养的CD34+细胞的NSGW41小鼠的骨髓中回收的人CD34+CD38low CD45+细胞中GFP+细胞百分比的比较。

图41描绘了对来自移植有空白或经编辑的细胞的NSGW41小鼠的总人CD45+细胞的CD34+门控的代表性流式细胞术分析。

图42描绘了通过重组HDM2的核转染而提高的HDR率。

具体实施方式

在以下的详细描述中，参考了附图，附图构成本文的一部分。在附图中，除非上下文另有指示，类似的符号通常标示类似的组分。在具体的描述、附图和权利要求中描述的说明性替代方式并不意味着是限制性的。在不脱离本文提出的主题的精神或范围的情况下，可以利用其它替代方式，并且可以进行其它改变。将容易理解的是，如本文一般性描述的和图中所示的，本公开的方面能够以各种不同的配置来布置、替换、组合、分离和设计，所有的配置都在本文明确的考虑之列。

在下文的描述中，广泛使用了很多术语。提供以下定义以帮助对本文替代方式的理解。除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。参见如Singleton等，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology 2nd ed.，J.Wiley&Sons(New York，NY 1994)；Sambrook等，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor，NY1989)。出于本公开的目的，将以下术语定义如下。

本文使用的冠词“一个/一种”(a和an)指的是该冠词的一个或多于一个(例如至少一个)的语法对象。举例来说，“一个/一种要素”表示一个/一种要素或多于一个/一种的要素。

“约”意味着数量、水平、值、数值、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参比数量、水平、值、数值、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

如在本说明书中所用，无论是在过渡性措辞中还是在权利要求的主体中，术语“包含(comprise(s))”和“包含(comprising)”将被解释为具有开放式含义。也就是说，所述术语与所述短语“至少具有”或“至少包括”将被同义地解释。当在过程的上下文中使用时，术语“包含(comprising)”意指该过程至少包含所列举的步骤，但可包含另外的步骤。当在化合物、组合物或装置的上下文中使用时，术语“包含(comprising)”意指所述化合物、组合物或装置至少包含所列举的特征或组分，但也可包括另外的特征或组分。

如本文所使用的，本文所述的“受试者”或“患者”在根据说明书阅读时具有其平常和普通的含义，并可以包括但不限于例如作为治疗、观测或实验对象的动物。“动物”包括冷血和温血脊椎动物和无脊椎动物，诸如鱼类、贝类、爬行动物，特别是哺乳动物。“哺乳动物”包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、绵羊、山羊、牛、马、灵长类动物，诸如猴子、黑猩猩和猿，特别是人。在一些替代方式中，受试者是人。

本文公开的一些替代方式涉及选择有需要的受试者或患者。在一些替代方式中，选择需要治疗、缓解、抑制、发展或改善疾病症状的患者或需要治病性疗法的患者。在一些替代方式中，选择具有X连锁高IgM综合征(X-HIGM)的症状的患者、已经被诊断为患有X-HIGM的患者或怀疑患有X-HIGM的患者。可以通过临床和/或诊断评价来进行所述有需要的受试者或患者的此类鉴别或选择。

X-HIGM是指一种原发性免疫缺陷紊乱，其特征在于由于CD40LG基因突变而导致的CD40信号传导缺陷。细胞表面分子CD40是肿瘤坏死因子受体超家族的成员，并由免疫细胞、造血细胞、血管细胞、上皮细胞和其它细胞(包括大范围的肿瘤细胞)广泛表达。CD40本身缺乏固有的激酶或其它信号传导活性，而是通过一系列复杂的下游接头分子介导其多种多样的作用，所述接头分子根据细胞类型和微环境差异性地改变基因表达。作为新的癌症疗法的潜在靶标，CD40可以通过免疫激活的间接作用和对表达CD40的肿瘤的直接细胞毒作用二者来介导肿瘤消退。

CD40由于其在B淋巴细胞、树突状细胞和单核细胞上的表达而被称为细胞免疫和体液免疫的关键调节子(Grewal和Flavell,Annu Rev Immunol.,16:111(1998)；vanKooten和Banchereau,J Leukoc Biol.,67:2(2000))。

CD40还在许多其它非免疫细胞的细胞表面上表达，所述非免疫细胞包括内皮细胞、成纤维细胞、造血祖细胞、血小板和基底上皮细胞(Grewal和Flavell,Annu RevImmunol.,16:111(1998)；van Kooten和Banchereau,J Leukoc Biol.,67:2(2000)；Young等，Immunol Today,9:502(1998)；Quezada等，Annu Rev Immunol.,22:307(2004))。CD40配体(CD40L，也称为CD154)是关于CD40所描述的主要配体，主要由激活的T淋巴细胞和血小板表达(van Kooten和Banchereau,J Leukoc Biol.,67:2(2000)；Armitage等，Nature,357:80(1992))。动脉粥样硬化、移植排斥、凝血、感染控制和自身免疫均受CD40-CD40L相互作用调节(Grewal和Flavell,Annu Rev Immunol.,16:111(1998)；van Kooten和Banchereau,JLeukoc Biol.,67:2(2000))。

术语“共刺激分子”涵盖如下的任何单个分子或分子的组合：当与由T细胞表面上的T细胞抗原受体(TCR)所结合的MHC/肽复合物一起作用时，提供共刺激作用以实现结合所述肽的I细胞的激活。

如本文所使用的，术语“治疗”在根据说明书阅读时具有其平常和普通的含义，并且可以包括但不限于例如响应于受试者(特别是患有X-HIGM的受试者)表现出的疾病、紊乱或生理状况而做出的干预。治疗的目的可包括但不限于如下中的一种或多种：减轻或预防症状，减缓或停止疾病、紊乱或病症的进展或恶化，疾病、紊乱或病症的治病性治疗，以及缓和疾病、紊乱或病症。在一些替代方式中，“治疗”是指基础疾病的治疗或疾病症状的治疗。例如，在一些替代方式中，治疗减少、减轻、缓解或根除疾病的症状和/或提供疾病的治病性疗法。

本文所述的“过继细胞疗法”或“过继细胞转移”在根据说明书阅读时具有其平常和普通的含义，并且可以包括但不限于例如将细胞(最常用的免疫来源的细胞)转移回同一患者或转移至新的受体宿主，目的在于将免疫功能和特性转移至新宿主中。在一些替代方式中，过继细胞疗法或过继细胞转移包括给予细胞以促进受试者中的CD40LG基因的同源介导的修复。

如本文所使用的，“同源介导的修复”(HDR)在根据说明书阅读时具有其平常和普通的含义，并且可以包括但不限于例如在细胞中、例如在修复DNA中的双链断裂(DSB)的过程中进行的DNA修复。HDR需要核苷酸序列同源性，并使用供体多核苷酸来修复在其中发生DSB(例如在靶标DNA序列内)发生的序列。供体多核苷酸通常与侧接于DSB的序列具有必需的序列同源性，以使供体多核苷酸可以充当合适的修复模板。HDR引起遗传信息从例如供体多核苷酸转移至DNA靶标序列。如果供体多核苷酸序列不同于DNA靶标序列并且供体多核苷酸的部分或全部被并入DNA靶标序列中，则HDR可引起DNA靶标序列的改变(例如插入、删除、突变)。在一些替代方式中，整个供体多核苷酸、供体多核苷酸的一部分或供体多核苷酸的拷贝被整合在DNA靶标序列的位点。

如本文所使用的，“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)；寡核苷酸；通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段；以及通过连接、切断、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用中任一种产生的片段。核酸分子可由单体组成，所述单体为天然存在的核苷酸(例如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的类似物(例如天然存在的核苷酸的对映体形式)，或两者的组合。经修饰的核苷酸可具有糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分的改变。糖修饰包括例如用卤素、烷基基团、胺类和叠氮基基团替换一个或多个羟基基团，或者可将糖官能化为醚或酯。此外，可用空间上和电子上相似的结构(例如氮杂糖或碳环糖类似物)替换整个糖部分。碱基部分中的修饰的实例包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、或其它公知的杂环置换。核酸单体可通过磷酸二酯键或此类连接的类似物连接。磷酸二酯连接的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)或氨基磷酸酯等。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，其包含连接至聚酰胺骨架的天然存在的核酸碱基或经修饰的核酸碱基。核酸可为单链核酸或双链核酸。核酸序列在本文中可以用SEQ ID NO描述，在整个申请中予以描述，并包括在附录I中。在一些替代方式中，本文描述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：12-SEQ ID NO：27中任一项的序列具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，或在上述百分比的任意两个所定义的范围内。

如本文所使用的，术语“融合(fusion)”或“融合的(fused)”在根据说明书阅读时具有其平常和普通的含义，并且可包括但不限于例如第一核酸通过磷酸二酯键连接至第二核酸，从而使第一核酸的3’端的编码序列与第二核酸的5’端的编码序列在读框内，并且通过引申可进一步指第一多肽在第一多肽的C-末端通过肽键连接至第二多肽。就其而言，本文所使用的“融合的”核酸或肽(或核酸或肽“的融合”)是指分子的构型，并且不一定涉及实施将两个分子结合在一起的动作。举例来说，第一核酸与第二核酸的融合可以编码单个多肽，所述多肽中第一多肽序列(由第一核酸编码)融合至第二多肽序列(由第二核酸编码)。在一些替代方式中，包含融合的核酸的分子被称为融合核酸。

如本文所使用的，术语“变体”在根据说明书阅读时具有其平常的和普通的含义，并且可以包括但不限于例如具有与参考多核苷酸(或多肽)实质上相似的序列的多核苷酸(或多肽)。在多核苷酸的情况中，与参考多核苷酸相比，变体可在5'端、3'端和/或一个或多个内部位点具有一个或多个核苷酸的删除、置换或添加。可以使用本领域已知的常规技术(例如聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术)来对变体和参考多核苷酸之间的序列方面的相似性和/或差异进行检测。变体多核苷酸还包括合成的衍生的多核苷酸，例如通过如使用定点诱变产生的那些多核苷酸。通常，如通过本领域技术人员已知的序列比对程序所确定的，多核苷酸(包括但不限于DNA)的变体可以与参考多核苷酸具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性，或在由任意两个上述值限定的范围内的量的序列同一性。在多肽的情况中，与参考多肽相比，变体可以具有一个或多个氨基酸的删除、置换或添加。变体和参考多肽之间的序列的相似性和/或差异可以使用本领域已知的常规技术如蛋白质印迹进行检测。通常，如通过本领域技术人员已知的序列比对程序所确定的，多肽的变体可以与参考多肽具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性，或在由任意两个上述值限定的范围内的量的序列同一性。

“调控元件”是调节核心启动子的活性的核苷酸序列。例如，调控元件可包含与细胞因子结合的核苷酸序列，所述细胞因子能够使得专门地或优先地在特定的细胞、组织或细胞器中转录。这些类型的调控元件通常与以“细胞特异性”、“组织特异性”或“细胞器特异性”的方式表达的基因相关联。在一些替代方式中，提供了用于编辑细胞中的至少一个靶基因的系统，其中所述系统包含编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列，其中所述CRISPR向导RNA与细胞中的至少一个靶基因互补，并且，其中所述第一核酸序列存在于载体中；所述系统还包含编码Cas9蛋白的第二核酸序列、编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列、以及编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列。在一些替代方式中，将第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列连接至在真核细胞(例如人细胞)中可操作的调控元件。

如本文所使用的，将术语“可操作地连接”用于描述调控元件和基因或其编码区之间的连接。通常，基因表达被置于一种或多种调控元件的控制下，所述调控元件例如但不限于组成型或诱导型启动子、组织特异性调控元件、以及增强子。基因或编码区被称为“可操作地连接至”或“操作性地连接至”或“可操作地关联”调控元件，意味着基因或编码区由调控元件控制或受调控元件影响。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。

如本文所使用的，“上游”在根据说明书阅读时具有其平常和普通的含义，并且可以包括但不限于例如多核苷酸上的定位的5’位置、以及朝向多肽上的定位的N-末端的位置。如本文所使用的，“下游”是指核苷酸上的定位的3’位置、以及朝向多肽上的定位的C-末端的位置。

如本文所使用的，术语“构建体”在根据说明书阅读时具有其平常和普通的含义，并且可以包括但不限于例如用于表达特定核苷酸序列的目的而生产的重组核酸、或用于构建其它重组核苷酸序列中的重组核酸。

“启动子”是指导结构基因转录的核苷酸序列。在一些替代方式中，启动子位于基因的5'非编码区中，临近结构基因的转录起始位点。在转录起始中发挥功能的启动子中的序列元件通常特征在于共有核苷酸序列。这些启动子元件包括：RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、分化特异性元件(DSE；McGehee等，Mol.Endocrinol.7:551(1993)；以引用的方式将其整体并入本文)、环AMP应答元件(CRE)、血清应答元件(SRE；Treisman，Seminarsin Cancer Biol.1:47(1990)；以引用的方式将其整体并入本文)、糖皮质激素应答元件(GRE)以及其它转录因子(例如CRE/ATF(O'Reilly等，J.Biol.Chem.267:19938(1992))、AP2(Ye等，J.Biol.Chem.269:25728(1994))、SP1)的结合位点、cAMP应答元件结合蛋白(CREB；Loeken,Gene Expr.3:253(1993))以及八聚体因子(octamer factors)(一般参见：Watson等编，Molecular Biology of the Gene，第4版(The Benjamin/Cummings PublishingCompany,Inc.，1987)、以及Lemaigre和Rousseau，Biochem.J.303:1(1994)；所有参考文献以引用的方式将其整体并入本文)。如本文使用的，启动子可为组成型激活、阻遏型或诱导型。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率响应于诱导剂而增加。反之，如果启动子是组成型启动子，则转录速率不受诱导剂调控。阻遏型启动子也是已知的。在一些替代方式中，调控元件可为非翻译区。在一些替代方式中，非翻译区是5'非翻译区。在一些替代方式中，非翻译区是3'非翻译区。在一些替代方式中，使用5'非翻译区或3'非翻译区。在一些替代方式中，使用5'非翻译区和3'非翻译区二者。本领域技术人员将理解本文的替代方式中使用的非翻译区的含义。在一些替代方式中，本文所述的启动子可为MND启动子。MND启动子的名称来自骨髓增生性肉瘤病毒增强子，其具有阴性对照区缺失，以及dl587rev引物结合位点取代，并且是γ逆转录病毒合成启动子，其包含骨髓增生性肉瘤病毒增强子与修饰的MoMulv LTR的U3区。

如本文所使用的，术语“增强子”是指可以调节转录效率的一类调控元件，而无关于增强子相对于转录起始位点的距离或方向。

如本文所使用的，术语“转染”在根据说明书阅读时具有其平常和普通的含义，并且可包括但不限于例如通过例如用本文所述的重组AAV载体接触细胞来向宿主细胞中引入核酸。如本文所使用的，“瞬时转染”是指由通常不会引起外源核酸整合至瞬时转染的宿主细胞的基因组中的方法将外源核酸引入宿主细胞中。在一些替代方式中，所述核酸是RNA。在一些替代方式中，所述核酸是DNA。在一些替代方式中，当所述核酸是RNA时，所述核酸通常不整合至瞬时转染的细胞的基因组中。在一些替代方式中，当所述核酸是DNA时，所述核酸可整合至瞬时转染的细胞的基因组中。

如本文所使用的，术语“载体”在根据说明书阅读时具有其平常和普通的含义，并且可以包括但不限于例如用于将遗传物质传输到宿主细胞的多核苷酸构建体，通常是质粒或病毒。载体可以是例如病毒、质粒、粘粒或噬菌体。本文所使用的载体可以由DNA或RNA组成。在一些替代方式中，载体由DNA组成。“表达载体”是当其存在于合适的环境中时能够指导由该载体携带的一个或多个基因编码的蛋白质的表达的载体。载体优选地能够自主复制。通常，表达载体包含转录启动子、基因和转录终止子。通常将基因表达置于启动子的控制之下，并且基因被称为“可操作地连接至”启动子。

如本文所使用的，“AAV系统”或“AAV表达系统”在根据说明书阅读时具有其平常和普通的含义，并且可以包括但不限于例如用于表达至少一种转录本编码核酸并被置于一个或多个AAV载体上的核酸。如本文所使用的，“活性依赖性表达”(以及该根术语的变体)是指在包含核酸的细胞的特定类型的活性改变(例如，细胞去极化)时将被诱导的核酸表达。在一些替代方式中，细胞是神经元，并且响应于刺激的神经元的去极化诱导“活性依赖性”核酸表达。在一些替代方式中，AAV载体包含以SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17示出的序列。

本文所述的术语“宿主细胞”在根据说明书阅读时具有其平常和普通的含义，并且可包括但不限于例如根据本发明的替代方式引入有Cas9-mRNA/AAV-向导RNA的细胞以及与本文的系统一起提供的细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。原核宿主细胞的实例包括但不限于：大肠杆菌(E.coli)、固氮菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、支原体(mycoplasmas)和/或蓝细菌(cyanobacteria)。真核宿主细胞的实例包括但不限于：原生动物细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、禽类细胞和哺乳动物细胞。在一些替代方式中，提供了用于编辑细胞中至少一个靶基因的系统，其中所述细胞是真核细胞。在一些替代方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些替代方式中，所述细胞是人细胞。在一些替代方式中，所述细胞是原代细胞。在一些替代方式中，所述细胞不是转化细胞。在一些替代方式中，所述细胞是原代淋巴细胞。在一些替代方式中，所述细胞是原代淋巴细胞、CD34

“原核”细胞缺乏真正的核。原核细胞的实例为细菌(例如蓝细菌、嗜酸乳杆菌、固氮菌、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌、破伤风梭菌、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎葡萄球菌(Staphylococcus pneumoniae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和/或大肠杆菌)和古细菌(例如泉古菌门(Crenarchaeota)、广古菌门(Euryarchaeota)和/或初古菌门(Korarchaeota))。本文所述的Cas9蛋白是来自于原核细胞的蛋白质。

“真核”细胞包括但不限于：藻类细胞、真菌细胞(例如酵母)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞或人细胞(例如T细胞)。

本文所述的“T细胞前体”在根据说明书阅读时具有其平常和普通的含义，并且可包括但不限于例如可迁移至胸腺并成为T细胞前体(其不表达T细胞受体)的淋巴样前体细胞。所有T细胞起源于骨髓中的造血干细胞。来自造血干细胞的造血祖细胞(淋巴样祖细胞)聚居于胸腺并通过细胞分裂扩增，以生成大群的未成熟胸腺细胞。最早的胸腺细胞既不表达CD4也不表达CD8，并且因此被归类为双阴性(CD4

本文所述的“造血干细胞”或“HSC”在根据说明书阅读时具有其平常和普通的含义，并且可包括但不限于例如可产生髓系细胞(例如，如巨噬细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞或淋巴样谱系(例如T细胞、B细胞、NK细胞))的前体细胞。HSC具有其中存在三类干细胞的异质群体，其通过它们在血液中的淋巴样后代与髓系后代的比(L/M)来区别。在一些替代方式中，提供的细胞是HSC细胞。在一些替代方式中，细胞是原代淋巴细胞或CD34

如本文所使用的，“自体的”是指干细胞的供体和受体是相同的，例如患者或受试者是细胞的来源。

本文所述的“原代人细胞”直接培养自其来源器官组织或血细胞。与永生化细胞系相比，原代人细胞提供增强的体内复制。在一些替代方式中，提供的细胞是原代人细胞。

如本文所使用的，本文所述的术语“共同递送”在根据说明书阅读时具有其平常和普通的含义，并且可以包括但不限于例如递送两个以上的单独的化学实体，无论是在体外或体内。共同递送是指单独的试剂的同时递送；是指试剂的混合物的同时递送；以及是指先递送一种试剂，随后递送第二种试剂或额外的试剂。在所有情况中，共同递送的试剂旨在与彼此联合工作。例如，在一些替代方式中，共同递送包括AAV载体和感兴趣的mRNA的递送。

本文所述的术语“核酸内切酶”在根据说明书阅读时具有其平常和普通的含义，并可包括但不限于例如切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶。所述多核苷酸可为双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、RNA、DNA和RNA的双链杂合体、或合成的DNA(例如含有除A、C、G和T以外的碱基)。核酸内切酶可对称地切割多核苷酸，留下“平”末端，或者在不直接相对的位置产生可被称为“粘性末端”的突出端(overhang)。本文所述的方法和组合物可应用于由核酸内切酶产生的切割位点。在所述系统的一些替代方式中，所述系统可进一步提供核酸，该核酸编码核酸内切酶(包括锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶(如MegaTAL)或CRISPR/Cas9)、或包含核酸内切酶(例如Cas9、TALEN或MegaTAL或它们的一个或多个部分)的结构域的融合蛋白。这些实例并不意味着是限制性的，其它核酸内切酶和包含其它核酸内切酶的系统和方法的替代方式以及这些示例性替代方式的变型和修饰是可能的，并不需要过度实验。

本文所述的术语“转录激活因子样(TAL)效应物核酸酶”(TALEN)在根据说明书阅读时具有其平常和普通的含义，并且可以包括但不限于例如包含与核酸酶结构域融合的TAL效应物结构域的核酸酶。可对TAL效应物DNA结合结构域进行工程化以结合至期望靶标并融合至核酸酶结构域(例如Fokl核酸酶结构域)，从而得到TAL效应物结构域-核酸酶融合蛋白。本文所述的方法和系统可应用于由TAL效应物核酸酶产生的切割位点。在本文提供的系统的一些替代方式中，所述系统可进一步包含TALEN核酸酶或者编码TALEN核酸酶的载体或核酸。在本文提供的方法的一些替代方式中，所述方法可进一步包括提供核酸酶，例如TALEN核酸酶。

MegaTAL由两种不同类型的DNA靶向酶的组合衍生而来。大范围核酸酶(也称为归巢核酸内切酶)是在同一结构域中同时具有DNA识别和核酸酶功能的特性的单肽链。在本文提供的系统的一些替代方式中，所述系统可进一步包含MegaTAL核酸酶或者编码MegaTAL核酸酶的载体或核酸。在本文提供的方法的一些替代方式中，所述方法可进一步包括提供MegaTAL核酸酶或者编码MegaTAL核酸酶的载体或核酸。

CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)是包含碱基序列的短重复的原核DNA的片段。每个重复跟随着来自先前暴露于细菌病毒或质粒的“间隔DNA”的短片段。

Cas9(CRISPR相关蛋白9)是一种RNA导向的DNA核酸内切酶，在其它细菌中，其与酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的CRISPR适应性免疫系统相关。酿脓链球菌利用Cas9来记忆并随后探询和切割外源DNA，例如侵入的噬菌体DNA或质粒DNA。Cas9通过将外源DNA解链并检查与向导RNA的20个碱基对的间隔区的互补性来进行该探询。如果DNA底物与向导RNA互补，则Cas9切割侵入的DNA。

将本文所述的CRISPR/Cas系统用于进行基因编辑(添加、破坏或改变特定基因的序列)和基因调控。通过将Cas9蛋白、其衍生物或其片段以及适当的向导RNA递送到细胞中，可在任何期望的位置切割有机体的基因组。使用CRISPR来建立能够改变整个群体的基因组的RNA导向的基因成为可能。CRISPR/Cas9系统的基本组分包括靶基因；向导RNA；以及Cas9核酸内切酶、其衍生物或其片段。应用CRISPR/Cas9进行基因编辑的重要方面在于需要有效地将向导RNA递送至各种各样的细胞类型的系统。例如，这可涉及如同核酸一样来递送体外产生的向导RNA(通过体外转录或化学合成产生的向导RNA)。在一些替代方式中，编码向导RNA的核酸通过掺入修饰的碱基(例如2'O-甲基碱基)而被赋予核酸酶抗性。在一些替代方式中，例如，本文所述的CRISPR/Cas9系统设置有包含一个或多个修饰的碱基(例如任何一个或多个本文所述的修饰的碱基)的向导RNA，所述系统中编码Cas9核酸酶或其衍生物或其功能片段的多核苷酸(例如带有Cas9的mRNA载体的20个核酸的序列)设置有期望长度的poly(T)尾或poly(A)尾并且根据本文所述的教导来制备。

在一些替代方式中，使用化学修饰的向导RNA在考虑之列。化学修饰的向导RNA已用于人原代细胞中的CRISPR-Cas基因组编辑(Hendel,A.等，Nat Biotechnol.2015Sep；33(9):985-9)。向导RNA的化学修饰可包括赋予核酸酶抗性的修饰。核酸酶可为核酸内切酶或核酸外切酶、或两者皆可。一些化学修饰不受限制地包括：2'-氟代、2'O-甲基、硫代磷酸酯二硫醇3'-3'端连接、2-氨基-dA、5-甲基-dC、C-5丙炔基-C、或C-5丙炔基-U、吗啉代等。这些实例并不意味着是限制性的，其它化学修饰以及这些示例性替代方式的变型和修饰也在考虑之列。

可用于本文所述的替代方式的示例性向导RNA可含有一个或多个本文所示的修饰的碱基。在一些替代方式中，向导RNA包括SEQ ID NO:12所示的序列。此外，由于腺相关病毒(AAV)载体能够转导广泛范围的原代细胞，在这种情况下，用于表达向导RNA的重要系统基于AAV载体的使用。AAV载体不会引起感染，也已知不会整合到基因组中。因此，使用AAV载体具有既安全又有效的益处。

术语“核酸外切酶”是指通过在3'末端或5'末端使磷酸二酯键断裂的水解反应在多核苷酸链的末端切割磷酸二酯键的酶。所述多核苷酸可为双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、RNA、DNA和RNA的双链杂合体、或合成的DNA(例如含有除A、C、G和T以外的碱基)。术语“5'核酸外切酶”是指在5'末端切割磷酸二酯键的核酸外切酶。术语“3'核酸外切酶”是指在3'末端切割磷酸二酯键的核酸外切酶。核酸外切酶可在核酸内切酶切割位点处或在通过其它化学或机械方式生成的末端处切割多核苷酸链末端处的磷酸二酯键，所述其它化学或机械方式例如剪切(例如通过穿过细规格的针头、加热、超声处理、微珠滚动(tumbling)或雾化)、电离辐射、紫外线辐射、氧自由基、化学水解或化疗剂。核酸外切酶可在平末端或粘性末端处切割磷酸二酯键。大肠杆菌核酸外切酶I和核酸外切酶III是两种常用的具有3'核苷酸外切单链降解活性的3'核酸外切酶。3'核酸外切酶的其它实例包括二磷酸核苷激酶(Nucleoside diphosphate kinases，NDK)NDK1(NM23-H1)、NDK5、NDK7和NDK8(Yoon J-H等，Characterization of the 3′to 5′exonuclease activity found in human nucleosidediphosphate kinase 1(NDK1)and several of its homologues.(Biochemistry 2005:44(48):15774-15786.))、WRN(Ahn,B.等，Regulation of WRN helicase activity in humanbase excision repair.J.Biol.Chem.2004,279:53465-53474)和三素修复核酸外切酶2(Three prime repair exonuclease 2，Trex2)(Mazur,D.J.,Perrino,F.W.,Excision of3′termini by the Trex1 and TREX2 3′→5′exonucleases，Characterization of therecombinant proteins.J.Biol.Chem.2001,276:17022-17029；以引用的方式将两篇参考文献整体并入本文)。大肠杆菌核酸外切酶VII和T7-核酸外切酶基因6是两种常用的具有5％核苷酸外切单链降解活性的5'-3'核酸外切酶。核酸外切酶可来源于原核生物(如大肠杆菌核酸外切酶)或真核生物(如酵母核酸外切酶、蠕虫核酸外切酶、鼠核酸外切酶或人核酸外切酶)。在本文提供的系统的一些替代方式中，所述系统可进一步包含核酸外切酶或者编码核酸外切酶的载体或核酸。在一些替代方式中，所述核酸外切酶是Trex2。在本文提供的方法的一些替代方式中，所述方法可进一步包括提供核酸外切酶或编码核酸外切酶(例如Trex2)的载体或核酸。

如本文所使用的，本文所述的“向导”在根据说明书阅读时具有其平常和普通的含义，并且可以包括但不限于例如位点特异性地将核酸酶导向靶标核酸序列的任意多核苷酸。在一些替代方式中，向导包括RNA、DNA、或RNA和DNA的组合。与本文所述的替代方式一起使用的示例性向导RNA以SEQ ID NO：12所示的序列提供，所述向导RNA可包含本文所述的一个或多个修饰的碱基。

“基因组区域”是宿主细胞的基因组中的染色体的区段，其存在于靶标核酸序列位点的任一侧，或可替代地还包含靶标位点的部分。供体多核苷酸的同源臂具有足够的同源性以与相应的基因组区域进行同源重组。在一些替代方式中，供体多核苷酸的同源性臂与紧邻靶标位点侧翼的基因组区域共享显著的序列同源性；认为可以将同源臂设计成与距靶标位点更远的基因组区域具有足够的同源性。

如本文所使用的，本文所述的“非同源末端连接”(NHEJ)在根据说明书阅读时具有其平常和普通的含义，并且可以包括但不限于例如，通过将断裂的一端直接连接至断裂的另一端来对DNA中的DSB进行修复，而无需供体多核苷酸。NHEJ是可用于细胞来修复DNA而无需使用修复模板的DNA修复途径。在缺少供体多核苷酸的情况下，NHEJ通常引起核苷酸在DSB的位点随机插入或删除。

如本文所使用的，“切割位点”是指介导第一多肽的分离的序列，否则所述第一多肽会与第二多肽呈顺式。因此，为简单起见，本文所使用的“切割”、“切割位点”等是指由单个多核苷酸顺式编码的任意两个多肽的分离。因此，“切割”和“切割位点”可以但并不必需是指蛋白水解位点和事件，并且也可以是指用于介导多肽分离的其它机制，例如核糖体跳跃。切割可通过多种方法(包括但不限于磷酸二酯键的酶促水解或化学水解)起始。单链切割和双链切割都是可能的，并且双链切割可以作为两个不同的单链切割事件的结果而发生。双链DNA、RNA或DNA/RNA杂合体的切割可引起平末端或交错末端(staggered end)的产生。

术语“与…互补”意味着互补序列与参考多核苷酸序列的全部或一个或多个部分同源。为了说明，核苷酸序列“CATTAG”对应于参考序列“CATTAG”并与参考序列“GTAATC”互补。

如本文所使用的，术语“标记”是指可检测的分子。多个合适的标记包括多肽。就其而言，如本文所使用的，“标记核酸”是指编码标记的核酸。在一些替代方式中，AAV载体系统包含标记多核苷酸。因此，在一些替代方式中，启动子(例如MND启动子)操作性地连接至标记多核苷酸，从而使得本文所述的AAV载体包含报告子。根据本文替代方式的合适的示例标记包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)(包括例如Aequoria victoria GFP、Renillamuelleri GFP、Renilla reniformis GFP、Renilla ptilosarcus GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)、青色荧光蛋白(CFP)或橙色荧光蛋白(OFP)。额外的报告基因包括但不限于新霉素、磷酸转移酶、氯霉素乙酰转移酶、胸苷激酶、荧光素酶、β-葡萄糖醛酸酶、氨基糖苷、磷酸转移酶、潮霉素B、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基、荧光素酶类(例如海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶等)、DHFR/甲氨蝶呤、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、turboRFP和/或tagRFP、或者任意的上述报告基因的核靶向形式。在一些替代方式中，例如当期望在激活的细胞中产生标记时，感兴趣的多肽包含标记本身。在一些替代方式中，本文提供的AAV构建体包含MND启动子驱动的GFP盒，并且其中，MND启动子驱动的GFP盒提供对AAV转导效率的追踪。

本文所述的术语“基因表达”在根据说明书阅读时具有其平常和普通的含义，并且可以包括但不限于例如基因产物的生物合成。例如，在结构基因的情况中，基因表达涉及将结构基因转录成mRNA以及将mRNA翻译成一种或多种多肽。

“多肽”是通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物，无论其是天然产生的还是合成产生的。具有少于约10个氨基酸残基的多肽通常称为“肽”。多肽可被认为是蛋白质。

“蛋白质”是包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白质还可包含非肽组分，如糖类基团。糖类和其它非肽取代基可由在其中产生蛋白质的细胞添加到该蛋白质，并且将随着细胞类型而变化。蛋白质在本文中根据其氨基酸骨架的结构来定义；取代基(例如糖类基团)通常不指明，尽管如此，其仍可以存在。在一些替代方式中，提供了用于编辑细胞中的至少一个靶基因的系统，其中所述系统包含编码CRISPR向导RNA的第一核酸序列，其中所述CRISPR向导RNA与细胞中的至少一个靶基因互补，并且，其中所述第一核酸序列存在于载体中；所述系统还包含编码Cas9蛋白的第二核酸序列、编码第一腺病毒蛋白的第三核酸序列以及编码第二腺病毒蛋白的第四核酸序列。氨基酸序列可以在本文中以SEQ ID NO描述，并且在整个申请中进行描述并且包括在附录I中。在一些替代方式中，本文描述的氨基酸序列与SEQ ID NO：10-SEQ ID NO：11中任一项的序列具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，或者在上述百分比中任意两个所定义的范围内。

关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以视上下文和/或应用的情况而从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为清楚起见，本文可以明确地阐述各种单数/复数的置换。

本领域技术人员将理解，通常，本文使用的术语、尤其是所附权利要求(例如所附权利要求的正文)中使用的术语通常旨在作为“开放式”术语(例如术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包含”应解释为“包含但不限于”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果期望特定数量的介绍性的权利要求详述，在权利要求中将明确地详述此类期望，并且在缺少这样的详述的情况下，不存在这样的期望。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求可以包含介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”的使用以引入权利要求详述。然而，即使当相同的权利要求包含介绍性短语“一个或多个”或“至少一个”，以及诸如“一种/一个”的不定冠词(例如“一种”和/或“一个”应该被解释为“至少一个/一种”或“一个或多个/一种或多种”)，这些短语的使用也不应被解释为暗示由不定冠词“一个/一种”介绍的权利要求详述将包含这种介绍性权利要求详述的任意特定权利要求限制于仅包含一个这样的详述的替代方式；对于用于介绍权利要求详述的定冠词的使用也是如此。另外，即使明确地引述了特定数量的介绍性权利要求详述，本领域技术人员将认识到，这种引述应该被解释为至少表示所引述的数字(例如，仅有“至少两个”而没有其它修饰语的详述表示至少两个详述或两个以上的详述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的惯例的情况下，通常这样的结构旨在在本领域技术人员将理解该惯例的意义上(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于具有单独的A、具有单独的B、具有单独的C、A和B一起具有、A和C一起具有、B和C一起具有、和/或A、B和C一起具有的系统等)。在使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的惯例的情况下，通常这样的结构旨在在本领域技术人员将理解该惯例的意义上(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于具有单独的A、具有单独的B、具有单独的C、A和B一起具有、A和C一起具有、B和C一起具有、和/或A、B和C一起具有的系统等)。本领域技术人员将进一步理解，无论是在说明书、权利要求或附图中，实际上呈现两个以上的可选术语的任意转折词和/或短语都应该被理解为考虑包括这些术语之一、任意一个术语或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

X-连锁高免疫球蛋白M(IgM)综合征(X-HIGM)发生在携带CD40LG突变的人中，其特征为反复感染，血清免疫球蛋白G、A和E(IgG、IgA和IgE)低而IgM水平正常或升高，记忆B细胞数量减少，以及类别转换记忆B细胞缺失(图1)。可将CD40L功能重构至适当的造血谱系的基因疗法可以大大改善这些患者的治疗选择。

有趣的是，对雌性X-HIGM携带者的研究表明CD40LG基因的X失活是随机且高度异质的，一些携带者在仅5％-10％的T细胞中表达未突变的CD40L。而且，在仅5％的T细胞上表达未突变的CD40L的雌性X-HIGM携带者表现出高IgM综合征的症状特征。在低至12％的T细胞中表达未突变CD40L的雌性携带者没有任何症状，这表明免疫功能不受损所必需的未突变CD40L表达的阈值可能存在于5％-12％之间。因此，即使用相对低百分比的修正的细胞，基因疗法也可以提供临床益处(Hollenbaugh,D.等，The Journal of clinicalinvestigation,1994.94(2):p.616-622；de Saint Basile,G.等，European journal ofimmunology,1999.29(1):p.367-373)。

CD40:CD40配体(CD40L)共刺激信号在抗原识别后B细胞和T细胞之间的交叉作用(cross-talk)中起重要作用(Banchereau,J.等，Annual review of immunology,1994.12(1):p.881-926；Foy,T.M.等，Annual review of immunology,1996.14(1):p.591-617；Elgueta,R.等，Immunol Rev,2009.229(1):p.152-72)。CD40L主要在激活的T细胞上表达，但在炎性条件下也由其它免疫细胞(如树突状细胞和巨噬细胞)表达，而CD40在B细胞上组成性表达(

先前开发用于X-HIGM的基因疗法的尝试使用γ-逆转录病毒将CD40L cDNA表达盒递送至Cd401-/-小鼠的骨髓造血干细胞(HSC)。然而，这导致大多数小鼠中的T细胞淋巴增生性紊乱，表明CD40L的内源性转录调控可能是重要的安全考虑因素(Sacco,M.G.等，Cancer gene therapy,2000.7(10):p.1299；Brown,M.P.等，Nature medicine,1998.4(11):p.1253)。

先前的工作涉及用于在原代人T细胞中内源性启动子的下游直接递送CD40L编码序列的基因编辑方法(Hubbard,N.等，Blood,2016.127(21):p.2513-22)。该方法基于使用CD40LG特异性TALE核酸酶(TALEN)和腺相关病毒血清型6(AAV6)递送的具有CD40LG同源臂的CD40L cDNA的同源介导修复(HDR)。CD40L在经基因编辑的T细胞中的表达动力学反映未编辑的T细胞中的内源性蛋白质的表达动力学。此外，基因编辑在体外挽救了X-HIGM患者T细胞中的CD40L表达和功能。尽管有希望作为T细胞疗法，但Hubbard中描述的方法并未转化为使用造血干细胞和祖细胞(HSPC)作为X-HIGM的潜在治病性治疗的基因编辑手段。

与T细胞相比，在CD34

因此，本文提供的一些替代方式涉及使用治疗性基因组编辑手段来治疗、缓解、抑制或改善X-HIGM。在一些替代方式中，提供了用于引入处于HSPC中的内源性启动子和增强子的控制下的完整CD40LG cDNA的系统和方法。在一些替代方式中，本文所述的系统和方法挽救CD40L中的免疫学缺陷和功能缺陷并提供治病性疗法。

例如，一些替代方式涉及CD34

此外，本文提供的公开内容涉及用于有效培养和编辑人外周血HSPC的CD40LG基因座以及在免疫缺陷小鼠中植人经编辑的多能干细胞的方法、系统和组合物。

在一些替代方式中，在两个核酸酶平台Cas9 RNP和TALEN之间显示了AAV辅助的HDR在人造血干细胞(HSC)中的效率。RNP向导RNA(gRNA)设计为将Cas9切割靶向至TALEN切割的15bp以内，以便使用相同的供体模板对核酸酶进行比较。因为CD40LG启动子在HSC中不活跃，所以AAV6供体被设计为递送在任一侧具有1kb的CD40LG同源的MND启动子-GFP表达盒(图2)(Challita,P.-M.等，Journal of virology,1995.69(2):p.748-755)。靶向构建体中的CD40LG同源臂缺失TALEN和Cas9 gRNA结合位点，使其不可被两种核酸酶切割。

一些替代方式关注将成体的动员的CD34

同源介导的修复(HDR)是指使用同源核酸(例如，姐妹染色单体或外源核酸)修复DNA损伤的过程。在正常细胞中，HDR通常涉及一系列步骤，例如对断裂的识别、断裂的稳定、切除、单链DNA的稳定、DNA交叉中间体的形成、交叉中间体的拆分、以及连接。如本文所述，HDR可用于改变靶标序列并修正(例如，修复或编辑)基因组中的突变。尽管不希望受到理论的束缚，据信靶标序列的改变通过具有供体模板或模板核酸的HDR发生。例如，供体模板或模板核酸提供靶位置的改变。

本文提供的一些替代方式涉及用于与X-HIGM相关的基因的同源介导的修复的方法和系统。在一些替代方式中，基因是CD40LG基因。在一些替代方式中，该方法包括在人造血细胞中的CD40LG基因的HDR。在一些替代方式中，该方法和系统包括CD40LG基因的基于核酸酶的HDR。在一些替代方式中，基于核酸酶的HDR包括基于TALEN的核酸酶。在一些替代方式中，基于核酸酶的HDR包括基于CRISPR/Cas的核酸酶。

转录激活因子样(TAL)效应物-DNA修饰酶(TALEN)是可被工程化以切割特定的DNA序列的限制性酶。通过将TAL效应物结构域与DNA切割结构域融合来制成TALEN。

在一些替代方式中，在用CD40LG TALEN进行的靶向中使用的CD40LG基因座与AAV供体共同递送。

在一些替代方式中，CD40LG TALEN正向序列由SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：21定义。在一些替代方式中，CD40LG TALEN反向序列由SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：22定义。在一些替代方式中，正向序列和/或反向顺序与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：22中任一项的序列具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，或在任意两个上述百分比所定义的范围内。

在一些替代方式中，AAV供体包含处于MND启动子控制下的GFP盒。在一些替代方式中，AAV供体具有侧接于MND启动子驱动的GFP盒(SEQ ID NO：14)的1kb同源臂。在一些替代方式中，AAV供体包含一个或多个核苷酸突变以消除TALEN和向导序列的切割，如SEQ IDNO：14和SEQ ID NO：15所示。在一些替代方式中，MND启动子的核苷酸序列与SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15中任一项的序列具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，或在任意两个上述百分比所定义的范围内。

本文提供的一些替代方式涉及用于CD40LG基因(SEQ ID NO：13)的HDR中的TALEN核酸酶。在一些替代方式中，TALEN结合至CD40LG基因中的TALEN结合位点。在一些替代方式中，CD40LG TALEN结合至天然CD40LG序列(SEQ ID NO：13)。在一些替代方式中，CD40LG基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：13的任一序列具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，或在任意两个上述百分比所定义的范围内。

用于使用CD40LG TALEN进行的靶向中的CD40LG基因座包含以下组分(从5'至3')：上游同源臂(SEQ ID NO：18)；外显子1(SEQ ID NO：26)，其包括向导RNA(SEQ ID NO：12)；T-for(TALEN正向结合位点；SEQ ID NO：23)；切割位点(SEQ ID NO：25)；T-rev(TALEN反向结合位点；SEQ ID NO：24)；外显子2(SEQ ID NO：27)；以及下游同源臂(SEQ ID NO：19)。在一些替代方式中，上述组分中的任一个(包括上游同源臂、外显子1、向导RNA、T-for、切割位点、T-rev、外显子2或下游同源臂中的任一个或多个)的核苷酸序列与如下的相应SEQ IDNO中的任一项序列具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，或在任意两个上述百分比所定义的范围内的同一性：分别包括SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：19。

在一些替代方式中，用于使用CD40LG TALEN进行的靶向中的CD40LG基因座与AAV供体共同递送。在一些替代方式中，CD40LG TALEN正向序列由SEQ ID NO：10定义。在一些替代方式中，CD40LG TALEN反向序列由SEQ ID NO：11定义。在一些替代方式中，AAV供体包含处于MND启动子的控制下的GFP盒。在一些替代方式中，AAV供体具有侧接于MND启动子驱动的GFP盒(SEQ ID NO：14)的1kb同源臂。在一些替代方式中，AAV供体包含一个或多个核苷酸突变以消除TALEN和向导序列的切割，如SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示。

本文提供的一些替代方式涉及用于感兴趣的基因的HDR中的Cas核酸酶。在一些替代方式中，Cas核酸酶是Cas9核酸酶。Cas9是RNA导向的DNA核酸内切酶，在其它细菌中，其与酿脓链球菌中的CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)适应性免疫系统相关。酿脓链球菌利用Cas9记忆并随后探询和切割外源DNA、例如侵入的噬菌体DNA或质粒DNA。Cas9通过将外源DNA解链并检查其是否与向导RNA的20个碱基对的间隔区互补来进行该探询。如果DNA底物与向导RNA互补，则Cas9切割侵入的DNA。

在一些替代方式中，Cas核酸酶以与单向导RNA的复合物(作为核糖核蛋白复合物(RNP))进行递送。在一些替代方式中，CRISPR向导序列通过SEQ ID NO:12定义。在一些替代方式中，RNP与AAV供体共同递送。在一些替代方式中，AAV供体是自互补AAV(scAAV)。在一些替代方式中，AAV供体包含在MND启动子的控制下的GFP盒，其中缺失了前间区序列邻近基序(PAM)位点。

在一些替代方式中，核酸包括单个向导RNA(sgRNA)，例如SEQ ID NO：12中任一项所编码的sgRNA。在一些替代方式中，编码sgRNA的核苷酸序列与SEQ ID NO：12的序列具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，或在任意两个上述百分比所定义的范围内。

本文提供的一些替代方式涉及核酸酶(例如TALEN或Cas核酸酶)和AAV供体模板的共同递送，用以修饰细胞中的内源性CD40LG基因座。在一些替代方式中，细胞是哺乳动物细胞。在一些替代方式中，细胞是人细胞。在一些替代方式中，细胞是自体细胞。在一些替代方式中，细胞是原代细胞。在一些替代方式中，细胞是淋巴细胞。在一些替代方式中，细胞不是转化细胞。在一些替代方式中，细胞是原代淋巴细胞。在一些替代方式中，细胞是淋巴细胞前体细胞。在一些替代方式中，细胞是T细胞。在一些替代方式中，细胞是造血细胞。在一些替代方式中，细胞是CD34

在一些替代方式中，通过核酸酶(例如TALEN核酸酶或Cas核酸酶)和AAV供体模板的共同递送对细胞进行转化，来修饰细胞中的内源性CD40LG基因座。在一些替代方式中，提供了在细胞中编辑CD40LG基因的方法，其中，所述方法包括向细胞中引入包含编码向导RNA(例如TALEN向导RNA或CRISPR向导RNA)的第一核酸序列的第一载体(其中向导RNA与所述细胞中的至少一个靶基因互补)，以及向所述细胞中引入编码核酸酶(例如TALEN核酸酶或Cas核酸酶、其衍生物或片段)的第二核酸序列。在一些替代方式中，提供了细胞，其中细胞通过所述方法制造。在一些替代方式中，该方法包括向细胞提供一种或多种本文所述的核酸组合物，例如根据SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：27中的一项或多项的序列或由SEQ ID NO：1-SEQID NO：27中的一项或多项编码的序列，或例如，与如下序列具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性或在任意两个上述百分比所定义的范围内：根据SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和/或SEQ ID NO：27中任一项的序列，或者由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和/或SEQ ID NO：27中任一项所编码的序列。

本文提供的一些替代方式涉及在有需要的受试者中促进CD40LG基因的HDR的方法。在一些替代方式中，该方法包括选择或辨别有需要的受试者。所选择或辨别的有需要的受试者是表现出X-HIGM的症状的受试者，或者是已经被诊断为患有X-HIGM的受试者。可以在临床上或通过诊断测试进行此类评价。

在一些替代方式中，该方法包括经处理的细胞向有需要的受试者的过继细胞转移或过继细胞疗法。在一些替代方式中，过继细胞疗法或过继细胞转移包括给予细胞以促进受试者中的CD40LG基因的同源介导的修复。在一些替代方式中，该方法包括从有需要的受试者获得细胞。在一些替代方式中，来自有需要的受试者的细胞是原代人造血细胞。在一些替代方式中，通过核酸酶(例如TALEN核酸酶或Cas核酸酶)和AAV供体的共同递送来转化细胞，这修饰细胞中的内源性CD40LG基因座。在一些替代方式中，该方法包括扩增经转化的细胞。在一些替代方式中，该方法包括选择在细胞中具有成功修饰的CD40LG基因座的经转化的细胞。在一些替代方式中，将经转化的细胞给予至患者。

在一些替代方式中，向患者给予经转化的细胞包括向患者给予自体细胞。在一些替代方式中，向患者给予经转化的细胞治疗、抑制或缓解X-HIGM的症状。在一些替代方式中，向患者给予经转化的细胞治疗X-HIGM。在一些替代方式中，该方法减少细菌感染或机会性感染。在一些替代方式中，该方法降低间歇性中性粒细胞减少。

在一些替代方式中，将一定量的经处理的细胞作为组合物给予。在一些替代方式中，所给予的细胞的量为1×10

在一些替代方式中，将经处理的细胞与用于治疗紊乱的症状或用于治疗紊乱的额外的疗法作为共同疗法给予至受试者。在一些替代方式中，额外的疗法包括免疫球蛋白疗法、抗生素疗法、抗微生物疗法、骨髓刺激疗法(例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)疗法)、骨髓移植疗法、皮质类固醇疗法或输入疗法。

通过本文提供的系统或方法制备的细胞可以直接给予至患者，用于CD40LG基因座的靶向的同源介导的修复以及用于治疗性或预防性应用，例如用于治疗、抑制或缓解X-HIGM。在一些替代方式中，细胞通过本文提供的系统进行制备。在一些替代方式中，提供了组合物，其中所述组合物包含细胞。在一些替代方式中，本文所述的组合物可用于治疗、预防、缓解或抑制X-HIGM、或者缓解与X-HIGM有关的疾病病症或症状的方法中。

包含细胞的组合物以任何合适的方式被给予，并且在一些替代方式中，与药学上可接受的载体一起被给予。给予包含细胞的此类组合物的合适方法是本领域技术人员可获得并且公知的，并且尽管可以使用多于一种的途径来给予特定的组合物，但是特定的途径通常可以比另一途径提供更直接和更有效的反应。

药学上可接受的载体部分地取决于所给予的特定组合物以及用于给予该组合物的特定方法。因此，存在多种可用的药物组合物的合适制剂(参见例如Remington’sPharmaceutical Sciences)。

适用于肠胃外给予的制剂(例如通过如静脉内、肌内、皮内和/或皮下途径给予的制剂)包括水性和/或非水性的等渗无菌注射溶液、和/或水性和/或非水性无菌混悬液，所述注射溶液可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、和/或使制剂与预期的接受者的血液等渗的溶质，所述混悬液可以包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和/或防腐剂。公开的组合物可以例如通过静脉内输注、口服、局部地、腹膜内、膀胱内或鞘内给予。化合物的制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封的容器中，例如安瓿或小瓶。注射溶液和混悬液可以从前述类型的无菌粉剂、颗粒剂和/或片剂制备。

在一些替代方式中，考虑如下中的一种或多种：肠胃外、皮下、关节内、支气管内、腹腔内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、侧脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、椎管内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病灶内、推注、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮的给予途径。在一些替代方式中，可以将待给予的组合物配制用于经由一种或多种上述途径递送。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括用于编辑细胞中的CD40LG基因的方法。一些此类实施方式包括：(i)向细胞中引入编码向导RNA(gRNA)的多核苷酸，或向细胞中引入编码TALEN的多核苷酸；以及(ii)向细胞中引入模板多核苷酸。在一些实施方式中，CD40LG基因与核苷酸序列SEQ ID NO：13具有至少95％同一性。

在一些实施方式中，gRNA包含与核苷酸序列SEQ ID NO：12具有至少约85％、90％、95％、99％或100％同一性的核酸。

在一些实施方式中，向细胞中引入编码gRNA的多核苷酸包括使细胞与包含CAS9蛋白和编码gRNA的多核苷酸的核糖核蛋白(RNP)接触。在一些实施方式中，RNP包含具有0.1:1至1:10的比例、1:1至1:5的比例、或约1:1.2的比例的CAS9蛋白和编码gRNA的多核苷酸。

在一些实施方式中，模板多核苷酸至少编码CD40LG基因的一部分、或其互补物。在一些实施方式中，模板多核苷酸至少编码野生型CD40LG基因的一部分或其互补物。在一些实施方式中，模板多核苷酸包含CD40LG基因的至少或至少约1kb。在一些实施方式中，模板多核苷酸包含与核苷酸序列SEQ ID NO：15具有至少95％同一性的核酸。在一些实施方式中，模板多核苷酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：15。

在一些实施方式中，病毒载体包含模板多核苷酸。在一些实施方式中，所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方式中，所述载体是自互补AAV(scAAV)载体。

一些实施方式还包括使细胞与IL-6接触。在一些实施方式中，IL-6具有约20ng/mL-约500mg/mL或20ng/mL-500mg/mL、约50ng/mL-约150mg/mL或50ng/mL-150mg/mL、或约100mg/mL或100mg/mL的浓度。在一些实施方式中，IL-6具有至少或至少约1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL的浓度，或前述浓度的任意两个的范围内的浓度。

在一些实施方式中，细胞在无血清扩增培养基II(SFEMII)培养基中孵育。

在一些实施方式中，细胞群包括所述细胞，所述群具有约1×10

一些实施方式还包括在进行步骤(i)和步骤(ii)之后稀释细胞群。在一些实施方式中，在进行步骤(i)和步骤(ii)之后约16小时或16小时对细胞群进行稀释。在一些实施方式中，将细胞群稀释至约250,000个细胞/mL或250,000个细胞/mL。在一些实施方式中，将细胞群稀释至小于2,000,000个细胞/mL、1,000,000个细胞/mL、500,000个细胞/mL、250,000个细胞/mL、100,000个细胞/mL、50,000个细胞/mL、10,000个细胞/mL、1000个细胞/mL，或小于约2,000,000个细胞/mL、1,000,000个细胞/mL、500,000个细胞/mL、250,000个细胞/mL、100,000个细胞/mL、50,000个细胞/mL、10,000个细胞/mL、1000个细胞/mL，或上述密度中任意两个的范围内的密度。

一些实施方式还包括使细胞与干细胞因子(SCF)、FMS样酪氨酸激酶3(Flt-3)、血小板生成素(TPO)、TPO受体激动剂、UM171或stemregenin(SR1)接触。在一些实施方式中，TPO受体激动剂包括Eltrombopag。

在一些实施方式中，步骤(i)和/或步骤(ii)包括使细胞与HDM2蛋白接触。在一些实施方式中，HDM2蛋白具有约1nM-约50nM或1nM-50nM、或约6.25nM-约25nM或6.25nM-25nM的浓度。在一些实施方式中，HDM2蛋白具有至少1nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、100nM、200nM、500nM、1000nM的浓度，或至少约1nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、100nM、200nM、500nM、1000nM的浓度，或在前述浓度的任意两个的范围内的浓度。

在一些实施方式中，使细胞与至少1000MOI或至少约1000MOI的AAV、或至少2500MOI或至少约2500MOI的AAV接触。在一些实施方式中，使细胞或包含该细胞的细胞群与以下量或浓度的AAV接触：至少10MOI、100MOI、200MOI、500MOI、1000MOI、2000MOI、5000MOI或10000MOI，或至少约10MOI、100MOI、200MOI、500MOI、1000MOI、2000MOI、5000MOI或10000MOI，或上述数量中任意两个的范围内的量或浓度。

在一些实施方式中，使细胞与至少100μg/mL或至少约100μg/mL的RNP、或至少200μg/mL或至少约200μg/mL的RNP接触。在一些实施方式中，使细胞与具有以下浓度的RNP接触：至少1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL或1000μg/mL的浓度，或至少约1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL或1000μg/mL的浓度，或任意两个前述浓度范围内的浓度。

在一些实施方式中，步骤(i)和/或步骤(ii)包括接触约1,000,000个细胞/20μL的核转染反应或1,000,000个细胞/20μL的核转染反应，其中，所述核转染反应包含gRNA和/或模板多核苷酸。

在一些实施方式中，以10μL或约10μL、50μL或约50μL、100μL或约100μL、200μL或约200μL、500μL或约500μL、1000μL或约1000μL、1500μL或约1500μL、2000μL或约2000μL、50000μL或约50000μL的体积、或任意两个上述体积的范围内的体积进行核转染反应。

在一些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，细胞是人细胞。在一些实施方式中，细胞是原代细胞。在一些实施方式中，细胞是造血干细胞(HSC)。在一些实施方式中，细胞是T细胞或B细胞。在一些实施方式中，细胞是CD34+细胞。在一些实施方式中，细胞是离体的。

实施例

非肥胖性糖尿病(NOD)scidγ(NSG)小鼠购自杰克逊实验室。所有动物研究均根据实验室动物护理评估和鉴定协会(AAALAC)标准进行，并得到SCRI机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。六至10周龄的小鼠通过腹膜内注射用25mg/kg或35mg/kg的BUSULFEX(Henry Schein Inc.)(在磷酸盐缓冲盐水中1:1稀释)处理。24小时后，通过眼眶后注射递送处于磷酸盐缓冲盐水中的2×10

CD34

基因编辑CD34

如前所述生产AAV原液(stocks)(Khan,I.F.,R.K.Hirata和D.W.Russell,NatProtoc,2011.6(4):p.482-501)。将AAV载体质粒、血清型辅助质粒和腺病毒辅助(HgT1-腺)质粒转染到HEK293T细胞中。48小时后收集细胞，并通过3次冻融循环进行裂解。随后将裂解物用benzonase处理并通过碘克沙醇密度梯度纯化。使用反向末端重复序列(ITR)特异性引物和探针通过AAV基因组的qPCR确定病毒原液的滴度(Aurnhammer,C.等，Hum Gene TherMethods,2012.23(1):p.18-28)。

重组AAV载体。所有质粒均改编自先前在Hubbard等中描述的质粒(Hubbard,N.等，Blood,2016.127(21):p.2513-22)。为了产生pAAV.MND.GFP.WPRE报告子构建体，将MND修饰的逆转录病毒启动子插入到先前描述的pAAV CD40LG[GFP.WPRE]质粒中(SEQ ID NO：16)。

将pAAV.CD40L.cDNA.WPRE3(SEQ ID NO：15)供体模板设计为具有侧接于密码子优化的CD40L的1kb的同源区、截短的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件3(WPRE3)、以及含有额外上游序列元件的晚期SV40聚腺苷酸化信号(Choi,J.-H.等，Molecular brain,2014.7(1):p.17)。完整的CD40L.cDNA.WPRE3.synPolyA是基因合成的(GeneArt)，并通过Infusion克隆(Clontech)克隆到具有两个侧接于CD40LG基因座的1kb同源区的pAAV骨架中。

使用GraphPad Prism 7(GraphPad，San Diego，CA)进行统计分析。对于多重比较，使用单因素ANOVA计算p值。除非另有说明，为了比较两组，使用非配对的双尾t检验计算p值。所有条形图均显示平均值±SEM。

所有电穿孔均使用Neon转染系统(Thermo Scientific)进行。在电穿孔之前，收集细胞并用PBS洗涤。将细胞重悬于Neon Buffer T中，使得在添加Cas9 RNP(100μg或200μgCas9蛋白/mL总反应体积)或mRNA(每个CD40L TALEN 50μg/mL总反应体积)后，最终浓度为2.5×10

当放大用于小鼠植入研究时，所有试剂浓度相同，但是每个电穿孔的总量增加十倍，并且使用100μL Neon吸头。因此，将2.5×10

集落形成单位。通过涡旋将空白或经基因编辑的HSPC与基于甲基纤维素的MethoCult H4034 Optimum培养基(STEMCELL Technologies)剧烈混合。混合后，将1.1mL基于甲基纤维素的培养基中的500个细胞分配到35mm的网格皿(gridded dish)中。将细胞在37℃下孵育14天，并根据生产说明书(STEMCELL Technologies)对集落进行分类和定量。使用EVOS fl倒置显微镜(AMG)对表达GFP的集落进行定量。

使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)从造血干细胞和祖细胞(HSPC)分离基因组DNA。为了评价CD40LG基因座的编辑率，使用结合AAV插入物内的正向引物和结合同源区外的CD40LG基因座的反向引物进行“in-out”微滴式数字PCR。对于ActB基因(SEQ ID NO：17)，产生了相似大小的对照扩增子(1.3kb)以用作对照。用于两种扩增子的探针均用FAM标记，并在单独的孔中进行反应。对于每个HDR和对照反应，在单独的孔中进行两次重复。使用QX200 Droplet Generator(Bio-Rad)将PCR反应划分成微滴。使用ddPCR Supermix forProbes without UTP(Bio-Rad)、900nM引物、250nM探针、50ng基因组DNA和1％DMSO进行扩增。使用QX200微滴式数字PCR系统(Bio-Rad)分析微滴，并使用QuantaSoft软件(Bio-Rad)进行分析。当CD40LG居于X染色体上时，来自雄性供体细胞的编辑率计算为来自CD40LG/ActB阳性微滴的拷贝数/μL乘以2的比率。

在LSR II流式细胞仪(BD Biosciences)上进行流式细胞术分析，并使用FlowJo软件(Tree Star)分析数据。为了评价经编辑的细胞在骨髓和脾内各种造血谱系中的植入，将细胞用以下荧光团缀合的抗体染色：人CD45-eFluor450(克隆HI30，eBioscience)、小鼠CD45-APC(克隆30-F11，eBioscience)、CD33-PE(克隆WM53，BD Biosciences)和CD19-Pe/Cy7(克隆HIB19，eBioscience)(详细的门控策略请参见图11)。为了评价造血干细胞表型，将细胞用以下荧光团缀合的抗体进行染色：CD34-APCCy7(克隆581，BioLegend)、CD38-PerCPCy5.5(克隆HIT2，BD Biosciences)、CD90-APC(克隆5E10，BD Biosciences)、和CD133-PE(克隆AC133，Miltenyi Biotec)。

mRNA合成。使用BsaI将pEVL CD40LG.TALEN(SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22)构建体线性化。根据制造商的方案，使用T7 mScript标准mRNA生产系统(Cellscript)进行体外转录和5′-加帽(capping)。将线性化的模板体外转录成未修饰的mRNA转录本，并使用提供的酶用cap-1 mRNA结构(2’-O-甲基转移酶)进行加帽(5’-7-甲基鸟苷酸帽)。使用NucleoSpin RNA Clean-up试剂盒(Machery Nagel)进行最终纯化。

核酸酶设计。CD40LG TALEN与先前在Hubbard等中描述的那些TALEN相同，不同之处在于CD40LG TALEN被克隆到pEVL骨架(SEQ ID NO：20)而非pUC57骨架中(Hubbard，N.等，Blood，2016.127(21)：p.2513-22；Grier，A.E.等，Molecular Therapy-Nucleic Acids，2016.5)。

CRISPR sgRNA(SEQ ID NO：12)被设计为产生双链断裂(DSB)，所述双链断裂尽可能靠近CD40LG TALEN对产生的DSB位点，以使两个核酸酶平台的比较不出现偏差。合成的sgRNA(5′-AAAGUUGAAAUGGUAUCUUC-3′，SEQ ID NO：28)购自Synthego(Pleasanton，CA)，并经在5′末端和3′末端两端的三个末端核苷酸之间的3′硫代磷酸酯核苷酸间连接和2′-O-甲基类似物进行化学修饰。通过在电穿孔前立即将Cas9蛋白(Integrated DNATechnologies)与sgRNA以1∶1.2摩尔比孵育15分钟来制备Cas9 RNP。

该实施例说明了用于在CD34+造血干细胞中的CD40LG基因座处引入GFP报告子的方法。本文所述的系统、方法和组合物的方面涉及提高对从健康供体富集的血液动员的CD34

该实施例说明了调节造血干细胞中HDR的细胞因子应答的方法。测试了用于CD34

该实施例说明了用于有效在内源性CD40LG启动子下游并入CD40L cDNA的方法。该实施例说明了用于治疗目的的内源性启动子驱动的CD40L cDNA表达。经导入内源性启动子下游的CD40L cDNA编辑的T细胞表现出与未编辑的细胞等同的CD40L表面表达(Hubbard,N.等，Blood,2016.127(21):p.2513-22)。为了编辑造血干细胞，设计了AAV供体模板(SEQ IDNO：15)，所述模板包含侧接于密码子优化的CD40L cDNA的相同的1kb同源臂、WPRE3元件、以及合成的聚腺苷酸化序列(图8)(Choi,J.-H.等，Molecular brain,2014.7(1):p.17)。如通过ddPCR所测量的，在约25％的细胞中观察到了cDNA的靶向整合(图9A和图9B)。因此，成功地将CD40L cDNA引入内源性CD40LG启动子的下游。

该实施例说明了用于将经编辑的细胞植入到NSG小鼠的骨髓中的方法。在对CD34

与在未处理的细胞中的59％相比，用1K MOI AAV和100μg/mL RNP处理的细胞在骨髓中具有47.7％的平均hCD45植入(图12C)。另一方面，与未处理的CD34

用AAV加RNP处理的细胞的表型与未处理的对照细胞相似。在接受AAV加RNP处理的细胞或未处理的细胞的小鼠中，CD33

在脾中发现了类似的hCD45植入和GFP表达模式。与接受未处理的细胞的小鼠相比，移植有经低剂量编辑的细胞的小鼠显示脾hCD45

该实施例说明了小分子对NSG小鼠中经编辑细胞的植入的影响。移植后长达16周，在NSG小鼠中检测到经编辑的细胞。此实施例说明了进一步增加经编辑并能够植入的LT-HSC数量的方法。将促进离体LT-HSC自我更新的小分子引入培养系统(Fares,I.等，Science,2014.345(6203):p.1509-12；Sun,H.等，Stem Cell Res,2012.9(2):p.77-86)。诱导自我更新提供了两倍的好处：它对待循环(在G或S2期)以便经历HDR的细胞来说是有用的，并且自我更新干细胞保持了其植入骨髓的能力并长期持留。

小分子UM171和SR-1增加造血干细胞的自我更新，并且该组合最近已用于支持经HDR编辑的细胞的植入(Schiroli,G.等，Sci Transl Med,2017.9(411)；Bak,R.O.andM.H.Porteus,Cell Rep,2017.20(3):p.750-756；Bak,R.O.等，Elife,2017,6；Fares I.等，(2013)Blood 122:798)。对这些小分子对编辑率和经编辑的细胞植入的影响进行了分析。将UM171和SR-1添加到培养基中略微增加了编辑后的细胞活力，但是对混合群体中或被染色为LT-HSC的细胞中的HDR率没有显著影响(图13A和图15A、图15B、图15C、图15D、图15E)。值得注意的是，在编辑后48小时，染色为LT-HSC的细胞百分比随小分子的添加而增加超过一倍(图13B)。总体而言，这些数据提供如下证据：在本文所述的培养系统的一些替代方式中，UM171和SR-1的添加比单独的细胞因子更能维持HSC的干性，但它们并不影响HDR率。

另一小分子eltrombopag可以扩增CD34

对这些小分子对经编辑的细胞植入NSG小鼠的能力的影响进行了测试。对于经AAV加RNP处理的细胞，UM171和SR-1的添加使骨髓中的总hCD45植入略微增加，从16.2％增加到25.4％(图13D)。有或没有该两个小分子的情况下，GFP

当将eltrombopag添加到培养基中时，对骨髓或脾中的整体hCD45植入没有影响(图16A、图16B、图16C、图16D、图16E、图16F、图16G)。然而，有低剂量的AAV+RNP的情况下，骨髓和脾二者中GFP

对较长的预刺激时间对经HDR编辑的动员的人CD34+细胞的体内植入潜能的影响进行了测试。在补充有TPO、SCF、FLT3L和IL6(100ng/mL)加35nM UM171、1μM SR1的SCGM培养基中，以1×10

与骨髓和脾二者中预刺激72小时的细胞相比，用细胞因子预刺激48小时的CD34+细胞中人细胞的总植入相对较低(图18和图20)。然而，随着更长的预刺激，经编辑的(GFP+)细胞的植入相对更高(图19和图21)。

检查了用于培养CD34

表1

对于方案A，将动员的人CD34+细胞在补充有TPO、SCF、FLT3L和IL6(100ng/mL)加35nM UM171、1μM SR1的SCGM培养基中，以1×10

在实施例1-实施例5中，使用方案A，并使用Neon电穿孔系统进行电穿孔。与通过Neon系统进行电穿孔相比，在Lonza系统上使用各种核转染程序进行了细胞活力的比较(图32)。在SCGM培养基中培养动员的成年人CD34

在下文中，使用方案A或方案B培养CD34+细胞，并使用Lonza核转染系统进行转染。

关于从骨髓中回收的细胞，测定了从移植有使用方案A或方案B培养的CD34

关于从脾中回收的细胞，测定了从移植有使用方案A或方案B培养的CD34

测定了从移植有使用方案A或方案B培养的CD34

与先前的研究相比，两种方案的经HDR编辑的(GFP+)细胞的植入增加(图24、图31)。所有受体NSG动物在骨髓和脾中的髓系细胞和B细胞群中都携带着所植入的经HDR编辑的人细胞(图25、图27、图34、图36)。这些谱系的存在比例与经空白编辑的人CD34+细胞的受体相同。这些数据与多能HSC的编辑相一致，并且表明经HDR编辑的干细胞的分化能力在编辑时并未受到损害。所有细胞谱系(B和髓系)中存在经HDR编辑的(GFP+)细胞，并以与空白细胞相当的比例存在(图26、图28、图35、图37、图38)。值得注意的是，植入到骨髓中的人CD45+造血干细胞(HSC)的百分比(由CD38low CD34+的表达所定义)与在经空白和HDR编辑的受体中相当(图39)。GFP+细胞存在于该群体内，这与HSC的编辑能够在体内长期持留相一致(图40、图41)。在这些研究中观测到的植入的、经HDR编辑的HSC的比例与预计在患有CD40L缺乏的患者的自体HSC编辑后所提供的临床益处的水平相一致。这些组合发现表明，该技术可以为使用这种方法进行治疗的患者提供临床益处。

HDM2是E3泛素蛋白连接酶，其介导p53/TP53的泛素化，导致其被蛋白酶体降解。测试了HDM2蛋白与RNP加AAV一起共同递送对CD34+细胞中观测到的HDR率的影响。使用方案B培养动员的成年人CD34+细胞48小时，随后与或不与HDM2一起(6.25nM-25nM)进行RNP核转染。AAV以1K的MOI添加。在第5天通过GFP表达评价HDR率。

与仅用RNP和AAV载体处理的细胞相比，用HDM2蛋白共转染的细胞的HDR率显著更高(高达3倍)(图42)。这些数据表明HDM2可用于提高CD34+细胞中CD40L基因座处的HDR编辑率，并可与上述方法结合使用以提高长期HSC中的HDR率。

应理解的是，尽管描述、具体示例和数据示明了示例性替代方式，但其是以说明的方式给出而不旨在限制本公开的各种替代方式。从本文包含的描述和数据，本公开内容内的各种改变和修改对本领域技术人员而言将是显而易见的，并因此被认为是本公开的各种替代方式的一部分。

序列表

<110> David J. Rawlings

Daniel Thomson

Iram F. Khan

<120> X连锁高IgM综合征的治疗性基因组编辑

<130> SCRI.192WO

<150> 62/663485

<151> 2018-04-27

<160> 28

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物CD40L MND.GFP（HDR）

<400> 1

acctgtcagc tcctttcc 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物CD40L cDNA（HDR）

<400> 2

agtgtcttcg tcaacgtgac ag 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物ActB

<400> 3

actctgcagg ttctatttgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物CD40L MND.GFP（HDR）

<400> 4

ggtccagatc ctaagagagg 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物CD40L cDNA（HDR）

<400> 5

tccctgataa agtgcaatca tcc 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物ActB

<400> 6

aatgatctga ggagggaagg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针CD40L MND.GFP（HDR）

<400> 7

tcaatccagc ggaccttcct 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针CD40L cDNA（HDR）

<400> 8

tcctggttag ttcttgccac 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针ActB

<400> 9

atcaaggtgg gtgtctttcc 20

<210> 10

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD40LG TALEN正向（RVD序列）

<400> 10

His Asp Asn Gly Asn Gly His Asp Asn Gly His Asp Asn Ile Asn Gly

1 5 10 15

Asn Asn His Asp Asn Gly Asn Asn His Asp His Asp His Gly

20 25 30

<210> 11

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD40LG TALEN反向（RVD序列）

<400> 11

Asn Asn Asn His Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asn Gly His Asp Asn Gly

1 5 10 15

His Asp Asn Gly Asn Gly His Asp Asn Gly

20 25

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRISPR向导序列

<400> 12

aaagttgaaa tggtatcttc 20

<210> 13

<211> 12214

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD40LG基因序列

<400> 13

actttgacag tcttctcatg ctgcctctgc caccttctct gccagaagat accatttcaa 60

ctttaacaca gcatgatcga aacatacaac caaacttctc cccgatctgc ggccactgga 120

ctgcccatca gcatgaaaat ttttatgtat ttacttactg tttttcttat cacccagatg 180

attgggtcag cactttttgc tgtgtatctt catagaaggt tggacaaggt aagatgaacc 240

acaagccttt attaactaaa tttggggtcc ttactaattc ataggttggt tctacccaaa 300

tgatggatga tggtagaaac caaatagaag aatggtcttg tggcataatg tttgttgcct 360

agtcaatgaa gtctcatatt cttgtctctg gttaggatct tgggatctgg agtcagactg 420

cctgggttca aatcttggct ctgcccatac catctctgtt atcctggggc aagtgcctca 480

gtttccacat ctgagaaatg gggatggtat tggtgtccat ttcatagatt aagtgagttt 540

agccttgtaa aaagcttagg agggggtctg atacatagta agcactatgt acgcactagc 600

tataattatt tgctaaagtt ctgctttaaa agtaagctat ttttttatgg agacagcttt 660

tttcttttaa atttccagct aggcaagaag agcgtcaatt tgatctaaaa tttcataatg 720

cttcagatta acatagacat ggataagtcc cagaatttgc agtcttttag taaaagtagc 780

attttctgtg taattcttca caagcactga ttgtagttgc aggatgctca gtctccctct 840

gagatgtttt acatttttaa atggttagac ttgcaggaac aaaagagcag agtaacttag 900

taggctgttt tgcattctta ggaaaagaaa accatcagga cttattttgt tttcatgtat 960

tttttcactt ccactgagga gtataattgg ctggtgttga caaaatacca atcatagatg 1020

taaaggagaa agttgattag ttttctggct gttcctaaaa ttctggatgc aggaactgtg 1080

gctagaaagc atctggatga ttgcacttta tcagggatac ttgagtgtcc tctcttagga 1140

tctggaccta gaattaatgt catgagattt ttctaacagg ataaggtgag gtagtgaggg 1200

ctgaagtcat ccactgggtt atccaaatat taggtttcac tgctgacaaa agagggggct 1260

tctggtctgg ttggttattt gtgtttggcc tgatgtgctc tgtcaatcaa atgtatggac 1320

ataggcctag cttctaaagg ggcaatagtg acctcagtgg actgatattt accgtactat 1380

ttacatgtgc tcttaattac agcagaagct gccagctaac tgaatcttgt tttgaatcta 1440

aaaaatctac tcttaaagca agaaaatggt ataaaattag ttgataatgc aagtgaattc 1500

tgtacattta attattctaa gacattggaa aataaaatat cttgttactt tgaggataaa 1560

agatgatttc tttaaaaatg caaatgtttt ctacaaatac taaagttaaa agggagagag 1620

atgtaattag aactcgttaa ctgacacatt gcaaattaac ttctttttat aaagcactgc 1680

atcacaaaca ctaaaatgaa gtgggcaaat tagctctgca gaaaactatt ttctaggctg 1740

atgtttataa tgaccaatca ttactgaagc aatgagaaat gtgacaatta cagaatattg 1800

ctgctatagt atgttgaaaa aatatgcatt ttgtagtgaa catttagtag aatagctctg 1860

atttctacct ggagtttctg ataacatgac atcttaattg ctgtctttta tagattttta 1920

aactgcaaat acaaaatagc aatcagccaa tataataact tattattctc catttatgcc 1980

tgaaagtcct cctcttgttg atgccgtgga aatgaatgta gaggcagata tcattagctg 2040

tattctcctt ccgaatgaca tttatcatat ccttgttatt ccaaaataga tagaagatga 2100

aaggaatctt catgaagatt ttgtattcat gaaaacgata cagagatgca acacaggaga 2160

aagatcctta tccttactga actgtgagga gattaaaagc cagtttgaag gctttgtgaa 2220

ggtaagcagc ttaattactg gtaaaagtgt cattgaaata ttttactaca tttgctagat 2280

cgggaaactg acaatgccaa tgtttaaaga ttggttatag acacagacac acagacacac 2340

acacacatat atatgcatgc agatatacac acatacatgg gtgtgtgtgt gggggttaaa 2400

aaaaaaaaac acaaagacac tctctgggga aaatacaccc ttaggggcac agtcacacat 2460

atttgtcagc ttacatatgc agctaccact aggcaaaatg atgaagtcca ccaagcttgg 2520

tttttgcatt gctgtgtctc cccatccaaa ccttgatgct ctcgcactgg ggacccagag 2580

tctgatcccc atttcccagg gaagcaatag ccgtcaacag ctgccgtggc agcaggccac 2640

aagtgaaggg acacctgaag actggtaaca gtctctggtg cttctctgat gatggaattt 2700

taggtgtcct gacagtgaga tctttccctt ttactgggga gagaggtgca gggaataagt 2760

aatagacatt ctcagtgtcg ctcaaaccag actccatata atatcacttg ctcatgaagc 2820

ccgcccactc tatggccggt catgaccaga ggcacagagg gttcaaagcc ttttagccca 2880

ccaggctggt agctagcatg aagtcactgc agtgactgtg gcttataaca gatacctaaa 2940

acaagaattt ttagaacctt tacattaatt ccatcatcac agacataggg tctaggggct 3000

ctttctcctg aggcagaaca tcaagagttc tttctgccta tgtccctttc agaacactga 3060

gtcaaatacc cttgggcctc ggctcactta ggggtcattt ctaggaggca gcactccaca 3120

ttgaggacag ttctgggcca ggtgggtggg tatctgggta aaccaacagg aattagttct 3180

cacatataga tgatgtgtaa tttaatgcag gcgtaaaagg gttaagatct tatttctgat 3240

cttatttctg ccctcctgta ctgtcaccga ggtgccattt aattcattag tgaagactct 3300

aacagcttat tcctgagtca cctacggaga acagaatgtg gctcaaatcc gctgcttgct 3360

ttcaggttct ttacactaat ctaggcttta gatgaaactc ctaaaccctt tctttgcaag 3420

actggccagc taggaaaatg atttgagttt cttcggttct tcgaggattt gggccagtat 3480

tacagagtat tggaagatgt taccagttta aatgtgaata aaggcacttt caaaacaatg 3540

gctaataatc caaataacag actgaatgtg cttggctatg tgactttggg taaataactt 3600

cacctttctg ggcctcagtt ttgtcatcta taacatgaga agacagatta tctgtaaggg 3660

cactatcagc tctgacattc tacaattatg tgataagcct tcagttccct ccaatggcag 3720

tgagagtggc ttgtcagtcc ccctcgtttc ttacggagac ttttacggtt gaattgtcaa 3780

ttcctcacgt cattatttca ggttggctat gtatgtaaag ctcccaaaat cagctaccga 3840

ggataggagt aaagaaaaca gtcagtttgg cctccctgct tatgcttgta tgaaaaaagt 3900

gacagctcca aagtttcata ttcttaaaag gcagatcttc tcaggcatgt cagccagggc 3960

cccagggatc tcctccttac atgcaactaa ggaggctcct tgtctctact gcagcaggtg 4020

tggaacccta gtcaacacca cctataccta ggattacgta caatgagtag atacaaagtc 4080

ctccagctac ccaatcctcc cccaatgacg gatccccttt ccaatacgct ttcccccaaa 4140

tttctcaccc taaaacaaaa ttcgagactt tgaaaaaact caataggaca attatagaat 4200

agctccagat tagattcata ttttcttagc taatgttagt aggctttctt tccgggccac 4260

agtctggctg cacctaagca acctcaagtt tgaatttgga gtctttgaat caggtcttga 4320

tggggtctta gaagtcatca gatccaattc tcaatccaca acttcagtct tctctccacc 4380

tcctgactaa gtggtcatcc aatctctgtt tgaacatctc tagtgacaag gaactcatta 4440

tctctggagg caggtagcac taatctgtca ttttggggga aagatggtat tcagggctca 4500

agtgagggta agcagaggta ttattttgaa tagtataatt tcatattaaa acttacaacc 4560

caccacacct ctgctagatg ttcagttcca tgattatttg cccaccaatg cctgcgatgc 4620

ctttgagaga gccaaagcat ttctatttca agttaaaggg caacctgtcc atacctgcca 4680

catggaactc ccactaagag agaaataacc cattctggat tttctgaaag tccactttaa 4740

aaagtatttc agttgaggtg gggagtgaag caagaaaaaa aaaaggctct ggggagtgtg 4800

gttgggcgaa agttcacgga aaggctaggc tgggctcatg aaacacgagc tttgctgact 4860

tcatgttttc atcttggcca ggcctcaaca ccaatgcaac aacttagcct aaaagtatct 4920

caaccttgat caccacactc tactttttga aaagacacta aatagtcatt tgtttacttg 4980

tgatctcaca aacattttcc tgtcaccaca tcttcatagt gccgcgcttc agctcaaatg 5040

gaaagttgaa gctctggggc ccatgtgagt gttctgaggc tcaggttccc ctggaggctc 5100

tatgaactac gcccttaaat ctggcaactg agctgggcct acagccagca ctcaacagtg 5160

acagcacaaa ttccttctgg aggaggaaat aaaaggaagg gtcctataga caactgattc 5220

caggagtggg aaggagcaca ggactttgat tatcataaga tgtgaaaata ctactgtctt 5280

cttcccttgt gtgcagagga tagacagatg gaattagcta agcccagcct atgaatgcca 5340

tctcacagtt tccactcttg gtttaaacct cagcttcttt gggtgacctc ataatgacca 5400

gttaagccct ccaggccttt tgttcagtct ctttaaaatg gcagcaacag cctttatcat 5460

cttccaacct gtgttgatgg aagttcctgt tagcttcttt aaatacctct agacttcctt 5520

cagtttataa gtgaaaagaa accttttaag aagtgtcgca cttgcctttg aacatcaaca 5580

ccattgggag atggcctgtg tttccgaaat gctgattatt ctaagtaaat acagtgcaac 5640

tatcaataag agaatctctt cagcccattg aaagggatag caaaattaaa aatgtctgag 5700

ggtcttttca tagtctggca tttctcccca aggtcaaact tactattatc ttttcctaca 5760

ggatttcaga ccaaatttat tctaatagat acacaccatg ctttatgttt aataatattc 5820

catataccag ttcccagggt agaatcatct ccccattcgg cattatttgt caatatctgt 5880

caaagccaag gaggttgagg tcataggaag ggtcaggatc acagcctctg gtctggagag 5940

agcactggaa tggagataat aaggcctgga ttttacttcc agattctccc ctgggctttc 6000

tgggttgttg gctcatctgt cagatccatg gactcccaat tggcatgatg gaattaatga 6060

caggatctga gtctatatga taatcctcac cagaaacaga caacagagta atgacagatg 6120

caaaacgaat gataatttta aaaccccaca gcagagcccc tgtcaaaatg acctcttgca 6180

atgcttctta ttttaggata taatgttaaa caaagaggag acgaagaaag aaaacagctt 6240

tgaaatgcaa aaaggtaggt ttgctatttg ctaatttcta tgaatgccta aaaactaaaa 6300

ggaagcttta ggctgatcat attgaacaac ccagtgttgt tgcatcaggg aacttttagc 6360

cctggaaata aaacaggaac acaattgtca aattgacacc ttctctggtc cctgtgattt 6420

ggaaagactt tgtacatata tatttatgaa aaaaggatgt gttcctttaa tgccgatgat 6480

accaaatctg aagaaatccc attatgttca ataccttaat agaagcaacc atacagcctg 6540

ataccaccta cagtggaata agaagacagg aaagtcatca tttggtaaca gtggcattca 6600

tcactcattg ataacagttt ttcatggggc acagtggccg gtggagcctc tgggatcaag 6660

gagtgacaat gtcacagtgt tctattattt gcccggttct taaagtgaga gcatcctgaa 6720

catctcaggg ttggaagaga acttgagagt tctcaaatcc agcaccatcc ccacaacaaa 6780

aatctccttc acaataacac tgaccgtcca gcctctgatc aaacatgtcg agggatgagg 6840

caccttccac ctcataaggc agcctgatcc gtctttgaat ggctctaata ataccaagat 6900

tactatacta ctccagagaa gtctttcctc ctcaagtcaa actttgttcc tataatctcc 6960

actcattggt cccagttctg ctctttgagg ccctagtaaa caaagtataa ttgctctcct 7020

acccagcagc tgtccagata tggaagacag caatcatggt ggccaagcct tgactgagct 7080

ttttcttctc caggctaaag atccctgatg tcttccactg tttctcctat gaccctttcc 7140

aggacctttc ttctgccact cacctccttt tcttggacac actaacgttt tcctgttctt 7200

ttagaatgtg gcatcgcaaa ccaatacaat aatgcgtgaa gtgacttcag cagcagatta 7260

tgggaaagac ggggtgttgt tagagagaat tttatatcac aaagttggtg aacatgatgt 7320

tatggcttct gcaaatttaa tacacacaaa aacatacata catacaggga tagagatact 7380

attttctgag gcaaagagag tactcagacc ttgccttaac tgttgttctg gatactaaat 7440

ggtcatccga cttccatgaa ggttttatct tcagaatgac tgcaagatat gttgagtaat 7500

agtaccacgc tgtctgttaa ttacagagaa atctgaggaa acagtttatg tagatgctgc 7560

ctagaagtct tcagggaaat gataatatta accaaactgg tcatttaggt catgcaattt 7620

aactcaacat ttatagggca cttacaaagt gcccaatatc aggctcataa ctggacaaaa 7680

agaaacttcc acacagtctc tgcccttaga agattgacac atctcattag ggagcagggc 7740

tttaacacaa gaaataatta aagacagata caatagttca gccagttgct tgaccaattc 7800

agaaaccata agaatcttac taagtgtgca gactttggag cccactaaaa tccccagtgt 7860

atggagttgt tcctaaaagc aagattcacg gtatgtttaa tgaagaccag tgtttttagc 7920

ctgtgtcaat ctatgcaaaa tggaatcgag tattgatcaa ctgttaggag aatgagaccg 7980

atggaaacag ccaattcaat tactcagata ttagaaacca acttttcctt cagtgggaga 8040

gatgtcagac cattttatct ttccttttat ataatctatt tttgcacagt ctctattaca 8100

cagttgtaga actggaccag atagttttgt gggcagtttt tgcattattt tagcctgaca 8160

gtttttggtt ccatttcagg tgatcagaat cctcaaattg cggcacatgt cataagtgag 8220

gccagcagta aaacaacatc tggtaagtca cacagcatct gagcggtagc cacccaaggg 8280

gaaaggctgg gatgccgaag tcatgttacc taatggttaa actcctcttt tcccctggga 8340

cccaatttac aaacctaccc ctacacttct cctattccct tctttgtctt caaagtgagt 8400

tcaaatgcac agatgggact tagagggaca aaaggaggtg gaatgcaatc tggatgttct 8460

cattatgttc ttgctcaatg gctgattcta aatgatgaat tactgggtgg agggaccatt 8520

gttctgacaa catagaagaa atggcatgta gtgacctcct gactgggagc atccctcctc 8580

ctaacccatc ttcactgtgt ggaaatgggc ctcatggggt atttcctgcc atctgtcaat 8640

ccctgtatga ttaagctcag cctcactgag gccaacctca gggaaagtaa aggtaaaatc 8700

attctgtaaa gatcaatagg tcccaagacg ttacattttc caatgaagta acaacagacg 8760

acatattgtg atcttttcaa ctctgaacga ttttatttcc atatacgttc tgccaccatt 8820

ctagccttta gatatttttt cccaaatgtg catcttgcga taactggtgc caaagaatat 8880

gtcgtatctg ataaatggat ggaaacatgc acgctaacat aaagtctccc atcaacataa 8940

aggcaagagc gtcagaggag tctttgaaaa attctacaga gtgctccgga atggagttct 9000

aagcagtgca tgtgtgtgtg catatgtgta tgtgtgtgac agggagagaa agagagatgg 9060

acagagagag aaaaaagaca ctgcttcatc tctgaagtgg cttgggcttc tcagtaggcg 9120

taacacatgg acagttatca ttatcatgga tcatggtacc aaagtaagag cactgaatag 9180

ggagtttttg aacactggga ttcaaggacc atgaccactg cttgctgggt gaccttgagc 9240

aagacccttt acctatgcag cagttttcta cttcacctac tttacagggt ggctttgagc 9300

atcaaatcag ctaatgtggc cgaaagtgat gctgtcgagt gctgtacaac cgtaaggtga 9360

cactacttag tttacttcac catggcttag atgtcaaaag ggtgacataa agcccctcac 9420

taataccagt tagttacaca atatttaata attttgtcaa gtaccccttc tctcttctgg 9480

atcagatgac aacaacagag aaatctccta gaagaatagc ttcccactgg tctttttttg 9540

cctgtatcta aacccttgat cttggatata tttcatagag ctcagattct cccaaaaggc 9600

ttgtaatgga tatcagtcct acaatatctt acagtctgca tcacaatagg tttccagggg 9660

atcagatggg aagacagtaa cattccaccc ccaccccagt cccaaacctc ttcttcctac 9720

ctagccatgc tgctaaaatc ttgccctaca tcccacagca agtactaaaa ttaggtaagg 9780

acgtaccaaa gtaaacttac tgaactaaaa gattgagaac ctgccctttt tttctcaata 9840

aaatggttca aaagggcaaa cattctaatg aagcattgtt tctggagtgg tctggagggc 9900

ccggatctgt caggcatttc aggatgcctc cctattagta aagggcgagt cttaccaggt 9960

gggatcttgt gccctgatag acctaagact atcgaatagg aattattttt taaaaagctc 10020

aaggaagcaa acacatcagt actttcactt ttcctcaacc ctcaccccca tcagtcagtc 10080

tagctttctg tgggagctga gatttcaagt cgggtgcaca cactactttg aacccactca 10140

acatctcagc cgagaaaatg gcacactgtt ggtgggtact ctggcttagc cacaagaata 10200

ctggtacttt caagttggtg gcgcccacta caatgggaga tcaaaacata ccgtgaaatg 10260

agcacacagt ttattttcat acttccttgc ctaattttag tccttgctgg gggaggcaga 10320

tcaggtttgc aacagcatga tcaggtagga agaaatgggg tcttttctct gtgctgaggc 10380

tgagctaggt agactgacaa ctctctgact ttgtaaaatt caaggcaagc aaggtattca 10440

tggtaatatt agcaaaaatt tggtccgagt aatttggtat gtataattta tgatgtcaaa 10500

ttttgaaatc atttgtgcct tcttaagttc aaggcaaatt ggctataaga actctaacga 10560

gagaaagaaa ctcactgtga tctcttactt tatttaatct tcacaagtct ctgaaatatg 10620

ctccaatatg agccccgtgt tgcagatgag gaactgaagc tcatggagat ttagagactt 10680

gcccaagctt aaatagagcc tagattggaa catggctctg tctgactctg aagcccatgg 10740

aaggggcctt gagaatccat ccctatacaa agccaatatc caacattaaa ctatattttt 10800

tgtcagaatg tgaaccatgc tctgcttcac ctcaccacaa actttccctt tctttgtaac 10860

agtgttacag tgggctgaaa aaggatacta caccatgagc aacaacttgg taaccctgga 10920

aaatgggaaa cagctgaccg ttaaaagaca aggactctat tatatctatg cccaagtcac 10980

cttctgttcc aatcgggaag cttcgagtca agctccattt atagccagcc tctgcctaaa 11040

gtcccccggt agattcgaga gaatcttact cagagctgca aatacccaca gttccgccaa 11100

accttgcggg caacaatcca ttcacttggg aggagtattt gaattgcaac caggtgcttc 11160

ggtgtttgtc aatgtgactg atccaagcca agtgagccat ggcactggct tcacgtcctt 11220

tggcttactc aaactctgaa cagtgtcacc ttgcaggctg tggtggagct gacgctggga 11280

gtcttcataa tacagcacag cggttaagcc caccccctgt taactgccta tttataaccc 11340

taggatcctc cttatggaga actatttatt atacactcca aggcatgtag aactgtaata 11400

agtgaattac aggtcacatg aaaccaaaac gggccctgct ccataagagc ttatatatct 11460

gaagcagcaa ccccactgat gcagacatcc agagagtcct atgaaaagac aaggccatta 11520

tgcacaggtt gaattctgag taaacagcag ataacttgcc aagttcagtt ttgtttcttt 11580

gcgtgcagtg tctttccatg gataatgcat ttgatttatc agtgaagatg cagaagggaa 11640

atggggagcc tcagctcaca ttcagttatg gttgactctg ggttcctatg gccttgttgg 11700

agggggccag gctctagaac gtctaacaca gtggagaacc gaaacccccc cccccccccc 11760

gccaccctct cggacagtta ttcattctct ttcaatctct ctctctccat ctctctcttt 11820

cagtctctct ctctcaacct ctttcttcca atctctcttt ctcaatctct ctgtttccct 11880

ttgtcagtct cttccctccc ccagtctctc ttctcaatcc ccctttctaa cacacacaca 11940

cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cagagtcagg ccgttgctag 12000

tcagttctct tctttccacc ctgtccctat ctctaccact atagatgagg gtgaggagta 12060

gggagtgcag ccctgagcct gcccactcct cattacgaaa tgactgtatt taaaggaaat 12120

ctattgtatc tacctgcagt ctccattgtt tccagagtga acttgtaatt atcttgttat 12180

ttattttttg aataataaag acctcttaac atta 12214

<210> 14

<211> 7825

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV6（MND.GFP）

<400> 14

cagctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc 60

tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120

actaggggtt ccttgtagtt aatgattaac ccgccatgct acttatctac gtagccatgc 180

tctagcggcc tcggcctctg cataaataaa aaaaattagt cagccatgag cttggacgcg 240

ttgcttaacg tgtttcaaat ttcttccatg cacatcttta ttagatcttc acagcaacct 300

acaggataag caagacaggt gcaagtgcct cctttgggta tgaggaaact gaggtctaaa 360

gagatgaagt gatttgccca aggctcatag caatttattg gtagagcaaa gactagaatt 420

cagatctctt aactgcagcc tattttccct attctgaact gttacatcag catcaacaat 480

tatctaatgg attggaacag tgtacacagg cagcttagct acgtcaagtc acgattttta 540

ctttaacttc aattccagag tcttggcctg atttccctca agaccctact tatctttgcc 600

tttgcaaaat ttatttttct tgcattatct ttccagctaa attttattta ataaccatca 660

gcatgctttt tttgctttat gccatgtaga cttgacctga aaacctgcca ggctttcatt 720

gagtttagtg attaaagaag taaagttctg agaagcaatt agttgatggg acaccagtca 780

taaaatcaat ccaaactttt gttgacatgt gtttctttct ccatatacca ggttcccgct 840

tcgtattagt aagattgaaa ttgaaataag tctattgctg gtggatgaat ttgtcacttt 900

ccttgaaact ggtgaaccca aaaagttaga cagtgatagg aaaatactgc cattgtctgt 960

taagaagtct atgacatttc aaggcaagaa tgaatatatg gaagaagaaa cttgtttctt 1020

ctttacttac aaaaaggaaa gcctggaagt gaatgatatg ggtataatta aaaaaaaaaa 1080

aaaaaacaaa aaacctttac gtaacgtttt tgctgggaga gaagactacg aagcacattt 1140

tccaggaagt gtgggctgca acgattgtgc gctcttaact aatcctgagt aaggtggcca 1200

ctttgacagt ctgccacctt ctctgccaac tttaacacag gcggccgcga acagagaaac 1260

aggagaatat gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc 1320

aagaacagtt ggaacagcag aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg 1380

ccccggctca gggccaagaa cagatggtcc ccagatgcgg tcccgccctc agcagtttct 1440

agagaaccat cagatgtttc cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct gtgccttatt 1500

tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttctgctc cccgagctct 1560

atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt 1620

ttgacctcca tagaagacac cgactctaga ggatccaccg gtcgccacca tggtgagcaa 1680

gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 1740

cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 1800

cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 1860

cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 1920

cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 1980

cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 2040

cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 2100

caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 2160

gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 2220

gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac 2280

ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 2340

cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaag tcgacaatca 2400

acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg ttgctccttt 2460

tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc 2520

tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc 2580

cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg 2640

gggcattgcc accacctgtc agctcctttc cgggactttc gctttccccc tccctattgc 2700

cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg acaggggctc ggctgttggg 2760

cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa gctgacgtcc tttccatggc tgctcgcctg 2820

tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc 2880

agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct 2940

tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc ccgcctggaa ttcgagctca 3000

ataaaagatc tttattttca ttagatctgt gtgttggttt tttgtgtggg cccatgatcg 3060

aaacatacaa ccaaacttct ccccgatctg cggccactgg actgcccatc agcatgaaaa 3120

tttttatgta tttacttact gtttttctta tcacccagat gattgggtca gcactttttg 3180

ctgtgtatct tcatagaagg ttggacaagg taagatgaac cacaagcctt tattaactaa 3240

atttggggtc cttactaatt cataggttgg ttctacccaa atgatggatg atggtagaaa 3300

ccaaatagaa gaatggtctt gtggcataat gtttgttgcc tagtcaatga agtctcatat 3360

tcttgtctct ggttaggatc ttgggatctg gagtcagact gcctgggttc aaatcttggc 3420

tctgcccata ccatctctgt tatcctgggg caagtgcctc agtttccaca tctgagaaat 3480

ggggatggta ttggtgtcca tttcatagat taagtgagtt tagccttgta aaaagcttag 3540

gagggggtct gatacatagt aagcactatg tacgcactag ctataattat ttgctaaagt 3600

tctgctttaa aagtaagcta tttttttatg gagacagctt ttttctttta aatttccagc 3660

taggcaagaa gagcgtcaat ttgatctaaa atttcataat gcttcagatt aacatagaca 3720

tggataagtc ccagaatttg cagtctttta gtaaaagtag cattttctgt gtaattcttc 3780

acaagcactg attgtagttg caggatgctc agtctccctc tgagatgttt tacattttta 3840

aatggttaga cttgcaggaa caaaagagca gagtaactta gtaggctgtt ttgcattctt 3900

aggaaaagaa aaccatcagg acttattttg ttttcatgta ttttttcact tccactgagg 3960

agtataattg gctggtgttg acaaaatacc aatcatagat gtaaaggaga aagttgatta 4020

gttttctggc tgttcctaaa attctggatg cagtctagag catggctacg tagataagta 4080

gcatggcggg ttaatcatta actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 4140

tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt 4200

tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc 4260

gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcga ttccgttgca 4320

atggctggcg gtaatattgt tctggatatt accagcaagg ccgatagttt gagttcttct 4380

actcaggcaa gtgatgttat tactaatcaa agaagtattg cgacaacggt taatttgcgt 4440

gatggacaga ctcttttact cggtggcctc actgattata aaaacacttc tcaggattct 4500

ggcgtaccgt tcctgtctaa aatcccttta atcggcctcc tgtttagctc ccgctctgat 4560

tctaacgagg aaagcacgtt atacgtgctc gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag 4620

cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag 4680

cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt 4740

tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca 4800

cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata 4860

gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca 4920

aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc 4980

gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa 5040

caaaatatta acgtttacaa tttaaatatt tgcttataca atcttcctgt ttttggggct 5100

tttctgatta tcaaccgggg tacatatgat tgacatgcta gttttacgat taccgttcat 5160

cgattctctt gtttgctcca gactctcagg caatgacctg atagcctttg tagagacctc 5220

tcaaaaatag ctaccctctc cggcatgaat ttatcagcta gaacggttga atatcatatt 5280

gatggtgatt tgactgtctc cggcctttct cacccgtttg aatctttacc tacacattac 5340

tcaggcattg catttaaaat atatgagggt tctaaaaatt tttatccttg cgttgaaata 5400

aaggcttctc ccgcaaaagt attacagggt cataatgttt ttggtacaac cgatttagct 5460

ttatgctctg aggctttatt gcttaatttt gctaattctt tgccttgcct gtatgattta 5520

ttggatgttg gaatcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 5580

accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc 5640

gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt 5700

acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac 5760

cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga 5820

taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 5880

tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 5940

aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 6000

ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 6060

aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 6120

acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 6180

ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 6240

gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 6300

atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 6360

acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 6420

tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 6480

ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 6540

aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 6600

aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 6660

ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 6720

atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 6780

aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 6840

accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 6900

tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 6960

tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 7020

tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 7080

cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 7140

caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 7200

cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 7260

cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 7320

gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 7380

acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 7440

atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 7500

cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 7560

gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 7620

tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg 7680

tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg 7740

agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc 7800

ccgcgcgttg gccgattcat taatg 7825

<210> 15

<211> 7250

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRISPR AAV供体模板、1 kb同源臂、

密码子优化的CD40L cDNA、WPRE3 元件、以及

合成的聚腺苷酸化序列

<400> 15