一种化合物、中药益生菌发酵产物及其在制备具有抗癌作用的药物或保健品中的应用

摘要

本发明涉及生物医学技术领域，具体公开了一种化合物、中药益生菌发酵产物及其在制备具有抗癌作用的药物或保健品中的应用。所述的化合物具有式(Ⅰ)所示的结构。所述的中药益生菌发酵产物，包含式(Ⅰ)化合物；其制备方法包含如下步骤：(1)取中药原料用益生菌进行发酵，得发酵液；(2)将发酵液进行干燥后即得所述的中药益生菌发酵产物；步骤(1)中所述的中药原料为包含姜黄、女贞子、黄芪、金银花、三七、丹参和党参的中药原料。本发明所述的式(Ⅰ)化合物以及中药益生菌发酵产物具有优异的抗癌作用，尤其是抗胃癌作用；可以用于制备药物和保健品。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种化合物、中药益生菌发酵产物及其在制备具有抗癌作用的药物或保健品中的应用。

背景技术

胃癌是指源于胃粘膜上内皮细胞的恶性肿瘤，主要为胃腺癌。胃癌占胃部恶性肿瘤的95％以上。2008年全球新诊断出胃癌近100万例，病死人数74万，分别居于全部恶性肿瘤诊断病例的第4位和恶性肿瘤病死率的第2位。虽然胃癌全球发病率有所下降，但2/3的胃癌病例仍分布在发展中国家。从地理分布上看，以中国、日本等东南亚国家较为高发。在我国，胃癌仍是常见的恶性肿瘤之一，其发病率因地区存在很大差异，北方高于南方、农村高于城市。男性胃癌的发病率和死亡率均高于女性，且55～70岁为高发年龄段。

胃癌的发生主要是由于在不良环境、饮食和Hp等多种因素的刺激下，COX-2及生长因子(表皮生长因子、转化生长因子-α)等介导发生慢性炎症，按照Correa描述的肠型胃癌的发生顺序，由慢性炎症—萎缩性胃炎—萎缩性胃炎伴肠化—异型增生而逐渐向胃癌演变。在此过程中，胃粘膜细胞增值与凋亡之间的正常的动态平衡被打破，基因发生突变；与胃癌发生相关的基因，如Ras基因、C-myc和Bcl-2活化；抑癌基因包括p53、APC、DCC等被抑制，胃上皮细胞过度增殖又不能皮冻凋亡信号，逐渐发展为胃癌。

癌症主要的治疗手段包括手术治疗、化疗及放疗。早期胃癌没有淋巴转移时，可采取内镜下粘膜切除术；进展期胃癌在没有全身转移的时候，可实行手术治疗。胃癌的预后直接与诊断的分期有关，迄今为止，手术仍是胃癌最主要的治疗手段。但由于胃癌早期诊断率低(约10％)，大部分胃癌在确诊时已经处于中晚期，5年生存率约为7％～34％。胃癌的治疗不仅仅包括内镜治疗、手术治疗和化疗，其他包括中医中药治疗、光动力学治疗、介入治疗和营养支持治疗等。

中药治疗癌症有着悠久的历史，早在《内径》等中医学著作中有相关记载。如中医治疗噎膈症(食道癌)、乳岩症(乳腺肿瘤)等，随着传统医学与现代医学的发展，中药的作用正在从提高肿瘤患者免疫力的辅助治疗，进入到标本兼治、直接抑制肿瘤细胞生长与增值、杀死杀伤肿瘤细胞的重要环节，抑制癌细胞的同时保护免疫机制，这也是中药独特的特征。同时中药以其应用历史悠久、价格低廉、药源广泛、疗效好、毒性低等优势，在肿瘤的治疗前景的作用也越来越宽广。

胃癌可导致系统紊乱，进一步导致肠道菌群的紊乱。益生菌减少可导致肠道菌群失调，病原菌乘机大量繁殖，其代谢产物中某些细菌酶能催化致癌前体物质向致癌物质转化，并随血流到达乳腺等肠外器官而发挥致癌作用。益生菌可恢复肠道菌群平衡，拮抗肠道中病原菌生长，使细菌酶的产生及活性降低，还可结合致癌物质随粪便排出，减少了其形成、活化及滞留机会。中药、果蔬中除富含具有生物活性的小分子化合物外，还含有大量蛋白质及肽类化合物。其中，生物活性的小分子化合物经肠道益生菌代谢后的代谢产物对肿瘤具有较好的亲和力和较强的特异性，因此更容易渗透到组织中，再者就是此类化合物具有低毒性等优点，还可以增加对肿瘤治疗的敏感度，因此成为近年来抗肿瘤治疗新型抗癌方法研究的热点之一。

发明内容

鉴于此，本发明首先提供一种新化合物，经进一步研究表明，该新化合物具有抗癌作用；尤其是抗胃癌作用。

此外，本发明还提供一种中药益生菌发酵产物，该中药益生菌发酵产物同样具有抗癌作用；尤其是抗胃癌作用。

另外，本发明还提供了一种上述新化合物和中药益生菌发酵产物的制备方法以及应用。

本发明的详细技术方案如下：

一种式(Ⅰ)化合物或其可药用盐；

式(Ⅰ)化合物命名为：

N-(3-(2-amino-3-phenylpropanamido)propyl)-3,4,5-trimethoxybenzamide。

优选地，所述可药用盐为可药用酸加成盐，其中所述酸选自：柠檬酸、酒石酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、富马酸、马来酸、盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸和硫酸。

本发明提供一种式(Ⅰ)化合物的制备方法，其包含如下步骤：

(1)取中药原料用益生菌进行发酵，得发酵液；

(2)将发酵液进行干燥后得粗产物；

(3)将粗产物用色谱技术进行分离，即得式(Ⅰ)化合物；

步骤(1)中所述的中药原料为包含姜黄、女贞子、黄芪、金银花、三七、丹参和党参的中药原料；或为包含姜黄提取物、女贞子提取物、黄芪提取物、金银花提取物、三七提取物、丹参提取物和党参提取物的中药原料；

步骤(1)中所述的益生菌选自嗜酸乳杆菌、婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌中的一种或二种以上的混合。

本发明中涉及的提取物均是常规的医药原料，可以通过购买得到。也可以采用乙醇通过常规的方法(如加热回流提取、超声提取或浸提等方法)提取得到。

优选地，步骤(1)的具体方法为：取中药原料、益生菌干粉以及水混合后，在温度为20～30℃、pH为5～6的条件下发酵16～30h，得发酵液；

所述中药原料、益生菌干粉以及水的重量用量比为：30～50：8～15：50～70。

优选地，步骤(1)中所述的中药原料中姜黄、女贞子、黄芪、金银花、三七、丹参和党参的重量用量比为1～5：1～5：1～5：1～5：1～5：1～5：1～5。

最优选地，步骤(1)中所述的中药原料中姜黄、女贞子、黄芪、金银花、三七、丹参和党参的重量用量比为1：1：1：1：1：1：1。

优选地，步骤(1)中所述的中药原料中姜黄提取物、女贞子提取物、黄芪提取物、金银花提取物、三七提取物、丹参提取物和党参提取物的重量用量比为1～5：1～5：1～5：1～5：1～5：1～5：1～5。

最优选地，步骤(1)中所述的中药原料中姜黄提取物、女贞子提取物、黄芪提取物、金银花提取物、三七提取物、丹参提取物和党参提取物的重量用量比为1：1：1：1：1：1：1。

优选地，步骤(1)中所述的益生菌为益生菌干粉，其中嗜酸乳杆菌干粉、婴儿双歧杆菌干粉以及短双歧杆菌干粉的重量用量比为1～5：1～5：1～5。

最优选地，步骤(1)中所述的益生菌为益生菌干粉，其中嗜酸乳杆菌干粉、婴儿双歧杆菌干粉以及短双歧杆菌干粉的重量用量比为1：1：1。

优选地，步骤(3)中所述的色谱技术为制备型HPLC技术；所述的制备型HPLC技术的具体条件为：采用反相色谱柱；选用紫外检测器，检测波长为220～230nm；以0.1～0.3体积％的三氟乙酸水溶液为流动相A，以0.1～0.3体积％的三氟乙酸乙腈溶液为流动相B，流动相A：流动相B＝78：22；收集8.8～9.8min色谱峰对应的部位，浓缩干燥后即得式(Ⅰ)化合物。

本发明还提供一种中药益生菌发酵产物，其包含式(Ⅰ)化合物。

本发明还提供一种上述中药益生菌发酵产物的制备方法，其包含如下步骤：

(1)取中药原料用益生菌进行发酵，得发酵液；

(2)将发酵液进行干燥后即得所述的中药益生菌发酵产物；

步骤(1)中所述的中药原料为包含姜黄、女贞子、黄芪、金银花、三七、丹参和党参的中药原料；或为包含姜黄提取物、女贞子提取物、黄芪提取物、金银花提取物、三七提取物、丹参提取物和党参提取物的中药原料；

步骤(1)中所述的益生菌选自嗜酸乳杆菌、婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌中的一种或二种以上的混合。

优选地，步骤(1)的具体方法为：取中药原料、益生菌干粉以及水混合后，在温度为20～30℃、pH为5～6的条件下发酵16～30h，得发酵液；

所述中药原料、益生菌干粉以及水的重量用量比为：30～50：8～15：50～70。

优选地，步骤(1)中所述的中药原料中姜黄、女贞子、黄芪、金银花、三七、丹参和党参的重量用量比为1～5：1～5：1～5：1～5：1～5：1～5：1～5。

最优选地，步骤(1)中所述的中药原料中姜黄、女贞子、黄芪、金银花、三七、丹参和党参的重量用量比为1：1：1：1：1：1：1。

优选地，步骤(1)中所述的中药原料中姜黄提取物、女贞子提取物、黄芪提取物、金银花提取物、三七提取物、丹参提取物和党参提取物的重量用量比为1～5：1～5：1～5：1～5：1～5：1～5：1～5。

最优选地，步骤(1)中所述的中药原料中姜黄提取物、女贞子提取物、黄芪提取物、金银花提取物、三七提取物、丹参提取物和党参提取物的重量用量比为1：1：1：1：1：1：1。

优选地，步骤(1)中所述的益生菌为益生菌干粉，其中嗜酸乳杆菌干粉、婴儿双歧杆菌干粉以及短双歧杆菌干粉的重量用量比为1～5：1～5：1～5。

最优选地，步骤(1)中所述的益生菌为益生菌干粉，其中嗜酸乳杆菌干粉、婴儿双歧杆菌干粉以及短双歧杆菌干粉的重量用量比为1：1：1。

本发明还提供式(Ⅰ)化合物或其可药用盐或上述中药益生菌发酵产物在制备药物或保健品中的应用。

优选地，所述的药物为具有抗癌作用的药物。

最优选地，所述的药物为具有抗胃癌作用的药物。

优选地，所述的药物或保健品含有式(Ⅰ)化合物或其可药用盐或中药益生菌发酵产物和载体；所述式(Ⅰ)化合物或其可药用盐或中药益生菌发酵产物的质量分数为5％～95％。

进一步优选地，所述载体包括溶剂、聚合物和脂质体中的至少一种。更进一步优选地，所述溶剂包括但不限于水、生理盐水，以及其他非水性溶剂。更进一步优选地，所述聚合物包括但不限于为聚赖氨酸、聚乙烯亚胺及其改性物、壳聚糖、聚乳酸、明胶。更进一步优选地，所述脂质体可以但不限于为胆固醇、豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂。

更进一步优选地，所述载体还包括稀释剂和赋形剂中的一种或多种。具体地，所述稀释剂包括淀粉类、糖类、纤维素类和无机盐中的一种或多种。具体地，所述赋形剂包括片剂中的黏合剂、填充剂、润滑剂，半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分，液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、着色剂中的一种或多种。

进一步优选地，所述式(Ⅰ)化合物或其可药用盐或中药益生菌发酵产物的质量分数为10％～90％、15％～85％或30％～80％。

进一步优选地，所述药物或保健品还可以包括第二活性成分。所述第二活性成分根据所述药物或保健品的用途进行选择，在此不作限定。具体的，包括但不限于，当所述组合物用于抗胃癌时，所述第二活性成分具有抗胃癌，可选的，所述第二活性成分包括维生素C、维生素E、辅酶Q、谷胱甘肽、胡萝卜素和甜菜碱中的至少一种；当所述组合物用于抗胃癌以及抗炎时，所述第二活性成分至少具有抗炎活性。

进一步优选地，所述组合物中所述第二活性成分的质量分数为1％～70％。

优选地，所述保健品或药物的形式包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂。

优选地，所述保健品的形式还包括、凝胶状或水剂状。

进一步优选地，所述保健品还包括辅料基质，所述辅料基质包括单糖、寡糖、多糖、氨基酸、防腐剂和pH调节剂中的一种或多种。

有益效果：(1)本发明提供了一种全新的式(Ⅰ)化合物、中药益生菌发酵产物及其制备方法；所述的式(Ⅰ)化合物、中药益生菌发酵产物具有优异的抗癌作用，尤其是抗胃癌作用；可以用于制备药物和保健品；(2)在本发明实验中，通过建立体外式(Ⅰ)化合物、中药益生菌发酵产物抗胃癌(GC)细胞增殖实验模型进行试验，发现所述式(Ⅰ)化合物、中药益生菌发酵产物可以通过提高细胞内ROS降低线粒体膜电位，从而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，达到抗肿瘤目的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明式(Ⅰ)化合物的质谱图；其中1a为正离子模式质谱图；1b为负离子模式质谱图。

图2是本发明式(Ⅰ)化合物的核磁共振氢谱图。

图3是本发明式(Ⅰ)化合物的核磁共振碳谱图。

图4是本发明中药益生菌发酵产物及式(Ⅰ)结构的单体化合物对GC肿瘤细胞的促凋亡作用影响。

图5是本发明中药益生菌发酵产物及式(Ⅰ)结构的单体化合物对GC肿瘤细胞细胞周期的影响。

图6是本发明中药益生菌发酵产物及式(Ⅰ)结构的单体化合物对GC肿瘤细胞中ROS及线粒体膜电位的影响，其中图6中(a)为ROS含量测定图，图6中(b)为线粒体膜电位变化测定图。

图7是本发明中药益生菌发酵产物及式(Ⅰ)结构的单体化合物对GC肿瘤细胞中相关促细胞凋亡信号通路中蛋白表达的影响，其中图7中(A)为对Bcl-2家族蛋白的影响测定图，图7中(B)为对Caspase相关蛋白的影响测定图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1式(Ⅰ)化合物的制备

(1)取中药原料30g、益生菌干粉10g于三维混合机中混合至色泽均匀一致，然后加入水50g，在温度为25℃、pH为5.5的条件下发酵24h，得发酵液；

(2)将发酵液于8000r/min离心30min，除去沉淀并保留上清液，对上清液进行冷冻干燥，得粗产物；

(3)将粗产物用色谱技术进行分离，即得式(Ⅰ)化合物；

步骤(1)中所述的中药原料由姜黄提取物、女贞子提取物、黄芪提取物、金银花提取物、三七提取物、丹参提取物和党参提取物按重量比1：1：1：1：1：1：1组成；所述的益生菌干粉由嗜酸乳杆菌干粉、婴儿双歧杆菌干粉以及短双歧杆菌干粉按重量比1：1：1组成；

步骤(3)中所述的色谱技术为制备型HPLC技术；所述的制备型HPLC技术的具体条件为：采用ODS反相色谱柱；选用紫外检测器，检测波长为220nm；以0.2体积％的三氟乙酸水溶液为流动相A，以0.2体积％的三氟乙酸乙腈溶液为流动相B，流动相A：流动相B＝78：22；收集8.8～9.8min色谱峰对应的部位，浓缩干燥后即得式(Ⅰ)化合物。

式(Ⅰ)化合物的质谱、氢谱及碳谱数据如下(具体见图1～3)：MS质谱数据显示416.2为[M+H]

经上述质谱、氢谱及碳谱数据解析，可以确定上述方法制备得到了式(Ⅰ)化合物N-(3-(2-amino-3-phenylpropanamido)propyl)-3,4,5-trimethoxybenzamide。

实施例2式(Ⅰ)化合物的制备

(1)取中药原料300g、益生菌干粉100g于三维混合机中混合至色泽均匀一致，然后加入水500g，超声提取60min；接着在在温度为25℃、pH为5.5的条件下发酵30h，得发酵液；

(2)将发酵液于8000r/min离心30min，除去沉淀并保留上清液，对上清液进行冷冻干燥，得粗产物；

(3)将粗产物用色谱技术进行分离，即得式(Ⅰ)化合物；

步骤(1)中所述的中药原料由姜黄、女贞子、黄芪、金银花、三七、丹参和党参按重量比1：1：1：1：1：1：1组成；所述的益生菌干粉由嗜酸乳杆菌干粉、婴儿双歧杆菌干粉以及短双歧杆菌干粉按重量比1：1：1组成；

步骤(3)中所述的色谱技术为制备型HPLC技术；所述的制备型HPLC技术的具体条件为：采用ODS反相色谱柱；选用紫外检测器，检测波长为220nm；以0.2体积％的三氟乙酸水溶液为流动相A，以0.2％的三氟乙酸乙腈溶液为流动相B，流动相A：流动相B＝78：22；收集8.8～9.8min色谱峰对应的部位，浓缩干燥后即得式(Ⅰ)化合物(质谱、氢谱及碳谱数据与实施例1一致)。

实施例3中药益生菌发酵产物的制备

(1)取中药原料30g、益生菌干粉10g于三维混合机中混合至色泽均匀一致，然后加入水50g，在温度为25℃、pH为5.5的条件下发酵24h，得发酵液；

(2)将发酵液于8000r/min离心30min，除去沉淀并保留上清液，对上清液进行冷冻干燥，得中药益生菌发酵产物；

步骤(1)中所述的中药原料由姜黄提取物、女贞子提取物、黄芪提取物、金银花提取物、三七提取物、丹参提取物和党参提取物(所述的提取物均是常规的医药原料，可以通过购买得到)按重量比1：1：1：1：1：1：1组成；所述的益生菌干粉由嗜酸乳杆菌干粉、婴儿双歧杆菌干粉以及短双歧杆菌干粉按重量比1：1：1组成。

实施例4中药益生菌发酵产物的制备

(1)取中药原料300g、益生菌干粉100g于三维混合机中混合至色泽均匀一致，然后加入水500g，超声提取60min；接着在在温度为25℃、pH为5.5的条件下发酵30h，得发酵液；

(2)将发酵液于8000r/min离心30min，除去沉淀并保留上清液，对上清液进行冷冻干燥，得中药益生菌发酵产物。

步骤(1)中所述的中药原料由姜黄、女贞子、黄芪、金银花、三七、丹参和党参按重量比1：1：1：1：1：1：1组成；所述的益生菌干粉由嗜酸乳杆菌干粉、婴儿双歧杆菌干粉以及短双歧杆菌干粉按重量比1：1：1组成。

对比例1中药提取物

取中药原料300g于三维混合机中混合至色泽均匀一致，然后加入水500g，超声提取60min，将提取液浓缩干燥得中药提取物。

实验例1

为了评估本发明上述方法制备得到的中药益生菌发酵产物及式(Ⅰ)结构的单体化合物的效果，进行如下效果实验。

(1)将GC肿瘤SGC-7901细胞在37℃进行培养，并随机分成4组，每组3个平行对照组，分别是正常对照组(简写为Control)及对比例1制备得到的中药提取物组(简写为TCM)、式(Ⅰ)单体化合物组(简写为SC)以及实施例3制备得到的中药益生菌发酵产物组(简写为TCMPM)，10.7μg/mL药物与SGC-7901细胞共培养48h，然后测定其对SGC-7901细胞增殖的影响。结果如图4所示，中药益生菌发酵产物和式(Ⅰ)单体化合物可以较明显的促进SGC-7901细胞凋亡，TCM组、TCMPM组、SC组的细胞凋亡比例与正常对照组相比，分别提高4.09％、8.51％、21.3％。结果如图5所示，中药提取物、中药益生菌发酵产物和式(Ⅰ)单体化合物均可明显的将SGC-7901细胞阻滞于G0/G1期，TCM组、TCMPM组、SC组的细胞G0/G1期与正常对照组相比，分别增加4.41％、36.2％、41.8％。

(2)将GC肿瘤SGC-7901细胞在37℃进行培养，并随机分成4组，每组3个平行对照组，分别是正常对照组(简写为Control)及对比例1制备得到的中药提取物组(简写为TCM)、式(Ⅰ)单体化合物组(简写为SC)以及实施例3制备得到的中药益生菌发酵产物组(简写为TCMPM)，10.7μg/mL药物与SGC-7901细胞共培养48h，然后测定其对SGC-7901细胞内ROS及线粒体膜电位的影响。DCFH-DA可通过细胞内酯酶水解而通过细胞膜产生DCFH。ROS可氧化DCFH产生荧光DCF。因此，检测DCF荧光可以揭示ROS的水平。实验结果图6a，6b显示，相比于Control组，TCM组、TCMPM组、SC组SGC-7901细胞内ROS含量与显著增高，细胞膜电位下降细胞比例显著增加。

(3)将GC肿瘤SGC-7901细胞在37℃进行培养，并随机分成4组，每组3个平行对照组，分别是正常对照组(简写为Control)及对比例1制备得到的中药提取物组(简写为TCM)、式(Ⅰ)单体化合物组(简写为SC)以及实施例3制备得到的中药益生菌发酵产物组(简写为TCMPM)，10.7μg/mL药物与SGC-7901细胞共培养48h，然后测定其对SGC-7901细胞内相关细胞凋亡通路蛋白表达的影响。实验结果图7A，7B显示，相比于正常组，TCM组、TCMPM组、SC组对相关Caspase、Bcl-2家族相关蛋白的表达具有明显的影响。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。