一种基于Nicking酶的分子锁构造方法

摘要

本发明公开了一种基于Nicking酶的分子锁构造方法，包括：根据Nicking酶的切刻特性原理通过DNA链置换技术构造逻辑计算模块；设计Nicking酶识别域的位置、从而构成两个Nicking酶的抑制作用并构造抑制模块；根据Nicking酶的切刻特性和抑制模块构造DNA分子锁。该方法首先通过Nicking酶的切刻特性，构造出逻辑计算模块。随后利用多个Nicking酶的相互作用构造出抑制模块，最后，基于上述构造的逻辑计算模块，构造出一个基于Nicking酶的具有自毁保护机制的DNA分子锁。

说明书

技术领域

本发明涉及生物计算领域，尤其涉及一种基于Nicking酶的分子锁构造方法。

背景技术

近年来，DNA纳米技术取得了飞速的发展，尤其是DNA分子与核酶、限制性核酸内切酶、金属离子等材料的结合，使得DNA分子广泛的用于构建各种纳米设备。其中，Nicking酶作为一种限制性核酸内切酶，能够对DNA双链进行特异性识别，并对相应的位置进行切刻，从而促进或者抑制反应的进行。利用该特性，Nicking酶成为了构建DNA分子设备的有力工具。随着人们对于信息安全的关注度越来越高，如何在分子水平上实现信息保护已经成为当前的焦点。分子锁作为一种智能的分子传感器，对于分子水平上的信息的保护展现了巨大的潜力。

然而当前大多数的分子锁装置虽然实现了基本的分子锁功能，但是缺乏自身的保护机制。当侵入者非法闯入时，进行穷举式密码破解，在一定的时间内可以破解系统，获取保护的信息。从而使得分子锁的安全性大大降低。

发明内容

根据现有技术存在的问题，本发明公开了一种基于Nicking酶的分子锁构造方法，具体包括如下步骤：

根据Nicking酶的切刻特性原理通过DNA链置换技术构造逻辑计算模块；

设计Nicking酶识别域的位置、从而构成两个Nicking酶的抑制作用并构造抑制模块；

根据Nicking酶的切刻特性和抑制模块构造DNA分子锁。

进一步的，通过Nicking酶的切刻特性构建逻辑计算模块，将Nicking酶作为计算模块的输入从而实现逻辑计算模块的执行。

进一步的，在构造抑制模块的过程中，通过设计Nicking酶识别域的位置从而实现抑制作用。

进一步的，通过Nicking酶作为密码构建出的DNA分子锁装置具有自毁保护机制。

由于采用了上述技术方案，本发明提供的一种基于Nicking酶的分子锁构造方法，该方法首先通过Nicking酶的切刻特性，构造出逻辑计算模块。随后利用多个Nicking酶的相互作用构造出抑制模块，最后，基于上述构造的逻辑计算模块，构造出一个基于Nicking酶的具有自毁保护机制的DNA分子锁。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为基于Nicking酶的逻辑计算模块示意图；

图2为抑制模块示意图；

图3为逻辑计算模块结果图；

图4为抑制模块结果图；

图5为分子锁结果图。

具体实施方式

为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚完整的描述：

如图1所示的一种基于Nicking酶的分子锁构造方法，该方法利用Nicking酶的切刻特性以及链置换技术，构造出逻辑计算模块，进而构造出抑制模块，最终构造出具有自毁保护机制的DNA分子锁，该方法中的DNA分子锁装置能够模拟实现电子锁的功能，具有自毁保护机制，进一步提高了分子锁的安全性，该方法具体包括如下步骤：

首先基于Nicking酶的切刻特性以及DNA链置换技术，构造出逻辑计算模块，如图1所示。在该逻辑计算模块中，将Nicking酶作为计算模块的输入，当输入Nicking酶时，激活计算模块，从而对双链A:B进行切刻，此时由于A3较短无法继续绑定在双链A:B上，最后脱落下来，双链A:B转换成A2:B，并且暴露出Toehold区域，触发了链C与其发生链置换反应产生下游输入的产物A2。在双链A2-F:B-B中，链A2-F的3端修饰了荧光团FAM，B-B的5端修饰了猝灭剂BHQ1。A2作为下游反应的输入，与双链A2-F:B-B发生反应，使得链A2-F和B-B分离，从而产生荧光信号。

其次，通过精心设计Nicking酶识别域的位置，实现两个Nicking酶之间的抑制作用，构造出抑制模块，如图2所示。在该抑制模块中，我们将两种Nicking酶作为模块的输入，仅有A存在时，才能触发模块的输出。当输入B时，由于没有A的激活，所以不会产生模块的输出。同样，当A、B同时输入时，虽然此时A激活了模块，但是由于B的存在使得用于下游反应的产物损坏，所以也不会触发模块的输出。最后，利用抑制模块的构造原理，我们通过对Nicking酶识别域的位置，实现了具有自毁保护机制的DNA分子锁。此处给出了抑制模块的构造方法，但本发明的保护范围不限于这一种基于Nicking酶的抑制模块的构造的结构。

实施例中的DNA序列购自上海生工，其中DNA序列经过PAGE纯化，荧光修饰的DNA序列经过HPLC纯化，所用Nicking酶购自NEW ENGLAN Biolabs(NEB)。

实施例中应用的试剂为：EDTA2Na、Tris、冰乙酸、醋酸镁、过硫酸铵、聚丙烯酰胺、N,N-亚甲基二丙烯酰胺、CutSmart、四甲基乙二胺和Stains all。CutSmart缓冲液：50mM醋酸钾,20mM Tris-乙酸,10mM醋酸镁,100ug/ml BSA,pH＝7.9。所有DNA链通过Nanodrop2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific Inc.USA)在吸光度λ＝260nm进行浓度测定。荧光信号采用酶标仪(Tecan，Spark)检测，吸收波长为492nm，发射波长为518nm。所有模块的实验均通过以下退火方式制备：首先将形成双链的DNA单链在1xCutSmart缓冲液中1:1混合进行退火，退火程序为90℃5分钟，88℃5分钟，随后按照每分钟0.8℃的速率降至22℃。链置换反应条件为1xCutSmart缓冲液，37℃1小时。荧光检测条件为1xCutSmart缓冲液，37℃，实施例的结果检测采用荧光信号检测的方式。

实施例1逻辑计算模块的构建

根据图1中逻辑计算模块的构造方法，图3给出了逻辑计算模块的结果分析。我们可以看到，当存在输入时，会产生强烈的输出信号。相反，当没有输入信号时，计算模块不会产生输出信号。说明了我们所构造的逻辑计算模块能够对输入做出正确的响应。

实施例2抑制模块的构建

根据图2中抑制模块的构造方法，图4给出了抑制模块的结果分析。我们可以看到，当输入A存在时，模块能产生明显的输出信号。相反，当输入信号B存在时以及A、B同时存在时，并不会产生明显的输出信号。对比没有输入的情况，结果形成了鲜明的对比。说明抑制模块对四种输入均能给出正确的输出结果。

实施例3DNA分子锁的构建

最后我们给出了DNA分子锁的结果，如图5所示。我们将正确的密码设置为A-B-C，我们可以看到，只有输入A-B-C时，分子锁才会给出响应。相反，其它五种结果没有明显的输出响应。对比没有输入的情况，充分的说明了我们所构造的分子锁装置能够对正确的输入做出正确的响应。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。