非神经元细胞向神经元的重编程、以及治疗神经退行性疾病和病症的方法和组合物

摘要

本文提供了将非神经元细胞重编程为神经元的方法。本发明的方面涉及使用抑制PTB的表达或活性的细胞重编程剂以将非神经元细胞转化为神经元。本文还提供了通过在体内将非神经元细胞重编程为功能神经元来治疗神经退行性疾病的方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C§119要求2018年4月11日提交的临时申请序列号62/656,322和2018年8月14日提交的临时申请序列号62/718,774的优先权，所述临时申请的公开内容通过引用并入本文。

政府许可权

本发明是在美国国立卫生研究院的第5R01GM052872号和5R01HG004659号政府资助下完成的。政府拥有该发明的某些权利。

技术领域

本发明涉及用于将非神经元细胞分化为神经元细胞的方法和组合物以及治疗神经退行性疾病和病症的方法。

通过引用并入序列表

此文件后附有序列表，标题为“Sequence_ST25.txt”，该序列表创建于2019年4月11日，且具有1,595字节的数据，在IBM-PC、MS-Windows操作系统上被机器格式化。出于所有目的，序列表在此通过引用完整地并入本文中。

背景技术

再生医学有望解决细胞损失的病症。一种方法采用细胞置换，而另一种方法则采用细胞转分化。细胞置换在治疗造血功能障碍方面取得了巨大的成功；但是在其他疾病中，这种方法要么显示出有限的功效，要么与触发免疫反应和/或肿瘤形成的风险相关。相反，转分化可以利用内源性细胞的现有细胞可塑性来产生新的细胞类型。挑战是确定有效的策略，以不仅在培养中而且更重要的是在其体内天然环境中将细胞从一种细胞类型转换为另一种细胞类型。

发明内容

本发明提供了一种神经元细胞，通过以下方式将星形胶质细胞转化为神经元细胞而产生：使星形胶质细胞与抑制多聚嘧啶串结合(PTB)蛋白的表达的抑制性核酸分子接触。在前述的一个实施方案或另一个实施方案中，所述神经元细胞在体外产生。在前述的一个实施方案或另一个实施方案中，所述神经元细胞在体内产生。在前述的一个实施方案或另一个实施方案中，所述抑制性核酸分子是RNAi分子。在前述的一个实施方案或另一个实施方案中，所述RNAi分子是shRNA。在前述的一个实施方案或另一个实施方案中，所述抑制性核酸分子是反义分子。在前述的一个实施方案或另一个实施方案中，所述抑制性核酸分子在病毒或病毒载体中。在前述的一个实施方案或另一个实施方案中，所述病毒或病毒载体是腺病毒、AAV、逆转录病毒或慢病毒。在前述的一个实施方案或另一个实施方案中，所述星形胶质细胞是人星形胶质细胞。

本发明提供了一种治疗神经退行性疾病或病症的方法，该方法包括使患有神经退行性疾病或病症的受试者中的星形胶质细胞与抑制PTB的表达的抑制性核酸接触，从而将星形胶质细胞分化为神经元并治疗该神经退行性疾病或病症。在前述的一个实施方案或另一个实施方案中，所述抑制性核酸被递送至与神经退行性疾病或病症相关的受试者的脑的中枢神经系统中的位点。在前述的一个实施方案或另一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在前述的一个实施方案或另一个实施方案中，所述哺乳动物是人。在前述的一个实施方案或另一个实施方案中，所述神经退行性疾病或病症选自由以下组成的组：缺血性和出血性中风、脊髓损伤、脑损伤、亨廷顿氏病，阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症、自闭症、共济失调、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、卢伽雷氏病、莱姆病、脑膜炎、偏头痛、运动神经元疾病、神经病、疼痛、脑损伤、脑功能障碍、脊髓病症、外周神经系统病症、颅神经病症、自主神经系统失调、诸如癫痫症的癫痫发作、诸如帕金森氏病的运动障碍、睡眠障碍、头痛、下背部和颈部疼痛、神经性疼痛、诸如阿尔茨海默氏病的谵妄与失智症、头晕和眩晕、木僵和昏迷、头部受伤、中风、神经系统肿瘤、多发性硬化症和其他脱髓鞘疾病、脑或脊髓感染以及朊病毒病。

本发明还提供了一种治疗患有神经退行性疾病或病症的受试者的方法，该方法包括将星形胶质细胞分化为神经元，并将神经元植入受试者中的神经退行性损伤的位点，其中通过抑制PTB的表达将星形胶质细胞转化为神经元。在前述的一个实施方案或另一个实施方案中，所述星形胶质细胞从受试者的神经退行性疾病或病症的位点获得并且被离体分化。

本发明还提供了用于针对治疗或抑制神经退行性疾病或病症的活性筛选药物或化合物的方法，该方法包括从患有神经退行性疾病或病症的受试者获得星形胶质细胞，和通过使所述星形胶质细胞与抑制PTB表达的抑制性核酸接触使星形胶质细胞分化为神经元细胞，和使所述神经元细胞与药物或化合物接触，以及确定所述药物或化合物是否抑制神经退行性疾病或病症的任何疾病标志物的表达。

在前述的一个实施方案或另一个实施方案中，所述抑制性核酸包含与SEQ ID NO：1或2具有至少80-100％同一性和/或其中T为U的序列。

本发明还提供了一种反义分子，其包含与SEQ ID NO：2具有至少98％同一性并且抑制PTB表达和/或其中T为U的序列。

本发明还提供了一种载体，其包含如SEQ ID NO：1或2所示的序列，或与所述序列具有至少80-99％同一性和/或其中所述序列(例如DNA或RNA)中的T为U的序列，且其中所述载体抑制PTB表达。

在某些实施方案中，本文公开了将人非神经元细胞重编程为成熟神经元的方法。在一些实施方案中，该方法包括：提供以比人成体成纤维细胞中表达水平更高的水平表达miR-9或Brn2的人非神经元细胞；使所述细胞与包含抑制人非神经元细胞中PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物接触，从而将人非神经元细胞重编程为成熟神经元。

在一些实施方案中，所述人非神经元细胞以比人成体成纤维细胞中表达的水平高至少两倍的水平表达miR-9或Brn2。在一些实施方案中，所述人非神经元细胞以比人成体成纤维细胞中表达的水平高至少十倍的水平表达miR-9或Brn2。在一些实施方案中，所述人非神经元细胞以比人成体成纤维细胞中的表达的水平更高的水平表达miR-9和Brn2。

在某些实施方案中，本文公开了将人神经胶质细胞重编程为成熟神经元的方法，该方法包括：提供待重编程的人神经胶质细胞；和使所述人神经胶质细胞与包含抑制人神经胶质细胞中PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物接触至少1天，从而将人神经胶质细胞重编程为成熟神经元。

在一些实施方案中，所述人神经胶质细胞选自由以下组成的组：星形胶质细胞、少突细胞、室管膜细胞、许旺氏细胞、小神经胶质和卫星细胞。在一些实施方案中，所述人神经胶质细胞对GFAP(胶质原纤维酸性蛋白)或ALDH1L1(醛脱氢酶1家族成员L1)呈阳性。

在某些实施方案中，本文公开了将星形胶质细胞重编程为成熟神经元的方法，该方法包括：提供待重编程的星形胶质细胞；和使所述星形胶质细胞与包含抑制星形胶质细胞中PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物接触至少1天，从而将星形胶质细胞重编程为成熟神经元。

在一些实施方案中，所述星形胶质细胞是小鼠星形胶质细胞。在一些实施方案中，该方法对多个小鼠星形胶质细胞进行重编程，且其中至少60％的小鼠星形胶质细胞被转化为Tuj1阳性的成熟神经元。在一些实施方案中，该方法对多个小鼠星形胶质细胞进行重编程，且其中至少40％的小鼠星形胶质细胞被转化为Map2阳性的成熟神经元。

在一些实施方案中，所述星形胶质细胞是人星形胶质细胞。在一些实施方案中，该方法对多个人星形胶质细胞进行重编程，其中至少40％、至少60％或至少80％的人星形胶质细胞被转化为Tuj1阳性的成熟神经元。在一些实施方案中，该方法对多个人星形胶质细胞进行重编程，其中至少20％、至少40％或至少60％的人星形胶质细胞被转化为Map2阳性的成熟神经元。

在一些实施方案中，所述组合物包含特异性抑制PTB的表达或活性的单一细胞编程剂。

在某些实施方案中，本文公开了将人非神经元细胞重编程为成熟神经元的方法，该方法包括：提供待重编程的人非神经元细胞；和使所述人非神经元细胞与包含抑制人非神经元细胞中PTB的表达或活性的单一细胞编程剂的组合物接触至少3天，从而将人非神经元细胞重编程为成熟神经元。

在某些实施方案中，本文公开了重编程人非神经元细胞的方法，该方法包括：提供待重编程的人非神经元细胞；和使所述人非神经元细胞与包含单一细胞编程剂的组合物接触，所述细胞编程剂导致人非神经元细胞中PTB的表达或活性降低以及在PTB的表达或活性降低后nPTB的表达或活性降低。

在一些实施方案中，随着PTB的表达或活性被抑制，初始nPTB表达水平升高至高nPTB表达水平。在一些实施方案中，在PTB的表达或活性被抑制后，nPTB表达从高nPTB表达水平降低至高于初始nPTB表达水平的低nPTB表达水平。在一些实施方案中，所述人非神经元细胞以比人成体成纤维细胞中的表达水平更高的水平表达miR-9或Brn2。在一些实施方案中，所述人非神经元细胞以比人成体成纤维细胞中的表达水平更高的水平表达miR-9和Brn2。

在一些实施方案中，该方法重编程多个人非神经元细胞、人神经胶质细胞或星形胶质细胞，其中至少40％的人非神经元细胞、人神经胶质细胞或星形胶质细胞被重编程为其特征在于表达选自由以下组成的组的一种或多种神经元标志物的成熟神经元：NeuN(神经元核抗原)、Map2(微管相关蛋白2)、NSE(神经元特异性烯醇酶)、160kDa中等神经丝、200kDa重神经丝、PDS-95(突触后密度蛋白95)、突触蛋白I、突触泡蛋白、GAD67(谷氨酸脱羧酶67)、GAD65(谷氨酸脱羧酶67)、小清蛋白、DARPP32(多巴胺-和cAMP-调节的神经元磷蛋白32)、vGLUT1(囊泡谷氨酸转运体1)、vGLUT2(囊泡谷氨酸转运体2)、乙酰胆碱和TH(酪氨酸羟化酶)。

在一些实施方案中，该方法重编程多个人非神经元细胞、人神经胶质细胞或星形胶质细胞，其中至少20％的人非神经元细胞、人神经胶质细胞或星形胶质细胞被重编程为其特征在于它们建立动作电位、突触连接、突触前神经递质释放和/或突触后反应的能力的功能神经元。

在一些实施方案中，所述细胞编程剂是抗PTB抑制剂。在一些实施方案中，所述抗PTB抑制剂是抗PTB反义寡核苷酸。在一些实施方案中，所述抗PTB抑制剂选自由以下组成的组：抗PTB shRNA、抗PTB miRNA、抗PTB反义寡核苷酸、抗PTB抗体、PTB的小分子抑制剂、显性负PTB突变体和含有多聚嘧啶串的海绵多核糖核苷酸。

在一些实施方案中，所述细胞编程剂抑制PTB的表达或活性至少5天。在一些实施方案中，所述细胞编程剂抑制PTB的表达或活性至少10天。在一些实施方案中，所述细胞编程剂抑制PTB的表达或活性至少15天。

在一些实施方案中，所述人非神经元细胞、人神经胶质细胞或星形胶质细胞在培养基中培养。在一些实施方案中，所述培养基包含选自由以下组成的组的试剂：ALK5的抑制剂、GSK3b的抑制剂、PKA的活化剂及其任意组合。在一些实施方案中，所述活化剂ALK5包含SB431542。在一些实施方案中，所述抑制剂GSK3b包含CHIR99021。在一些实施方案中，所述PKA的活化剂包括二丁酰腺苷3',5'-环单磷酸酯(Db-cAMP)。在一些实施方案中，所述细胞编程剂在慢病毒载体中被递送。

在某些实施方案中，本文公开了在体内产生功能神经元的方法，其包括向受试者的脑施用包含抑制脑中星形胶质细胞中的PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物，并允许星形胶质细胞重编程为功能神经元。

在某些实施方案中，本文公开了在体内产生功能神经元的方法，其包括向受试者的中脑施用包含抑制中脑中非神经元细胞中的PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物，并允许非神经元细胞重编程为功能神经元。

在某些实施方案中，本文公开了在体内产生多巴胺能神经元的方法，其包括向受试者的脑施用包含抑制脑中非神经元细胞中的PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物，并允许非神经元细胞重编程为多巴胺能神经元。

在一些实施方案中，所述多巴胺能神经元表达酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运体(DAT/SLC6A3)、囊泡单胺转运体2(VMAT2)、锯齿形同源盒1(En1)、FoxA2和/或LIM同源盒转录因子1α(Lmx1α)。

在一些实施方案中，该方法对脑中的多个非神经元细胞进行重编程，且其中至少10％的非神经元细胞被转化为多巴胺能神经元。在一些实施方案中，该方法对脑中的多个非神经元细胞进行重编程，且其中至少30％的非神经元细胞被转化为多巴胺能神经元。

在一些实施方案中，所述功能神经元或多巴胺能神经元的轴突端到达受试者的纹状体。

在一些实施方案中，所述细胞编程剂被施用于受试者的黑质。

在一些实施方案中，所述受试者是人。

在一些实施方案中，所述受试者是非人动物。

在某些实施方案中，本文公开了在体内产生功能神经元的方法，其包括向人受试者的脑施用抑制脑中非神经元细胞中的PTB的表达或活性的细胞编程剂，并允许非神经元细胞重编程为功能神经元。

在一些实施方案中，所述非神经元细胞是神经胶质细胞。在一些实施方案中，所述神经胶质细胞是星形胶质细胞。

在一些实施方案中，所述细胞编程剂被施用于人受试者的中脑、纹状体或皮质。在一些实施方案中，所述细胞编程剂被施用于人受试者的黑质。

在一些实施方案中，所述功能神经元是多巴胺能神经元。在一些实施方案中，所述功能神经元表达酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运体(DAT)、囊泡单胺转运体2(VMAT2)、锯齿形同源盒1(En1)、叉头框A2(FoxA2)和/或LIM同源盒转录因子1α(Lmx1α)。

在一些实施方案中，所述功能神经元或多巴胺能神经元表现出突触前神经递质。在一些实施方案中，所述功能神经元或多巴胺能神经元被整合在脑中现有的神经元回路中。

在一些实施方案中，该方法对脑中的多个非神经元细胞或星形胶质细胞进行重编程，其中至少30％的非神经元细胞或星形胶质细胞被重编程为特征在于表达选自由以下组成的组的一种或多种神经元标志物的成熟神经元：神经元核抗原(NeuN)、微管相关蛋白2(Map2)、神经元特异性烯醇酶(NSE)、160kDa中等神经丝，200kDa重神经丝、突触后密度蛋白95(PDS-95)、突触蛋白I、突触泡蛋白、谷氨酸脱羧酶67(GAD67)、谷氨酸脱羧酶67(GAD65)、小清蛋白、多巴胺-和cAMP-调节的神经元磷蛋白32(DARPP32)、囊泡谷氨酸转运体1(vGLUT1)、囊泡谷氨酸转运体2(vGLUT2)、乙酰胆碱和酪氨酸羟化酶(TH)。

在一些实施方案中，该方法对脑中的多个非神经元细胞或星形胶质细胞进行重编程，其中至少20％的非神经元细胞或星形胶质细胞被重编程为特征在于它们建立动作电位、突触连接、突触前神经递质和/或突触后反应的能力的功能神经元。

在一些实施方案中，所述细胞编程剂包含抗PTB反义寡核苷酸。在一些实施方案中，所述细胞编程剂选自由以下组成的组：抗PTB shRNA、抗PTB miRNA、抗PTB反义寡核苷酸、抗PTB抗体、PTB的小分子抑制剂、显性负PTB突变体、含有多聚嘧啶串的海绵多核糖核苷酸以及其任意组合。

在一些实施方案中，所述细胞编程剂抑制PTB的表达或活性至少5天。在一些实施方案中，所述细胞编程剂抑制PTB的表达或活性至少10天。在一些实施方案中，所述细胞编程剂抑制PTB的表达或活性至少15天。在一些实施方案中，所述细胞编程剂在AAV载体中被递送。

在某些实施方案中，本文公开了治疗与脑区域中的功能神经元退化有关的神经系统疾病的方法，其包括向有需要的受试者的脑区域施用包含抑制脑区域中的非神经元细胞中的PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物，以及允许非神经元细胞重编程为功能神经元，从而补充脑区域中退化的功能神经元。

在一些实施方案中，所述神经系统病症选自由以下组成的组：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、精神分裂症、抑郁症和药物成瘾。

在某些实施方案中，本文公开了治疗与脑区域中的多巴胺能神经元退化有关的神经系统疾病的方法，其包括向有需要的受试者的脑区域施用包含抑制脑区域中的非神经元细胞中的PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物，以及允许非神经元细胞重编程为多巴胺能神经元，从而补充脑区域中退化的多巴胺能神经元。

在某些实施方案中，本文公开了恢复具有与正常水平相比降低量的多巴胺的受试者中的多巴胺生物发生的方法，其包括向受试者的脑区域施用包含抑制脑区域中的非神经元细胞中的PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物，以及允许非神经元细胞重编程为多巴胺能神经元，从而恢复多巴胺的降低量的至少50％。

在一些实施方案中，所述非神经元细胞是神经胶质细胞。在一些实施方案中，所述非神经元细胞是星形胶质细胞。

在一些实施方案中，所述细胞编程剂包含抗PTB反义寡核苷酸。在一些实施方案中，所述单一细胞编程剂选自由以下组成的组：抗PTB shRNA、抗PTB miRNA、抗PTB反义寡核苷酸、抗PTB抗体、PTB的小分子抑制剂、显性负PTB突变体、含有多聚嘧啶串的海绵多核糖核苷酸以及其任意组合。

在一些实施方案中，所述功能神经元或多巴胺能神经元被整合在脑区域中现有的神经元回路中。

在一些实施方案中，所述功能神经元或多巴胺能神经元表现出动作电位、突触前神经递质和/或突触后反应。

在一些实施方案中，所述细胞编程剂被施用于受试者的中脑、纹状体或皮质。在一些实施方案中，所述细胞编程剂被施用于受试者的黑质。

在一些实施方案中，所述功能神经元或多巴胺能神经元的轴突端到达受试者的纹状体。

在一些实施方案中，所述神经系统疾病是帕金森氏病。在一些实施方案中，所述细胞编程剂的施用改善帕金森氏病的一种或多种症状。在一些实施方案中，所述帕金森氏病的一种或多种症状选自由以下组成的组：震颤、僵硬、迟钝、平衡受损、曳行步态、姿势不稳、嗅觉障碍、认知损害、抑郁、睡眠障碍、自主机能障碍、疼痛和疲劳。

在本文提供的方法的一些实施方案中，细胞编程剂包含与细胞靶向部分缀合的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸被配置为抑制靶细胞中PTB的表达或活性。在一些实施方案中，所述细胞靶向部分被配置为将反义寡核苷酸递送至靶细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞包括非神经元细胞、神经胶质细胞或星形胶质细胞。在一些实施方案中，所述细胞靶向部分包含多肽。

在本文提供的方法的一些实施方案中，所述细胞编程剂包含与SEQ ID NO：1或2具有至少80％、至少90％或100％同一性的核酸序列。

在某些实施方案中，本文公开了包含有效地通过抑制非神经元细胞中PTB的表达或活性将哺乳动物非神经元细胞重编程为成熟神经元的量的细胞编程剂的药物组合物。

在某些实施方案中，本文公开了本文提供的药物组合物，所述药物组合物被配制用于注射、吸入、肠胃外施用、静脉内施用、皮下施用、肌内施用、皮内施用、局部施用或口服施用。

在某些实施方案中，本文公开了包含反义寡核苷酸的可注射组合物，所述反义寡核苷酸被配置为抑制非神经元细胞中PTB的表达或活性。在一些实施方案中，所述非神经元细胞是神经胶质细胞。在一些实施方案中，所述神经胶质细胞是星形胶质细胞。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含与SEQ ID NO 1或2具有至少80％、至少90％或100％同一性的核酸序列。

在某些实施方案中，本文公开了组合物，所述组合物包含被配置为抑制非神经元细胞中PTB的表达或活性的慢病毒-shRNA构建体。在一些实施方案中，所述非神经元细胞是神经胶质细胞。在一些实施方案中，所述神经胶质细胞是星形胶质细胞。在一些实施方案中，所述构建体包含与SEQ ID NO 1或2具有至少80％、至少90％或100％同一性的核酸序列。

在某些实施方案中，本文公开了包含AAV-shRNA构建体的可注射组合物，所述AAV-shRNA构建体被配置为抑制非神经元细胞中PTB的表达或活性。在一些实施方案中，所述非神经元细胞是神经胶质细胞。在一些实施方案中，所述神经胶质细胞是星形胶质细胞。在一些实施方案中，所述构建体包含与SEQ ID NO 1或2具有至少80％、至少90％或100％同一性的核酸序列。

在某些实施方案中，本文公开了用于将非神经元细胞转化为神经元的组合物，其包含与细胞靶向部分缀合的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸被配置为抑制非神经元细胞中的PTB的表达或活性，其中所述细胞靶向部分被配置为将反义寡核苷酸递送至非神经元细胞。

在一些实施方案中，所述细胞靶向部分包含多肽。在一些实施方案中，所述细胞靶向部分被特异性地配置成特异性地靶向非神经元细胞。在一些实施方案中，所述非神经元细胞选自由以下组成的组：神经胶质细胞、成体原代成纤维细胞、胚胎成纤维细胞、上皮细胞、黑素细胞、角化细胞、脂肪细胞、血细胞、骨髓基质细胞、朗格汉斯细胞、肌肉细胞、直肠细胞和软骨细胞。在一些实施方案中，所述非神经元细胞来自选自由以下组成的组的细胞系：星形胶质瘤细胞、Hela细胞系、NT2细胞系、ARPE19细胞系和N2A细胞系。在一些实施方案中，所述非神经元细胞是神经胶质细胞。在一些实施方案中，所述神经胶质细胞选自由以下组成的组：星形胶质细胞、少突细胞、室管膜细胞、许旺氏细胞、NG2细胞和卫星细胞。在一些实施方案中，所述神经胶质细胞是星形胶质细胞。在一些实施方案中，所述组合物用于治疗与脑区域中的功能神经元退化有关的神经系统疾病。在一些实施方案中，所述神经系统疾病选自由以下组成的组：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、精神分裂症、抑郁症和药物成瘾。在一些实施方案中，所述神经系统病况是帕金森氏病。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含与SEQ ID NO 1或2具有至少80％、至少90％或100％同一性的核酸序列。

在某些实施方案中，本文公开了脑区域中包含重编程的神经元的动物，其中所述重编程的神经元是通过本文公开的任何方法制备的。在一些实施方案中，所述动物是哺乳动物。在一些实施方案中，所述动物是人。在一些实施方案中，所述动物是啮齿动物。在一些实施方案中，所述动物是猪。

在某些实施方案中，本文公开了包含重编程的神经元的本文公开的任何动物的脑组织。

在某些实施方案中，本文公开了通过本文公开的方法之一制备的重编程神经元。

附图说明

图1是由PTB控制的用于神经元诱导和由nPTB控制用于神经元成熟的两个连续调节回路的示意图。

图2A-F显示了在小鼠星形胶质细胞、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和小鼠神经元(图2A、2C和2E)以及在人星形胶质细胞、人成体成纤维细胞HDF和人神经元(图2B、2D和2F)中通过蛋白质印迹检测的Brn2的表达水平和通过RT-qPCR检测的miR-124和miR-9的表达水平。统计结果表示为平均值±SEM；基于用事后Turkey检验的ANOVA(n＝3个生物学重复)，**p＜0.01，***p＜0.001。

图3A显示了响应于HDF(左)、小鼠(中)和人星形胶质细胞(右)中PTB下调的通过蛋白质印迹对nPTB水平的时程分析。

图3B显示了数据的定量。

图4显示了分离的小鼠和人星形胶质细胞的表征：培养物中的大多数小鼠和人星形胶质细胞对星形胶质细胞标志物(GFAP和ALDH1L1)呈免疫阳性且无可检测的其他细胞类型，如神经元标志物(Tuj1、NSE、NeuN、GAD67、VGluT1、TH)、少突细胞标志物(少突细胞转录因子2，OLIG2)、小神经胶质标志物(CD11抗原样家族成员B，CD11b)、NG2细胞标志物(神经/神经胶质抗原2，NG2)、神经祖细胞标志物(巢蛋白)、多能性标志物(NANOG)和成纤维细胞标志物(纤连蛋白)的阴性染色所指示的。比例尺：30μm。

图5A显示了来自小鼠星形胶质细胞的PTB敲低诱导的神经元对泛神经元标志物Tuj1(红色)和MAP2(绿色)呈免疫阳性。在相同的培养条件下，感染有对照病毒(shCtrl)的小鼠星形胶质细胞未显示出神经元标志物的阳性染色。基于5个生物学重复的正确定量。比例尺：100μm。

图5B显示了通过成熟神经元的标志物(NeuN，NSE)和不同神经元亚型的标志物(包括谷氨酸能神经元的标志物(VGlut1)、GABA能神经元的标志物(GAD67)和多巴胺能神经元的标志物(TH))对诱导的神经元的表征。比例尺：30μm。

图5C显示了来自小鼠星形胶质细胞的转化的神经元的亚型的定量。来自4个生物学重复的数据。

图5D显示了来自小鼠星形胶质细胞的诱导的神经元的电生理分析，显示了重复动作电位(左，在18个被检查的细胞中12个显示了记录的活动)和电压依赖性钠和钾通道的大电流(中，在17个被检查的细胞中13个显示了记录的活动)。与大鼠星形胶质细胞共培养后，还记录了自发的突触后电流(右，15个被检查的细胞中10个显示出记录的活动)。比例尺：100μm。

图5E显示了在人星形胶质细胞中通过PTB敲低诱导的Tuj1(红色)和MAP2(绿色)的表达。右图显示了来自4个生物学重复的定量。

图5F显示了来自人星形胶质细胞的表达成熟神经元的标志物(NeuN、NSE)和不同神经亚型的标志物(VGlut1、GAD67和TH)的诱导的神经元。比例尺：40μm。

图5G显示了来自人星形胶质细胞的转化的神经元的亚型的定量。来自5个生物学重复的数据。

图5H显示了从人星形胶质细胞诱导的神经元的电生理分析，显示了重复动作电位(左，11个被检查的细胞中9个显示了记录的活动)、电压依赖性钠和钾通道的电流(中，20个被检查的细胞中17个显示了记录的活动)和自发的突触后电流(右，14个被检查的细胞中13个显示记录的活动)。

图5I显示了定量在使用AAV-shPTB转化为神经元之前和之后的小鼠皮质星形胶质细胞中通过RT-qPCR测量的SLC6A3(左)和FoxA2(右)的表达水平的图。

图5J-K显示了通过针对DAT(J)和VMAT2(K)免疫染色表征的诱导的多巴胺能神经元的示例性图像。比例尺：20μm。

图5L显示了与TH相比，表达DAP和VMAT2的转化的神经元的百分比的定量(基于三个生物学重复)。

图6A和6C显示了分别在PTB敲低诱导的神经元转化后小鼠(图6A)和人(图6C)星形胶质细胞上检测到的自发兴奋性和抑制性突触后电流，所示电流也被证明依次被针对兴奋性(NBQX+APV)和抑制性(PiTX)受体的抑制剂阻断。

图6B和6D显示模拟小鼠(图6B)和人星形胶质细胞(图6D)分别未显示任何神经元电生理特性，例如动作电位(上)、电压依赖性通道得电流(中)和突触后事件(下)。

图6E显示了来自源自中脑的星形胶质细胞的shPTB转化的Tuj1阳性神经元的TH染色。比例尺：10μm。

图6F显示了来自皮质和中脑的星形胶质细胞之间的神经元转换效率的比较，显示出Tuj1阳性神经元的相似高百分比(左)，但是相对于来自皮质的星形胶质细胞而言，从源自中脑的星形胶质细胞转化的多巴胺能神经元的百分比显著更高(右)。基于三个生物学重复，

图6G显示了蛋白质印迹结果，表明来自皮质和中脑的星形胶质细胞来源的神经元中泛神经元标志物(Tuj1)和多巴胺能神经元的两种特定标志物(TH、VMAT2)的表达。

图7A-7K例示了在小鼠中脑中通过PTB下调将星形胶质细胞转化为功能神经元。(A)是AAV载体设计的示意图，所述AAV载体包含两个loxP位点，其包围终止信号，其后是针对PTB的RFP和shRNA。(B)显示出空载体感染的星形胶质细胞显示GFAP阳性染色但未显示NeuN染色(上图)，并且相反，感染有shPTB表达载体的大多数星形胶质细胞在感染后10周均为NeuN阳性(下图)。右侧显示了来自3只小鼠的定量数据。比例尺：30μm。(C)显示出转化的神经元对多种神经元标志物(包括Tuj1、MAP2、NSE和PSD95)呈免疫阳性。比例尺：10μm。(D)显示出中脑中转化的神经元的主要群体表达TH。右图显示了转化的多巴胺能神经元的亚组的定量。数据来自3只小鼠。比例尺：20μm。(E-G)显示了示例性结果，表明在不同脑区域中原位转化的多巴胺能神经元的特异性和效率。(E)和(F)显示了中脑、纹状体和皮层中shPTB诱导的成熟神经元(NeuN)和多巴胺能神经元(TH)的免疫染色图像。箭头指示几个转化后的神经元细胞体，其中RFP和NeuN(A)或TH(B)的信号重叠。比例尺：30μm。(G)显示(E)和(F)中染色结果的定量。数据来自三只小鼠。显著差异由用事后Tukey检验的ANOVA的p值表示。(H)显示了转化的神经元的示例性膜片钳记录。用填充在记录移液管中的神经生物素488标记膜片细胞。膜片记录后的免疫染色显示，所追踪的细胞为TH阳性。比例尺：20μm。(I-K)证明脑切片上的示例性转化的神经元显示出电压依赖性钠和钾通道的电流(I，12个被检查的细胞中11个显示了记录的活动)、重复动作电位(J，12个被检查的细胞中9个显示了记录的活动)以及自发的突触后电流(K，11个被检查的细胞中9个显示记录的活动)。

图8A-8F显示了小鼠中脑中的示例性AAV-shPTB诱导的神经元转化的表征。(A)显示了在注射的WT小鼠中LoxP-Stop-LoxP AAV表达单元的泄漏检测不到。与接受相同病毒注射的GFAP-Cre转基因小鼠相比(右)，注射AAV-Empty和AAV-shPTB病毒后的野生型小鼠的中脑中很少检测到RFP阳性细胞(左)。比例尺：150μm。(B)显示RFP阳性细胞逐渐转化为中脑中的神经元。注射AAV-shPTB后3至10周，RFP标记的NeuN阳性细胞的百分比逐渐增加。比例尺：50μm。(C)显示了(B)中数据以及未显示的基于3只小鼠的其他点的定量。(D)显示在RFP阳性细胞周围很少检测到NG2细胞(左图)，而在AAV-Empty转导的中脑的同一切片中，NG2阳性细胞通常不被RFP阳性细胞包围(右图)。比例尺：15μm。(E)显示了谷氨酸能神经元标志物(VGluT2)和GABA能神经元标志物(GAD65)的免疫染色显示转化的神经元的不同亚型。比例尺：20μm。(F)显示了A9多巴胺能神经元标志物Girk2的免疫染色。箭头指示Girk2与RFP和TH染色的信号的共定位。比例尺：20μm。

图8G显示了A10多巴胺能神经元标志物钙结合蛋白的免疫染色。箭头指示钙结合蛋白与RFP和TH信号的共定位。星号指示钙结合蛋白染色阴性的转化的多巴胺能神经元(RFP和TH阳性)。比例尺：20μm。

图8H显示了与该脑区域中的RFP阳性细胞相比针对TH染色的注射有AAV-shPTB的黑质的低倍放大图，所述AAV-shPTB也表达RFP用于监测新转化的神经元。比例尺：100μm。这些数据来自未受损的脑，显示了大量内源性TH阳性多巴胺能神经元(绿色)。在黑质(由虚线近似)内以及周围区域中检测到RFP阳性细胞。

图8I显示了黑质中TH阳性和RFP阳性细胞体的放大图。通过Z-堆栈图像的正交视图突出显示了RFP和TH双阳性细胞体，所述图像分别贴在每个图的主图像的右侧和底部。箭头指示TH和RFP均呈阳性的神经元突起。比例尺：10μm。

图8J显示了与在黑质和周围区域中均表达RFP和TH的转化的多巴胺能神经元相比，总RFP阳性细胞的定量。数据来自三只小鼠。

图9A-9I显示了从黑质到纹状体的示例性的PTB敲低诱导的多巴胺能神经元的投射特征。(A)是来自小鼠中脑中的示例性转化的神经元的RFP阳性纤维的概观，显示了从背侧到腹侧的三个连续切片。顶部白色箭头：隔核；中间的黑色箭头：伏核；底部黄色箭头：嗅结节。(B)显示针对多巴胺能神经元标志物的转化的细胞的染色，所述标志物包括DAT(多巴胺转运体)、VMAT2(囊泡单胺转运体2)、En1(锯齿形同源盒1)和Lmx1α(LIM同源盒转录因子1α)。比例尺：20μm。(C)显示黑质中TH和RFP阳性细胞体。箭指示RFP和TH双阳性细胞。比例尺：30μm。(D)显示RFP阳性纤维到纹状体中的投射，这些纤维中的一些对TH呈阳性染色。比例尺：20μm(左)；10μm(右)。(E)显示了向早期用AAV-shPTB治疗的小鼠中纹状体注射荧光逆行轴突示踪珠的方案。(F)显示用逆行珠标记黑质中的TH/RFP阳性细胞。箭头指示珠标记的转化的细胞，且箭指向珠标记的内源性多巴胺能神经元(TH阳性，但RFP阴性)。比例尺：20μm。(G)显示了RFP阳性投射支配的纹状体的低倍放大视图。比例尺：300μm。插入图显示了不同区域中RFP阳性投射的放大视图。CPu：尾状壳核；NAc：伏核；Sept：隔膜；OT：嗅结节。比例尺：15μm。(H)显示了一部分RFP阳性纤维的图像显示与TH共染色(箭头)，而其他则为TH阴性(箭)。比例尺：5μm。(I)显示了在野生型小鼠脑中转导AAV-shPTB后总RFP阳性纤维和RFP/TH双阳性纤维的密度的定量。数据基于三只小鼠的图像。

图10例示了帕金森氏病的小鼠模型的构建。上图显示了将6-OHDA注射到小鼠黑质、然后固定和染色小鼠脑的时间轴。底部荧光图像显示未接受6-OHDA注射的小鼠的纹状体的免疫染色结果(左)和接受6-OHDA注射的小鼠的纹状体的免疫染色结果(右)。左图和右图之间的比较表明6-OHDA注射后，TH阳性纤维束的损失和沿受损纤维束GFAP阳性星形胶质细胞的增加。

图11A-11E例示了化学诱导的小鼠PD模型中黑质纹状体通路的重建和PD表型的挽救。(A)是在黑质(SN)中6-OHDA诱导损伤、然后用AAV-PTB重编程并进行行为分析的实验时间表的示意图。(B)显示了中脑中的6-OHDA诱导损伤中的TH阳性细胞体的单侧损失(顶部，比例尺：500μm)和纹状体中的TH染色的纤维束(底部，比例尺：500μm)的诱导。(D)显示了受损的黑质中GFAP阳性星形胶质细胞的群体急剧增加。比例尺：50μm。(D)显示了对照(上图)和6-OHDA受损黑质(中图)之间的比较，表明通过AAV-shPTB增加了转化的多巴胺能神经元(黄色，箭头)(下图)，而星号指示内源性多巴胺能神经元(绿色)。比例尺：50μm。(E)显示了纹状体中再生的RFP和TH阳性纤维的示例性图像。比例尺：50μm(顶部)；10μm(底部)。

图11F-11J显示了表明shPTB转化的神经元补充了黑质中大部分损失的多巴胺能神经元的示例性结果。(F)显示了针对TH染色的未受损黑质的低放大率视图。比例尺：80μm。(G)显示了用6-OHDA损伤并用AAV-shPTB转导的黑质。比例尺：80μm。用6-OHDA损伤但用空病毒载体处理的黑质与受损但未处理的黑质(未显示)之间看起来相同。(H)显示了黑质中共表达TH的RFP阳性细胞的放大图。比例尺：10μm。由z-堆栈图像的正交视图突出显示了两个RFP/TH-双阳性细胞体，所述图像分别贴在每个图的主图像的右侧和底部。(I)显示了黑质中RFP/TH双阳性突起(箭头)或RFP阳性、TH阴性突起(箭)的图像。比例尺：10μm。(J)显示了未受损侧内的多巴胺能神经元(蓝色)、用空载体处理的受损侧内的剩余内源性多巴胺能神经元的群体(绿色)以及受损侧中的转化的RFP阳性多巴胺能神经元(橙色)的定量。数据来自两组图像，每组图像均来自用AAV-shPTB或空载体处理的三只小鼠。

图11K显示了对用AAV-shPTB转导后的6-OHDA损伤的脑中的总RFP阳性纤维和RFP/TH-双阳性纤维的密度进行定量的图。数据基于来自三只小鼠的图像。

图11L显示了对用AAV-shPTB转导的未受损小鼠和受损小鼠的纹状体中的总TH阳性纤维的光密度进行定量的图，其显示了受损的脑中TH阳性多巴胺能神经元的恢复。数据基于每组三只小鼠的分析。

图12A-12C证明了在6-OHDA处理的AAV-shPTB重编程的小鼠中的行为恢复至WT水平。(A)显示在模拟处理的、6-OHDA处理的AAV-shPTB重编程的小鼠中行为的恢复。安非他明(左，基于来自6只小鼠的数据)或阿扑吗啡(右，基于来自7只小鼠的数据)诱导旋转。(B)和(C)描绘了模拟处理的、6-OHDA处理的AAV-shPTB重编程的小鼠的行为恢复的时程分析。阿朴吗啡(B)诱导旋转，并记录单侧受损小鼠的同侧接触(C)的百分比。n＝每组中分析的小鼠。统计结果表示为平均值+/-SEM；显著性差异通过基于用事后Tukey检验的ANOVA的p值表示。

图13A显示了靶向PTB的有效反义寡核苷酸的筛选。通过蛋白质印迹法在用不同ASO处理的小鼠星形胶质细胞中检测PTB水平。对于其余实验，选择了ASO4#。

图13B显示了来自小鼠星形胶质细胞的示例性PTB-ASO诱导的神经元，其对Tuj1和MAP2(左)、NSE和NeuN(中)以及多巴胺能神经元标志物TH(右)呈阳性染色。在相同的培养条件下，用GFP-ASO处理的小鼠星形胶质细胞未显示任何神经元标志物的阳性染色(未显示)。比例尺：20μm。

图13C显示了PTB-ASO而非GFP-ASO挽救了6-OHDA损伤的小鼠中由阿扑吗啡诱导的旋转行为。统计结果表示为平均值+/-SEM；基于未配对Student氏t检验，

图14A-14D显示了示例性的PTB-ASO诱导了小鼠中脑中的星形胶质细胞的神经元转化。(A)是用于在体内标记和追踪星形胶质细胞的转基因小鼠的示意图。(B)显示在双转基因GFAP-CreER：Rosa-tdTomato小鼠的中脑中，在它莫西芬的处理后3周，tdTomato标记的细胞均未对NeuN呈阳性染色(左)，但它们的大多数为GFAP阳性(右)，比例尺：50μm。(C)显示在中脑中注射PTB-ASO后8周，tdTomato标记的细胞的一部分变为NeuN阳性。比例尺：20μm。(D)显示示例性的PTB-ASO转化的神经元对多巴胺能神经元标志物TH呈阳性染色。比例尺：15μm。

图15A-F显示AAV-shPTB处理显著恢复了纹状体多巴胺水平。(A)显示了描绘在野生型脑中多巴胺范围内添加两种不同剂量的“掺入”多巴胺”后，通过HPLC检测到的脑中的多巴胺水平的图。(B)显示了由添加至不同水平的“掺入”多巴胺生成的标准曲线。(C)和(D)描绘了未受损脑的两侧的纹状体多巴胺水平的比较(C)和响应于单侧6-OHDA损伤的纹状体多巴胺的减少(D)。(E)显示在同侧黑质中注射AAV-shPTB后纹状体多巴胺的显著恢复。(F)是在所示的不同条件下对纹状体多巴胺水平进行定量的图。n：每组中分析的小鼠数量。显著差异由用事后Tukey检验的ANOVA的p值表示。

图16A是化学遗传学方法的示意图，以证明转化的神经元直接负责表型的恢复。

图16B是对化学遗传学实验的行为结果进行定量的图，其中进行圆筒测试以显示在注射AAV-hM4Di-shPTB以及用CNO治疗之前和之后和停药后3天，受损小鼠中优先的同侧接触。未损伤的小鼠充当对照。n＝每组中分析的小鼠。

图17A-F描绘了通过转化的多巴胺能神经元重建黑质纹状体通路。(A)显示了从黑质延伸到纹状体的RFP阳性投射的图像。示意图显示水平截面的背-腹侧水平。比例尺：100μm。CPu，尾状壳核；GP，苍白球；IC，内囊；SN，黑质。(B)-(E)显示了不同脑区域的更高放大率视图。比例尺：25μm。(F)显示了苍白球中与TH(箭头)共染色的RFP阳性纤维的一部分的图像。箭表示内源性多巴胺能纤维。比例尺：5μm。

具体实施方案

如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”，“一种”和“该”包括复数指示对象，除非上下文另有明确规定。因此，例如，对“一种抑制剂”的引用包括多种抑制剂，并且对“该试剂”的引用包括对一种或多种试剂以及本领域技术人员所知的其等同物，等等。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和试剂都可以用于所公开的方法和组合物的实践中，但现在描述示例性的方法和材料。

本文中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式全文并入本文，用于描述和公开出版物中描述的方法的目的，所述出版物可与本文中的描述结合使用，就像每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出以引用的方式并入一样。在本申请的申请日之前，仅提供以上讨论的和贯穿全文的出版物以供其公开。本文中的任何内容均不得被解释为承认发明人无权因事先公开而提前公开。此外，对于在一个或多个出版物中呈现的与本发明中明确定义的术语类似或相同的任何术语，在所有方面将以本发明中明确提供的术语的定义为准。

同样，“和”的使用意指“和/或”，除非另有说明。相似地，“包含”和“包括”("comprise"、"comprises"、"comprising"、"include"、"includes"和"including")是可互换的，且不旨在加以限制。

应当进一步理解的是，在各个实施方案的描述使用术语“包含”的情况下，本领域技术人员将理解，在某些特定的实例中，实施方案可以替代地使用语言“基本上由...组成”或“由...组成”进行描述。

“星形胶质细胞”可以指脑和脊髓中特征性的星形的胶质细胞。对本领域技术人员来说清楚的是，星形胶质细胞的特征可以是星形的，表达标志物如胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和醛脱氢酶1家族成员L1(ALDH1L1)、兴奋性氨基酸转运体1/谷氨酸天门冬氨酸转运体(EAAT1/GLAST)、谷氨酰胺合成酶、S100β或兴奋性氨基酸转运体1/谷氨酸转运体1(EAAT2/GLT-1)，与内皮细胞一起参与血-脑屏障、递质摄取和释放、调节细胞外空间中的离子浓度、对神经元损伤的反应和参与神经系统修复以及代谢支持周围神经元。在本发明的某些实施方案中，星形胶质细胞可以指神经系统中表达胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、醛脱氢酶1家族成员L1(ALDH1L1)或两者的非神经元细胞。在某些实施方案中，星形胶质细胞可以指神经系统中表达胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子驱动的转基因(例如红色荧光蛋白(RFP)、Cre重组酶)的非神经元细胞。

“BRN2转录因子”或“脑-2转录因子”，也称为“POU结构域第3类转录因子2”(“POU3F2”)或“Oct-7”，可以指可以主要在中枢神经系统中表达的III类POU-结构域转录因子，其具有由通过包含短的a-螺旋折叠的接头连接的约75个氨基酸的N端POU特异性结构域和约60个氨基酸的C端POU同源结构域组成的DNA结合POU结构域。BRN2可以在中枢神经系统中表达，并且可以与原神经碱性-螺旋-环-螺旋转录因子Mashl相互作用以调节神经发生的方面，例如神经元分化。

如本文所用，术语使细胞与本发明的组合物“接触”是指将组合物(例如化合物、核酸、病毒载体等)放置在允许其接触细胞以产生“接触的”细胞的位置。可以使用任何合适的方法来完成接触。例如，在一个实施方案中，接触是通过将化合物添加至细胞培养物中。接触也可以通过将其注射或将组合物递送至体内的位置以使组合物“接触”靶向的细胞类型来完成。

如本文所用，术语“分化(differentiation)”、“分化(differentiate)”或“转化”或“诱导分化”可互换使用，是指将默认细胞类型(基因型和/或表型)改变为非默认细胞类型(基因型和/或表型)。因此，“诱导星形胶质细胞分化”是指诱导细胞从其星形胶质细胞的形态改变为神经元细胞类型(即由基因分析如微阵列所确定的基因表达的变化)和/或表型(即蛋白质表达的变化)。

如本文所用，术语“神经胶质细胞”通常可以指中枢神经系统(例如，脑和脊髓)和周围神经系统中的支持细胞的类型。在一些实施方案中，与神经元不同，神经胶质细胞不传导电脉冲或表现出动作电位。在一些实施方案中，神经胶质细胞不通过突触联系或电信号与彼此或与神经元传递信息。在神经系统或体外培养系统中，神经胶质细胞可以围绕神经元并为神经元之间提供支持和隔离。神经胶质细胞的非限制性实例包括少突细胞、星形胶质细胞、室管膜细胞、雪旺氏细胞、小神经胶质和卫星细胞。

在本文可互换使用的术语“iRNA”、“RNAi试剂”、“iRNA试剂”、“RNA干扰剂”是指含有RNA且通过RNA诱导的沉默复合物(RISC)通路介导RNA转录物的靶向裂解的试剂。iRNA通过称为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序列特异性降解。所述iRNA调节例如抑制细胞中例如受试者诸如哺乳动物受试者的细胞中的PTB的表达。RNAi试剂包括但不限于“小干扰RNA(siRNA)”、“内切核糖核酸酶制备的siRNA(e-siRNA)”、“短发夹RNA(shRNA)”和“小时间调控的RNA”(stRNA)”、“切割的siRNA(d-siRNA)”以及适体、寡核苷酸和包含至少一个尿嘧啶碱基的其他合成核酸。在一些实施方案中，此类RNAi试剂由载体递送，所述载体例如但不限于复制缺陷或有复制能力的病毒载体(例如，腺病毒载体、慢病毒载体、γ逆转录病毒载体等)。

“微小RNA”或“miRNA”是指与至少部分互补核酸序列(mRNA)结合并在转录后水平负调控靶mRNA的表达的非编码核酸(RNA)序列。微小RNA通常从具有双链发夹环结构的“前体”miRNA被加工至“成熟”形式。通常，成熟的微小RNA序列的长度为约19-25个核苷酸。

“miR-9”是短的非编码RNA基因，其参与基因调控，并且从果蝇和小鼠到人是高度保守的。成熟的～21nt miRNA通过切酶从发夹前体序列被加工而成。miR-9可能是发育中和成体脊椎动物脑中最高表达的微小RNA之一。关键的转录调节因子如FoxG1、Hes1或Tlx可能是miR-9的直接靶标，将其置于控制神经元祖细胞状态的基因网络的核心。

如本文所用，本文使用的术语“神经元”或“神经元细胞”可以具有本领域技术人员将理解的一般含义。在一些实施方案中，神经元可以指可以通过电信号(例如，膜电位放电)和化学信号(例如，神经递质的突触传递)接收、处理和传输信息的电可兴奋细胞。如本领域技术人员将理解的，在神经元之间转导的化学信号(例如，基于神经递质的释放和识别)可以通过称为突触的专门连接发生。如本文所用，术语“成熟神经元”可以指分化的神经元。在一些实施方案中，如果神经元表达成熟神经元的一种或多种标志物，例如微管相关蛋白2(MAP2)和神经元核(NeuN)、神经元特异性烯醇酶(NSE)、160kDa中等神经丝、200kDa重神经丝、突触后密度蛋白95(PDS-95)、突触蛋白I、突触泡蛋白、谷氨酸脱羧酶67(GAD67)、谷氨酸脱羧酶67(GAD65)、小清蛋白、多巴胺-和cAMP-调节的神经元磷蛋白32(DARPP32)、囊泡谷氨酸转运体1(vGLUT1)、囊泡谷氨酸转运体2(vGLUT2)、乙酰胆碱和酪氨酸羟化酶(TH)，则神经元为成熟神经元。如本文所用，术语“功能神经元”可以指能够通过化学或电信号发送或接收信息的神经元。在一些实施方案中，功能神经元表现出存在于正常神经系统中的成熟神经元的一种或多种功能特性，包括但不限于：兴奋性(例如，表现出动作电位的能力，例如跨细胞膜的电压或膜电位的快速上升和随后下降)、与其他神经元形成突触连接、突触前神经递质释放和突触后反应(例如，兴奋性突触后电流或抑制性突触后电流)。在一些实施方案中，功能神经元的特征在于其表达功能神经元的一种或多种标志物，包括但不限于突触蛋白、突触泡蛋白、谷氨酸脱羧酶67(GAD67)、谷氨酸脱羧酶67(GAD65)、小清蛋白、多巴胺-和cAMP-调节的神经元磷蛋白32(DARPP32)、囊泡谷氨酸转运体1(vGLUT1)、囊泡谷氨酸转运体2(vGLUT2)、乙酰胆碱、酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺、囊泡GABA转运体(VGAT)和γ-氨基丁酸(GABA)。

如本文所用，术语“非神经元细胞”可以指不是神经元的任何类型的细胞。示例性非神经元细胞是除神经元谱系以外的细胞谱系(例如，造血谱系)的细胞。在一些实施方案中，非神经元细胞是神经元谱系但不是神经元的细胞，例如神经胶质细胞。在一些实施方案中，非神经元细胞是非神经元的体细胞，例如但不限于神经胶质细胞、成体原代成纤维细胞、胚胎成纤维细胞、上皮细胞、黑素细胞、角化细胞、脂肪细胞、血细胞、骨髓基质细胞、朗格汉斯细胞、肌肉细胞、直肠细胞或软骨细胞。在一些实施方案中，非神经元细胞来自非神经元细胞系，例如但不限于胶质母细胞瘤细胞系、Hela细胞系、NT2细胞系、ARPE19细胞系或N2A细胞系。“细胞谱系”或“谱系”可以表示来自受精胚胎的组织或器官的发育史。“神经元谱系”可以指从神经干细胞到成熟神经元的发育史，包括沿着该过程(称为神经发生)的各个阶段，例如但不限于神经干细胞(神经上皮细胞、放射状神经胶质细胞)、神经祖细胞(例如，中间神经元前体)、神经元、星形胶质细胞、少突细胞和小神经胶质。

在本文中可互换使用的术语“核酸”和“多核苷酸”可以指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语可以包括含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键的核酸，这些核苷酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以与参考核苷酸类似的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、锁定核酸(LNA)和肽-核酸(PNA)。

“少突细胞”可以指神经胶质细胞的类型，其可以产生髓鞘，所述髓鞘围绕神经元轴突，从而为中枢神经系统中的轴突提供支持和隔离。少突细胞的特征也可以在于其表达：PDGF受体α(PDGFR-α)、SOX10、神经/神经胶质抗原2(NG2)、Olig1、Olig2和Olig3、少突细胞特异性蛋白(OSP)、髓鞘碱性蛋白(MBP)或髓鞘少突细胞糖蛋白(MOG)。

“多聚嘧啶串结合蛋白”或“PTB”及其同源物神经PTB(nPTB)都是普遍存在的RNA结合蛋白。PTB也可以称为多聚嘧啶串结合蛋白1，并且在人中是由PTBP1基因编码的。PTBP1基因属于普遍表达的异质核糖核蛋白(hnRNPs)的亚家族。hnRNP是RNA结合蛋白，并且它们与异质核RNA(hnRNA)复合。这些蛋白质与细胞核中的前体mRNA缔合，并且似乎会影响前体mRNA加工以及mRNA代谢和转运的其他方面。PTB可具有结合RNA的准-RNA识别基序(RRM)结构域的四个重复。与其广泛表达相一致，PTB可以有助于抑制大量的可替代剪接事件。PTB可以识别位于富含嘧啶的环境中的短RNA基序，例如UCUU和UCUCU，并且经常与组成型外显子和可替代外显子的3'剪接位点的上游的多聚嘧啶串相关。在一些情况下，PTB的结合位点还可以包括外显子序列和受调控外显子的下游的内含子中的序列。在由PTB调控的大多数可替代剪接系统中，可以通过PTB与可替代外显子周围的多个PTB结合位点的相互作用来实现抑制。在一些情况下，抑制可能涉及单个PTB结合位点。通过PTB与U2AF65之间的直接竞争，通过PTB的剪接抑制可能发生，这进而可以阻止U2 snRNP在分支点上的组装。在一些情况下，通过PTB的剪接抑制可能涉及位于可替代外显子两侧的PTB结合位点，并且可能起因于环出(loop out)RNA的PTB分子之间的协同相互作用，从而使剪接位点无法被剪接机制所利用。通过PTB的剪接抑制也可能涉及来自高亲和力结合位点的PTB的多聚化，其可以产生覆盖可替代外显子并阻止其识别的抑制波。

PTB可以在非神经元细胞中广泛表达，而nPTB可局限于神经元。在神经元分化过程中，PTB和nPTB可能经历编程转换。例如，如图1所示，在神经元分化过程中，PTB在神经元诱导阶段逐渐下调，一致地或必然地，nPTB水平逐渐上调至峰值水平。随后，当神经元分化进入神经元成熟阶段时，nPTB水平在其初始上升后经历降低，然后，当细胞发育为成熟神经元时，返回到与神经元分化过程中的其峰值水平相比相对低的水平。

PTB的序列是已知的(参见，例如，Romanelli等人(2005)Gene,August 15:356:11-8；Robinson等人,PLoS One.2008Mar.12；3(3):e1801.doi:10.1371/journal.pone.0001801；Makeyev等人,Mol.Cell(2007)August 3；27(3):435-48)；因此，本领域技术人员可以设计和构建反义、miRNA、siRNA分子等，以调节例如降低或抑制PTB的表达；实践本发明的方法。

可互换使用的术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以指氨基酸聚合物或一组两个或更多个相互作用或结合的氨基酸聚合物。

如本文所用的术语“启动子”可以指指导核酸转录的一系列核酸控制序列。如本文所用，启动子包括靠近转录的起始位点的必需核酸序列，例如在聚合酶II型启动子的情况下，TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或阻遏子元件，其可位于距转录起始位点多达数千个碱基对的位置。启动子包括组成型和诱导型启动子。“组成型”启动子是可在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是可在环境或发育调节下具有活性的启动子。术语“可操作连接”可以指核酸表达控制序列(如启动子或一系列转录因子结合位点)与第二核酸序列之间的功能连接，其中表达控制序列指导与第二核酸序列相对应的核酸的转录。

如本文所使用的术语“重编程”或“转分化”可以指从不同类型的细胞(例如成纤维细胞)产生某种谱系的细胞(例如神经元细胞)且没有将细胞去分化为表现出多能干细胞特征的细胞的中间过程。“多能”可以指细胞形成身体或体细胞(即，胚体)的所有谱系的能力。示例性的“多能干细胞”可包括胚胎干细胞和诱导的多能干细胞。

可互换使用的术语“受试者”和“患者”可以指，除非另有说明，哺乳动物，例如人和非人灵长类动物，以及兔、大鼠、小鼠、山羊、猪和其他哺乳动物。该术语不一定表示该受试者已被诊断出患有特定疾病，而是反而可以指在医学监督下的个体。例如，受益于所公开的方法和组合物的哺乳动物物种包括但不限于灵长类动物，例如猿、黑猩猩、猩猩、人、猴；驯养的动物(例如宠物)，例如狗、猫、豚鼠、仓鼠、越南大肚猪、兔和雪貂；驯养的农场动物，例如牛、野牛、马、驴、猪、绵羊和山羊；通常在动物园中发现的野外动物，例如熊、狮、虎、黑豹、大象、河马、犀牛、长颈鹿、羚羊、树懒、瞪羚、斑马、牛羚、草原犬鼠、考拉熊、袋鼠、负鼠、浣熊、熊猫、鬣狗、海豹、海狮、海象、水獭、鼠海豚、海豚和鲸鱼。

“载体”是指能够将另一种核酸转运到细胞中的核酸。当载体存在于适当的环境中时，载体能够指导由该载体携带的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白质或由该载体携带的多核苷酸编码的微小RNA的表达。

“病毒载体”是可以能够将另一种核酸转运到细胞中的病毒来源的核酸。当病毒载体存在于适当的环境中时，它能够指导由该载体携带的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白质或由该载体携带的多核苷酸编码的微小RNA的表达。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体。

本发明提供了通过敲低多聚嘧啶串结合蛋白(PTB)将非神经元哺乳动物细胞或星形胶质细胞转化或分化为功能神经元的组合物和方法。本发明的一些方面提供了将非神经元细胞重编程为成熟神经元的方法。示例性的方法包括：提供非神经元细胞，以及使该非神经元细胞与包含抑制该非神经元细胞中PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物接触，从而将该非神经元细胞重编程为成熟神经元。该方法和组合物不仅在体外而且直接在体内在脑中转化细胞。

根据本发明的一些实施方案，当人非神经元细胞以比人成体成纤维细胞中表达的水平更高的水平表达miR-9或Brn2时，抑制人非神经元细胞中PTB的表达或活性的单一细胞编程剂可将非神经元细胞直接转化为成熟神经元。在本发明的一些实施方案中，通过单一细胞编程剂将非神经元细胞直接转化为神经元可以意味着非神经元细胞向神经元的转化不需要除了与单一细胞编程剂接触以外的干预。

示例性方法包括：提供以比人成体成纤维细胞中表达的水平更高的水平表达miR-9或Brn2的人非神经元细胞；和使人非神经元细胞与包含抑制人非神经元细胞中PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物接触，从而将人非神经元细胞重编程为成熟神经元。

根据本发明的一些实施方案，人神经胶质细胞可以比人成体成纤维细胞中表达的水平更高的水平表达miR-9或Brn2。在另一个实施方案中，本发明提供了将人神经胶质细胞重编程为成熟神经元的方法。示例性方法包括：提供待重编程的人神经胶质细胞；和使人神经胶质细胞与包含抑制人神经胶质细胞中PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物接触至少1天，从而将人神经胶质细胞重编程为成熟神经元。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种将星形胶质细胞重编程为成熟神经元的方法。示例性的方法包括：提供待重编程的星形胶质细胞；和使星形胶质细胞与包含抑制所述星形胶质细胞中PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物接触至少1天，从而将所述星形胶质细胞重编程为成熟神经元。在一些实施方案中，抑制星形胶质细胞中PTB的表达或活性的单一细胞编程剂可以将星形胶质细胞直接转化为神经元。

根据本发明，在一些情况下，PTB降低可以诱导许多关键的神经元分化因子。例如，不希望受某种理论的束缚，PTB和nPTB可能分别参与两个独立但相互交织的回路，这在神经元分化中可能是重要的。如图1所示，PTB可以抑制神经元诱导回路，其中微小RNA miR-124可以抑制转录阻遏物RE1-沉默转录因子(REST)，其进而可以阻断miR-124和许多神经元特异性基因(回路I)的诱导。在正常的神经元分化过程期间，PTB可以逐渐下调，并且PTB下调可以因此诱导nPTB的表达，这是包括转录激活因子Brn2和miR-9的神经元成熟的第二回路的一部分(图1，回路II)。如图1所示，在回路II中，nPTB可以抑制Brn2，因此可以抑制miR-9，而miR-9进而可以抑制nPTB。

根据本发明的一些实施方案，通过抑制非神经元细胞中的PTB的表达或活性的细胞编程剂，非神经元细胞中的miR-9或Brn2的表达水平可以影响非神经元细胞向成熟神经元的转化。例如，人成体成纤维细胞可以具有低表达水平的miR-9和Brn2。在一些实施方案中，抑制人成体成纤维细胞中PTB的表达或活性的单一试剂可以诱导人成体成纤维细胞分化为神经元样细胞(例如表达Tuj1蛋白)，但不分化为成熟神经元(例如，表达NeuN蛋白或成熟神经元的其他标志物)。不希望受特定理论的束缚，在一些实施方案中，主题方法和组合物在指导非神经元细胞转化为神经元的分子变化中在创建强化反馈回路方面是特别有效的。不希望受特定理论的束缚，当PTB表达或活性最初被外源性抗PTB剂下调时，REST水平可以被下调，这进而导致miR-124水平上调。不希望受特定理论的束缚，在一些情况下，如图1所示，由于miR-124可以靶向并抑制PTB的表达，因此上调的miR-124可以加强对细胞中PTB的抑制；即使在某些情况下，抗PTB试剂(例如，针对PTB的反义寡核苷酸)可能只是在细胞中暂时存在且具有活性，但这种积极的强化作用可能是持久的。

根据本发明的一些实施方案，当人非神经元细胞以比人成体成纤维细胞中表达的水平更高的水平表达miR-9或Brn2时，抑制人非神经元细胞中PTB的表达或活性的单一细胞编程剂可将非神经元细胞直接转化为成熟神经元。可以在本文提供的方法中使用的示例性人非神经元细胞以人成体成纤维细胞中表达的水平的至少两倍的水平表达miR-9或Brn2。在一些实施方案中，人非神经元细胞以人成体成纤维细胞中表达的水平的至少约1.2倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.8倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约15倍、至少约20倍或至少约50倍的水平表达miR-9或Brn2。在一些实施方案中，人非神经元细胞以人成体成纤维细胞中表达的水平的约1.2倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.8倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约5.5倍、约6倍、约6.5倍、约7倍、约7.5倍、约8倍、约8.5倍、约9倍、约9.5倍、约10倍、约11倍、约12倍、约15倍、约20倍或约50倍的水平表达miR-9或Brn2。

在一些实施方案中，当人非神经元细胞以比人成体成纤维细胞中表达的水平更高的水平表达miR-9和Brn2时，抑制人非神经元细胞中PTB的表达或活性的单一细胞编程剂可以将非神经元细胞直接转化为成熟神经元。可以在本文提供的方法中使用的示例性人非神经元细胞以人成体成纤维细胞中表达的水平的至少两倍的水平表达miR-9和Brn2。在一些实施方案中，人非神经元细胞以人成体成纤维细胞中表达的水平的至少约1.2倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.8倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约15倍、至少约20倍或至少约50倍的水平表达miR-9和Brn2。

在一些实施方案，当人非神经元细胞以比人成体成纤维细胞中表达的水平更高的水平表达内源miR-9或内源Brn2时，抑制人非神经元细胞中PTB的表达或活性的单一细胞编程剂可将非神经元细胞直接转化为成熟神经元。在一些实施方案中，没有将外源miR-9引入人非神经元细胞。在一些实施方案中，没有将外源Brn2引入人非神经元细胞。

在一些实施方案中，可以通过本领域技术人员将理解的任何技术来评估非神经元细胞中miR-9或Brn2的表达水平。例如，可以通过逆转录(RT)-聚合酶链反应(PCR)、miRNA阵列、RNA测序(RNA-seq)和多重miRNA测定来测量细胞中miR-9的表达水平。miR-9的表达水平也可以通过原位方法如原位杂交进行测定。Brn2作为蛋白质的表达水平可以通过常规技术，如蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫染色，或通过其他技术诸如但不限于蛋白质微阵列和光谱法(例如高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱(LC/MS))进行测定。在一些实施方案中，可以通过参考微小RNA的公开可获得的数据库例如但不限于人MiRNA表达数据库(HMED)、miRGator 3.0、miRmine和PhenomiR获得关于细胞或某种类型的组织/细胞中miR-9的表达水平的信息。在一些实施方案中，可以通过参考用于蛋白质表达的公开可获得的数据库，包括但不限于人蛋白质Atlas、GeMDBJ蛋白质组学、人Proteinpedia和Kahn动态蛋白质组学数据库获得关于细胞或某种类型的组织/细胞中的miR-9的表达水平的信息。

根据本发明的某些实施方案，示例性方法包括提供待重编程的人非神经元细胞；和使人非神经元细胞与包含单一细胞编程剂的组合物接触，该细胞编程剂使人非神经元细胞中PTB的表达或活性降低以及使PTB的表达或活性降低后nPTB的表达或活性降低。在一些实施方案中，所述细胞编程剂可导致关于在特定类型的非神经元细胞例如人非神经元细胞例如人神经胶质细胞中的PTB和nPTB的表达或活性水平的顺序事件。在一些实施方案中，与细胞编程剂接触的直接作用是降低非神经元细胞中PTB的表达或活性。在一些实施方案中，在非神经元细胞中，非神经元细胞中PTB的表达或活性的降低伴随着非神经元细胞中nPTB表达水平的初始增加。在一些实施方案中，随着PTB的表达或活性被抑制，初始nPTB表达水平升高至高nPTB表达水平。在一些实施方案中，在初始增加之后，nPTB表达从高nPTB表达水平降低至低nPTB表达水平。在一些实施方案中，在抑制PTB的表达或活性后，低nPTB表达水平仍高于初始nPTB表达水平。在一些实施方案中，nPTB表达水平在初始增加后自发地降低，且无需除抑制PTB的表达或活性的细胞编程剂以外的外部干预。不受特定理论的束缚，通过细胞编程剂使PTB表达或活性降低后，非神经元细胞中nPTB表达水平的随后降低可与非神经元细胞通过细胞编程剂直接转化为成熟细胞有关。根据一些实施方案，抑制PTB的表达或活性的单一细胞编程剂不诱导人成体成纤维细胞中的如上所述的顺序事件，例如，nPTB可以经历表达水平的初始增加，但是随后没有降低至某一低水平。在一些实施方案中，在人星形胶质细胞中，抑制人星形胶质细胞中PTB的表达或活性的单一细胞编程剂导致PTB的表达或活性立即降低，nPTB的表达水平的初始增加以及nPTB的表达水平随后的降低。在一些实施方案中，抑制PTB的表达或活性的单一细胞编程剂将人星形胶质细胞直接转化为成熟神经元。在一些实施方案中，非神经元细胞中miR-9或Brn2的表达水平可能与非神经元细胞中nPTB表达水平在PTB表达或活性被细胞编程剂抑制后的初始增加后是否降低相关。例如，在人星形胶质细胞中,在miR-9或Brn2以比人成体成纤维细胞更高的水平表达的情况下，在PTB的表达或活性被细胞编程剂抑制后，非神经元细胞中的nPTB表达水平在初始增加之后下降，而在人成纤维细胞中，如上所述，在一些情况下，nPTB的表达水平可能不会随之下降。

根据本发明的一些实施方案，可以在本文提供的方法中重编程为成熟神经元的示例性非神经元细胞可以包括神经胶质细胞，例如但不限于星形胶质细胞、少突细胞、室管膜细胞、许旺氏细胞、NG2细胞和卫星细胞。在一些实施方案中，神经胶质细胞可以是人神经胶质细胞，例如人星形胶质细胞。在一些实施方案中，神经胶质细胞可以是小鼠神经胶质细胞。在一些实施方案中，神经胶质细胞可以是来自任何其他哺乳动物例如但不限于非人灵长类动物、猪、狗、驴、马、大鼠、兔和骆驼的神经胶质细胞。

在一些实施方案中，可用于本文提供的方法中的神经胶质细胞是从脑分离的神经胶质细胞。在一些实施方案中，神经胶质细胞是细胞培养物中的神经胶质细胞，例如，从亲代神经胶质细胞分离的。在一些实施方案中，本文提供的神经胶质细胞是在外部诱导下从不同类型的细胞分化的神经胶质细胞，例如，从含有分化因子的培养基中的神经干细胞体外分化的神经胶质细胞，或从诱导的多能干细胞分化的神经胶质细胞。在其他一些实施方案中，神经胶质细胞是神经系统中的神经胶质细胞，例如驻留在脑区域中的星形胶质细胞。

在一些实施方案中，可用于本文提供的方法中的星形胶质细胞是脑或脊髓中星形的神经胶质细胞。在一些实施方案中，星形胶质细胞表达一种或多种公认的星形胶质细胞标志物，包括但不限于神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和醛脱氢酶1家族成员L1(ALDH1L1)、兴奋性氨基酸转运体1/谷氨酸天门冬氨酸转运体(EAAT1/GLAST)、谷氨酰胺合成酶、S100β或兴奋性氨基酸转运体1/谷氨酸转运体1(EAAT2/GLT-1)。在一些实施方案中，星形胶质细胞表达神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、醛脱氢酶1家族成员L1(ALDH1L1)或两者。在某些实施方案中，星形胶质细胞是神经系统中的非神经元细胞，其表达神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子驱动的转基因(例如，红色荧光蛋白(RFP)、Cre重组酶)。在一些实施方案中，本文所述的星形胶质细胞对神经元标志物(例如Tuj1、NSE、NeuN、GAD67、VGluT1或TH)不是免疫阳性的。在一些实施方案中，本文所述的星形胶质细胞对少突细胞标志物(例如少突细胞转录因子2，OLIG2)不是免疫阳性的。在一些实施方案中，如本文所述的星形胶质细胞对小神经胶质标志物(例如，跨膜蛋白119(TMEM119)、CD45、离子化钙结合衔接子分子1(Iba1)、CD68、CD40、F4/80或CD11抗原样家庭成员B(CD11b))不是免疫阳性的。在一些实施方案中，本文所述的星形胶质细胞对NG2细胞标志物(例如，神经/神经胶质抗原2，NG2)不是免疫阳性的。在一些实施方案中，本文所述的星形胶质细胞对神经祖细胞标志物(例如巢蛋白、CXCR4、Musashi、Notch-1、SRY-Box 1(SOX1)、SRY-Box 2(SOX2)、阶段特异性胚胎抗原1(SSEA-1，也称为CD15)或波形蛋白)不是免疫阳性的。在一些实施方案中，本文所述的星形胶质细胞对多能性标志物(例如NANOG、八聚体结合转录因子4(Oct-4)、SOX2、Kruppel样因子4(KLF4)、SSEA-1或阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4))不是免疫阳性的。在一些实施方案中，本文所述的星形胶质细胞对成纤维细胞标志物(例如纤连蛋白)不是免疫阳性的。

星形胶质细胞可以包括不同类型或分类。根据本发明的方法，适用于不同类型的星形胶质细胞。不同类型的星形胶质细胞的非限制性实例包括1型星形胶质细胞，其可以是Ran2

如本文所提供的，细胞编程剂将PTB的表达或活性抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％。至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的内源或天然水平。如本文所提供，细胞编程剂将PTB的表达或活性抑制约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的内源或天然水平。在一些实施方案中，本文提供的细胞编程剂直接抑制PTB的表达水平，例如抑制PTB的转录、翻译或蛋白质稳定性。在一些实施方案中，本文提供的细胞编程剂直接抑制PTB的活性，例如阻断PTB与其靶分子的结合。在一些实施方案中，本文提供的细胞编程剂直接影响PTB的表达或活性，而不影响其他细胞信号传导通路。在一些实施方案中，本文提供的细胞编程剂不通过抑制或上调另一种蛋白质或微小RNA例如miR-124、miR-9或Brn2的表达或活性水平来抑制PTB的表达或活性。

如本文所提供的，抑制PTB的表达或活性的细胞编程剂可以是抑制或消除PTB的蛋白表达或蛋白活性的任何类型的试剂。在一些实施方案中，细胞编程剂可以是被配置为抑制PTB的表达或活性的小化学分子、干扰RNA、短发夹RNA、微小RNA、显性负PTB、海绵多核苷酸、核酶、反义寡核苷酸、单克隆抗体或多克隆抗体。

PTB的小化学分子抑制剂可以是有机或无机化合物。如本文所用，“小分子”可以指分子量低于约3,000道尔顿的有机或无机小分子。小分子可以是天然产物或合成产物。PTB的小分子抑制剂可以具有基于PTB的活性片段的结构。例如，本领域已知的计算机建模方法可用于合理设计具有类似于PTB的活性片段的结构(例如RNA-结合基序(例如1、2、3、4或更多个不同的RNA-结合基序))的分子。

RNA干扰可用于降低靶基因PTB的表达水平。如本文所提供的，该方法可以包括使用RNA干扰来抑制非神经元细胞中的PTB的表达。据信在首先经受称为DICER的RNase E样酶(Bernstein等人,Nature 409:363,2001)加工成由两个21nt链(每条链均具有5'磷酸酯基和3'羟基并包含与另一链精确互补的19nt区域，因此存在19nt双链体区域，侧翼为2nt-3'突出端)组成的较小dsRNA分子之后，dsRNA分子指导各种类型细胞中mRNA的序列特异性降解。因此，RNAi可以由短干扰RNA(siRNA)介导，该siRNA通常包含一个双链区，其长度约为19个核苷酸，每条链上有1-2个核苷酸的3'突出端，导致总长约为21-23个核苷酸。

可用于本文提供的方法中的短干扰RNA(siRNA)可包含长约19个碱基对的RNA双链体，并任选地还包含一个或两个单链突出端或环，导致总长为约21-23个核苷酸。siRNA可包含两条杂交在一起的RNA链，或可替代地包含含有自杂交部分的单一RNA链。siRNA可以包括一个或多个自由链末端，其可以包括磷酸酯和/或羟基。siRNA通常可以包括在严格条件下与靶转录物杂交的部分。siRNA的一条链(或siRNA的自杂交部分)可以与靶转录物(例如PTBmRNA转录物)的区域精确互补，这意味着siRNA与靶转录物杂交且没有单个错配。在某些实施方案中，没有实现完美的互补。在一些实施方案中，错配位于siRNA末端处或附近。

如本文所用，siRNA还包括可以在体内加工以产生此类分子的各种RNA结构(例如，短发夹RNA(shRNA))。shRNA可以包括含有两个互补元件的RNA链，所述两个互补元件彼此杂交以形成茎、环和任选的突出端，例如3'突出端。茎可以长约19bp，环长约1-20，例如约4-10和约6-8nt，和/或突出端长约1-20，例如约2-15nt。在某些实施方案中，茎的长度可以最小为19个核苷酸，并且长度可以高达约29个核苷酸。本文提供的经典siRNA可以触发它们靶向的mRNA(例如PTB mRNA转录物)的降解，从而也降低了蛋白质合成的速度。在一些实施方案中，与PTB mRNA转录物的3'UTR结合的某些siRNA(例如，微小RNA)可以通过与经典RNA干扰有关但不同于经典RNA干扰的机制(例如，通过降低转录物的翻译，而不是降低其稳定性)抑制模板转录物编码的蛋白质的表达。微小RNA的长度可以为约20至26个核苷酸，例如长为22nt。微小RNA可用于使靶转录物不稳定和/或阻断其翻译(例如PTB表达)。

通过转染或病毒介导的感染，将包含编码特定所需siRNA序列的DNA序列的质粒递送至靶细胞中。一旦进入细胞，该DNA序列就被连续转录为RNA分子，所述RNA分子自我成环并通过分子内碱基配对形成发夹结构。这些发夹结构一旦被细胞加工，就相当于转染的siRNA分子，并被细胞用于介导所需蛋白质的RNAi。shRNA的使用优于siRNA转染，因为前者可导致稳定、长期的蛋白质表达的抑制。转染的siRNA的蛋白质表达的抑制是一种短暂的现象，在超过几天的时期就不会发生。在一些情况下，这是优选的且理想的。如果需要较长时间的蛋白质抑制，则shRNA介导的抑制是优选的。短发夹RNA(shRNA)可以由茎-环结构组成，所述茎-环结构可以设计为包含5'侧翼区域、siRNA区域片段、环区域、3'siRNA区域和3'侧翼区域。shRNA可以有效敲低靶序列。

具有与部分或全部靶RNA转录物(例如，PTB mRNA转录物)互补的碱基序列的海绵多核苷酸也可以在本文提供的方法中使用。例如，海绵多核苷酸可以包含多聚嘧啶串。海绵多核苷酸可用于“捕获”PTB mRNA转录物，从而阻断其被正常剪接、翻译或转运，从而可降低PTB蛋白的表达水平。

在一些实施方案中，细胞编程剂可以是可以抑制PTB分子活性的显性负突变体。显性负突变体可以是抑制PTB分子活性的肽或模拟肽，或DNA载体或基因治疗载体形式的核酸组合物，其表达可抑制PTB的活性的显性负多肽。显性负突变体可以与靶RNA或PTB的配体结合，影响其靶相互作用。显性负分子可以例如通过阻断蛋白质-蛋白质相互作用或蛋白质-RNA相互作用而起作用。

多肽模拟物组合物可包含非天然结构组分的任何组合，其通常来自三个结构基团：a)除天然酰胺键(“肽键”)连接以外的残基连接基团；b)代替天然存在的氨基酸残基的非天然残基；或c)诱导二级结构模仿(例如，诱导或稳定二级结构，例如β转向、γ转向、β折叠、α螺旋构象等)的残基。各个拟肽残基可通过肽键、其他化学键或偶联方式(例如戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双官能马来酰亚胺、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)或N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC))连接。可以替代传统酰胺键(“肽键”)连接的连接基团包括，例如，酮亚甲基(例如，对于—C(═O)—NH—的———C(═O)—CH

细胞编程剂的另一个非限制性实例可以是抗PTB抗体。抗PTB抗体可以是特异性结合PTB的多克隆抗体或单克隆抗体。本文所用的抗PTB抗体可以在其活性片段或非活性片段处结合PTB。在一些构型中，与PTB的活性片段结合的抗PTB抗体可以阻断PTB与其功能性靶标(例如靶标RNA转录物)或配偶体(例如蛋白质配体)相互作用，从而抑制PTB的活性。在其他构型中，在一些情况下与PTB的无活性片段结合的抗PTB抗体可诱导PTB聚集，从而将PTB固定在细胞内，阻止其重定位以与其靶标或配偶体相互作用。在一些情况下，抗PTB抗体由于与抗体结合，也可以诱导PTB的蛋白质降解。

反义核酸(例如，DNA、RNA、修饰的DNA或修饰的RNA)通常是与靶核酸(例如，PTBmRNA转录物)的一部分互补的单链核酸，因此能够与靶结合以形成双链。抗PTB反义核苷酸可以被配置为抑制例如细胞中的PTB的表达或活性。反义寡核苷酸(ASO)可与靶mRNA配对以使RNA成为核内酶RNase H切割的底物。在一些实施方案中，反义寡核苷酸在注射入脑脊液之后可介导神经系统(例如啮齿动物和非人灵长类神经系统)中的靶mRNA降解约3个月。如本文所提供的，可用于本文所提供的方法中的反义寡核苷酸通常是长度范围为15至35个核苷酸的寡核苷酸，但长度范围也可以为10个直至约50个核苷酸。结合可降低或抑制靶PTB核酸的功能。例如，反义寡核苷酸可以当与基因组DNA(例如PTB基因)结合时阻断转录，当与mRNA(如PTB mRNA转录物)结合时可抑制翻译，和/或导致核酸降解。PTB表达降低可以通过施用包含与编码多肽的mRNA的序列互补的序列的反义核酸或肽核酸来实现。反义技术及其应用是现有技术中已知的并且描述于Phillips,M.I.(编)Antisense Technology,MethodsEnzymol.,313和314:2000和其中提及的参考文献。也参见Crooke,S.“ANTISENSE DRUGTECHNOLOGY:PRINCIPLES,STRATEGIES,AND APPLICATIONS”(第1版)Marcel Dekker；和其中引用的参考文献。

在一些实施方案中，如本文所提供的反义寡核苷酸可以包含锁定核酸(LNA)。在一些实施方案中，所述LNA是指修饰的RNA核苷酸，其中核糖部分被连接2'氧和4'碳的额外桥修饰，并且该桥将核糖“锁定”在3'-内(North)构象中。在一些实施方案中，LNA在任何需要的时候与寡核苷酸中的DNA或RNA残基混合，并根据Watson-Crick碱基配对规则与DNA或RNA杂交。锁定的核糖构象可以增强碱基堆积和骨架预组织。在一些实施方案中，在如本文所提供的寡核苷酸中包含LNA，增加寡核苷酸的杂交特性(解链温度)。在一些情况下，LNA的包含阻断靶mRNA的翻译，但不会诱导被mRNA的降解。使用LNA的示例性技术和应用可以见于PCT/US2013/047157和Campbell MA等人,Chem.Soc.Rev.,40(12),5680-9，其通过引用全文并入本文。

如本文所提供的细胞编程剂还可包括可催化RNA分子的序列特异性切割的核酶或脱氧核酶。通过RNA或DNA酶中的核苷酸与靶RNA(例如，PTB mRNA转录物)中的核苷酸的互补配对来确定切割位点。因此，可以将RNA和DNA酶设计为切割PTB mRNA转录物，从而提高其降解速度。

如本文所提供的，取决于待重编程的非神经元细胞的类型、非神经元细胞所处的环境、细胞编程剂的类型以及所需的细胞重编程结果，可以以任何合适的方式使非神经元细胞与细胞编程剂接触。在一些实施方案中，鉴于细胞编程剂本身表现出细胞膜穿透能力，将细胞编程剂例如PTB的小分子抑制剂或反义寡核苷酸直接施用于非神经元细胞。在一些实施方案中，以表达所需细胞编程剂的核酸载体的形式引入细胞编程剂，例如shRNA、抗体或显性负突变体。在这些配置中，利用非病毒转染方法或病毒转导方法来引入细胞编程剂。非病毒转染可以指未通过病毒介导的所有细胞转染方法。非病毒转染的非限制性实例包括电穿孔、显微注射、磷酸钙沉淀、用阳离子聚合物(例如DEAE-葡聚糖，然后是聚乙二醇)转染、用树状聚合物转染、脂质体介导的转染(“lipofection”)、微粒轰击(“基因枪”)、fugene、直接声波加载、细胞挤压、光学转染、原生质体融合、不完整转染(impalefection)、磁转染、核转染及其任意组合。在一些实施方案中，本文提供的方法利用病毒载体作为用于将细胞编程剂递送至非神经元细胞的合适介质。合适的病毒载体的例子可以包括腺病毒、慢病毒、腺相关病毒(AAV)、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)或鼠科马洛尼基病毒载体。在一些实施方案中，载体是AAV载体。如本文提供的，病毒载体方法可包括使用DNA或RNA病毒载体。在一些实施方案中，细胞编程剂以AAV载体的形式施用。在一些实施方案中，以慢病毒载体的形式施用细胞编程剂。例如，可使用慢病毒或腺病毒相关病毒(AAV)将细胞编程剂递送至非神经元细胞，以表达针对PTB的shRNA。

根据本发明的一些实施方案，本文提供的方法包括经由足够量的细胞编程剂抑制非神经元细胞中PTB的表达或活性以将非神经元细胞重编程为成熟神经元。如本领域技术人员将容易理解的，可以根据经验确定细胞编程剂的足够量。在一些实施方案中，可以通过检查非神经元细胞中细胞编程剂的活性的任何类型的测定来确定细胞编程剂的量。例如，当将细胞编程剂配置为抑制非神经元细胞中PTB的表达时，可以通过评估施用细胞编程剂后示例性非神经元细胞中PTB的表达水平(例如通过蛋白质印迹)来确定细胞编程剂的足够量。在一些实施方案中，利用功能测定法评估细胞编程剂递送至示例性非神经元细胞后PTB的活性。在一些实施方案中，检查下游神经元特性的其他功能测定如针对神经元标志物的免疫染色、针对神经元功能特性的电记录用于确定细胞编程因子的足够量。在一些实施方案中，细胞编程剂以病毒载体的形式递送。病毒载体可包含一个或多个拷贝(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50或100拷贝)的编码细胞编程剂的表达序列，例如shRNA、微小RNA、显性负突变体或抗体。如本领域技术人员将能够确定的，可以将病毒载体滴定至用于施用的任何合适的量。例如，通过PCR、RT-PCR或其他方法确定的滴度可以是至少约10

本文提供的方法可以包括在足以将非神经元细胞重编程为成熟神经元的一定时期内抑制非神经元细胞中的PTB的表达或活性。在一些实施方案中，示例性方法包括使非神经元细胞与抑制非神经元细胞中PTB的表达或活性的细胞编程剂接触至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少3周、至少4周、至少5周、至少2个月、至少3个月、至少4个月或至少5个月，从而将非神经元细胞重编程为成熟神经元。在一些实施方案中，示例性方法包括使非神经元细胞与抑制非神经元细胞中PTB的表达或活性的细胞编程剂接触约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约3周、约4周、约5周、约2个月、约3个月、约4个月或约5个月，从而将非神经元细胞重编程为成熟神经元。在一些实施方案中，示例性方法包括使非神经元细胞与抑制非神经元细胞中PTB的表达或活性的细胞编程剂接触至多2天、至多3天、至多4天、至多5天、至多6天、至多7天、至多8天、至多9天、至多10天、至多11天、至多12天、至多13天、至多14天、至多15天、至多3周、至多4周、至多5周、至多2个月、至多3个月、至多4个月或至多5个月，从而将非神经元细胞重编程为成熟神经元。在一些配置中，本文提供的方法包括仅施用细胞编程剂一次，例如，将细胞编程剂添加到包含非神经元细胞的细胞培养物中或将细胞编程剂递送到包含非神经元细胞的脑区域仅一次，并且细胞编程剂可以在抑制非神经元细胞中PTB的表达或活性的过程中保持活性所需的时间量，例如至少1天、至少2天、至少4天或至少10天。例如，当细胞编程剂包含表达抗PTB shRNA的AAV载体时，AAV载体的设计可以使其在很长一段时间内保持转录活性。在一些实施方案中，本文提供的方法包括施用细胞编程剂一次以上，例如至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次、至少12次、至少15次、至少20次或更多次。

如本文提供的方法可以包括在合适的培养条件下体外将非神经元细胞重编程为神经元。本领域技术人员将理解，可以选择适当的细胞培养条件以促进神经元生长。在一些实施方案中，可以在培养基中提供各种因子以维持非神经元细胞(所述细胞经历重编程)和重编程的神经元的存活。能够支持细胞生长的任何已知培养基可以被使用并被优化以获得期望的结果。培养基可以包括HEM、DMEM、RPMI、F-12等。培养基可以包含对于细胞代谢重要的补充物，例如谷氨酰胺或其他氨基酸、维生素、矿物质或有用的蛋白质，例如转铁蛋白等。培养基还可以包含抗生素例如青霉素、链霉素、庆大霉素等以防止被酵母、细菌和真菌污染。在一些情况下，培养基可以包含源自牛、马、鸡等的血清。用于作为起始细胞的星形胶质细胞的示例性培养基可包括DMEM/F12、FBS、青霉素/链霉素、B27、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子2(FGF2)。在一些情况下，在重编程和/或维持重编程的神经元期间使用神经元分化培养基。在一些情况下，神经元分化培养基包含ALK5(TGFβI型受体激酶)的抑制剂，例如SB431542、A-77-01、ALK5的抑制剂II、RepSox、SB525334、GW788388、SD-208、LY215729或LY364947。在某些情况下，神经元分化培养基包含GSK3b(糖原合酶激酶3β)的抑制剂，例如CHIR99021、IM-12、TWS119、BIO、3F8、AR-A014418、AT9283或2-硫代(3-碘苄基)-5-(1-吡啶基)-[1,3,4]-噁二唑。在一些情况下，神经元分化培养基包含PKA(蛋白激酶A)的活化剂，例如联丁酰基-cAMP(环状单磷酸腺苷)、8-溴-cAMP、8-CPT-cAMP、紫杉醇、贝利司他或Sp-cAMPs。示例性的神经元分化培养基包括N3/基础培养基，其包含DMEM/F12、Neurobasal、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、黄体酮、腐胺，其补充有B27、FBS，ChIR99021、SB431542和Db-cAMP和/或神经营养因子，如BDNF、GDNF、NT3和CNTF。

根据本发明的一些实施方案，本文提供的方法包括以高效率将多个非神经元细胞重编程为成熟神经元。

在一些实施方案中，该方法包括将小鼠星形胶质细胞重编程为成熟神经元，并且至少60％的小鼠星形胶质细胞被转化为Tuj1阳性的成熟神经元。在一些实施方案中，至少40％的小鼠星形胶质细胞被转化为Map2阳性的成熟神经元。在一些实施方案中，至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约38％、至少约40％、至少约42％、至少约44％、至少约46％、至少约48％、至少约50％、至少约52％、至少约54％、至少约56％、至少约58％、至少约60％、至少约62％、至少约64％、至少约66％、至少约68％、至少约70％、至少约72％、至少约74％、至少约76％、至少约78％、至少约80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％、至少约98％、至少约99％或100％的小鼠星形胶质细胞被转化为Tuj1或Map2阳性的成熟神经元。

在一些实施方案中，该方法包括将人星形胶质细胞重编程为成熟神经元，并且至少40％、至少60％或至少80％的人星形胶质细胞被转化为Tuj1阳性的成熟神经元。在一些实施方案中，至少20％、至少40％或至少60％的人星形胶质细胞被转化为Map2阳性的成熟神经元。在一些实施方案中，至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约38％、至少约40％、至少约42％、至少约44％、至少约46％、至少约48％、至少约50％、至少约52％、至少约54％、至少约56％、至少约58％、至少约60％、至少约62％、至少约64％、至少约66％、至少约68％、至少约70％、至少约72％、至少约74％、至少约76％、至少约78％、至少约80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％、至少约98％、至少约99％或约100％的人星形胶质细胞被转化为Tuj1或Map2阳性的成熟神经元。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括对多个非神经元细胞(例如人非神经元细胞，例如人神经胶质细胞或星形胶质细胞)进行重编程，且至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约38％、至少约40％、至少约42％、至少约44％、至少约46％、至少约48％、至少约50％、至少约52％、至少约54％、至少约56％、至少约58％、至少约60％、至少约62％、至少约64％、至少约66％、至少约68％、至少约70％、至少约72％、至少约74％、至少约76％、至少约78％、至少约80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％、至少约98％、或至少约99％的非神经元细胞，例如人非神经元细胞，例如人神经胶质细胞或星形胶质细胞被重编程为成熟神经元。在一些实施方案中，本文提供的方法将约20％、约25％、约30％、约35％、约38％、约40％、约42％、约44％、约46％、约48％、约50％、约52％、约54％、约56％、约58％、约60％、约62％、约64％、约66％、约68％、约70％、约72％、约74％、约76％、约78％、约80％、约82％、约84％、约86％、约88％、约90％、约92％、约94％、约96％、约98％、约99％或约100％的非神经元细胞(例如人非神经元细胞，例如人神经胶质细胞或星形胶质细胞)重编程为成熟神经元。

在一些实施方案中，成熟神经元的特征在于其表达选自由以下组成的组的一种或多种神经元标志物：NeuN(神经元核抗原)、Map2(微管相关蛋白2)、NSE(神经元特异性烯醇酶)、160kDa中等神经丝、200kDa重神经丝、PDS-95(突触后密度蛋白95)、突触蛋白I、突触泡蛋白、GAD67(谷氨酸脱羧酶67)、GAD65(谷氨酸脱羧酶67)、小清蛋白、DARPP32(多巴胺-和cAMP-调节的神经磷蛋白32)、vGLUT1(囊泡谷氨酸转运体1)、vGLUT2(囊泡谷氨酸转运体1)、乙酰胆碱、囊泡GABA转运体(VGAT)和γ-氨基丁酸(GABA)和TH(酪氨酸羟化酶)。在一些实施方案中，至少40％的非神经元细胞，例如人非神经元细胞，例如人神经胶质细胞或星形胶质细胞被重编程为成熟神经元。

如本领域普通技术人员将容易理解的，以上所有那些标志物的表达可以通过任何常用技术来评估。例如，如本文所述，使用针对特定细胞类型标志物的抗体进行的免疫染色可揭示感兴趣的细胞是否表达相应的细胞类型标志物。在某些条件下进行免疫染色还可以发现细胞类型标志物的亚细胞分布，这对于确定感兴趣的细胞的发育阶段也是重要的。例如，可以在有丝分裂期后成熟神经元中的各种神经突(例如树突)中发现Map2的表达，但是在神经元的轴突中没有发现。电压门控钠通道(例如，α亚基Nav1.1–1.9)和β亚基的表达可以是另一个例子，它们可以聚集在成熟神经元中的轴突始段(在此处动作电位可以被启动)以及郎飞氏结中。在一些实施方案中，其他技术例如但不限于，流式细胞术、质谱、原位杂交、RT-PCR和微阵列，也可以用于评估本文所述的特定细胞类型标志物的表达。

本发明的某些方面提供了包括对多个非神经元细胞进行重编程，且至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约38％、至少约40％、至少约42％、至少约44％、至少约46％、至少约48％、至少约50％、至少约52％、至少约54％、至少约56％、至少约58％、至少约60％、至少约62％、至少约64％、至少约66％、至少约68％、至少约70％、至少约72％、至少约74％、至少约76％、至少约78％、至少约80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％、至少约98％或至少约99％的非神经元细胞、例如人非神经元细胞，例如人神经胶质细胞或星形胶质细胞重编程为功能神经元的方法。在一些实施方案中，本文提供的方法将至少20％的非神经元细胞，例如人非神经元细胞，例如人神经胶质细胞或星形胶质细胞重编程为功能神经元。在一些实施方案中，本文提供的方法将约20％、约25％、约30％、约35％、约38％、约40％、约42％、约44％、约46％、约48％、约50％、约52％、约54％、约56％、约58％、约60％、约62％、约64％、约66％、约68％、约70％、约72％、约74％、约76％、约78％、约80％、约82％、约84％、约86％、约88％、约90％、约92％、约94％、约96％、约98％、约99％或约100％的非神经元细胞，例如人非神经元细胞，例如人神经胶质细胞或星形胶质细胞重编程为功能神经元。

在一些实施方案中，功能神经元的特征在于其形成神经元网络、发送和接收神经元信号或两者的能力。在一些实施方案中，功能神经元激发动作电位。在一些实施方案中，功能神经元建立与其他神经元的突触连接。例如，功能神经元可以是突触中的突触后神经元，例如具有与另一神经元形成突触中的突触后区室的其树突末端(例如树突棘)。例如，功能神经元可以是突触中的突触前神经元，例如具有与另一神经元形成突触中的突触前末端的轴突端。功能神经元可与另一神经元形成的突触可包括但不限于轴-轴突触、轴-树突触、和轴-体突触。功能神经元可与另一神经元形成的突触可以是兴奋性的(例如，谷氨酸能的)、抑制性的(例如，GABA能的)、调节性的或它们的任何组合。在一些实施方案中，功能神经元与另一神经元形成的突触是谷氨酸能的、GABA能的、胆碱能的、肾上腺素能的、多巴胺能的或任何其他合适的类型。作为突触前神经元，功能神经元可以释放神经递质，例如但不限于谷氨酸、GABA、乙酰胆碱、天门冬氨酸、D-丝氨酸、甘氨酸、一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)、硫化氢(H

功能神经元的特征可以通过本领域技术人员可用的常规技术来评估。例如，可以通过诸如膜片钳记录(例如电流钳和电压钳记录)、细胞内记录和细胞外记录(例如四极记录、单线记录和场电位记录)的技术来检查功能神经元的电特性，例如激发动作电位和对神经递质释放的突触后反应。也可以通过膜片钳记录来检查功能神经元的特定特性(例如，离子通道的表达和静息膜电位)，其中膜片钳记录的不同变体可以用于不同的目的，例如细胞贴附式膜片、内面向外式膜片、外面向外膜片、全细胞记录、穿孔膜片、散膜片。通过电学方法的突触后反应的评估可与电刺激突触前神经元、应用神经递质或受体激动剂或拮抗剂相结合。在一些情况下，可以通过AMPA受体激动剂(例如AMPA)或拮抗剂(例如2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并喹喔啉(NBQX)或6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX))来评估AMPA型谷氨酸受体介导的突触后电流。在一些情况下，可以通过NMDA受体激动剂，例如NMDA和甘氨酸，或拮抗剂，例如AP5和氯胺酮来评估NMDA型谷氨酸受体介导的突触后电流。在一些实施方案中，通过除电学方法以外的技术检查功能神经元。例如，各种荧光染料或遗传编码的荧光蛋白和成像技术的最新开发可用于监测功能神经元传递或传输的电信号。在本文中，钙依赖性荧光染料(例如，钙指示剂)例如但不限于，fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4和钙绿-1以及钙依赖性的荧光蛋白例如但不限于Cameleons、FIP-CBSM、Pericams、GCaMP、TN-L15、TN-humTnC、TN-XL、TN-XXL和Twitch，作为神经细胞膜电位的指示剂，可用于追踪钙的流入和流出。替代地或附加地，可以响应于电压变化而改变其光谱特性的电压敏感染料也可以用于监测神经元活动。

神经递质的释放可以是功能神经元的重要方面。本文提供的方法可包括将非神经元细胞重编程为释放某种类型的神经递质的功能神经元。在一些实施方案中，功能神经元释放神经递质，例如但不限于谷氨酸、GABA、乙酰胆碱、天门冬氨酸、D-丝氨酸、甘氨酸、一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)、硫化氢(H

在一方面，本发明提供了在体内产生功能神经元的方法。示例性方法包括向受试者的神经系统例如脑或脊髓中的区域施用包含神经系统、例如脑或脊髓中的区域中的非神经元细胞中的细胞编程剂的组合物，并允许非神经元细胞重编程为功能神经元。在一些实施方案中，细胞编程剂抑制PTB的表达或活性。在一些实施方案中，细胞编程剂不包含NeuroD1蛋白或编码NeuroD1的表达构建体。

根据本发明的一些实施方案，本文提供的方法包括向受试者的神经系统例如脑或脊髓中的区域直接施用细胞编程剂。在一些实施方案中，细胞编程剂被局部递送至神经系统中的区域。在一个实施方案中，通过向脑区域的立体定向或对流增强递送，向受试者或生物体施用包含细胞编程剂，例如但不限于病毒载体、反义寡核苷酸、小分子抑制剂或表达盒的组合物。使用立体定位系统，本领域技术人员将能够定位待用包含细胞编程剂的组合物施用的特定脑区域。这样的方法和装置可以容易地用于将本文提供的组合物递送至受试者或生物体。在另一个实施方案中，将本文提供的组合物全身递送至受试者或受试者的神经系统、例如脑或脊髓中的区域，例如递送至脑脊髓液或脑室，并且该组合物包含一种或多种被配置为将细胞编程剂重定位至受试者的神经系统中的特定区域或受试者的神经系统中的特定类型细胞的试剂。

在一些实施方案中，本文提供的方法中使用的细胞编程剂包含表达抗PTB shRNA、抗PTB微小RNA、显性负PTB突变体或含有多聚嘧啶串的海绵多核糖核苷酸的病毒，且该方法包括将病毒立体定位注射到所需的脑区域中。在一些实施方案中，该病毒包括腺病毒、慢病毒、腺相关病毒(AAV)、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)或鼠科马洛尼基病毒。可以在本文提供的方法中使用的AAV可以是任何合适的血清型的AAV，例如但不限于AAV2、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8。在一些实施方案中，所述方法包括递送基于AAV2的病毒载体，所述病毒载体表达抑制神经系统、例如脑或脊髓中的区域中的非神经元细胞中的PTB的表达或活性的试剂。在一些实施方案中，该细胞编程剂包含PTB的小分子抑制剂。

如上所述，在一些实施方案中，本文提供的方法包括将各种非神经元细胞重编程为成熟神经元。在一些实施方案中，本文提供的方法包括向受试者的神经系统(例如脑或脊髓)中的区域，施用包含抑制神经系统中的各种非神经元细胞(例如但不限于神经胶质细胞，例如星形胶质细胞、少突细胞、NG2细胞、卫星细胞或室管膜细胞)中的PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物，并允许非神经元细胞重编程为功能神经元。在一些实施方案中，本文提供的方法包括将受试者的神经系统、例如脑或脊髓中的区域中的星形胶质细胞重编程为功能神经元。

如上所讨论，本文提供的方法可以包括将特定脑区域中的非神经元细胞重编程为功能神经元。可以在本文提供的方法中使用的示例性脑区域可以位于后脑、中脑或前脑中的任何一个中。在一些实施方案中，本文提供的方法包括向受试者的中脑、纹状体或皮层施用包含抑制中脑中的非神经元细胞中的PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物，并允许非神经元细胞重编程为功能神经元。在一些实施方案中，本文提供的方法包括向受试者的中脑施用包含抑制中脑中的非神经元细胞中的PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物，并允许非神经元细胞重编程为功能神经元。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括将脑区域中的非神经元细胞重编程为功能神经元，所述脑区域例如但不限于延髓、延髓锥体、橄榄状体、下橄榄核、延髓头端腹外侧、延髓尾端腹外侧、孤束核、呼吸中枢-呼吸组、背侧呼吸组、腹侧呼吸组或长吸中枢、前包钦格复合体(pre-

在一个方面，本发明提供了在体内产生多巴胺能神经元的方法。示例性的方法包括向受试者的脑施用包含抑制脑中非神经元细胞中的PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物，以及使该非神经元细胞重编程为多巴胺能神经元。在一些实施方案中，所述方法包括将所述组合物施用于所述受试者的中脑，以产生多巴胺能神经元。在一些实施方案中，将组合物施用于黑质(SN)中。在一些实施方案中，将组合物施用于腹侧被盖区(VTA)。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括向受试者的神经系统(例如脑或脊髓)中的区域施用包含抑制该区域中的非神经元细胞中的PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物，以及允许非神经元细胞重编程为该区域中的主要的亚型的功能神经元。不受特定理论的束缚，当在体内将非神经元细胞重编程为功能神经元时，本文提供的方法可以利用例如特定脑区域的区域中的局部诱导信号。例如，多巴胺神经元聚集在中脑区域，例如，黑质(SN)、腹侧被盖区(VTA)或红核后区(RRF)。局部神经元，非神经元细胞(例如星形胶质细胞，小神经胶质或两者)或中脑的其他局部成分可有助于由非神经元细胞在细胞编程剂的诱导下生成的神经元的亚型规范。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括向受试者的脑区域施用包含抑制所述脑区域中的多个非神经元细胞中的PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物，且该方法还包括将至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约38％、至少约40％、至少约42％、至少约44％、至少约46％、至少约48％、至少约50％、至少约52％、至少约54％、至少约56％、至少约58％、至少约60％、至少约62％、至少约64％、至少约66％、至少约68％、至少约70％、至少约72％、至少约74％、至少约76％、至少约78％、至少约80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％、至少约98％或至少约99％的非神经元细胞重编程为多巴胺能神经元。在一些实施方案中，本文提供的方法包括将包含抑制脑区域中的多个非神经元细胞中的PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物施用于受试者的脑区域，且至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约38％、至少约40％、至少约42％、至少约44％、至少约46％、至少约48％、至少约50％、至少约52％、至少约54％、至少约56％、至少约58％、至少约60％、至少约62％、至少约64％、至少约66％、至少约68％、至少约70％、至少约72％、至少约74％、至少约76％、至少约78％、至少约80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％、至少约98％、或至少约99％由所述方法产生的功能神经元是多巴胺能的。在一些实施方案中，在本文提供的方法中产生的多巴胺能神经元表达一种或多种多巴胺能神经元的标志物，所述标志物包括但不限于多巴胺、酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运体(DAT)、囊泡单胺转运体2(VMAT2)、锯齿形同源盒1(En1)、核受体相关1(Nurr1)、G蛋白调节的内向整流钾通道2(Girk2)、叉头盒A2(FoxA2)、锯齿形同源盒2(OTX2)和/或LIM同源盒转录因子1α(Lmx1α)。在一些实施方案中，在本文提供的方法中产生的多巴胺神经元表现出I

根据本发明的一些实施方案，本文提供的方法包括将受试者的神经系统(例如脑或脊髓)的区域中的非神经元细胞重编程为功能神经元。在一些实施方案中，如本文讨论的功能神经元被整合到神经系统中的神经网络中。如本文所述，重编程的功能神经元可与局部神经元(例如与重编程的功能神经元相邻的神经元)形成突触连接。例如，随着重编程的神经元在体内成熟，可以形成重编程的神经元和邻近的初级神经元(例如，谷氨酸能神经元)、GABA能中间神经元或其他邻近的神经元(例如，多巴胺能神经元、肾上腺素能神经元或胆碱能神经元)之间的突触连接。在与局部神经元的这些突触连接中，重编程的功能神经元可以是突触前神经元、突触后神经元或两者。在一些实施方案中，重编程的功能神经元将轴突投射发送到远端脑区域。例如，根据本文的一些实施方案产生的中脑区域中的多巴胺能神经元可以投射到纹状体，所述纹状体是来自中脑区域的天然多巴胺能神经元的常规靶标。根据本文的一些实施方案产生的中脑区域中的多巴胺能神经元可投射到尾状壳核、伏核、中隔核、嗅结节或其任何组合。根据本文的一些实施方案产生的中脑区域中的多巴胺能神经元可以投射到脑区域，中脑区域中的天然多巴胺能神经元可以投射到该脑区域。在一些实施方案中，重编程的功能神经元可以将其自身整合到脑或脊髓中的一个或多个现有神经通路中，例如但不限于上纵束、弓状束、钩束、穿孔通路、丘脑皮质辐射、胼胝体、前连合、杏仁足通路、丘脑间粘连、后连合、缰连合、穹窿、乳头被盖束、脑下丘脑通路(incertohypothalamic pathway)、脑脚、前脑内侧束、内侧纵束、肌阵挛三角、中脑皮层通路、中脑边缘系统通道、黑质纹状体通路、结节漏斗通路、锥体外系、锥体束、皮质脊髓束或脑脊髓纤维、皮质脊髓侧束、前皮质脊髓径、皮质脑桥束、额桥纤维、颞桥纤维、皮质延髓束、皮质中脑束、顶盖脊髓束、间质核脊髄路、红核脊髓束、红核橄榄束、橄榄小脑束、橄榄脊髓束、前庭脊髓束、外侧前庭脊髓束、内侧前庭脊髓径、网状脊髓束、外侧缝线核脊髄路、后柱-内侧丘系通路、薄束、楔状束、内侧丘系、脊髓丘脑束、脊髓丘脑侧束、脊髓丘脑前束、脊髓中脑束、脊髓小脑束、脊髓橄榄束和脊髓网状束。不受特定理论的束缚，局部细胞环境可以与根据本发明的一些实施方案产生的功能神经元的投射相关。例如，根据本文提供的方法的一些实施方案，在中脑中产生的功能神经元可以受到中脑的局部环境中的其他细胞，例如，释放用于其他天然多巴胺能神经元或投射共同靶脑区域的天然多巴胺能神经元的轴突生长的指导信号的细胞的影响。

在一个方面，本发明提供了治疗与神经系统区域中的功能神经元退化有关的神经系统疾病的方法。示例性的方法包括向有需要的受试者的神经系统(例如脑或脊髓)的区域施用包含抑制该区域中非神经元细胞中的PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物，并使非神经元细胞重编程为功能神经元，从而补充该区域中退化的功能神经元。

根据本发明的一些实施方案，本文提供的方法包括治疗神经系统疾病，所述神经系统疾病包括但不限于帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、精神分裂症、抑郁症和药物成瘾。适用的神经系统疾病还可包括与脊髓中的神经元缺失有关的疾病，例如但不限于肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和运动神经元疾病。本文提供的方法还可用于治疗或减轻神经退行性疾病的一种或多种症状，包括但不限于：常染色体显性遗传性小脑共济失调、常染色体隐性的Charlevoix-Saguenay的痉挛性共济失调、皮质基底节变性、皮质基底膜综合征、克雅氏病、脆性x相关震颤/共济失调综合征、与17号染色体连锁的额颞叶痴呆和帕金森症、Kufor-Rakeb综合征、莱姆病、马查多-约瑟夫病、尼曼匹克氏病、脑桥小脑发育不全、雷夫叙姆病、丙酮酸脱氢酶复合物缺乏症、山德霍夫氏病、Shy-Drager综合征、Tay-Sachs病和Wobbly刺猬综合征。如本文所提供的，“神经退行性疾病”或其语法等价物可以指神经元的结构、功能或两者的进行性丧失，包括神经元的死亡。神经退行性疾病可以归因于任何类型的机制。本文提供的方法适用于的神经系统疾病可以是任何病因的。神经系统疾病可能是遗传性的或偶发性的，可能是由于基因突变、蛋白质错误折叠、氧化应激或环境暴露(例如毒素或滥用药物)引起的。

在一些实施方案中，本文提供的方法治疗与脑区域中的多巴胺能神经元退化相关的神经系统疾病。在其他实施方案中，本文提供的方法治疗与任何类型的神经元例如但不限于谷氨酸能神经元、GABA能神经元、胆碱能神经元、肾上腺素能神经元、多巴胺能神经元或释放神经递质(天门冬氨酸、D-丝氨酸、甘氨酸、一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)、硫化氢(H

本文提供的方法可用于治疗或缓解与帕金森氏病有关的一种或多种症状。帕金森氏病是一种神经退行性疾病，具有黑质致密部(SNpc)中的多巴胺能神经元的早期明显的功能受损或死亡。基底神经节内产生的多巴胺缺乏可导致特征为典型的帕金森氏运动症状的运动障碍。帕金森氏病也可能与许多非运动症状有关。诊断帕金森氏病的一个标准是在死后病理检查中发现SNpc变性和路易氏病理。路易氏病理可能包括α-突触核蛋白的异常聚集，称为路易体和路易神经突。帕金森氏病患者可表现出多种症状，包括运动症状和非运动症状。本文提供的方法可以治疗或减轻与帕金森氏病有关的这些运动或非运动症状中的一种或多种。帕金森氏病的运动症状(帕金森氏病症状)可能包括运动徐缓(迟缓)、僵硬、受损的平衡能力、曳行步态和姿势不稳。帕金森氏病患者的运动特征可能是异质的，这促使尝试对疾病的亚型进行分类，例如，震颤为主的帕金森氏病(相对没有其他运动症状)、非震颤为主的帕金森氏病(可以包括被描述为强直综合征和姿势不稳步态障碍的表型)，以及具有混合或不确定的表型(具有几种严重程度相当的运动症状)的另一亚群。帕金森氏病的非运动症状可能包括嗅觉功能障碍、认知损害、精神症状(例如抑郁)、睡眠障碍、自主神经功能障碍、疼痛和疲劳。这些症状可以在早期帕金森氏症中常见。在典型的运动症状发作之前，帕金森氏病中还可以经常出现非运动功能。该疾病的运动前期或前驱期的特征可为嗅觉受损、便秘、抑郁、白天过度嗜睡以及快速眼动睡眠行为障碍。

在一些实施方案中，本文提供的方法减缓或减慢帕金森氏病的进展。帕金森氏病的进展可以以运动功能恶化为特征。随着疾病的进展，可能出现与长期症状疗法有关的并发症，包括运动和非运动性波动、运动障碍和精神病。

帕金森氏病的一种病理特征可以是黑质(例如，黑质致密部(SNpc))内的多巴胺能神经元的丧失。根据一些实施方案，本文提供的方法补充患者的黑质(例如，SNpc)中的功能性多巴胺神经元。帕金森氏病的神经元丧失也可能发生在许多其他脑区域，包括蓝斑、迈内特基底核、脚桥核、中缝核、迷走神经的背侧运动核、杏仁核和下丘脑。在一些实施方案中，如本文提供的在受试者中治疗或减轻帕金森氏病的一种或多种症状的方法包括将患有帕金森氏病的患者的经历神经元丧失的脑区域中的非神经元细胞重编程为功能神经元。

本文提供的方法可用于治疗不同病因的帕金森氏病。例如，由于一种或多种遗传突变(例如但不限于基因SNCA、LRRK2、VPS35、EIF4G1、DNAJC13、CHCHD2、Parkin、PINK1、DJ-1、ATP13A2、C9ORF72、FBXO7、PLA2G6、POLG1、SCA2、SCA3、SYNJ1、RAB39B以及可能22q11.2微缺失综合症中受影响的一种或多种基因中的突变)而导致的帕金森氏病。或者可能是不具有已知的遗传性状的帕金森氏病。

如本文所提供的，本文所提供的方法可以减轻的帕金森氏病的一种或多种症状不仅可以包括如上所述的运动症状和非症状，还可以包括其他水平的病理学特征。例如，通过补充可以整合到神经元回路中并重建至适当的脑区域例如纹状体的多巴胺神经元投射的功能性多巴胺神经元，可以通过本文提供的方法逆转或减轻帕金森氏病患者的脑中多巴胺信号传导的降低。

在一个方面，本发明还提供了在具有与正常水平相比降低的多巴胺生物发生量的受试者中恢复多巴胺释放的方法。示例性方法包括重编程受试者的脑区域中的非神经元细胞，并允许该非神经元细胞重编程为多巴胺能神经元，从而恢复多巴胺的降低量的至少50％。在一些实施方案中，通过向受试者的脑区域施用包含抑制脑区域中非神经元细胞中PTB的表达或活性的细胞编程剂的组合物来进行重编程。在一些实施方案中，本文提供的方法恢复多巴胺的降低量的至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％。在一些实施方案中，本文提供的方法恢复多巴胺的降低量的约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％或约100％。在一些实施方案中，本文提供的方法恢复多巴胺的降低量的至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％。在一些实施方案中，本文提供的方法恢复多巴胺的降低量的至少约50％。

在一方面，本发明提供了包含有效地通过抑制非神经元细胞中PTB的表达或活性将哺乳动物非神经元细胞重编程为成熟神经元的量的细胞编程剂的药物组合物。示例性的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。如上所述，本文提供的细胞编程剂可以是小化学分子、干扰RNA、短发夹RNA、微小RNA、显性负突变体、核酶、反义寡核苷酸、蛋白抑制剂、单克隆抗体、多克隆抗体、肽、或任何形式的修饰核酸。

本文提供的药物组合物可包含一种或多种载体和赋形剂(包括但不限于缓冲剂、碳水化合物、甘露醇、蛋白质、肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂)；水；油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油(例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)；盐水溶液；葡萄糖水溶液和甘油溶液；调味剂；着色剂；增粘剂和其他可接受的添加剂或粘合剂；近似生理条件所需的其他药学上可接受的辅助物质，例如pH缓冲剂、张力调节剂、乳化剂、湿润剂等。赋形剂的例子包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。在另一种情况下，该组合物基本上不含防腐剂。在其他实施方案中，该组合物包含至少一种防腐剂。关于药物剂型的一般方法可以在Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Lippencott Williams&Wilkins,Baltimore Md.(1999))中找到。将认识到，虽然可以使用本领域普通技术人员已知的任何合适的载体来施用本文所述的药物组合物，但载体的类型可以根据施用模式而变化。合适的制剂和额外的载体被描述在Remington"The Science and Practice ofPharmacy"(第20版,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore Md.)，其中的教导通过引用被整体并入本文中。示例性药物组合物可配制为注射、吸入、肠胃外施用、静脉内施用、皮下施用、肌肉内施用、皮内施用、局部施用或口服施用。本领域技术人员将理解，根据细胞编程剂的类型和药物组合物被设计的施用途径，药物组合物可以包含任何合适的载体或赋形剂。例如，本文提供的含有细胞编程剂的组合物可配制用于肠胃外施用，并且可以单位剂量形式呈现在安瓶、预充式注射器、小体积输液或含有添加防腐剂的多剂量容器中。所述组合物可以采用诸如油或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳剂的形式，例如，含水的聚乙二醇中的溶液。例如，对于注射用制剂，媒介物可以选自现有技术中已知的合适的媒介物，包括水溶液或油悬浮液、或乳剂与芝麻油、玉米油、棉籽油、或花生油，以及酏剂、甘露醇、葡萄糖、或无菌水溶液和类似药物媒介物。该制剂还可以包括生物相容性、生物可降解的聚合物组合物，如乳酸乙醇酸共聚物。这些材料可以制成微球或纳米球，其负载药物，并进一步被涂覆或衍生，以提供优越的缓释性能。适用于眼周或眼内注射的媒介物包括，例如，注射级水、脂质体和适用于亲脂性物质的媒介物以及现有技术中已知的媒介物中的活性剂的悬浮液。本文提供的组合物还可以包含除细胞编程剂和药物可接受的载体或赋形剂之外的其他试剂。例如，可以提供其他试剂以促进神经元存活的目的。可替代或另外地，也可以提供其他试剂用于监测药效学目的。在一些实施方案中，组合物包含作为渗透增强剂或用于活性成分、例如细胞编程剂的持续释放或控制释放的其他试剂。

本文提供的组合物可以约0.0005、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL或更高的剂量体积施用于受试者。所述组合物可以作为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量疗程方案施用。有时，该组合物可以作为2、3或4个剂量疗程方案施用。有时该组合物可以作为1剂量疗程方案施用。

2个剂量疗程方案的第一剂量和第二剂量的施用可相隔约0天、1天、2天、5天、7天、14天、21天、30天、2个月、4个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年、3年、4年、5年、10年、20年或更长时间。可以每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、一年一次、一年两次、一年三次、每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年向受试者施用本文所述的组合物。有时，可以每2、3、4、5、6、7或更多年向受试者施用该组合物。有时，可以一次向受试者施用该组合物。

本发明的一些实施方案提供了用于细胞或组织移植的方法和组合物。示例性方法可以包括在体外将非神经元细胞重编程为神经元，以及将重编程的神经元移植到受试者的脑区域中。在一些实施方案中，可以根据本文提供的方法进行体外重编程。示例性组合物可包含根据本文提供的方法的任何实施方案重编程的神经元。

在其他实施方案中，本文提供的方法包括在体内将非神经元细胞重编程为神经元，并移植重编程的神经元。在一些实施方案中，外植体包含含有重编程的神经元的脑组织。在一些实施方案中，将外植体移植到受试者的脑区域中。如本文提供的，根据本文提供的方法重编程的神经元的移植可用于补充患有与神经元损失有关的病症的受试者中的退化的神经元。

本发明的一些其他方面涉及包含根据本文提供的方法的任何实施方案重编程的神经元的动物。如本文提供的，动物可以是任何哺乳动物。动物可以是人。动物可以是非人灵长类动物，例如但不限于恒河猴、食蟹猕猴、短尾猕猴、猪尾猕猴、松鼠猴、猫头鹰猴、狒狒、黑猩猩、狨猴和蜘蛛猴。动物可以是研究动物、基因修饰的动物或任何其他合适类型的动物。例如，可以提供包含根据本发明的实施方案重编程的一个或多个神经元的小鼠或大鼠。本文还提供了动物的脑组织(例如，外植体)，其包含根据本发明的任何实施方案重编程的一个或多个神经元。这样的脑组织可以是活的。在一些实施方案中，脑组织可以通过任何合适的固定剂固定。脑组织可用于移植、医学研究、基础研究或任何类型的目的。

本发明证明该方法适用于神经退行性疾病的疾病模型。例如，本发明显示星形胶质细胞向神经元的转化策略可以在化学诱导的帕金森氏病模型中起作用。该方法和组合物可以将星形胶质细胞转化为神经元，包括多巴胺能神经元、谷氨酸能神经元和GABA能神经元，这些神经元能够在脑中形成突触，并且显著地，转化的神经元可以有效地重建受损的黑质纹状体通路，以纠正可测量的帕金森氏表型。使用单剂量的抗PTB ASO，在培养的星形胶质细胞(人和小鼠)以及小鼠帕金森氏病模型的体内均证明了该方法的有效性。不仅如此，转化的神经元可以延伸突起至纹状体中。因此，该策略具有治愈帕金森氏病的潜力，其还可以应用于广泛范围的神经退行性疾病(例如与神经元功能障碍有关的其他神经系统疾病)。在一些实施方案中，本发明的方法利用了已经存在但潜伏于一旦它们通过PTB抑制被重编程就会逐渐产生成熟的神经元的两种哺乳动物星形胶质细胞中的神经成熟程序的遗传基础。这些发现提供了一种使用单剂量的抗PTB ASO或递送包含siRNA的载体从哺乳动物脑中的局部星形胶质细胞产生神经元的临床可行的方法。PTB敲低诱导的神经元的表型可能与它们产生的环境和/或它们来源的星形胶质细胞有关。

本发明表明星形胶质细胞向神经元(例如黑质中的多巴胺神经元，其中一部分向纹状体中发送投射，为黑质纹状体多巴胺通路的重建提供证据)的有效转化。更具体地，本发明显示在化学诱导的小鼠帕金森氏病(PD)模型中，该策略可以有效地纠正PD表型，从而满足体内重编程的所有五个因素。本发明还显示针对PTB的反义寡核苷酸(ASO)也可以有效纠正PD表型，表明短暂的用即跑(hit-and-run)策略对于治疗PD和可能其他神经退行性疾病的可行性。

本文提供的数据显示，哺乳动物脑中PTB的降低可将星形胶质细胞转化为神经元(例如，能够重建黑质纹状体通路的多巴胺能神经元，如通过新转化的神经元的黑质中的存在判断的)以及行为缺陷的逆转(例如，化学诱导的PD模型中的)。

本发明的组合物的“治疗有效量”将根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及组合物在个体中引起期望的反应的能力等因素而变化。治疗有效量也可以是其中所述治疗有益作用超过所述组合物的任何毒性或有害作用的量。不希望受特定理论的束缚，预期在一些情况下，如本文所提供的细胞编程剂的治疗有效量可以是细胞编程剂将脑区域中经历神经元缺失的一定比例的星形胶质细胞转化的量，脑区域中的这种比例的星形胶质细胞转化为功能神经元足以改善或治疗与脑区域中的神经元缺失有关的疾病或病症，并且同时，星形胶质细胞的这种比例不超过可导致可能超过神经元转化所带来的有益作用的不良作用(例如，由于作为神经元转化的直接结果，脑区域中的星形胶质细胞数量的过度减少)的阈值水平。

以下实施例旨在说明而非限制本发明。尽管它们是可能使用的典型方法，但也可以使用本领域技术人员已知的其他程序。

实施例

实施例1.miR-9和Brn2在星形胶质细胞中的表达。

在小鼠和人原代星形胶质细胞中测试PTB/nPTB调控的基因表达程序。如图2C-2F所示，miR-124和miR-9都在神经元中高表达，但在成纤维细胞中却没有。在人和小鼠星形胶质细胞中，发现miR-124以低水平存在(图2C和2D)，这可能解释了这种非神经元细胞类型中的高REST水平，并表明星形胶质细胞中紧密的PTB调控的回路。但是，出乎意料的是，发现miR-9在小鼠和人星形胶质细胞中都高表达(图2E和2F)。Brn2遵循与miR-9相同的表达模式，在成纤维细胞中低，但在星形胶质细胞和神经元中均高(图2A和2B)。这些观察结果与星形胶质细胞和神经元可能共享共同祖代的观点一致。

实施例2.小鼠和人星形胶质细胞中PTB的敲低导致nPTB诱导，随后nPTB下降。

在本发明中认识到，星形胶质细胞已经表达了对于神经元成熟可能重要的因子(例如miR-9和Brn2)，测试了miR-9立即抵消PTB敲低诱导的nPTB的可能性。与人成纤维细胞中的PTB/nPTB的表达谱相反，在小鼠和人星形胶质细胞中显示，PTB敲低导致nPTB诱导，随后nPTB下降(图3A和3B)。因此，通过单独消耗星形胶质细胞中的PTB，高水平的miR-9可以增强星形胶质细胞向成熟神经元的稳定重编程。

实施例3：在体外敲低PTB有效地将星形胶质细胞转化为功能神经元。

为了探索PTB下调将导致星形胶质细胞有效转化为成熟神经元的可能性，将小鼠星形胶质细胞从出生后第4至5天(P4-5)的幼鼠的脑皮层中解离出来，并从商业来源(ScienCell)获得人胎儿星形胶质细胞。来自两种来源的细胞均表达预期的星形胶质细胞标志物GFAP和ALDH1L1，且没有可检测到的神经元细胞污染，如缺乏神经元或神经嵴祖细胞的标志物所示的(图4)。

用表达针对PTB的小发夹RNA(shPTB)的慢病毒载体感染小鼠星形胶质细胞。转导后四周，保持在含有一组小分子的标准神经元分化培养基中的约50％的shPTB处理的细胞显示神经元形态和泛神经标志物Tuj1和MAP2的阳性染色，而用对照shRNA转导的细胞则没有(图5A)。shPTB诱导的神经元还表达成熟神经元的标志物，包括NeuN和神经元特异性烯醇酶(NSE)(图5B)。为了定义转化的神经元的类型，检查了谷氨酸能神经元(VGlut1)、GABA能神经元(GAD67)、多巴胺能神经元(酪氨酸羟化酶，TH)和其他的标志物(图5C)。大多数诱导的神经元是谷氨酸能或GABA能的，少数(1-2％)Tuj-1阳性细胞表达多巴胺能标志物(TH)(图5C)。通过免疫染色检查了其他多巴胺能标志物(例如通过RT-qPCR的SLC6A3和FoxA2以及DAT和VMAT2)的表达，并且观察到它们的低效率的诱导(图5I-L)。诱导的神经元均未表达可检测的胆碱能或血清素能标志物，包括胆碱乙酰基转移酶或色氨酸羟化酶。

为了测试PTB敲低转化的细胞的功能，在shPTB表达后5～6周进行了膜片钳记录。大多数膜片细胞显示电压门控的钠/钾通道的电流和重复动作电位放电，表明这些转化细胞的神经元活动(图5D)。此外，当将转化的神经元与新鲜分离的带有GFP标志物的大鼠星形胶质细胞共培养时，检测到不同频率的自发突触后事件(图5D)。这些神经元活动可能反映对来自谷氨酸能和GABA能神经元的突触输入的反应，因为2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并[f]喹喔啉-2,3-二酮(NBQX)加D(-)-2-氨基-5-膦酰戊酸(APV)(谷氨酸能通道受体的拮抗剂)和苦味毒素(PiTX，GABAA通道受体的拮抗剂)可以依次阻断信号(图6A)。在由对照shRNA转导的细胞的膜片钳记录中未检测到神经元电生理特性(图6B)。

人星形胶质细胞看起来比小鼠星形胶质细胞甚至更有效地重编程。用shPTB慢病毒载体转导后四周，观察到几乎定量的星形胶质细胞向神经元转化，其中约90％的细胞标记有由Tuj1抗体识别的神经元特异性β-微管蛋白(图5E)。转化的神经元表达NeuN和NSE(图5F)，并且与小鼠星形胶质细胞一样，人星形胶质细胞大部分转化为谷氨酸能或GABA能神经元，小部分(1％至2％)表达可检测水平的TH(图5H)。要注意的是，在实验条件下，与小鼠星形胶质细胞相比，人星形胶质细胞的转化效率更高，而GAD67和VGlut1神经元亚型的相对百分比较低，这可能表明人星形胶质细胞来源的神经元的多样化程度更高。电生理研究证明，PTB耗竭后5到6周，绝大多数神经元中电压门控通道携带的电流和重复动作电位，并且当与大鼠星形胶质细胞共培养时，大多数人星形胶质细胞转化的神经元也表现出自发突触后事件(图5H)。这些突触后活动可以被NBQX+APV和PiTX依次阻断(图6C)，并且在由对照shRNA转导的细胞的膜片钳记录中未检测到神经元电生理特性(图6D)。这些数据表明，通过下调PTB，可以在单一步骤中将小鼠星形胶质细胞和人星形胶质细胞有效地转化为功能神经元。

实施例4：敲低PTB诱导小鼠中脑中的星形胶质细胞直接转化为神经元。

通过使用AAV血清型2载体表达shPTB进行体内递送，设计了基于AAV的策略(图7A)。为了能够对转化的神经元进行谱系追踪，将红色荧光蛋白(RFP)基因置于shPTB的5'端。将LoxP-Stop-LoxP单元插入RFP的5'端，以允许条件型表达RFP和shPTB。将这种AAV-shPTB载体注入野生型(WT)小鼠的中脑后10周，RFP阳性细胞几乎不存在(图8A)。相反，当将相同的AAV载体注入在星形胶质细胞特异性GFAP启动子下表达Cre重组酶的转基因小鼠的脑中时，RFP和shPTB均在星形胶质细胞中选择性表达(参见下文)。

在P30和P40之间(已知星形胶质细胞已经在中脑中失去其产生神经球的能力时的发育阶段)将AAV-shPTB注射入GFAP-Cre小鼠的黑质的一侧。作为阴性对照，使用仅编码RFP的载体(AAV-Empty)进行类似注射。如预期的那样，在AAV-Empty注射组中，大多数RFP阳性细胞为GFAP阳性，但为NeuN阴性，表明没有转导的星形胶质细胞转化为神经元(图7B，左上两图)。相反，到注射AAV-shPTB后3周，虽然大多数转导的细胞仍保持GFAP阳性并具有典型的星形胶质细胞形态，但约20％的RFP阳性细胞开始表达成熟神经元标志物NeuN，并且这些RFP标记的NeuN阳性细胞的百分比到5周急剧增加(图8B和8C)。到10周，>80％的RFP阳性细胞变为NeuN阳性，并且不再表达可检测的GFAP(图7B，左下两图，在右图上定量)。这些数据表明，中脑中的RFP阳性细胞逐渐转化为神经元。

通过用一系列神经元标志物(包括Tuj1、MAP2、NSE和PSD-95)进行免疫染色，检查转化的神经元。在AAV-shPTB递送后10周，大多数转化的神经元都表达了这些标志物中的所有四种(图7C)。PSD-95(存在于突触后膜中的膜相关鸟苷酸激酶)的染色显示NeuN/RFP-双阳性细胞中典型的点状模式。值得注意的是，与体外星形胶质细胞向神经元转化的结果相比(参见图5C)，显著部分的RFP阳性神经元(30％至35％)对多巴胺能神经元的典型标志物酪氨酸羟化酶(TH)呈阳性染色(图7D)，而可检测到相对较低的水平的谷氨酸能和GABA能神经元(图8E)。大多数转化的细胞还表达了A9多巴胺能神经元的标志物Girk2(图8F)，而较小的群体对A10多巴胺能神经元的标志物钙结合蛋白-D28k呈阳性染色(图8G)。这些发现表明星形胶质细胞向不同神经元亚型的转分化的区域特异性。

为了进一步探讨神经元亚型诱导的区域特异性，体外比较了来自皮质的星形胶质细胞与来自中脑的星形胶质细胞的转化。发现，与皮质来源的星形胶质细胞(仅1-2％转化)相比，中脑来源的星形胶质细胞以高得多效率(8％至10％)转化成TH阳性神经元，如通过免疫染色和免疫印迹所确定的(图6E-G)。这些数据与本发明的认识一致，即在某些情况下，来自不同脑区域的星形胶质细胞可以表现出不同的基因表达程序，表明脑中存在区域不同类型的星形胶质细胞。

然后研究了从来自小鼠脑的不同部位的星形胶质细胞转化的神经元的亚型。发现在体内中脑星形胶质细胞，而不是来自皮质或纹状体的星形胶质细胞，被有效地转分化为TH阳性神经元，尽管全部都以相似地高效率(～80％)转化为NeuN阳性神经元(图7E-G)。纹状体中几乎没有星形胶质细胞来源的TH阳性神经元是引人注目的，因为这是由黑质多巴胺能神经元的轴突支配的区域。与体外的(～10％)相比体内转化的星形胶质细胞来源的TH阳性神经元的更高百分比(～35％)表明局部环境诱因可能进一步增强转化的神经元发育为不同的脑区域中的特定亚型。这些发现与本发明的认识一致，即来自中脑而不是其他脑区域的星形胶质细胞促进从神经元干细胞向多巴胺能神经元的分化。

实施例5.如脑切片中所表征的，星形胶质细胞转化的神经元具有功能。

为了原位功能上表征星形胶质细胞转化的神经元，在用AAV-shPTB转导后5～6周对脑切片进行了电生理研究。向RFP阳性神经元注射荧光染料Neurobiotin 488以标记细胞，获取所述细胞的膜片钳记录，并在记录后通过TH染色确认膜片细胞的多巴胺能亚型(图7H)。检测到Na

实施例6.中脑星形胶质细胞来源的神经元整合到黑质纹状体通路中。

定量分析揭示，在黑质内约4000个总RFP阳性细胞产生了约1300个TH阳性神经元(图8H-J)。通过在脑切片上对多巴胺转运体(DAT)、囊泡单胺转运体2(VMAT2)以及中脑多巴胺能神经元的特异性标志物例如，锯齿形同源盒1(En1)和LIM同源盒转录因子1α(Lmx1α)进行免疫染色，进一步确认了这些重编程的神经元的亚型特异性(图9B)。虽然RFP阳性细胞体仅存在于黑质中，但在尾状壳核以及其他靶区域(包括伏核、隔膜和嗅结节)中检测到RFP阳性纤维(图9A和9G)，如在小鼠中脑中移植有神经元干细胞的较早的研究中观察到的。这些纤维的一部分也呈TH阳性(图9H)。纤维密度的定量揭示，RFP/TH双阳性突起主要分布在纹状体的尾状壳核(CPu)和伏核(NAc)区中(图9I)，尽管在隔膜(Sept)中存在更多(～3倍)的RFP阳性纤维(还参见图9G)。这些数据支持了黑质纹状体通路中的环境诱因通过星形胶质细胞转化的神经元影响神经支配模式的可能性。

为了进一步证明新转化的神经元的轴突延伸到纹状体，在AAV-shPTB递送后10周，将荧光逆行轴突追踪珠注射到小鼠的尾状壳核中(图9E)。注射逆珠(retrobead)后一天，检测到黑质内的内源性TH阳性细胞和转化的TH/RFP双阳性细胞，它们均被绿色珠逆行标记(图9F中的箭头)。综上所述，这些数据表明将AAV-shPTB注射入中脑星形胶质细胞可导致重编程并转化为功能性多巴胺能神经元。

实施例7.补充黑质纹状体通路中损失的多巴胺能神经元。

星形胶质细胞转化为多巴胺能神经元的数量以及其轴突向纹状体的相对强劲生长表明PTB介导的星形胶质细胞转化的神经元可能能够重建受损的黑质纹状体通路。为探讨这种可能性，多巴胺能神经元的退化通过向前脑内侧束单侧注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)(对多巴胺能神经元有毒的多巴胺类似物)进行诱导(图11A)。如所预期的，注射6-OHDA后一个月，在中脑和纹状体去神经支配中观察到TH阳性细胞体的单侧损失(图11B)。伴随着受损黑质中的多巴胺能神经元的损失，GFAP阳性星形胶质细胞群体急剧增加(图11C)，这表明预期的反应性星形胶质细胞反应。

使用6-OHDA的单侧受损后一个月，将AAV-shPTB或AAV-Empty注入中脑。注射AAV-shPTB而非AAV-Empty后10周对受损黑质的检查显示TH阳性神经元的数量增加，其中一部分也是RFP阳性(图11D-1)。神经元计数揭示，在未受损黑质中见到的最初～4500个TH阳性神经元细胞体在受损侧减少了90％以上(降至～400个)。重要的是，AAV-PTB施用诱导了～1000个新RFP/TH-双阳性神经元(图11J)，从而将TH阳性神经元恢复到初始数目的1/3。

在纹状体中并沿着黑质纹状体通路也检测到显著量的RFP阳性纤维，其中一部分也对TH呈阳性(图11E，图17A-F)。纤维密度的定量分析揭示，6-OHDA将TH阳性纤维降低到初始水平的～15％，AAV-PTB将TH阳性纤维恢复到在未受损侧检测到的野生型水平的～40％(图11L)。通过对不同纹状体区域中的RFP阳性和RFP/TH双阳性纤维进行定量，确定尾状壳核(CPu)区域包含最高比例的RFP/TH双阳性纤维(图11K)。尽管类似的，部分重建的黑质纹状体通路已经通过在小鼠脑中移植干细胞来源的多巴胺能神经元而实现，这些数据显示，无需任何其他处理来指定神经元亚型，AAV-shPTB可以诱导从内源性中脑星形胶质细胞转化的新的神经元以补充损失的多巴胺能神经元。

实施例8.通过在中脑中直接重编程逆转帕金森氏病表型。

为了确定重建的黑质纹状体通路恢复回路功能的能力，检查了AAV-shPTB转导的小鼠在单侧6-OHDA损伤后是否显示改善的运动功能。进行了三项标准行为测试，其中两项基于药物诱发的旋转，而第三相基于自发运动活动。在6-OHDA诱导的损伤后，由阿扑吗啡诱导的对侧旋转和由安非他明触发的同侧旋转均显著增加。值得注意的是，在AAV-shPTB处理后3个月，这两种表型均恢复到了近乎野生型的水平，而在AAV-Empty转导的小鼠中没有记录显著的纠正(图12A)。同组小鼠的阿扑吗啡诱导的旋转的时程在2-3个月内显示进行性表型恢复(图12B)。

为了检查自发运动活动，进行了圆筒测试以评分肢体使用偏倚。未患病小鼠以相对相等的频率使用双肢，而单侧受损小鼠显示优先的同侧接触，表明对侧前肢功能障碍。在AAV-shPTB转导的小鼠中，观察到前肢使用的急剧的、时间依赖的改善，到治疗后3个月达到野生型水平的表现，而AAV-Empty转导的小鼠没有显示任何改善(图12C)。

为了测试重编程的神经元是否直接负责正常运动功能的恢复，通过在转化的神经元中表达抑制性hM4Di受体(代替AAV-shPTB载体中的RFP)采取了化学遗传学方法(图16A)。已充分证实，表达hM4Di受体的神经元的动作电位被注射后1-2天内代谢的药物氯氮平-N-氧化物(CNO)明显抑制。如用圆筒测定所测量的，6-OHDA处理的小鼠的运动性能恢复在腹膜内注射CNO后被消除，表型在注射的40分钟内再次出现。向未损伤小鼠注射CNO不起作用。值得注意的是，与药物代谢相关，运动表型在3天内再次消失(图16B)。这些结果表明，星形胶质细胞转化的神经元可以直接负责运动恢复。

实施例9.重编程的脑中纹状体多巴胺的恢复。

制备来自纹状体的提取物以HPLC分析有无AAV-shPTB介导的星形胶质细胞转化的情况下未受损侧与受损侧相比的多巴胺。为了鉴定多巴胺信号，正常多巴胺水平的范围内的已知量被掺入纹状体裂解物。显示信号与添加量呈线性相关(图15A和15B)。接下来，在不同条件下测量纹状体中多巴胺的水平，并显示6-OHDA损伤小鼠中多巴胺的有效消融，但AVV-shPTB重编程的小鼠中的多巴胺显著恢复(图15C-15F)。基于3个独立实验的结果的定量表明，相对于未损伤的纹状体，多巴胺的水平从受损的纹状体中的～25％升高到AAV-shPTB处理后的65％(图6F)。多巴胺生物合成中的这～40％的净增加在黑质和纹状体的突起中的RFP/TH双阳性细胞体的恢复的30％至35％的范围内，表明AAV-shPTB重编程的神经元可负责观察到的表型恢复。

实施例10.针对PTB mRNA的反义寡核苷酸诱导神经元转化并挽救化学诱导的帕金森氏病表型。

合成了五种靶向PTB的21-核苷酸碱基反义寡核苷酸(ASO)(PTB-ASO)，其含有硫代磷酸酯骨架(以增加整体稳定性并有助于递送)和3'荧光素(以允许追踪所注射的ASO)。还合成了靶向GFP的ASO(GFP-ASO)作为阴性对照。3种PTB-ASO而非GFP-ASO，在转染到分离的小鼠星形胶质细胞中时，有效降低了PTB表达(图13A)。在导入具有最高靶向效率的PTB-ASO的PTB-ASO(#4)后五周，在标准神经元分化培养基中培养的小鼠星形胶质细胞显示包括Tuj1、MAP2、NSE和NeuN的一系列神经元标志物的合成，而用对照ASO转染的星形胶质细胞没有(图13B)，因此转化的神经元保持健康的神经元形态至少3个月，这是测试的最长时间(数据未显示)。类似于AAV-shPTB病毒载体，小部分转化的神经元是多巴胺能的，如阳性TH染色所示的(图13B)。

显示PTB-ASO在小鼠中脑中体内诱导神经元转化，其携带GFAP-CreER

实施例11.材料和方法。

该实施例描述了用于实施例1-10的几种方法。

载体和病毒产生

为了构建慢病毒载体以在小鼠星形胶质细胞中表达shPTB，将靶序列(5'-GGGTGAAGATCCTGTTCAATA-3'；SEQ ID NO：1)穿梭至pLKO.1-潮霉素载体(Addgene，#24150)中。对于人星形胶质细胞，使用包含靶序列(5'-GCGTGAAGATCCTGTTCAATA-3'；SEQ ID NO：2)的相似载体。将病毒颗粒与两种包装质粒pCMV-VSV-G(Addgene,#8454)和pCMV-dR8.2 dvpr(Addgene,#8455)在Lenti-X 293T细胞(Clontech)中一起包装。在装有SW-28转子的Beckman XL-90离心机上通过超速离心浓缩病毒颗粒。

为了构建AAV载体，首先将针对小鼠PTB的相同靶序列插入到pTRIPZ-RFP载体的EcoR I和Xho I位点之间。然后通过使用AscI将包含RFP和shRNA的片段亚克隆以替换AAV-CMV-LOX-STOP-LOX-mG-CaMP3.0载体(Addgene，#50022)中的CaMP3.0。为构建对照载体，将仅包含RFP的相似片段克隆到AAV-CMV-LOX-STOP-LOX-mG-CaMP3.0载体中。所得载体称为AAV-shPTB或AAV-Empty。AAV-hM4Di-shPTB载体是通过用从pAAV-CBA-DIO-hM4Di-mCherry载体(Addgene，#81008)亚克隆的hM4Di的cDNA替代AAV-shPTB中的RFP来构建的。

将AAV2的病毒颗粒与其他两个质粒pAAV-RC和pAAV-Helper(Agilent Genomics)在转染的293T细胞中一起包装。收获后，用肝素柱(GE HEALTHCARE BIOSCIENCES)纯化病毒颗粒，然后用μltra-4离心过滤器单元(Amicon，100,000分子量截止值)浓缩。通过qPCR确定病毒颗粒的滴度为>1×10

反义寡核苷酸的合成

从Integrated DNA Technologies合成反义寡核苷酸。靶向小鼠PTB的ASO(ASO-mPTB)的序列为5’-GGGTGAAGATCCTGTTCAATA-3’(SEQ ID NO:1)。合成靶向Turbo GFP的ASO(5’-GTTGGTGCTCTTCATCTTGTT-3’)作为对照。所有ASO的骨架都含有硫代磷酸酯修饰。荧光素(FAM)附接至这些ASO的3'端用于荧光检测。

蛋白质印迹法和RT-PCR

为了通过蛋白质印迹进行分析，将细胞在1×SDS加样缓冲液中裂解，并且在定量之后，添加溴酚蓝至终浓度0.1％。将25～30μg的总蛋白溶解在10％Nupage Bis-Tris凝胶中，并用以下抗体进行探测：兔抗PTBP1(由Douglas Black友情提供，1：3000)、小鼠抗PTBP2(Santa Cruz，sc-376316，1：1000)、小鼠抗β肌动蛋白(Sigma，A2228，1：10000)、兔抗Tuj1(Covance，MRB-435P，1：10000)、兔抗Brn2(Cell Signaling，12137，1：1000)，鸡抗TH(Aveslab，TYH，1：1000)和兔抗VMAT2(Proteintech，20873-1-AP，1：500)。

为了进行RT-qPCR分析，用Trizol(Life Technology)提取RNA，并使用10ug/ml的糖原增强小RNA的沉淀。总RNA首先用DNase I(Promega)处理，然后用miScript II RT试剂盒(QIAGEN，218160)进行逆转录。使用miScript SYBR Green PCR试剂盒(QIAGEN，218073)在Step-One Plus PCR机器(Applied Biosystems)上进行RT-qPCR。使用的引物是U6-F：5'-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3'(SEQ ID NO：4)；miR-124-F：5’-TAAGGCACGCGGTGAATGCC-3’(SEQID NO：5)；和miR-9-F：5'-GCGCTCTTTGGTTATCTAGCTGTATG-3'(SEQ ID NO：6)。

体外细胞培养和转分化

从出生后的(P4～P5)幼崽中分离出小鼠星形胶质细胞。从全脑切下皮层组织，并与胰蛋白酶孵育，然后铺板到包被有聚-D-赖氨酸(Sigma)的培养皿上。分离的星形胶质细胞在DMEM(GIBCO)加上10％胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素(GIBCO)中培养。每天小心摇动培养皿以清除非星形胶质细胞。达到约90％汇合后，将星形胶质细胞用Accutase(Innovative Cell Technologies)解离，然后以800rpm离心3分钟，然后在含有DMEM/F12(GIBCO)、10％FBS(GIBCO)、青霉素/链霉素(GIBCO)、B27(GIBCO)、10ng/ml表皮生长因子(EGF，PeproTech)和10ng/ml成纤维细胞生长因子2(FGF2，PeproTech)的培养基中培养。

为了在体外诱导转分化，用含有靶向小鼠PTB的慢病毒的星形胶质细胞培养基重悬浮小鼠星形胶质细胞，然后铺板在包被Matrigel Matrix(Corning)的盖玻片(12mm)上。24小时后，在新鲜的星形胶质细胞培养基中用潮霉素B(100ug/ml，Invitrogen)选择细胞72小时。接下来将培养基转换为补充有0.4％B27、2％FBS、3种小分子(1μm ChIR99021、10μmSB431542和1mM Db-cAMP)的混合物和神经营养因子(BDNF、GDNF、NT3和CNTF，均为10ng/ml)的N3/基础培养基(DMEM/F12和Neurobasal的1：1混合物，25μg/ml胰岛素、50μg/ml转铁蛋白、30nM亚硒酸钠、20nM孕酮、100nM腐胺)。培养基每隔一天换一半。为了测量突触电流，在6周后添加转化的细胞与新鲜的GFP标记的大鼠星形胶质细胞，并在再共培养3至4周后，进行膜片钳记录。

人星形胶质细胞购自商业来源(ScienCell)。细胞在星形胶质细胞培养基(ScienCell)中生长并传代培养，直至达到～80％汇合。为了在体外进行转分化，首先将培养的人星形胶质细胞用胰蛋白酶解离；重悬浮在含有靶向人PTB的慢病毒的星形胶质细胞培养基中；并铺板于包被Matrigel Matrix的盖玻片上。24小时后，用潮霉素B(100ug/ml，Invitrogen)选择细胞72小时。将培养基换成补充有0.4％B27、2％FBS和神经营养因子(BDNF、GDNF、NT3和CNTF，均为10ng/ml)的N3/基础培养基。为测量突触电流，在3周后添加转化的细胞与新鲜的GFP标记的大鼠星形胶质细胞，并且在再共培养2至3周后，进行膜片钳记录。

免疫细胞化学。

将生长于载玻片上的培养细胞在室温下用4％多聚甲醛(Affymetrix)固定15分钟，然后在冰上用PBS中0.1％Triton X-100透化15分钟。用PBS洗涤两次后，细胞在室温下在含有3％BSA的PBS中封闭1小时。将固定的细胞与一抗在4℃下在含有3％BSA的PBS中孵育过夜。用PBS洗涤两次后，将细胞与和Alexa Fluoro 488、Alexa 546、Alexa 594或Alexa647(1：500，Molecμlar Probes)缀合的二抗孵育1小时。在室温下将PBS中的300nM DAPI施用于细胞20分钟以标记细胞核。在用PBS额外洗涤3次后，将Fluoromount-G封固介质施加到载玻片上，并在Olympus FluoView FV1000下检查并记录图像。

为了对脑切片染色，用CO

使用了以下一抗：兔抗Tuj1(Covance，MRB-435P，1：1,000)、小鼠抗Tuj1(Covance，MMS-435P，1：1,000)、小鼠抗MAP2(Milipore，MAB3418，1：1000)、小鼠抗NeuN(Milipore，MAB377，1：200)、鸡抗NSE(Aves lab，NSE，1：1000)、兔抗VGlut1(Synaptic Systems，135-303，1：200)、兔抗GAD67(Cell Signaling，63080、1：200)、鸡抗TH(Aves lab，TYH，1：1000)、兔抗PSD95(Cell Signaling，3450，1：200)、兔抗DAT(Bioss，bs-1714R，1：100)、山羊抗VMAT2(Everest biotech，EB06558，1：100)、兔抗En1(Abgent，AP7278a，1：100)、兔抗Lmx1a(ProSci，7087，1：100)、兔抗GFAP(Cell Signaling，12389，1：200)、鸡抗GFAP(Aves lab，GFAP，1：100)，兔抗ALDH1L1(EnCor Biotechnology，RPCA-ALDH1L1，1：2000)、小鼠抗OLIG2(Santa Cruz，sc-293163，1：100)、鸡抗CD11b(Aves lab，MAC，1：1000)、小鼠抗NG2(SantaCruz，sc-53389，1：100)、鼠抗巢蛋白(Cell Signaling，4760、1：200)、小鼠抗NANOG(SantaCruz，sc-293121，1：100)、小鼠抗纤连蛋白(DSHB，1H9，1：500)、兔抗GAD65(CellSignaling，5843，1:50)、兔抗VGlut2(Bioss，bs-9686R，1：100)、兔抗Girk2(Proteintech，21647-1-AP，1：100)、兔抗钙结合蛋白D28K(Proteintech，14479-1-AP，1：100)和小鼠抗RFP(ThermoFisher，MA5-15257，1：200)。

神经元细胞体和纤维密度的定量。

以120～140μm的间隔对横跨中脑的冠状切面进行采样，用于TH和RFP的免疫染色。使用Nt＝Ns*(St/Ss)的公式计算感兴趣的细胞类型的总数(Nt)，其中如前所述，Ns是计数的神经元数量，St是脑区域中的切片总数，且Ss是采样部分的数量。使用先前公布的方法对RFP阳性和RFP/TH双阳性纤维进行定量。从每个脑中选择三个冠状切片(A/P+1.3，+1.0和+0.70)进行分析。对于每个选定的区域，使用60倍油浸物镜以1μm的间隔从z堆栈图像的一个部分捕获三个随机选择的区域。然后，产生球体(直径：14μm)作为探针，以测量整个z堆栈内的纤维密度。穿过球体表面的每根纤维均被给予一个评分。从相同的切片测定纹状体TH纤维的光密度。用10倍物镜捕获采样切片的数字化图像，并通过Image-J1.47v(WayneRasband，Bethesda，MD)进行分析。

电生理学。

使用连接到Digidata1440A接口(Axon Instruments)的Axopatch-1D放大器或Axopatch 200B放大器(Axon Instruments)进行膜片钳记录。使用pClamp 10.0或Igor4.04软件获取数据，并使用MatLab v2009b进行分析。对于从体外小鼠星形胶质细胞转化的神经元，在膜片钳记录前1周从培养基中去除小分子。首先将培养的小鼠和人类细胞与加氧的(95％O

为了记录体内转化的神经元的活动，在注射AAV载体后

膜片移液器(5-8MΩ)溶液包含150mM KCl、5mM NaCl、1mM MgCl

小鼠模型的构建

将GFAP-Cre转基因小鼠(B6.Cg-Tg(Gfap-cre)77.6Mvs/2J)用于AAV-shPTB诱导的体内重编程实验中。为了测试ASO的体内作用，将GFAP-CreER

用6-OHDA和立体定位注射的同侧损伤。

使用成年WT和出生后第40天龄的GFAP-Cre小鼠进行手术以诱发损伤。首先用氯胺酮(80-100mg/kg)和甲苯噻嗪(8-10mg/kg)的混合物麻醉动物，然后将它们放置在立体定位的小鼠框架中。在注射6-羟基多巴胺(6-OHDA，Sigma)之前，首先用地昔帕明(25mg/kg)和巴吉林(5mg/kg)的混合物处理小鼠。6-OHDA以15mg/ml的浓度溶于0.02％冰冷的抗坏血酸盐/盐水溶液中，并在3小时内使用。在以下坐标(相对于前囟)将有毒溶液注入前脑内侧束(MFB)：前-后(A/P)＝-1.2mm；中-侧(M/L)＝-1.3mm，和背-腹(D/V)＝-4.75mm(从硬脑膜起)。在5μl Hamilton注射器中使用33G针以0.1μl/min的速度持续3分钟施加注射，然后缓慢移出针头。损伤后进行伤口的清洁和缝合。

在6-OHDA诱导的损伤后约30天，将AAV载体或ASO注射入黑质中。在以下坐标将4μlAAV载体或2μl ASO(1ug/μl)注射入受损的黑质中：A/P＝-3.0mm；M/L＝-1.2mm，和D/V＝-4.5mm。使用相同的注射器和针头以0.5μl/min的速度持续3分钟进行注射，然后缓慢移出针头。

逆行示踪。

为了逆行示踪黑质纹状体通路，首先向具有或不具有6-OHDA诱导的损伤的GFAP-Cre小鼠注射AAV-shPTB载体。AAV递送后3个月，使用以下两个坐标，将绿色Retrobeads IX(Lumafluor，Naples，FL)在两个部位单侧注射到纹状体中AAV注射的同一侧上：A/P＝+0.5mm，M/L＝+2.0mm，D/V＝+3.0mm和A/P＝+1.2mm，M/L＝+2.0mm，D/V＝+3.0mm。注射～2μl的珠。24小时后，处死动物并立即灌注，用4％PFA固定它们的脑以用于切片和免疫染色。

纹状体多巴胺的测量。

通过反相高效液相色谱法(HPLC)测量小鼠纹状体中的多巴胺水平。使用具有Agilent Zorbax SB-C18半制备柱(ID 9.4x 250mm，5μm，

行为测试。

所有行为测试均在6-OHDA诱导的损伤后21-28天或AAV载体或ASO的递送后2、3和5个月进行。对于旋转测试，在实时视频系统下腹膜内注射阿扑吗啡(Sigma，0.5mg/kg)后，记录阿扑吗啡诱导的小鼠旋转。在进行旋转测试之前分开的两天(例如，如果要在周五进行测试，则将首先在周一和周三注射小鼠，这旨在防止可能使最终结果模糊的“发条”效应(’wind-up’effect))，给小鼠注射阿扑吗啡(0.5mg/kg)。如前所述，在注射10分钟的时段后5分钟测量旋转，并且只有全身旋转次数被计数。数据表示为每分钟净对侧转动。对于圆筒测试，将小鼠分别放入玻璃圆筒(直径19cm，高度25cm)中，并将镜子放置在后面以完整查看所有接触，如上所述。小鼠在实时视频系统下被记录5分钟。在记录之前，没有进行小鼠对圆筒的适应。逐帧视频播放器(KMPlayer版本4.0.7.1)用于评分。只有与同侧或对侧前肢独立的壁接触被计数。分析中不包括同时壁触摸(两个爪同时执行接触)。数据表示为同侧接触在总接触中的百分比。

对于化学遗传学实验，在6-OHDA诱导的损伤后21-28天和递送AAV-hM4Di-shPTB后2个月进行圆筒测试。在随后的测试中，首先给动物注射生理盐水以记录恢复的基线。在腹膜内注射CNO(Biomol International，4mg/kg)后40分钟或药物代谢后72小时进行后续记录。

实施例12.蛋白质或核酸序列

表1蛋白质或核酸序列

虽然本文已经显示和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，仅通过实例的方式提供了这样的实施方案。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替代。应当理解，在实施本发明时可以采用本发明的实施方案的各种替代方案。意图以下权利要求限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

序列表

<110> 加利福尼亚大学董事会

<120> 非神经元细胞向神经元的重编程、以及治疗神经退行性疾病和病症的方法和组合物

<130> 00015-350WO1

<140> 没有分配

<141> 2019-04-11

<150> US 62/656,322

<151> 2018-04-11

<150> US 62/718,774

<151> 2018-08-14

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠 shPTB

<400> 1

gggtgaagat cctgttcaat a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人 shPTB

<400> 2

gcgtgaagat cctgttcaat a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 针对Turbo GFP的反义寡核苷酸

<400> 3

gttggtgctc ttcatcttgt t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U6-正向引物

<400> 4

acgcaaattc gtgaagcgtt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-124 正向引物

<400> 5

taaggcacgc ggtgaatgcc 20

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-9 正向引物

<400> 6

gcgctctttg gttatctagc tgtatg 26