治疗新生儿缺氧缺血性脑病的方法

摘要

本发明属于医学治疗领域。它提供了治疗新生儿窒息引起的急性或亚急性脑损伤的手段和方法。现已发现，通过向需要这种治疗的受试者施用包含膜联蛋白A1的组合物可以有效地治疗新生儿缺氧缺血性脑病。因此，本发明涉及通过对早产新生儿施用包含膜联蛋白A1的组合物来治疗新生儿缺氧缺血性脑病。

说明书

技术领域

本发明属于医学治疗领域。它提供了治疗早产新生儿窒息所致的急性或亚急性脑损伤的手段和方法。更特别地，其提供对新生儿缺氧缺血性脑病的治疗。

背景技术

围产期窒息，更恰当地称为新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)，其可以由窒息引起的急性或亚急性脑损伤的临床表现和实验证据来表征。这种疾病的主要原因是系统性低氧血症和/或低脑血流量(CBF)。出生窒息导致全球840,000例或23％的新生儿死亡[1,2,3]。

新生儿缺氧缺血性脑病是一种神经系统疾病，其因供氧不足而对新生儿的脑细胞造成损害。全身性低氧血症和低脑血流量(CBF)引起的脑缺氧和缺血是导致新生儿HIE并发新生儿灰质和白质损伤的主要原因。新生儿HIE可能会导致新生儿期死亡或造成后期确认的发育迟缓、智力障碍或脑瘫(CP)。即使最近已经研发出不同的治疗策略，新生儿HIE仍然是一种严重的疾病，其在接近足月、早产和足月新生儿中造成显著的死亡率和发病率，因此，它仍然是围产期医学的挑战。

患有缺氧缺血(HI)所致脑损伤的足月新生儿目前以降温疗法治疗。但是，该疗法仅对早产新生儿中的轻微症病例有效，且相关结果不佳，故将其排除在任何疗法之外。

最近，本发明人发现，静脉注射间充质干细胞(MSC)、多能成体祖细胞(MAPC)或源于所述细胞的细胞外囊泡(EV)在全身(global)缺氧缺血(HI)后早产脑损伤的转化(translational)绵羊模型中具有神经保护作用[4]。此类疗法需要培养真核细胞或源于真核细胞的产物，并将其施用到受试者。这引起了关于治疗的安全性的问题，以及对手术的成本和后续安排的关注，特别是当这种细胞被存活状态下施用时。

因此，尚需针对HIE的更好、安全、可靠和可负担的治疗。

发明内容

现已发现，通过施用包含膜联蛋白A1或其等同物的组合物可以有效地治疗新生儿缺氧缺血性脑病。因此，本发明涉及一种包含膜联蛋白A1或其等同物的组合物，该组合物用于治疗由缺血性事件引起的新生儿缺氧性脑病，其中，在缺血性事件后24小时内向新生儿施用所述包含膜联蛋白A1或其等同物的组合物，条件是该组合物不包含间充质干细胞(MSC)、多能成体祖细胞(MAPC)或源于所述细胞的细胞外囊泡(EV)。

如示例1中所述，我们采用了已建立的针对HIE的活体内绵羊模型系统。本文中，使用围绕脐带的可充气血管闭塞器将脐带阻塞，以诱发全身短暂性缺氧缺血(HI)。

本文所述的我们的实验研究表明，HI后4-6小时血脑屏障(BBB)的通透性增加，并伴有内皮细胞紧密连接蛋白组成和白蛋白渗出方面的变化。

我们发现HI导致白蛋白渗入脑实质增加，并且这种渗漏在缺血性事件后持续增加。

这是由本文所述的实验得出的结论，在实验中对每只动物中相近尺寸的血管的10张图像(放大200倍)进行了白蛋白染色分析。为了评价BBB的完整性，如果在血管的周围脑组织中存在白蛋白染色阳性，则将白蛋白渗出记为(+)，并且如果在脑实质中不存在白蛋白则记为(-)(图1)。

在我们的实验模型(示例1)中，我们观察到在再灌注后7天，与对照相比，经HI处理的动物的渗漏增加了34％(图1B)。这些结果以指示血管渗漏的白蛋白渗出的百分比提供。在图1A中示出如下，其中，与来自对照绵羊的右侧图(其中100％的绵羊白蛋白包含在血管中)相比，左侧图显示出血管渗漏(17％的白蛋白在血管外部)。在再灌注的第3天和第7天，渗漏分别增加到约28％和56％。我们从这些实验中得出结论，HI会破坏血脑屏障(BBB)。

BBB由内皮细胞组成，这些内皮细胞经由粘附连接和转运蛋白结构在外周系统与中枢神经系统细胞(如周细胞、神经元、星形胶质细胞)之间进行通讯。这种高度特异化的结构对于调节大脑的动态平衡和保护中枢神经系统(CNS)免受潜在的有害浸润性免疫细胞和炎症分子的影响至关重要。这些血源性介质(mediators)的涌入通过激活小胶质细胞以及随后分泌促炎性细胞因子和活性氧而使神经炎症持续从而损害脑的发育。

我们还使用可与膜联蛋白A1特异性反应的抗体对胎儿脑部切片进行了免疫组织化学分析(示例2)。为了量化膜联蛋白A1免疫反应性(IR)的强度，我们设计了一个评分体系(1-3)来评价膜联蛋白A1的免疫反应性强度，其中得分1为较低，得分2为中等，得分3为强烈的免疫反应性。利用以Leica Qwin Pro V 3.5.1软件(Leica，Rijswijk，荷兰)确定的标准阈值强度，通过被表示为阳性染色相对于总面积的百分比的面积分数的分析来完善评分。此外，用ImageJ软件1.48版测量膜联蛋白A1阳性染色的脑室周围区域的厚度。对小胶质细胞中膜联蛋白A1免疫反应性的评定是根据细胞表型以及利用与膜联蛋白A1免疫反应性共定位的IBA-1对相邻切片的染色而确定。

我们发现，在全身HI之后1天，与对照相比，血管和室管膜衬层细胞中膜联蛋白A1的免疫反应性显著降低，而在三天和七天后膜联蛋白A1的表达恢复正常(图2A和图2B)。

我们得出的结论是，HI严重损害了血脑屏障，并且尽管在第3天膜联蛋白A1的表达增多，但血管外出现的内源性绵羊白蛋白随时间而增多证实了这种损害已经存在。这给医生留下的治疗窗口最多3天，优选48小时，甚至更优选24或12小时，诸如6、5、4、3、2或1小时或更短的时间。最优选的是在缺血性事件之后立即进行治疗。

为了评定对BBB完整性的影响是否由膜联蛋白A1介导，我们使用了公认的用于BBB完整性的模型，即出生后第3天从大鼠脑中分离的原代胎儿内皮细胞(EC)。

在半透性滤器插件(Transwell，3460Corning)上培养内皮细胞(EC)的细胞单层。如前所述(Srinivasan等，J.Lab Autom.2015(2)107-126)，使用带有两个筷状电极的上皮伏特计(Epithelial Voltohmmeter)(EVOM2)，每个电极都包含用于测量电压的银-氯化银颗粒和用于测量通过电流的银颗粒，测量跨内皮电阻(TEER)作为针对屏障完整性的既有定量读数。通过将一个电极放置在上部隔室中并将另一电极放置在下部隔室中在半透膜上进行跨细胞层电阻(以欧姆(Ω)为单位)测量。在更换培养基之后30分钟，每个插件一式两份进行测量，并连续进行若干天，并且在所有测量之前和之间将温度保持在37℃。一旦数值稳保持定，膜达到融合状态(confluency)，可以进行进一步的实验(基线测量)。

当EC在Transwell中达到融合时，将细胞随机分配到氧糖剥夺(OGD)或常氧条件下。OGD通过以下方法执行：用不含葡萄糖和谷氨酰胺的DMEM(A1443001Thermofisher)替换培养基，并将EC在37℃的低氧室中暴露于0％的氧气中4小时。在4小时的常氧/OGD后，将介质更换为培养基，并在以下浓度和条件下处理之后测量TEER(T0)：膜联蛋白A1(3μM)，FPR1/2受体阻断剂WRW4(10μM)和环孢菌素H(1μM)。维甲酸(10μM)用作增强BBB完整性的阳性对照(Leoni等，J.Clin.Invest.2013(123(1)443-454；，Lippmann等，Sci.Rep.2014(4)4160)。

随后，在常氧/OGD之后1小时、3小时、6小时、12小时和24测量所有组的TEER。此设置得到以下处理组(每个实验n＝2)：(1)未处理，(2)膜联蛋白A1，(3)WRW4，(4)WRW4+膜联蛋白A1，(5)环孢菌素H以及(6)环孢菌素H+膜联蛋白A1。将常氧对照保留为正常培养条件，介质未更换。重复细胞培养实验以测试可重复性。

在继续实验之前，培养物中内皮细胞的基线TEER值约为每个插件150欧姆。在OGD之后一小时，每个处理组的TEER值均显著下降。随后，膜联蛋白A1处理使TEER稳定地增大，其值稳定在130欧姆(图3)。引人注目的是，未处理或者用环孢菌素H和WRW4阻断FPR1或FPR2受体导致TEER值连续降低至100-110欧姆(图3)。

因此，在本文中我们利用已建立的BBB恢复模型已表明，膜联蛋白A1在氧糖剥夺后使内皮电阻和/或屏障完整性恢复。总之，这表明在HI发作后立即或马上增强BBB的完整性，可通过刺激内源性修复机制来预防脑损伤。

因此，本发明涉及一种包含膜联蛋白A1或其等同物的组合物，其用于治疗由缺血性事件引起的新生儿缺氧性脑病，其中，在缺血性事件后24小时内向新生儿施用所述包含膜联蛋白A1或其等同物的组合物，条件是该组合物不包含间充质干细胞(MSC)、多能成体祖细胞(MAPC)或源于所述细胞的细胞外囊泡(EV)。膜联蛋白A1可以商购获得，并且优选为人源性的。甚至更优选使用重组膜联蛋白A1，如人重组膜联蛋白A1(Kusters等人，Plos One10(6)e0130484DOI：10.1371)。

在一个优选的实施方案中，如上所述使用的组合物包含药学上可接受的载体。

膜联蛋白A1的等同物优选选自人膜联蛋白A1，截短型膜联蛋白A1，或人膜联蛋白A1与其他人膜联蛋白的嵌合体，或它们的组合。嵌合体优选是融合蛋白，其包含膜联蛋白A1和膜联蛋白A5。在另一个优选的实施方案中，该组合物静脉内施用。

如上所述的治疗优选在缺血性事件的12小时内进行，优选在6小时之内，诸如5、4、3、2或1小时或更短的时间内进行，如在缺血性事件之后立即进行。

优选地，膜联蛋白A1或其等同物每24小时以每公斤体重1μg至10mg之间的剂量进行肠胃外团注(as a bolus)给药或以每小时每公斤体重0.1μg至1mg之间的剂量连续输注给药。

如本文所用，术语治疗剂的“治疗有效量”是指当施用于患有或易患病症、疾患和/或疾病的对象时足以治疗、诊断、预防和/或延迟病症、疾患和/或疾病的症状发作的量。本领域普通技术人员将理解，通常通过包含至少一个单位剂量的给药方案来给予治疗有效量。

如本文所用，短语“治疗剂”是指当施用于对象时具有治疗作用和/或引起期望的生物作用和/或药理作用的任何药剂。

如本文所用，术语“治疗”、“疗法”是指任何这样的方法，其用于部分或完全缓解、改善、减轻、抑制、预防特定病症、疾患和/或疾病的一种或多种症状或特征，或者延缓其发作、降低其严重性和/或减少其发生率。

如本文所用，词语“早产”是指在正常妊娠期结束之前出生的后代。对于人类来说，早产婴儿是指在妊娠37周之前出生的婴儿。词语“足月”是指在正常妊娠期结束时或之后出生的后代。对于人类，足月出生的婴儿是指在妊娠37周或之后出生的婴儿。

附图说明

图1A：HI后第7天白蛋白从血管渗出(箭头)进入脑实质(+)以及对照中白蛋白在血管内(-)的代表性组织学图像。

图1B：再灌注后7天，与对照相比，在经HI处理的动物中观察到渗漏增加了34％。这些结果以指示血管渗漏的白蛋白渗出百分比提供。

图2：HI后一段时间内，脑血管(A)和室管膜衬层(B)中膜联蛋白A1的免疫反应性。X轴，以天(d)为单位的时间，Y轴，膜联蛋白A1免疫反应性的相对评分。

图3：膜联蛋白A1通过FPR1和FPR2受体改善BBB的完整性。在0小时时，在开始OGD之前进行基线TEER测量。OGD之后4小时，将细胞用膜联蛋白A1和/或FPR抑制剂处理，并在处理后进行追踪3、6、12和24小时。细节如下：使大鼠胎儿内皮细胞经受OGD持续4h，并在再灌注开始时用包含重组膜联蛋白A1、WRW4和环孢菌素H(它们是FPR2和FPR1拮抗剂)的组合物进行处理。在处理后3小时、6小时、12小时和24小时测量以欧姆为单位的TEER。时间点0大致为实验的起点和实验条件的起点(OGD之前的TEER测量)。

实施例

实验程序和研究设计符合动物实验机构指南，并得到荷兰马斯特里赫特大学动物伦理委员会的批准。Texel妊娠母羊的单个胎儿(n＝37)随机地不接受闭塞器(n＝18)或接受闭塞器(n＝19)。

如前所述(Ophelders等，Stem Cells Transl.Med.(干细胞转化医学)2016 5(6)754-763)，所有胎儿均在孕龄102天(足月妊娠约147天)加装仪器(instrumented)。简而言之，在脐带周围插入可充气的血管闭塞器，其用于诱导短暂的全身性缺氧缺血。进一步地，将脐血管导管置于股动脉和肱静脉中，以分别测量血压和MSC-EV给药。在4天的恢复期后，通过快速膨胀血管闭塞器使胎儿经受25分钟的假闭塞或脐带闭塞(UCO)。在(假)UCO后1天(n＝10)、3天(n＝8)或7天(n＝19)处死胎儿。进行(假)脐带闭塞、组织采样和尸体解剖分析的研究人员对处理的分配不知情。

固定后，将包括侧脑室、脑室周围白质和基底神经节的预定区域包埋在石蜡中，并用Leica RM2235切片机切出连续的冠状切片(4μm)。针对作为BBB渗漏的标志物的白蛋白、作为常规的小胶质细胞标志物的离子钙结合衔接分子1(IBA-1)以及膜联蛋白A1进行了冠状切片的染色。首先，将切片脱蜡并重新水化。通过用溶于Tris-缓冲盐溶液(TBS)的0.3％过氧化氢进行温育来淬灭内源性过氧化物酶活性。抗原回收涉及使用微波炉煮沸处于柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中的组织。接下来，将切片与初级多克隆兔抗膜联蛋白A1(AB137745，Abcam；1:100)、抗白蛋白(NY11590，Westbury；1:2000)、抗IBA-1(019-19741，Wakochemicals；1:1000)抗体在4C°温育过夜，然后与次级多克隆猪抗兔生物素(E0353，Dako；1:200)温育。用Vectastain ABC过氧化物酶精华试剂盒(PK-6200，Vector Laboratories，Burlingame，CA)增强抗体特异性染色，然后进行3,3'-二氨基联苯胺(DAB)染色。细胞核被Mayer的苏木精染色。

在使用具有Leica Qwin Pro 3.4.0版本的软件(Leica Microsystems，曼海姆，德国)的Leica DM2000显微镜拍摄数字图像后进行免疫组织化学染色分析。膜联蛋白A1和IBA-1的图像以100倍的放大倍数拍摄。目标区域包括血管、室管膜衬层细胞和包括用IBA-1染色的小胶质细胞的白质。使用Leica QWin Pro V3.4软件来处理该图像。

为了量化膜联蛋白A1免疫反应性的强度，我们设计了一个评分体系(1-3)来评价膜联蛋白A1的免疫反应性强度，其中得分1为较低，得分2为中等，得分3为强烈的免疫反应性。利用以Leica Qwin Pro V 3.5.1软件(Leica，Rijswijk，荷兰)确定的标准阈值强度，通过被表示为阳性染色相对于总面积的百分比的面积分数的分析来完善评分。此外，用ImageJ软件1.48版测量膜联蛋白A1阳性染色的脑室周围区域的厚度。对小胶质细胞中膜联蛋白A1免疫反应性的评定是根据细胞表型以及利用与膜联蛋白A1免疫反应性共定位的IBA-1对相邻切片的染色而确定。

对每只动物的相近尺寸的血管的10个图像(放大200倍)进行白蛋白染色分析。为了评价BBB的完整性，如果在血管的周围脑组织中存在阳性白蛋白染色，则将白蛋白渗出记为(+)，如果在脑实质中不存在白蛋白则记为(-)(图1)。这些结果显示为白蛋白渗出的百分比，其指示血管渗漏。

分离细胞并如下培养。在出生后第3天(P3)颈脱位处死富余的大鼠幼崽，该大鼠幼崽接收自马斯特里赫特大学神经科学系。啮齿动物在出生后第3天的大脑发育阶段与早产人类婴儿相当(Kinney和Volpe；Neurol.Res.Int.2012，10.1155/2012/295389.Epub2012年5月23日)。细胞分离方案改编自Bernas等人(Nat Protoc.2010年7月；5(7):1265-1722。在线发布于2010年6月10日，doi:10.1038/nprot.2010.76)。简而言之，从颅骨解剖大脑，并且在组织研磨之前，通过使碎片通过渐缩的移液器吸头来除去脑膜和大血管。使细胞悬液通过500μM的滤器，以滤出大碎片。将流通液中的细胞收集在30μM的滤器上，然后以51×g离心10分钟。将所得沉淀重悬于其中补充有10％的热灭活的胎牛血清(FBS)(F7524，Sigma)、1％的抗生素-抗真菌溶液(A5955，Sigma)、50μg/mL的内皮细胞生长补充剂(ECGS)(354006，BDBiosciences)、1mg/mL肝素(L6510，Biochrom)以及氢化可的松500nM(07904，StemcellTechnologies)的DMEM-F12-glutamax(10565018，Thermofisher)中，然后转移至以I型胶原蛋白(354236，Corning)预涂敷的T25烧瓶中。允许培养物扩增约一个月以获得高度融合的内皮细胞，其如通过免疫细胞化学分析所确定的那样显示出周细胞的污染最小(＜5％)。

利用免疫细胞化学分析进行培养物中细胞的表征并评估细胞群的纯度。使细胞在载玻片上生长，并针对作为内皮细胞标志物的血管性血友病因子(vWF)(A0082，Dako)、紧密连接蛋白1(zona-occludens 1)(ZO-1)(61-7300，Invitrogen)、闭合蛋白(Occludin)(71-1500，Invitrogen)以及作为周细胞标志物的α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)(A5228，Sigma)进行了染色。通过在4％多聚甲醛(抗体)或MeOH(抗体)中温育来固定细胞，然后用在磷酸盐缓冲液(PBS)中的牛血清白蛋白(BSA)、正常山羊血清(NGS)或FBS进行封闭。接下来，将细胞与初级抗体(1:100/200)在4℃温育过夜，然后与适当的alexa-fluor标记的次级抗体(1:200)温育。细胞核用DAPI染色，使用荧光封片剂(Dako)来架设盖玻片。

在半透性滤器插件(Transwell)(3460Corning)上培养内皮细胞(EC)的细胞单层。使用带有两个筷状电极的上皮伏特欧姆表(Epithelial Volt-ohmmeter)(EVOM2)，每个电极都包含用于测量电压的银-氯化银颗粒和用于测量通过电流的银颗粒，测量TEER作为针对屏障完整性的既有定量读数(Srinivasan等人，J.Lab Autom..J Lab Autom.2015Apr；20(2):107–126，2015年1月13日在线发布。doi：10.1177/2211068214561025)。通过在上隔室中放置一个电极，在下隔室中放置另一个电极，在半透膜上进行跨细胞层的欧姆电阻(Ω)测量。在更换培养基后30分钟，对每个插件进行两次测量并连续进行若干天，并且在全部测量之前和之间，将温度保持在37℃。一旦数值稳定，膜达到融合状态，则可以进行进一步的实验(基线测量)。

当EC在Transwell中达到融合时，将细胞随机分配到氧糖剥夺(OGD)或常氧条件下。通过用不含葡萄糖和谷氨酰胺的DMEM(A1443001Thermofisher)替换培养基，并将EC在37℃的低氧室中暴露于0％的氧气中4小时来进行OGD。4小时的常氧/OGD之后，将介质更换为培养基，并在以下浓度和条件下处理之后测量TEER(T0)：膜联蛋白A1(3μM)，FPR1/2受体阻断剂WRW4(10μM)和环孢菌素H(1μM)。维甲酸(10μM)用作增强BBB完整性的阳性对照(Leoni等，J.Clin.Invest.2013(123(1)443-454；Lippmann等，Sci.Rep.2014(4)4160)。

随后在常氧/OGD之后1小时、3小时、6小时、12小时和24测量所有组的TEER。此设置得到以下处理组(每个实验n＝2)：(1)未处理、(2)膜联蛋白A1、(3)WRW4、(4)WRW4+膜联蛋白A1、(5)环孢菌素H，以及(6)环孢菌素H+膜联蛋白A1。将常氧对照保留在正常培养条件下而不更换介质。重复细胞培养实验以测试可重复性。

在继续实验之前，我们培养物中的内皮细胞的基线TEER值约为每个插件150欧姆。OGD之后一小时，每个处理组的TEER值均显著减小。随后，膜联蛋白A1处理使TEER稳定地增大，并且数值从12个小时之后一直稳定在130欧姆处。引人注目的是，未处理或者用环孢菌素H和WRW4阻断FPR1或FPR2受体导致TEER值连续降低至100-110欧姆(图3)。

免疫组织化学：所有数值均显示为平均值，具有95％的置信区间(CI)或标准差(SD)。采用方差分析(ANOVA)进行不同实验组之间的比较。

来自TEER测量的数据是从每个治疗组以n＝2分别进行的2个独立实验获得的。半透膜上的内皮细胞层的电阻(Ω)乘以半透膜的有效面积(cm2)。这些经调整的电阻测量值被表示为与相应的平均的调整电阻测量值之比。结果，比较了不同实验组之间的规格化值(normalized value)。数据使用GraphPad Prism 5呈现，并使用非配对样本t检验进行显著性检验。

使用IBM SPSS Statistics 22.0版(IBM Corp.，Armonk，NY，美国；SPSS)进行统计分析，使用GraphPad Prism 5进行图表设计。报告了准确的p值，并得到p<0.05的统计显著性。

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