利用丛枝菌根真菌和根瘤菌促进豆科植物生长的方法

摘要

本发明公开了一种能够提高豆科植物草地产量和品质且不会对草地生态系统造成破坏的利用丛枝菌根真菌和根瘤菌促进豆科植物生长的方法。该方法通过接种丛枝菌根真菌菌剂和根瘤菌，可促进豆科植物养分吸收，提高群落的多样性和稳定性，可提高空间土壤肥料利用率，促进豆科固氮，协助宿主植物吸收土壤养分，能疏松土壤、消除土壤板结、改善土壤结构，可以减少化肥、农药用量，防止人工施用化学氮肥的流失，降低环境污染，保护生态安全，并且相比化肥利用率更高、作用时间长，且能够增加土壤的有机质及养分含量、改良培肥土壤，减少温室气体的排放，从而促进草地农业生态系统的良性循环。适合在牧草种植技术领域推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及牧草种植技术领域，具体涉及一种利用丛枝菌根真菌和根瘤菌促进豆科植物生长的方法。

背景技术

近年来,由于各种自然灾害、草地载畜量严重超载、滥垦滥挖、旅游等人为干扰问题的增多,草地生态系统遭到破坏，严重影响草地畜牧业的发展，并且随着当今世界经济的快速发展，人们对肉类、乳制品等动物性食品的需求不断扩大，对草地生产力提出了更大的要求，为适应时代发展，兼顾生态和生产，从根本上解决我国肉、奶生产中面临的优质饲草料严重短缺的瓶颈问题,同时遏制生态功能严重衰退等生态安全问题，必须调整种植业结构，发展草地畜牧业。

现有对于促进豆本科植物生长的方法主要是通过施肥实现，但是施肥促进豆科植物草地生长的方法生产成本高，要投入很多人力、物力，过少的施肥量对草地增产效果不显著，过多的施肥又会造成土壤酸化、土壤板结，肥料的大量富集随会着降雨流入附近水体造成环境破坏，扰乱生态系统。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够提高豆科植物草地产量和品质且不会对草地生态系统造成破坏的利用丛枝菌根真菌和根瘤菌促进豆科植物生长的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：该利用丛枝菌根真菌和根瘤菌促进豆科植物生长的方法，包括以下步骤：

A、种子选取；选取籽粒饱满的豆本科牧草种子；

B、灭菌处理：对选取的豆本科牧草种子进行灭菌处理；

C、萌发培养：将灭菌处理后的豆科牧草种子置于灭菌的蛭石上进行萌发培养至牧草种子出苗后并继续培养25天得到豆科牧草幼苗，在萌发培养的过程中，每隔1-3天浇一次水；

D、移栽：将豆科牧草幼苗移栽至若干个花盆内，具体方法如下所述：首先，选取地面以下15cm的土壤并经过筛网过滤，接着将过滤后的土壤与河沙按照重量比为1：(2-4)的比例混合用经过高温灭菌处理并冷却后作为基质，然后向每个花盆中装入花盆体积2/3的基质并在基质表面铺撒一层丛枝菌根真菌复合菌剂，再覆盖2cm后的基质，接着将豆科牧草幼苗移栽至每个花盆内，每个花盆内移栽的豆科牧草幼苗数量均相同且长势相同，最后用注射器吸取根瘤菌菌剂按照每株牧草幼苗植物1.5-3ml的量接种根瘤菌，最后将移栽有牧草幼苗的花盆置于在温室中培养，采用随机排列法，每两周换位一次，采用自然光照，白天温度为20-30，晚上温度为15-25℃，在温室中培养的过程中，每隔2-3天浇一次水；移栽一周内观察牧草幼苗生长情况，若出现幼苗死亡，则选取生长良好的同种牧草幼苗进行替换；在温室中培养1个月后每周补充1次Hoagland培养液。

进一步的是，在步骤A中，选取的豆科牧草种子为白三叶牧草种子或苜蓿种子。

进一步的是，在步骤B中，对选取的豆科牧草种子和禾本科牧草种子分别进行灭菌处理的过程如下所述：将选取的豆科牧草种子先浸泡于75％的乙醇1min，用蒸馏水冲洗干净后，再浸泡在5％的次氯酸钠2min，然后用蒸馏水冲洗干净即可。

进一步的是，在步骤C中，在萌发培养的过程中，每隔2天浇一次水。

进一步的是，在步骤D中，所述筛网的孔径为2mm，将过滤后的土壤与砂石按照重量比为1：3的比例混合后经过高温灭菌处理并冷却后作为基质，所述高温灭菌处理的温度为121℃、时间为2小时。

进一步的是，在步骤D中，每个花盆内移栽的豆科牧草幼苗数量为6株。

进一步的是，在步骤D中，注射器吸取根瘤菌菌剂按照每株牧草幼苗植物2ml的量接种根瘤菌。

进一步的是，在步骤D中，所述丛枝菌根真菌菌剂采用如下方法得到：选取优质高粱种子，在生长室无菌育苗15天，准备直径为10cm的消毒塑料盆，装入2/3的基质，接着加入一层厚度为1-2cm的复合菌剂，所述复合菌剂是带有孢子、菌丝的栽培基质，其中包括根内球囊霉(Glomus intraradices)、摩西球囊霉(Glomus mosseae)和幼套球囊霉(Glomusetunicatum)，然后再加入一层厚度为2cm的基质，把高粱苗移栽至消毒塑料盆中作为宿主植物，每盆4-6株，培养4个月的盆栽土即为丛枝菌根真菌菌剂。

进一步的是，所述根瘤菌菌剂采用如下方法得到：选择白三叶根瘤菌ACCC18007和苜蓿根瘤菌ACCC17676，先接种到YMA斜面进行活化，然后再25℃条件下恒温培养3d后转于装有YMA培养液的三角瓶中，摇床150转28度振荡48h，培养至对数生长期即可得到液体的根瘤菌菌剂，所述液体的根瘤菌菌剂含菌数为1×10

进一步的是，在步骤D中，所述Hoagland培养液由四水硝酸钙、硝酸钾、硝酸铵、无水磷酸二氢钾、七水硫酸镁、铁盐溶液、微量元素液组成，其组分的含量如下：四水硝酸钙1180mg·L-1，硝酸钾505mg·L-1，硝酸铵80mg·L-1，无水磷酸二氢钾(pH＝6.0)68mg·L-1，七水硫酸镁493mg·L-1，铁盐溶液22.5mg·L-1，微量元素液5.151mg·L-1。

本发明的有益效果在于：本发明所述的利用丛枝菌根真菌和根瘤菌促进豆科植物生长的方法通过接种丛枝菌根真菌菌剂和根瘤菌，它们能与宿主植物发生共生关系，形成丛枝菌根和根瘤，丛枝菌根真菌、根瘤菌和豆科植物形成的共生体系通过豆科的根系分泌物以及枯落物降解吸收养分，增加了土壤中可利用的氮磷营养，可促进豆科植物养分吸收，使牧草种内和种间相容性提高，竞争降到最低，从而提高群落的多样性和稳定性，可提高空间土壤肥料利用率，促进豆科固氮，并且有很大一部分氮素通过菌丝网络向相邻非固氮植物传递，从而为整个植物群落贡献氮素，协助宿主植物吸收土壤养分，丛枝菌根能疏松土壤、消除土壤板结、改善土壤结构，可以减少化肥、农药用量，防止人工施用化学氮肥的流失，降低环境污染，保护生态安全，并且相比化肥利用率更高、作用时间长，简单易行，且能够增加土壤的有机质及养分含量、改良培肥土壤，减少温室气体的排放，从而促进草地农业生态系统的良性循环，进而促进整个草地生产量和品质的提高，为家畜提供提供优良牧草。

附图说明

图1为四个实施例对苜蓿地上生物量的影响；

图2为四个实施例对苜蓿地上部磷含量的影响；

图3为四个实施例对苜蓿地上部氮含量的影响，

图4为四个实施例对苜蓿结瘤数的影响；

图5为四个实施例对白三叶地上生物量的影响；

图6为四个实施例对白三叶根瘤数的影响。

具体实施方式

现有对于促进豆科草地生长的方法主要是通过施肥实现，但是施肥促进草地生长的方法生产成本高，要投入很多人力、物力，过少的施肥量对草地增产效果不显著，过多的施肥又会造成土壤酸化、土壤板结，肥料的大量富集随会着降雨流入附近水体造成环境破坏，扰乱生态系统。为了解决上述问题，本发明提供了一种利用丛枝菌根真菌和根瘤菌促进豆科植物生长的方法。具体的，本发明所述的利用丛枝菌根真菌和根瘤菌促进豆科植物生长的方法，包括以下步骤：

A、种子选取；选取籽粒饱满的豆科牧草种子；

B、灭菌处理：对选取的豆科牧草种子进行灭菌处理；

C、萌发培养：将灭菌处理后的豆科牧草种子置于灭菌的蛭石上进行萌发培养至牧草种子出苗后并继续培养25天得到豆科牧草幼苗，在萌发培养的过程中，每隔1-3天浇一次水；

D、移栽：将豆科牧草幼苗移栽至若干个花盆内，具体方法如下所述：首先，选取地面以下15cm的土壤并经过筛网过滤，接着将过滤后的土壤与河沙按照重量比为1：(2-4)的比例混合用经过高温灭菌处理并冷却后作为基质，然后向每个花盆中装入花盆体积2/3的基质并在基质表面铺撒一层丛枝菌根真菌复合菌剂，再覆盖2cm后的基质，接着将豆科牧草幼苗移栽至每个花盆内，每个花盆内移栽的豆科牧草幼苗数量均相同且长势相同，最后用注射器吸取根瘤菌菌剂按照每株牧草幼苗植物1.5-3ml的量接种根瘤菌，最后将移栽有牧草幼苗的花盆置于在温室中培养，采用随机排列法，每两周换位一次，采用自然光照，白天温度为20-30，晚上温度为15-25℃，在温室中培养的过程中，每隔2-3天浇一次水；移栽一周内观察牧草幼苗生长情况，若出现幼苗死亡，则选取生长良好的同种牧草幼苗进行替换；在温室中培养1个月后每周补充1次Hoagland培养液。

由于土壤微生物群落是影响植物群落生产力和群落结构的重要驱动因子之一。丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)和根瘤菌(Rhizobium)是两类重要的共生微生物，能与宿主植物发生共生关系，形成丛枝菌根和根瘤，协助宿主植物吸收土壤养分，增加土壤中氮和磷的有效性，共同促进宿主植物的生长。AMF和根瘤菌可同时向宿主植物提供生长所必须的养分，宿主植物则向AMF和根瘤菌提供光合产物，AMF和根瘤菌通过调节植物对二者碳水化合物的分配，以及协助植物吸收养分的互补效应，对植物群落产生正向或反向的交互作用，这种交互作用在维持草地的高产稳定性中非常重要。有研究表明，根瘤菌和豆科植物形成的共生体通过根系吸收氮素，并将很大一部分氮素通过菌丝网络向相邻非固氮植物传递，从而为整个植物群落贡献氮素。豆科植物根系周围生长着大量的丛枝菌根真菌和根瘤菌，它们在长期的进化过程中形成了豆科植物与丛枝菌根真菌和根瘤菌的共生体系，为豆科植物的生长提供了丰富的营养。本发明正是基于此，通过接种丛枝菌根真菌和根瘤菌，它们能与宿主植物发生共生关系，形成丛枝菌根和根瘤，，增加了土壤中可利用的氮磷营养，可促进豆科植物养分吸收，使牧草种内和种间相容性提高，竞争降到最低，从而提高群落的多样性和稳定性，可提高空间土壤肥料利用率，促进豆科固氮，并且有很大一部分氮素通过菌丝网络向相邻非固氮植物传递，从而为整个植物群落贡献氮素，协助宿主植物吸收土壤养分，丛枝菌根、根瘤能疏松土壤、消除土壤板结、改善土壤结构，可以减少化肥、农药用量，防止人工施用化学氮肥的流失，降低环境污染，保护生态安全，并且相比化肥利用率更高、作用时间长，简单易行，且能够增加土壤的有机质及养分含量、改良培肥土壤，减少温室气体的排放，从而促进草地农业生态系统的良性循环，进而促进整个草地生产量和品质的提高，为家畜提供提供优良牧草。

进一步的是，在步骤D中，所述丛枝菌根真菌菌剂采用如下方法得到：选取优质高粱种子，在生长室无菌育苗15天，准备直径为10cm的消毒塑料盆，装入2/3的基质，接着加入一层厚度为1-2cm的复合菌剂，所述复合菌剂是带有孢子、菌丝的栽培基质，其中包括根内球囊霉(Glomus intraradices)、摩西球囊霉(Glomus mosseae)和幼套球囊霉(Glomusetunicatum)，所述复合菌剂可在丛枝菌根真菌种质资源库(BGC)进行购买，然后再加入一层厚度为2cm的基质，把高粱苗移栽至消毒塑料盆中作为宿主植物，每盆4-6株，培养4个月的盆栽土即为丛枝菌根真菌菌剂。所述根瘤菌菌剂采用如下方法得到：选择白三叶根瘤菌ACCC18007和苜蓿根瘤菌ACCC17676，先接种到YMA斜面进行活化，然后再25℃条件下恒温培养3d后转于装有YMA培养液的三角瓶中，摇床150转28度振荡48h，培养至对数生长期即可得到液体的根瘤菌菌剂，所述液体的根瘤菌菌剂含菌数为1×10

另外，在步骤D中，所述Hoagland培养液由四水硝酸钙、硝酸钾、硝酸铵、无水磷酸二氢钾、七水硫酸镁、铁盐溶液、微量元素液组成，其组分的含量如下：四水硝酸钙1180mg·L

对比实施例1

首先，选取籽粒饱满的白三叶(海法)种子和苜蓿(WL168)种子；接着，将选取的白三叶(海法)种子和苜蓿(WL168)种子先浸泡于75％的乙醇1min，用蒸馏水冲洗干净后，再浸泡在5％的次氯酸钠2min，然后用蒸馏水冲洗干净置于灭菌的蛭石上进行萌发培养，在培养过程中，每隔2天浇一次水，确保水分充足，至牧草种子出苗后并继续培养25天得到白三叶和苜蓿幼苗，接下来将白三叶和苜蓿幼苗移栽至若干个花盆内，首先，选取地面以下15cm的土壤并经过筛网过滤，接着将过滤后的土壤与河沙按照重量比为1：3的比例混合用经过高温灭菌处理并冷却后作为基质，然后向每个花盆中装入花盆体积2/3的基质，接着将白三叶和苜蓿幼苗分别移栽至每个花盆内，每个花盆内移栽的白三叶或苜蓿幼苗数量均相同且长势相同，最后将移栽有牧草幼苗的花盆置于在温室中培养，采用随机排列法，每两周换位一次，采用自然光照，白天温度为20-30，晚上温度为15-25℃，在温室中培养的过程中，前期浇水两天一次，后期3天一次，确保水分充足；移栽一周内观察牧草幼苗生长情况，若出现幼苗死亡，则选取生长良好的同种牧草幼苗进行替换；在温室中培养1个月后每周补充1次Hoagland培养液。在生长季末收获植株并从基径处分开，将两部分分别在105℃条件下杀青30min，然后置于70℃烘干至恒重后测定地上生物量。用清水小心冲洗植物根系，注意保存根系和根瘤的完整性。用镊子将根系根瘤小心摘下，记录单株有效根瘤数及总根瘤数。分别使用钼锑抗吸光光度法、凯氏定氮法来测定全磷、全氮含量。

对比实施例2

首先，选取籽粒饱满的白三叶(海法)种子和苜蓿(WL168)种子；接着，将选取的白三叶(海法)种子和苜蓿(WL168)种子先浸泡于75％的乙醇1min，用蒸馏水冲洗干净后，再浸泡在5％的次氯酸钠2min，然后用蒸馏水冲洗干净置于灭菌的蛭石上进行萌发培养，在培养过程中，每隔2天浇一次水，确保水分充足，至牧草种子出苗后并继续培养25天得到白三叶和苜蓿幼苗，接下来将白三叶和苜蓿幼苗分别移栽至若干个花盆内，首先，选取地面以下15cm的土壤并经过筛网过滤，接着将过滤后的土壤与河沙按照重量比为1：3的比例混合用经过高温灭菌处理并冷却后作为基质，然后向每个花盆中装入花盆体积2/3的基质并在基质表面铺撒一层丛枝菌根真菌复合菌剂，再覆盖2cm后的基质，接着将白三叶和苜蓿幼苗分别移栽至每个花盆内，每个花盆内移栽的白三叶或苜蓿幼苗数量均相同且长势相同，最后将移栽有牧草幼苗的花盆置于在温室中培养，采用随机排列法，每两周换位一次，采用自然光照，白天温度为20-30，晚上温度为15-25℃，在温室中培养的过程中，前期浇水两天一次，后期3天一次，确保水分充足；移栽一周内观察牧草幼苗生长情况，若出现幼苗死亡，则选取生长良好的同种牧草幼苗进行替换；在温室中培养1个月后每周补充1次Hoagland培养液。在生长季末收获植株并从基径处分开，将两部分分别在105℃条件下杀青30min，然后置于70℃烘干至恒重后测定地上生物量。用清水小心冲洗植物根系，注意保存根系和根瘤的完整性。用镊子将根系根瘤小心摘下，记录单株有效根瘤数及总根瘤数。分别使用钼锑抗吸光光度法、凯氏定氮法来测定全磷、全氮含量。

对比实施例3

首先，选取籽粒饱满的白三叶(海法)种子和苜蓿(WL168)种子；接着，将选取的白三叶(海法)种子和苜蓿(WL168)种子先浸泡于75％的乙醇1min，用蒸馏水冲洗干净后，再浸泡在5％的次氯酸钠2min，然后用蒸馏水冲洗干净置于灭菌的蛭石上进行萌发培养，在培养过程中，每隔2天浇一次水，确保水分充足，至牧草种子出苗后并继续培养25天得到白三叶和苜蓿幼苗，接下来将白三叶和苜蓿幼苗分别移栽至若干个花盆内，首先，选取地面以下15cm的土壤并经过筛网过滤，接着将过滤后的土壤与河沙按照重量比为1：3的比例混合用经过高温灭菌处理并冷却后作为基质，然后向每个花盆中装入花盆体积2/3的基质，接着将白三叶和苜蓿幼苗分别移栽至每个花盆内，每个花盆内移栽的白三叶或苜蓿幼苗数量均相同且长势相同，最后用注射器吸取根瘤菌菌剂按照每株牧草幼苗植物2ml的量接种根瘤菌，最后将移栽有牧草幼苗的花盆置于在温室中培养，采用随机排列法，每两周换位一次，采用自然光照，白天温度为20-30，晚上温度为15-25℃，在温室中培养的过程中，前期浇水两天一次，后期3天一次，确保水分充足；移栽一周内观察牧草幼苗生长情况，若出现幼苗死亡，则选取生长良好的同种牧草幼苗进行替换；在温室中培养1个月后每周补充1次Hoagland培养液。在生长季末收获植株并从基径处分开，将两部分分别在105℃条件下杀青30min，然后置于70℃烘干至恒重后测定地上生物量。用清水小心冲洗植物根系，注意保存根系和根瘤的完整性。用镊子将根系根瘤小心摘下，记录单株有效根瘤数及总根瘤数。分别使用钼锑抗吸光光度法、凯氏定氮法来测定全磷、全氮含量。

实施例4

首先，选取籽粒饱满的白三叶(海法)种子和苜蓿(WL168)种子；接着，将选取的白三叶(海法)种子和苜蓿(WL168)种子先浸泡于75％的乙醇1min，用蒸馏水冲洗干净后，再浸泡在5％的次氯酸钠2min，然后用蒸馏水冲洗干净置于灭菌的蛭石上进行萌发培养，在培养过程中，每隔2天浇一次水，确保水分充足，至牧草种子出苗后并继续培养25天得到白三叶和苜蓿幼苗，接下来将白三叶和苜蓿幼苗分别移栽至若干个花盆内，首先，选取地面以下15cm的土壤并经过筛网过滤，接着将过滤后的土壤与河沙按照重量比为1：3的比例混合用经过高温灭菌处理并冷却后作为基质，然后向每个花盆中装入花盆体积2/3的基质并在基质表面铺撒一层丛枝菌根真菌复合菌剂，再覆盖2cm后的基质，接着将白三叶和苜蓿幼苗分别移栽至每个花盆内，每个花盆内移栽的白三叶或苜蓿幼苗数量均相同且长势相同，最后用注射器吸取根瘤菌菌剂按照每株牧草幼苗植物2ml的量接种根瘤菌，最后将移栽有牧草幼苗的花盆置于在温室中培养，采用随机排列法，每两周换位一次，采用自然光照，白天温度为20-30，晚上温度为15-25℃，在温室中培养的过程中，前期浇水两天一次，后期3天一次，确保水分充足；移栽一周内观察牧草幼苗生长情况，若出现幼苗死亡，则选取生长良好的同种牧草幼苗进行替换；在温室中培养1个月后每周补充1次Hoagland培养液。在生长季末收获植株并从基径处分开，将两部分分别在105℃条件下杀青30min，然后置于70℃烘干至恒重后测定地上生物量。用清水小心冲洗植物根系，注意保存根系和根瘤的完整性。用镊子将根系根瘤小心摘下，记录单株有效根瘤数及总根瘤数。分别使用钼锑抗吸光光度法、凯氏定氮法来测定全磷、全氮含量。

通过实验设计是否添加丛枝菌根真菌(+AMF，-AMF)和根瘤菌(+R，-R)形成4个实验处理：对比实施例1为不添加AMF和根瘤菌(-AMF/-R)，对比实施例2为添加AMF不添加根瘤菌(+AMF/-R)，对比实施例3为添加根瘤菌不添加AMF(-AMF/+R)，实施例4为添加AMF和根瘤菌(+AMF/+R)。图1为四个实施例对苜蓿地上生物量的影响；图2为四个实施例对苜蓿地上部磷含量的影响；图3为四个实施例对苜蓿地上部氮含量的影响，图4为四个实施例对苜蓿结瘤数的影响；图5为四个实施例对白三叶地上生物量的影响，图6为四个实施例对白三叶根瘤数的影响。

由图1-图6可知，与未接种相比，接种AMF和根瘤菌显著提高了苜蓿地上、地下生物量，并且接种AMF和根瘤菌显著增加地上部氮、磷含量，促进苜蓿的结瘤，证明了接种AMF和根瘤菌对于豆科植物的养分吸收具有积极作用。相比未接种处理，接种AMF和根瘤菌为白三叶生长及结瘤固氮创造有利的条件，提高了白三叶的地上生物量，显著促进了白三叶的结瘤，增加了土壤中可利用的氮磷营养，可降低植物间的种间养分竞争强度，从而提高群落的多样性和稳定性，可提高空间土壤肥料利用率，促进豆科固氮，并且有很大一部分氮素通过菌丝网络向相邻非固氮植物传递，从而为整个植物群落贡献氮素，协助宿主植物吸收土壤养分，丛枝菌根、根瘤能疏松土壤、消除土壤板结、改善土壤结构，可以减少化肥、农药用量，防止人工施用化学氮肥的流失，降低环境污染，保护生态安全，并且相比化肥利用率更高、作用时间长，简单易行，且能够增加土壤的有机质及养分含量、改良培肥土壤，减少温室气体的排放，从而促进草地农业生态系统的良性循环，进而促进整个草地生产量和品质的提高，为家畜提供提供优良牧草

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可以利用上述的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的变动和修饰，均属于本发明技术方案保护的范围内。