异亮氨酸羟化酶突变体及在(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸合成中的应用

摘要

本发明涉及异亮氨酸羟化酶突变体及在(2S,3R,4S)‑4‑羟基异亮氨酸合成中的应用。该异亮氨酸羟化酶突变体是将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第38位、56位、88位、123位、135位、138位、155位、162位、176位、179位、182位、196位、205位、226位、228位、234位和236位氨基酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质。与野生型异亮氨酸羟化酶相比，本发明所述异亮氨酸羟化酶突变体对底物异亮氨酸的活力有大幅度提高，所述异亮氨酸羟化酶突变体可用于高效制备糖尿病治疗药物(2S,3R,4S)‑4‑羟基异亮氨酸，具有很好的工业应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种异亮氨酸羟化酶突变体及其基因，含有该基因的重组表达质粒和重组表达转化体，异亮氨酸羟化酶突变体的制备，以及异亮氨酸羟化酶突变体在(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸合成中的应用。

背景技术

1973年，英国Fowden课题组首次从成熟的葫芦巴种子中分离并纯化出其中的主要活性物质，即一种非天然的氨基酸，(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸(Phytochemistry 1973,12:1707-1711)。它具有促进胰岛素分泌、降血脂和降低胰岛素抵制的作用(Molecular andCellular Endocrinology 2014,395:51-60)，而且与其它抗糖尿病药相反，(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸(HIL)介导的胰岛素反应严格依赖于葡萄糖浓度。这种独特的性质可防止在II型糖尿病治疗中出现不良副作用，使得(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸成为治疗糖尿病最有前途的口服药物之一，具有广阔的市场前景。

早期，(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸主要是从葫芦巴种子中提取获得，提取率仅为0.1％(Phytochemistry 1973,12:1707-1711)。1984年，法国Sauvaire课题组采用70％的乙醇萃取100g脱脂研磨的葫芦巴种子，最终获得0.6g光学纯的(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸，提取率升高到0.6％(Phytochemistry 1984,23:479-486)。由于资源、技术有限，提取率低，以天然分离提取的方式获得的(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸数量非常少，并且葫芦巴的生长周期长，且占用大量的土地资源，所以(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸的价格一直很昂贵。随着科学技术的发展以及对(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸的需求不断增加，采用化学或生物合成的手段来制备(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸受到人们的广泛关注。

2002年，中国王强课题组以3-羟基-2-甲基丁酸乙酯为起始原料经过一步酶法催化和八步化学反应实现了光学纯(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸的合成，得率为39％，非对映异构体过量值(de)为82％(European Journal of Organic Chemistry 2002,2002:834-839)。2006年，法国Claude课题组利用对甲氧基苯胺和乙醛酸乙酯作为底物，经(S)-脯氨酸催化Mannich反应、DBN不对称催化，再经过氧化脱保护、还原，水解和树脂分离纯化制得光学纯的(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸，总收率约为9.4％，非对映异构体过量值(de)为80％(WO,2006117696,2006)。2010年，中国邓勇课题组对Claude等人的方法进行改进，使选择性和得率进一步提高，经过四步反应条件的优化，总收率提高至30％，非对映异构体过量值(de)提高至86.7％(Chinese Journal of Pharmaceuticals 2010,41:491-494)。2012年，法国Praly课题组以薄荷酮为底物通过加成反应得到E-1,4-氯-2-丁烯后，再经过5步化学反应实现了光学纯(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸的合成，总收率约21％，非对映异构体过量值(de)大于99％(Tetrahedron Letters 2012,53:2817-2821)。虽然化学法能够获得光学纯较高的(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸，但是均存在反应条件苛刻、步骤繁琐、得率低等缺点，因此不适用于大规模工业化生产。

生物合成(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸的方法包括酶促合成法和细胞合成法。2007年，俄罗斯Smirnov课题组提出(2S,3R,4S)-4-HIL的两步酶促合成法，以乙醛、α-丁酮酸和L-谷氨酸起始原料，在体外用来自于Arthrobacter simplex strain AKU626的醛缩酶催化得到(3S,4S)-4-羟基-3-甲基-2-氧戊酸，然后在转氨酶的作用下将其胺化得到(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸。两步级联反应总转化率仅有4％，非对映异构体过量值(de)为71％(US20080212767,2008)。2009年，日本Kodera课题组首次发现苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)2e2中的异亮氨酸羟化酶(L-isoleucine hydroxylase,IDO)能特异性地催化L-异亮氨酸(L-Ile)羟化反应生成单一构型的(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸。通过将编码IDO的基因导入能够利用自身代谢系统产生α-酮戊二酸的大肠杆菌中，向500mL培养基中添加0.4％(w/v)葡萄糖、0.4％(w/v)可溶性淀粉以及0.2％(w/v)L-异亮氨酸等物质，在30℃经过12h的培养，最终可以从1g异亮氨酸生物合成23mg的(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸(Biochemical and Biophysical Research Communications 2009,390:506-510)。2017年，该课题组在另一篇文献中报道了应用蛋白质工程的方法对来源于Bacillussubtilis的4-羟基异亮氨酸脱氢酶(BtHILDH)进行分子改造，获得能够将2-氨基-3-甲基-4-酮基戊酸(AMKP)还原为4-HIL的双点突变体HILDH

2009年，日本Kodera课题组报道了从Bacillus thuringiensis菌株2e2 AKU 0251中分离纯化得到能特异性催化异亮氨酸生成(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸的L-异亮氨酸羟化酶(IDO)(Biochemical and Biophysical Research Communications 2009,390:506-510)。对其基本酶学性质研究发现细胞破碎液的羟化酶活力为3.8mU/mg，进一步研究表明该酶催化反应严格依赖于α-酮戊二酸和Fe

2014年，中国张成林课题组克隆并表达了来源于Bacillus thuringiensis TCCC11826的IDO，与已报道的Bacillus thuringiensis 2e2 IDO的基因相似度为97.47％(Applied Microbiology and Biotechnology 2013,97:2467-2472)。同年，中国聂尧课题组从土壤中成功筛选得到具有IDO活性的菌株，发现该菌株中的IDO与其它7个类似IDO的同源性高达96.7％。利用全细胞作为催化剂在30℃和异亮氨酸浓度为20mM的条件下反应过夜合成(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸，产率达到85％(微生物学通报2017,44:505-512)。

2018年华东理工大学许建和课题组在专利ZL 201811611461.7中公开了一株重组表达异亮氨酸羟化酶的重组菌株，但是该菌株在催化异亮氨酸羟化反应过程中的效率较差。在底物异亮氨酸上载量为30g/L，细胞上载量为40g/L时，转化24h，转化率低于94％。高浓度的催化剂上载量不利于产物的后处理，同时催化剂的应用成本也偏高，远远不能达到工业应用的要求。

2017年，中国张成林课题组为了获得活性改善的IDO，开发了一种高通量筛选策略，将辅底物α-酮戊二酸脱羧生成的琥珀酸与大肠杆菌细胞的生长相偶联(Bioengineered2017,9:72-79)。利用该策略获得了五个突变体，并研究了具有最高活性的IDO M

2018年，中国石峰课题组通过定向进化，结合纸层析色谱高通量筛选方法，对来源于Bacillus weihenstephanensis KBAB4的IDO进行改造，得到一个催化效率相对母本有3.0倍提高的IDO

2019年，中国饶志明课题组对Bacillus cereus 13658IDO的二硫键进行理性设计，以提高其热稳定性。所获得的T181C突变体在50℃的半衰期为4.03h，是野生型(t

发明内容

本发明针对现有技术中异亮氨酸羟化酶IDO的不足，通过易错PCR、定点饱和突变和组合突变等定向进化策略提供一种催化性能明显改善的异亮氨酸羟化酶突变体，使用该异亮氨酸羟化酶突变体催化底物异亮氨酸羟化合成(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸，具有底物浓度高、反应条件温和、环境友好、产率高等显著优点。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的技术方案之一是：提供一种异亮氨酸羟化酶突变体，即提供一种可以作为异亮氨酸羟化酶的分离的蛋白质，其是将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第38位谷氨酰胺、第56位天冬酰胺、第88位苯丙氨酸、第123位苯丙氨酸、第135位天冬氨酸、第138位赖氨酸、第155位天冬酰胺、第162位异亮氨酸、第176位亮氨酸、第179位亮氨酸、第182位苏氨酸、第196位谷氨酸、第205位天冬氨酸、第226位谷氨酸、第228位天冬酰胺、第234位天冬氨酸和第236位亮氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质。

具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质命名为IDO。

本发明还提供多种较佳的异亮氨酸羟化酶突变体，其是由下述任一氨基酸序列组成的蛋白质：

(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第38位谷氨酰胺替换为组氨酸；

(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第56位天冬酰胺替换为酪氨酸；

(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第88位苯丙氨酸替换为亮氨酸；

(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第88位苯丙氨酸替换为丝氨酸；

(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位苯丙氨酸替换为亮氨酸；

(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第135位天冬氨酸替换为甘氨酸；

(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位赖氨酸替换为精氨酸；

(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第155位天冬酰胺替换为丝氨酸；

(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第162位异亮氨酸替换为天冬酰胺；

(10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第162位异亮氨酸替换为苏氨酸；

(11)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第176位亮氨酸替换为谷氨酰胺；

(12)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第179位亮氨酸替换为谷氨酰胺；

(13)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第182位苏氨酸替换为脯氨酸；

(14)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第182位苏氨酸替换为天冬酰胺；

(15)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第196位谷氨酸替换为甘氨酸；

(16)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第205位天冬氨酸替换为甘氨酸；

(17)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第226位谷氨酸替换为赖氨酸；

(18)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第228位天冬酰胺替换为丝氨酸；

(19)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第234位天冬氨酸替换为谷氨酸；

(20)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第236位亮氨酸替换为缬氨酸；

(21)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第38位谷氨酰胺替换为组氨酸，第155位天冬酰胺替换为丝氨酸，第182位苏氨酸替换为脯氨酸；

(22)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第56位天冬酰胺替换为酪氨酸，第205位天冬氨酸替换为甘氨酸；

(23)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第88位苯丙氨酸替换为亮氨酸，第176位亮氨酸替换为谷氨酰胺；

(24)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第88位苯丙氨酸替换为丝氨酸，第162位异亮氨酸替换为天冬酰胺；

(25)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位苯丙氨酸替换为亮氨酸，第226位谷氨酸替换为赖氨酸；

(26)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第135位天冬氨酸替换为甘氨酸，第196位谷氨酸替换为甘氨酸；

(27)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位赖氨酸替换为精氨酸，第179位亮氨酸替换为谷氨酰胺；

(28)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第162位异亮氨酸替换为苏氨酸，第182位苏氨酸替换为天冬酰胺；

(29)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第228位天冬酰胺替换为丝氨酸，第234位天冬氨酸替换为谷氨酸，第236位亮氨酸替换为缬氨酸。

本发明所述蛋白质的制备方法为本领域常规制备方法。所述制备方法较佳地为：将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到表达载体，将所得重组载体转化到表达宿主中，得到重组表达转化体；培养所得的重组表达转化体，分离纯化获得所述的蛋白质。所述制备方法也可以通过人工合成蛋白质的序列获得。

本发明的技术方案之二是：提供了编码所述异亮氨酸羟化酶突变体的核酸。所述核酸编码表达如技术方案一所述的进化改造获得的异亮氨酸羟化酶突变体，其来源包括：通过基因工程技术对技术方案一所述的系列异亮氨酸羟化酶突变体的基因序列进行克隆；或者通过人工全序列合成的方法得到编码如技术方案一所述异亮氨酸羟化酶突变体的核酸分子。

本发明的技术方案之三是：提供一种包含上述异亮氨酸羟化酶突变体核酸的重组表达载体。所述的重组表达载体可通过本领域常规方法，将编码本发明所述的异亮氨酸羟化酶突变体的核酸序列连接于各种市售空载载体上构建而成。所述的市售空载载体可以是本领域常规的各种质粒载体，只要所述重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制，并表达相应的羟化酶即可。针对不同的表达宿主，优选的质粒载体是不同的。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。对于大肠杆菌宿主，所述质粒载体优选为pET-28a(+)质粒。可通过下述方法制得本发明所述的大肠杆菌重组表达载体：将通过PCR扩增所得的异亮氨酸羟化酶突变体的基因DNA片段用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切，同时将空载质粒pET-28a(+)同样用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切，回收上述酶切后的异亮氨酸羟化酶突变体的DNA片段以及空载质粒，利用T

本发明的技术方案之四是：提供一种包含本发明所述异亮氨酸羟化酶突变体基因或其重组表达载体的重组表达转化体。可通过将已经构建好的重组表达载体转化至宿主细胞来制备重组表达转化体。所述宿主细胞为本领域的各种常规宿主细胞，只要所述的重组表达载体能够稳定地自行复制并能通过诱导剂诱导后有效表达目标蛋白质即可。本发明首选大肠杆菌作为宿主细胞，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)用于高效表达本发明所述的异亮氨酸羟化酶突变体。

本发明的技术方案之五是：提供一种重组异亮氨酸羟化酶突变体催化剂，所述的重组异亮氨酸羟化酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：

(1)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述异亮氨酸羟化酶突变体的转化体细胞；

(2)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述异亮氨酸羟化酶突变体的粗酶液；

(3)将所述异亮氨酸羟化酶突变体的粗酶液冷冻干燥得到的粗酶粉。

其中所述重组表达转化体的培养方法和条件为本领域常规的方法和条件，其包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组异亮氨酸羟化酶。对于重组大肠杆菌，优选培养基为LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 6.5-7.0。优选的培养方法为：将如上所述的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素的LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜。将种子液接入装有3L LB培养基(含卡那霉素)的5L发酵罐中，通过调整搅拌转速、补加碳源和氮源控制溶氧(DO)在30％以上，当培养液的OD

本发明的技术方案之六是：所述异亮氨酸羟化酶突变体或重组异亮氨酸羟化酶突变体催化剂的应用，包括以下步骤，在水溶液中，在辅底物氧气和α-酮戊二酸，辅因子Fe

所述的(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸由于具有依赖葡萄糖浓度而促进胰岛素分泌的作用在糖尿病药物市场上具有广泛的应用价值。

优选地，本发明所述底物浓度为100～1000mmol/L(13.1～131g/L)，所述α-酮戊二酸的用量为异亮氨酸摩尔量的1.0-2.0倍，所述异亮氨酸双加氧酶用量为10～250kU/L；所述的反应进程可以采用本领域中常规的检测方法，如液相色谱HPLC或薄板层析TLC进行监测，反应时间为2～96小时，或以底物浓度不再减少，或产物浓度不再增加的时间为准。

与现有技术相比，本发明的创新和改进效果在于：

本发明提供了一种催化性能更好的异亮氨酸羟化酶突变体，能够高效催化异亮氨酸进行羟化反应，制备光学纯的(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸。

本发明异亮氨酸羟化酶突变体能够催化30g/L异亮氨酸的羟化，实现99％以上的转化率，时空产率达到80.8g L

附图说明

图1为异亮氨酸羟化酶突变体对异亮氨酸进行羟化反应制得(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸的反应。

具体实施方式

本发明内容中所述的各反应或检测条件，可根据本领域常识进行组合或更改，并可通过实验得到验证。下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案和技术效果进行清楚、完整地描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

下列实施例中的材料来源为：

重组质粒pET28a-IDO，含有如序列表SEQ ID No.1所示的核酸序列，为发明人自行构建，在专利ZL 201811611461.7中也有公开。

空质粒载体pET-28a购自Novagen公司。

E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。

限制性内切酶EcoR I、Hind III均为New England Biolabs(NEB)公司的市售产品。

实施例中的mM为mmol/L的简写。

除非另有说明，下列实施例中的具体实验按照本领域常规方法和条件进行，或遵照试剂盒的商品说明书。

实施例1随机突变筛选活性提高的异亮氨酸羟化酶突变体

采用易错PCR技术对如序列表SEQ ID No.1所示编码异亮氨酸羟化酶IDO的核苷酸序列进行随机突变。

使用的引物为：

上游引物序列：CCG

下游引物序列：CCC

其中上游引物中GAATTC序列为EcoR I的酶切位点，下游引物中AAGCTT序列为HindIII的酶切位点。

以pET28a-IDO为模板，用rTaq DNA聚合酶进行易错PCR，构建随机突变体库。PCR体系(50μL)：rTaq DNA聚合酶0.5μL，10×PCR buffer(Mg

将转化平板上的转化子用灭菌牙签挑入96孔深孔板中，于37℃，220rpm摇床中培养过夜。从一级板中吸取50μL菌液接入二级板中，于37℃，220rpm摇床中培养2-3h后，加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃培养20h。然后于4℃、3500×g离心10min，倒掉上层培养基，每个孔中加入200μL溶菌酶液(750mg溶菌酶和10mg DNA酶溶解于1L去离子水中)，振荡混匀，再于37℃摇床上处理1.5h。随后4℃、3500×g离心10min，取20μL细胞破碎上清转移到包含480μL反应液的96孔深孔板中(反应液配方为：100mM KPB,pH 7.0，10mM异亮氨酸，10mMα-酮戊二酸，0.5mM V

通过筛选，发现将异亮氨酸羟化酶IDO第38位谷氨酰胺替换为组氨酸，56位天冬酰胺替换为酪氨酸，第88位苯丙氨酸替换为亮氨酸，第123位苯丙氨酸替换为亮氨酸，第135位天冬氨酸替换为甘氨酸，第138位赖氨酸替换为精氨酸，第155位天冬酰胺替换为丝氨酸，第162位异亮氨酸替换为天冬酰胺，第176位亮氨酸替换为谷氨酰胺，第179位亮氨酸替换为谷氨酰胺，第182位苏氨酸替换为脯氨酸，第196位谷氨酸替换为甘氨酸，第205位天冬氨酸替换为甘氨酸，第226位谷氨酸替换为赖氨酸，第228位天冬酰胺替换为丝氨酸，第234位天冬氨酸替换为谷氨酸，第236位亮氨酸替换为缬氨酸获得的优选突变体对异亮氨酸的活性显著提高。

实施例2重组异亮氨酸羟化酶突变体的纯化

将2.0g重组异亮氨酸羟化酶突变体的静息细胞用10mL的缓冲液(A液)重悬，冰水浴中进行超声破碎：400W功率，工作4s，间歇6s，进行99个循环，4℃下15000rpm离心40分钟，收集上清液，利用镍柱亲和层析进行蛋白纯化。以下为缓冲液配方：A液：KPB缓冲液(20mM,pH 7.0)，含有0.5M NaCl、10mM咪唑；B液：KPB缓冲液(20mM,pH 7.0)，含有0.5M NaCl、0.5M咪唑；C液：KPB缓冲液(25mM,pH 7.0)，150mM NaCl、1mM DTT。将异亮氨酸羟化酶粗酶液上样到镍柱上，首先用A液洗脱杂蛋白，随后用B液洗脱目标蛋白，超滤浓缩到一定体积后用C液进行置换，降低蛋白溶液中的咪唑浓度。根据SDS-PAGE检测的结果收集纯化的蛋白质，加入终浓度为20％(w/v)的甘油，于-80℃保存备用。

实施例3异亮氨酸羟化酶突变体活力测定

测活反应体系1mL：10mM异亮氨酸，10mMα-酮戊二酸，0.5mM Fe

GITC柱前衍生化方法：反应液加入相同体积的乙腈溶液终止反应，去除变性蛋白后取100μL上清液至2mL EP管中，加入150μL乙腈-水-三乙胺溶液(5mL-5mL-40mg)，再加入250μL GITC溶液(5mM，溶于乙腈)，30℃衍生化反应30min。

HPLC分析条件：使用配备有UV检测器的HPLC系统分析底物异亮氨酸和产物(2S,3R,4S)-4-HIL。Diomansil C18柱(5μm,250mm×4.6mm)，流动相为甲醇：水＝55:45，流动相流速0.8mL/min，柱温30℃，等梯度洗脱，紫外检测波长254nm。

在表1的列表中，序列标号分别指表1后面相对应的序列；突变体比活力提高倍数中，一个加号“+”表示突变体蛋白的比活力比由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质提高0.1-1倍；两个加号“++”表示突变体蛋白的比活力比由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质提高1-4倍；三个加号“+++”表示突变体蛋白的比活力比由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质提高4-10倍。

表1异亮氨酸羟化酶突变体序列及其比活力提高倍数

对应于序列标号的异亮氨酸羟化酶突变体的氨基酸序列分别如下：

(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第38位谷氨酰胺替换为组氨酸；

(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第56位天冬酰胺替换为酪氨酸；

(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第88位苯丙氨酸替换为丝氨酸；

(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第88位苯丙氨酸替换为亮氨酸；

(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位苯丙氨酸替换为亮氨酸；

(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第135位天冬氨酸替换为甘氨酸；

(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位赖氨酸替换为精氨酸；

(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第155位天冬酰胺替换为丝氨酸；

(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第162位异亮氨酸替换为天冬酰胺；

(10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第162位异亮氨酸替换为苏氨酸；

(11)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第176位亮氨酸替换为谷氨酰胺；

(12)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第179位亮氨酸替换为谷氨酰胺；

(13)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第182位苏氨酸替换为脯氨酸；

(14)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第182位苏氨酸替换为天冬酰胺；

(15)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第196位谷氨酸替换为甘氨酸；

(16)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第205位天冬氨酸替换为甘氨酸；

(17)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第226位谷氨酸替换为赖氨酸；

(18)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第228位天冬酰胺替换为丝氨酸；

(19)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第234位天冬氨酸替换为谷氨酸；

(20)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第236位亮氨酸替换为缬氨酸；

(21)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第38位谷氨酰胺替换为组氨酸，第155位天冬酰胺替换为丝氨酸，第182位苏氨酸替换为脯氨酸；

(22)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第56位天冬酰胺替换为酪氨酸，第205位天冬氨酸替换为甘氨酸；

(23)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第88位苯丙氨酸替换为亮氨酸，第176位亮氨酸替换为谷氨酰胺；

(24)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第88位苯丙氨酸替换为丝氨酸，第162位异亮氨酸替换为天冬酰胺；

(25)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第123位苯丙氨酸替换为亮氨酸，第226位谷氨酸替换为赖氨酸；

(26)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第135位天冬氨酸替换为甘氨酸，第196位谷氨酸替换为甘氨酸；

(27)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第138位赖氨酸替换为精氨酸，第179位亮氨酸替换为谷氨酰胺；

(28)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第162位异亮氨酸替换为苏氨酸，第182位苏氨酸替换为天冬酰胺；

(29)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第228位天冬酰胺替换为丝氨酸，第234位天冬氨酸替换为谷氨酸，第236位亮氨酸替换为缬氨酸。

实施例4重组异亮氨酸羟化酶突变体的发酵制备

将实施例1中所得的包含异亮氨酸羟化酶突变体IDO

实施例5重组异亮氨酸羟化酶突变体细胞破碎液、冻干细胞及冻干酶粉的制备

将100g实施例4中收获的重组细胞进行冷冻干燥，获得含有所述异亮氨酸羟化酶突变体的冻干细胞25g。将50g收获的重组细胞悬浮于0.4L的缓冲液中，高压匀浆破碎，离心收集上清液，即可获得所述重组异亮氨酸羟化酶突变体的粗酶液。收集的粗酶液放置在-80℃下冷冻，然后使用真空冷冻干燥机低温干燥，获得所述重组异亮氨酸羟化酶突变体的冻干酶粉10g。将所获得的冻干酶粉保存在4℃冰箱内，可以方便地使用。

实施例6 IDO

参考图1，在250mL摇瓶中装液量为50mL，底物异亮氨酸的上载量为100mM，α-酮戊二酸添加量为100mM，Fe

实施例7 IDO

在250mL摇瓶中装液量为50mL，底物异亮氨酸的上载量为230mM，α-酮戊二酸添加量为345mM，Fe

实施例8 IDO

在250mL摇瓶中装液量为50mL，底物异亮氨酸的上载量为0.5M，α-酮戊二酸添加量为1M，Fe

实施例9 IDO

在250mL摇瓶中装液量为50mL，底物异亮氨酸的上载量为1.0M，α-酮戊二酸添加量为1.5M，Fe

实施例10 IDO

在250mL摇瓶中装液量为50mL，底物异亮氨酸的上载量为1.0M，α-酮戊二酸添加量为1.5M，Fe

实施例11 IDO

在250mL摇瓶中装液量为50mL，底物异亮氨酸的上载量为1.0M，α-酮戊二酸添加量为1.5M，Fe

实施例12 3L规模IDO

反应在5L发酵罐中进行，装液量为3L，底物异亮氨酸的上载量为220mM，α-酮戊二酸添加量为330mM，Fe

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华东理工大学

苏州百福安酶技术有限公司

<120> 异亮氨酸羟化酶突变体及在(2S, 3R, 4S)-4-羟基异亮氨酸合成中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 741

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 1

atgctgacca ccgtgagcaa caagaccagc agcttcgacg tggaacaaaa cgttcacgag 60

tttgaaagca acggttatat tcagatcgcg aacgatattt tcctgcagga ccaagaagat 120

caggcgctgc tgaccaaggc gcaactggac tactatagcc tgcagaacga tctgtacggc 180

gagtgccgtg cgcgtgcgta cagccgttat atcaaatacg cgggtagcag cgactatgtg 240

ctggacaccg ataacggcta cttccaaagc gaggaataca actatgacga tggtggcaag 300

attcgtaact tcaacagcat caccgacgag tttctgcaca acagcctgat tgaaaaaatc 360

gttcgttttg atagcgagtt cgcgtttaac accaacatcc tggacaccag caaggatatc 420

attatcggtc tgcaccaagt gcgttataaa gcgacccgtg aaaacccgag cttcagcagc 480

ccgatttggc tgaataagga cgatgagccg atcgtttttc tgcacctgat gaacctgagc 540

aacaccgcgc tgggtggcga caacctgatt gcgaacagcc cgcgtgaaat taacaagttc 600

atcagcctga aagatccgct ggagaccctg gttttcggtc aaaaagtgtt tcatgcggtt 660

accccgctgg gtaccgagtg caacaccgaa gcggtgcgtg atatcctgct ggttaccttt 720

agctacaagg agccgaaata a 741

<210> 2

<211> 246

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 2

Met Leu Thr Thr Val Ser Asn Lys Thr Ser Ser Phe Asp Val Glu Gln

1 5 10 15

Asn Val His Glu Phe Glu Ser Asn Gly Tyr Ile Gln Ile Ala Asn Asp

20 25 30

Ile Phe Leu Gln Asp Gln Glu Asp Gln Ala Leu Leu Thr Lys Ala Gln

35 40 45

Leu Asp Tyr Tyr Ser Leu Gln Asn Asp Leu Tyr Gly Glu Cys Arg Ala

50 55 60

Arg Ala Tyr Ser Arg Tyr Ile Lys Tyr Ala Gly Ser Ser Asp Tyr Val

65 70 75 80

Leu Asp Thr Asp Asn Gly Tyr Phe Gln Ser Glu Glu Tyr Asn Tyr Asp

85 90 95

Asp Gly Gly Lys Ile Arg Asn Phe Asn Ser Ile Thr Asp Glu Phe Leu

100 105 110

His Asn Ser Leu Ile Glu Lys Ile Val Arg Phe Asp Ser Glu Phe Ala

115 120 125

Phe Asn Thr Asn Ile Leu Asp Thr Ser Lys Asp Ile Ile Ile Gly Leu

130 135 140

His Gln Val Arg Tyr Lys Ala Thr Arg Glu Asn Pro Ser Phe Ser Ser

145 150 155 160

Pro Ile Trp Leu Asn Lys Asp Asp Glu Pro Ile Val Phe Leu His Leu

165 170 175

Met Asn Leu Ser Asn Thr Ala Leu Gly Gly Asp Asn Leu Ile Ala Asn

180 185 190

Ser Pro Arg Glu Ile Asn Lys Phe Ile Ser Leu Lys Asp Pro Leu Glu

195 200 205

Thr Leu Val Phe Gly Gln Lys Val Phe His Ala Val Thr Pro Leu Gly

210 215 220

Thr Glu Cys Asn Thr Glu Ala Val Arg Asp Ile Leu Leu Val Thr Phe

225 230 235 240

Ser Tyr Lys Glu Pro Lys

245

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccggaattca tgctgaccac cgtgagcaac aa 32

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaagcttt tatttcggct ccttgtagct 30