一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法

摘要

本发明公开了一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法，涉及硅藻群体的特定引物绝对定量检测方法技术领域，为解决目前市面上缺少标准的目标硅藻群体的特定引物绝对定量检测方法的问题。包括以下步骤：步骤1：进行DNA样品的制备；步骤2：使用DNeasy Powersoil kit对各样品进行DNA提取，将样品按比例稀释到相同的浓度；步骤3：选定3对硅藻检测片段及特异性引物用于预实验；步骤4：选择能够得到拷贝数浓度已知的质粒样品，通过进行Sanger测序计算得到质粒的相对分子质量；步骤5：确定内标添加量和实验条件；步骤6：根据样品提取的DNA浓度确定DNA上样量，采用SYBRGreen法进行预实验；步骤7：采用SYBRGreen法进行实验；步骤8：计算硅藻18SrRNA基因拷贝数。

说明书

技术领域

本发明涉及硅藻群体的特定引物绝对定量检测方法技术领域，具体为一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法。

背景技术

实现环境样品中硅藻的绝对定量可以帮助我们了解样品中硅藻的真实含量情况、进行不同域的微生物量的比较，从而对生态学现象做出准确的判断。当前的硅藻定量方法主要有镜检法、高通量测序法和荧光定量PCR法。

目前市面上缺少标准的目标硅藻群体的特定引物绝对定量检测方法，因此市场上急需一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法来解决这些问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法，以解决上述背景技术中提出的目前市面上缺少标准的目标硅藻群体的特定引物绝对定量检测方法的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法，包括以下步骤：

步骤1：DNA样品的制备，土壤或淤泥采样时通过冷冻干燥处理后，称取样品0.5g，得土壤或淤泥样品，水体采样时，采集取水样1L，用0.22μm滤膜过滤收集滤膜样品，得水样，空气沉降物采集时，将采样装置放置在户外，采样时间为15-20天，称取样品0.5g，得空气沉降物样品；

步骤2：使用DNeasy Powersoil kit对各样品进行DNA提取，记录DNA最终洗脱体积，使用Nano Drop微量紫外分光光度计检测OD260及OD280的值，得DNA样品浓度并记录，使用pH值为8.0的10mM Tris-HCl溶液将样品按比例稀释到相同的浓度；

步骤3：根据硅藻种类通用性，选定3对硅藻检测片段及特异性引物用于预实验；

步骤4：选择能够得到拷贝数浓度已知的质粒样品，通过进行Sanger测序计算得到质粒的相对分子质量，经浓度测定，即可根据根式计算得到质粒样品的拷贝数浓度；

步骤5：确定内标添加量和实验条件，将4个样品进行混样用于预实验，按照每个样品取100ngDNA混样，样品名称记为M，用于预实验的M样品DNA浓度为17.74ng/μL，共制备4份混合样品，在4份M样品中分别加入不同浓度内标设置浓度梯度，内标终浓度范围分别为：1、5、50和500pg/μl；相应内标的摩尔浓度为：0.48pM、2.40pM、2.40×101pM和2.40×102pM；

步骤6：根据样品提取的DNA浓度确定DNA上样量，引物的退火温度，预实验标准曲线中的Ct值，采用SYBRGreen法进行预实验，在96孔板中加样；样品板在荧光定量仪上进行检测，首先，95℃解链5min，再进行退火和延伸58℃，2min，共进行40个循环；

步骤7：使用Primer5软件，根据质粒序列，设计特异性引物，扩增结果经电泳确认硅藻特异性引物、内标特异性引物，扩增结果应当为单一的，长度符合预期的清晰条带，采用SYBRGreen法进行实验，每个反应做3个副孔；

步骤8：计算硅藻18SrRNA基因拷贝数；

基因测得浓度(pM)＝0.48pM×2^[-(样品测得平均Cq值-内参测得平均Cq值)]；

每单位样品量含有的基因总量(pmol/单位样品量)＝(基因测得浓度×稀释倍数×DNA体积/浓缩比)/土壤重量(或水样体积)；

每单位样品量含有的基因拷贝数(copies/单位样品量)＝6.02×10^

所述步骤1中土壤或淤泥采样时冷阱温度在-50～-80℃。

所述步骤2中DNA提取具体为：

步骤2-1：吸取1000ulCTAB裂解液至2.0mlEP管里，加入20ul溶菌酶，将适量的样品加入裂解液中，65度水浴2小时，期间颠倒混匀数次，以使样品充分裂解；

步骤2-2：离心取950ul上清，加入与上清等体积的pH值为8.0的酚、氯仿和异戊醇的混合物，酚：氯仿：异戊醇的比例为25：24：1，颠倒混匀，离心混合转速为12000rpm，混合时间为10min；

步骤2-3：取上清，加入等体积的氯仿和异戊醇，氯仿和异戊醇的比例为24:1，颠倒混匀，离心混合转速为12000rpm，混合时间为10min；

步骤2-4：吸取上清至1.5mL离心管里，加入上清液3/4体积的异丙醇，上下摇晃，在20摄氏度下进行沉淀；

步骤2-5：离心混合，混合转速为2000rpm，混合时间为10分钟，倒出液体，用1ml75％乙醇洗涤2次，剩余的少量液体可再次离心收集，然后用枪头吸出；

步骤2-6：将超净工作台吹干或室温晾干；

步骤2-7：加入51μl的ddH2O溶解DNA样品，于55～60℃下孵育10min助溶。

，所述步骤2-1中1000ulCTAB裂解液通过M/V为2％的CTAB，1.4MNaCl，pH值8.0的100mMTris-Cl，pH值8.0的20mMEDTA，V/V为2％的β-巯基乙醇进行混合。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供一种基于荧光定量内标法的硅藻绝对定量的方法，该方法经样品DNA提取、硅藻特异性片段引物选择、筛选与目标检测片段扩增效率相当的内标物，应用荧光定量PCR平台进行检测，经数据处理和计算实现环境样品中硅藻的绝对定量。除此之外，本发明提供了一个标准的方法流程，可以根据需求设计目标硅藻群体的特定引物从而实现硅藻大类下的特定属或特定种的绝对定量检测。

附图说明

图1为本发明的工作流程图；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1：

一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法，包括以下步骤：

步骤1：DNA样品的制备，土壤或淤泥采样时通过冷冻干燥处理后，称取样品0.5g，得土壤或淤泥样品，水体采样时，采集取水样1L，用0.22μm滤膜过滤收集滤膜样品，得水样，空气沉降物采集时，将采样装置放置在户外，采样时间为15天，称取样品0.5g，得空气沉降物样品；

步骤2：使用DNeasy Powersoil kit对各样品进行DNA提取，记录DNA最终洗脱体积，使用Nano Drop微量紫外分光光度计检测OD260及OD280的值，得DNA样品浓度并记录，使用pH值为8.0的10mM Tris-HCl溶液将样品按比例稀释到相同的浓度；

步骤3：根据硅藻种类通用性，选定3对硅藻检测片段及特异性引物用于预实验；

步骤4：选择能够得到拷贝数浓度已知的质粒样品，通过进行Sanger测序计算得到质粒的相对分子质量，经浓度测定，即可根据根式计算得到质粒样品的拷贝数浓度；

步骤5：确定内标添加量和实验条件，将4个样品进行混样用于预实验，按照每个样品取100ngDNA混样，样品名称记为M，用于预实验的M样品DNA浓度为17.74ng/μL，共制备4份混合样品，在4份M样品中分别加入不同浓度内标设置浓度梯度，内标终浓度范围分别为：1、5、50和500pg/μl；相应内标的摩尔浓度为：0.48pM、2.40pM、2.40×101pM和2.40×102pM；

步骤6：根据样品提取的DNA浓度确定DNA上样量，引物的退火温度，预实验标准曲线中的Ct值，采用SYBRGreen法进行预实验，在96孔板中加样；样品板在荧光定量仪上进行检测，首先，95℃解链5min，再进行退火和延伸58℃，2min，共进行40个循环；

步骤7：使用Primer5软件，根据质粒序列，设计特异性引物，扩增结果经电泳确认硅藻特异性引物、内标特异性引物，扩增结果应当为单一的，长度符合预期的清晰条带，采用SYBRGreen法进行实验，每个反应做3个副孔；

步骤8：计算硅藻18SrRNA基因拷贝数；

基因测得浓度(pM)＝0.48pM×2^[-(样品测得平均Cq值-内参测得平均Cq值)]；

每单位样品量含有的基因总量(pmol/单位样品量)＝(基因测得浓度×稀释倍数×DNA体积/浓缩比)/土壤重量(或水样体积)；

每单位样品量含有的基因拷贝数(copies/单位样品量)＝6.02×10^

所述步骤1中土壤或淤泥采样时冷阱温度在-50～-80℃。

所述步骤2中DNA提取具体为：

步骤2-1：吸取1000ulCTAB裂解液至2.0mlEP管里，加入20ul溶菌酶，将适量的样品加入裂解液中，65度水浴2小时，期间颠倒混匀数次，以使样品充分裂解；

步骤2-2：离心取950ul上清，加入与上清等体积的pH值为8.0的酚、氯仿和异戊醇的混合物，酚：氯仿：异戊醇的比例为25：24：1，颠倒混匀，离心混合转速为12000rpm，混合时间为10min；

步骤2-3：取上清，加入等体积的氯仿和异戊醇，氯仿和异戊醇的比例为24:1，颠倒混匀，离心混合转速为12000rpm，混合时间为10min；

步骤2-4：吸取上清至1.5mL离心管里，加入上清液3/4体积的异丙醇，上下摇晃，在20摄氏度下进行沉淀；

步骤2-5：离心混合，混合转速为2000rpm，混合时间为10分钟，倒出液体，用1ml75％乙醇洗涤2次，剩余的少量液体可再次离心收集，然后用枪头吸出；

步骤2-6：将超净工作台吹干或室温晾干；

步骤2-7：加入51μl的ddH2O溶解DNA样品，于55～60℃下孵育10min助溶。

，所述步骤2-1中1000ulCTAB裂解液通过M/V为2％的CTAB，1.4MNaCl，pH值8.0的100mMTris-Cl，pH值8.0的20mMEDTA，V/V为2％的β-巯基乙醇进行混合。

实施例2：

一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法，包括以下步骤：

步骤1：DNA样品的制备，土壤或淤泥采样时通过冷冻干燥处理后，称取样品0.5g，得土壤或淤泥样品，水体采样时，采集取水样1L，用0.22μm滤膜过滤收集滤膜样品，得水样，空气沉降物采集时，将采样装置放置在户外，采样时间为20天，称取样品0.5g，得空气沉降物样品；

样品信息如下：

步骤2：使用DNeasy Powersoil kit对各样品进行DNA提取，记录DNA最终洗脱体积，使用Nano Drop微量紫外分光光度计检测OD260及OD280的值，得DNA样品浓度并记录，使用pH值为8.0的10mM Tris-HCl溶液将样品按比例稀释到相同的浓度；

步骤3：根据硅藻种类通用性，选定3对硅藻检测片段及特异性引物用于预实验；

步骤4：选择能够得到拷贝数浓度已知的质粒样品，通过进行Sanger测序计算得到质粒的相对分子质量，经浓度测定，即可根据根式计算得到质粒样品的拷贝数浓度；

设计得到3对待定内标引物，引物列表如下：

步骤5：确定内标添加量和实验条件，将4个样品进行混样用于预实验，按照每个样品取100ngDNA混样，样品名称记为M，用于预实验的M样品DNA浓度为17.74ng/μL，共制备4份混合样品，在4份M样品中分别加入不同浓度内标设置浓度梯度，内标终浓度范围分别为：1、5、50和500pg/μl；相应内标的摩尔浓度为：0.48pM、2.40pM、2.40×101pM和2.40×102pM；

步骤6：根据样品提取的DNA浓度确定DNA上样量，引物的退火温度，预实验标准曲线中的Ct值，采用SYBRGreen法进行预实验，在96孔板中加样；样品板在荧光定量仪上进行检测，首先，95℃解链5min，再进行退火和延伸58℃，2min，共进行40个循环；

qPCR采用SYBR Green法，反应体系如下：

步骤7：使用Primer5软件，根据质粒序列，设计特异性引物，扩增结果经电泳确认硅藻特异性引物、内标特异性引物，扩增结果应当为单一的，长度符合预期的清晰条带，采用SYBRGreen法进行实验，每个反应做3个副孔；

荧光定量测得Cq值

步骤8：计算硅藻18SrRNA基因拷贝数；

基因测得浓度(pM)＝0.48pM×2^[-(样品测得平均Cq值-内参测得平均Cq值)]；

每单位样品量含有的基因总量(pmol/单位样品量)＝(基因测得浓度×稀释倍数×DNA体积/浓缩比)/土壤重量(或水样体积)；

每单位样品量含有的基因拷贝数(copies/单位样品量)＝6.02×10^

4个样品的计算结果见下表：

所述步骤1中土壤或淤泥采样时冷阱温度在-50～-80℃。

所述步骤2中DNA提取具体为：

步骤2-1：吸取1000ulCTAB裂解液至2.0mlEP管里，加入20ul溶菌酶，将适量的样品加入裂解液中，65度水浴2小时，期间颠倒混匀数次，以使样品充分裂解；

步骤2-2：离心取950ul上清，加入与上清等体积的pH值为8.0的酚、氯仿和异戊醇的混合物，酚：氯仿：异戊醇的比例为25：24：1，颠倒混匀，离心混合转速为12000rpm，混合时间为10min；

步骤2-3：取上清，加入等体积的氯仿和异戊醇，氯仿和异戊醇的比例为24:1，颠倒混匀，离心混合转速为12000rpm，混合时间为10min；

步骤2-4：吸取上清至1.5mL离心管里，加入上清液3/4体积的异丙醇，上下摇晃，在20摄氏度下进行沉淀；

步骤2-5：离心混合，混合转速为2000rpm，混合时间为10分钟，倒出液体，用1ml75％乙醇洗涤2次，剩余的少量液体可再次离心收集，然后用枪头吸出；

步骤2-6：将超净工作台吹干或室温晾干；

步骤2-7：加入51μl的ddH2O溶解DNA样品，于55～60℃下孵育10min助溶。

，所述步骤2-1中1000ulCTAB裂解液通过M/V为2％的CTAB，1.4MNaCl，pH值8.0的100mMTris-Cl，pH值8.0的20mMEDTA，V/V为2％的β-巯基乙醇进行混合。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。