一种大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas12a检测用引物组合物和检测方法

摘要

本发明提供了一种大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas12a检测用引物组合物和检测方法。该引物组合物包括MIRA扩增引物和crRNA；MIRA扩增引物包括选自核苷酸序列为SEQ ID No.1～2的一条引物和选自核苷酸序列为SEQ ID No.3～5中的一条引物；crRNA的核苷酸序列为SEQ ID No.6。采用该引物组合物的大肠杆菌O157:H7的检测方法速度快、灵敏度高、特异性强，且操作简单，反应结果易于观察，适合于现场快速检测，可以为监管部门对上市产品的监督检查和突发事件处理提供快速的筛查结果。本发明首次设计、筛选到大肠杆菌O157:H7的MIRA扩增引物，优化了CRISPR/Cas12a的检测体系，结合Fe3O4@PDA@UiO‑66‑NH2的富集功能建立起了大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas12a检测方法，填补了国内外在此检测领域的空白。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种大肠杆菌O157:H7的 CRISPR/Cas12a检测用引物组合物和检测方法。

背景技术

大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)，一种革兰氏阴性菌，是引起人类肠道 疾病甚至死亡的人兽共患病病原体之一。它主要通过食用受污染的肉或肉制品， 特别是牛肉制品传播给人类

以核酸为基础的检测方法，如聚合酶链反应(PCR)、实时PCR(RT-PCR) 等，已广泛应用于食品中病原体的检测，具有灵敏度高、特异性强、检测限低等 特点。Rubén Gordillo等建立了一种基于fliC

成簇的规则间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)技术在临床诊断中显示出巨大的应用前景，引起 了广泛关注。基于RNA的CRISPR/Cas核酸检测迅速发展起来，其中Cas12a反式 切割活性及其在核酸检测中的首次应用《one-hour lowcost multipurpose highly efficient system orHOLMES》于2017年在中国获得发明专利。以Cas12体系的检 测原理为例：Cas12、crRNA(或sgRNA)与靶核酸形成三元复合物后，侧支ssDNA 报告子被反式切割成小片段。通过报告子的量反映靶核酸的量。结合重组酶-聚 合酶扩增(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)技术，研制了基于Cas12a 的DETECTR(DNA Endonuclease-TargetedCRISPR Trans Reporter)检测体系

由于实际样本的复杂性，将目标从样本背景中分离和富集，对于提高检测的 灵敏度和准确性显得尤为重要。近年来，磁分离技术已被广泛应用于细菌、病毒、 蛋白质、有毒化学物质和细胞等特定目标的分离。磁性金属有机骨架材料 (Magnetic metal-organicframeworks，MMOFs)是近年来兴起的一种新型功能纳 米材料，在分离富集方面显示出一定的优势

但目前尚未见MMOFs与CRISPR/Cas12a结合并用于大肠杆菌O157:H7的 检测，更无合适高效的引物用于该领域的CRISPR/Cas12a检测。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题，提供一种速度快、灵敏度高、特异性 强的大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas12a检测用引物组合物及结合免疫MMOFs 高效分离富集的检测方法。

本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案：

本发明的第一方面提供一种大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas12a检测用引 物组合物，包括MIRA扩增引物和crRNA；

其中，MIRA扩增引物包括选自核苷酸序列为SEQ ID No.1～2的一条引物， 和选自核苷酸序列为SEQ ID No.3～5中的一条引物；

crRNA的核苷酸序列为SEQ ID No.6。

进一步地，上述MIRA扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No. 5。

进一步地，上述引物组合物还包括一探针；该探针的序列为5’ -6-FAM-TTATT-BHQ1-3’。

本发明的第二方面是提供包括上述引物组合物的检测大肠杆菌O157:H7的 试剂盒。

进一步地，上述试剂盒还包括Fe

本发明的第三方面是提供采用上述试剂盒的大肠杆菌O157:H7的检测方法， 其采用上述引物组合物、通过MIRA扩增反应的产物作为CRISPR/Cas12a检测 的靶标。

进一步地，上述MIRA扩增反应的条件为37℃-39℃，恒温30min。

进一步优选地，上述MIRA扩增反应的条件为37℃，恒温30min。

进一步地，上述CRISPR/Cas12a的反应体系为：0.6μL crRNA(1μM)、0.8μL Cas12a(1μM)、1.2μL探针(10μM)、1μL MIRA扩增产物，16.4μL 1×NEBuffer 2.1；反应条件为37℃，恒温30min。

进一步地，上述检测方法还包括在扩增核酸之前，采用 Fe

进一步地，上述Fe

步骤一，将三氯化铁、乙酸钠和无水柠檬酸钠溶解于乙二醇中，超声处理至 完全溶解，转移到不锈钢反应釜的聚四氟乙烯内衬中，密封加热；然后冷却至室 温，用磁铁收集所得沉淀物，洗涤，干燥，得到Fe

步骤二，将上述Fe

步骤三，将上述Fe

步骤四，将上述Fe

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

(1)本发明通过CRISPR/Cas12a技术特有的荧光颜色变化检测样品中的大 肠杆菌O157:H7。

(2)本发明方法不受检测条件的限制，可在60min内完成核酸的检测。

(3)本发明对大肠杆菌O157:H7定性检测灵敏度可达到0.9pg·μL

(4)本发明方法操作简单，反应结果易于观察，特异性好，适合于现场快 速检测，可以为监管部门对上市产品的监督检查和突发事件处理提供快速的筛查 结果。

(5)本发明首次设计、筛选到大肠杆菌O157:H7的MIRA扩增引物，优化了 CRISPR/Cas12a的检测体系，结合Fe

附图说明

图1为本发明一实施例中对6对大肠杆菌O157:H7的MIRA扩增引物进行 凝胶电泳(图1A)、CRISPR/Cas12a反应的结果(图1B)及SEQ ID No.1与 SEQ ID No.5和SEQ ID No.2与SEQ ID No.5两对引物的CRISPR/Cas12a反应 优化结果(图1C)；其中，在图1A和图1B中，a：大肠杆菌(ATCC25922)； b：大肠杆菌O157:H7(CICC 21530)；c：大肠杆菌O111；d：铜绿假单胞菌；1-6 分别代表6对引物(SEQ ID No.1与SEQ ID No.3、SEQ ID No.1与SEQ ID No.4、SEQ ID No.1与SEQ ID No.5、SEQ ID No.2与SEQ ID No.3、SEQ ID No.2 与SEQ ID No.4和SEQ ID No.2与SEQ ID No.5)；在图1C中，1、2、3、4 分别代表探针(1μM)的体积为0.4、0.8、1.2、2.0μL，“+”和“-”分别代表 扩增模板为大肠杆菌O157:H7的DNA和无菌水，a和b分别代表SEQ ID No.1 与SEQ ID No.5引物对、SEQ ID No.2与SEQ ID No.5引物对)；

图2为本发明一实施例中大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas12a反应体系的 优化图；其中，a：Cas12a(Cpf1)；b：crRNA；c：探针(1-8分别代表0.6、 0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0μL)；

图3为本发明一实施例中大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas12a反应体系 DNA浓度的检测灵敏度结果图；其中，a：MIRA凝胶电泳结果；b：RT-PCR；c： CRISPR/cas12a；

图4为本发明一实施例中大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas12a反应体系细 菌浓度的检测灵敏度结果图；其中，a：MIRA凝胶电泳结果；b：RT-PCR；c： CRISPR/cas12a；

图5为本发明一实施例中大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas12a体系的检测 特异性结果图；其中，1-21编号指代的菌株见表2；

图6为本发明一实施例中碎牛肉样品中大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas12a 体系的检测结果图；其中，M表示Fe

具体实施方式

本发明提供了一种大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas12a检测用引物组合物， 其包括MIRA扩增引物和crRNA；

其中，MIRA扩增引物包括选自核苷酸序列为SEQ ID No.1～2的一条引物， 和选自核苷酸序列为SEQ ID No.3～5中的一条引物；crRNA的核苷酸序列为SEQ ID No.6。

此外，上述引物组合物还包括一探针；该探针的序列为5’ -6-FAM-TTATT-BHQ1-3’。

另一方面，本发明提供了包括上述引物组合物的检测大肠杆菌O157:H7的 试剂盒。

在本发明一优选的实施例中，上述试剂盒还包括Fe

在本发明一优选的实施例中，上述Fe

(1)2.43g三氯化铁、6g乙酸钠和0.877g无水柠檬酸钠溶解于200mL乙二醇 中。超声处理30min，完全溶解后，转移到不锈钢反应釜的聚四氟乙烯内衬中， 在200℃下密封并加热10h。冷却至室温后，用磁铁收集所得沉淀物，无水乙醇 和水交替洗涤三次，在80℃干燥6h，得到Fe

(2)将1g Fe

(3)将0.1g Fe

(4)0.05g Fe

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理 解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使 用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。除非另行定义，文中所使用的所有专 业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相 似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。

实施例1

本实施例提供基于CRISPR/Cas12a的大肠杆菌O157:H7的检测方法，其包 括如下步骤：

1.引物的制备：从GenBank获得的大肠杆菌O157:H7的rfbE基因序列 (GenebankNo.S83460.1)；用引物5.0设计了MIRA引物；引物长度在29～34bp 之间。所用引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。针对靶序列设计 了5条MIRA引物(包括两条正义链(F1和F2)和三条反义链(R1、R2和R3)) 及1条crRNA序列，其核苷酸序列列于表1。其中，采用这6对MIRA扩增引 物进行扩增和凝胶电泳，扩增的结果如图1所示。

表1.CRISPR/Cas12a技术所用引物信息

2.采用Fe

3.提取待测样本中的DNA，进行MIRA扩增反应。其中，MIRA扩增体系 采用潍坊安普未来生物科技有限公司的DNA恒温快速扩增试剂盒(基础型)试 剂盒(产品编号：WLN8203KIT)；MIRA扩增体系的具体配置为10μM的F1 和R3各2μL；29.4μL缓冲液A；2μL DNA模板；12.1μL双蒸水；2.5μL缓冲 液B；MIRA扩增反应条件为：37℃恒温30min。

4.向反应管中加入探针、Cas12a蛋白、crRNA和MIRA扩增产物以及检测 试剂，在荧光定量PCR仪上进行CRISPR反应(反应条件为37℃恒温30min)， 每30s测定一次荧光值。其中，发明人对CRISPR/Cas12a反应体系进行了优化， 如图2所示，经验证，CRISPR/Cas12a检测体系经过优化后具体配置为0.8μL cas12a(1μM)，0.6μL crRNA(1μM)，1.2μL探针(10μM)，1μL MIRA产物，16.4μL 1×NEBuffer 2.1。

本发明人采用上述步骤2～4，分别利用上述6对引物对大肠杆菌(ATCC25922)、 大肠杆菌O157:H7(CICC 21530)、大肠杆菌O111和铜绿假单胞菌进行扩增，然 后用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1A所示。然后再进行CRISPR反应， 得到的检测结果如图1B所示。根据图1A和图1B的结果筛选出SEQ ID No.1 与SEQ ID No.5和SEQ ID No.2与SEQ ID No.5两对引物进一步进行 CRISPR/Cas12a反应，结果如图1C所示。由图1C可知，用上述两对引物在 CRISPR/Cas12a体系的优化过程中发现，SEQ ID No.1与SEQ ID No.5的特异性 更好，假阳性率更低。

验证实施例1

本实施例检测实施例1提供的检测方法的特异性和灵敏度，具体操作和结果 如下：

特异性试验

通过对4株大肠杆菌O157:H7菌种和17株其他细菌菌种进行检测(见表2)。 按如下列原则判定CRISPR/Cas12a检测结果。

结果判断为阳性反应的现象为：采用罗氏诊断公司的实时定量PCR仪LightCycler 480II进行实时荧光检测；或采用美国Invitrogen公司的E-Gel SafeImager

1)若荧光值＞0或肉眼可见有荧光，判定CRISPR/Cas12a测试结果为阳性；

2)若荧光值＝0或肉眼不可见有荧光，判定CRISPR/Cas12a测试结果为阴性；

引物SEQ ID No.1与SEQ ID No.5在全部4株大肠杆菌O157:H7菌种中均 显示阳性反应，且采用罗氏诊断公司的实时定量PCR仪Light Cycler 480II进行 实时荧光检测荧光值大于0，采用美国Invitrogen公司的E-Gel SafeImager

表2.试验用菌种及CRISPR/Cas12a检测结果

其中：CICC指中国工业微生物菌种保藏管理中心；CMCC指中国医学微生 物菌种保藏管理中心；ATCC指美国标准菌株保藏中心；ST指中国食品药品检 定研究院提供。

灵敏度试验

将大肠杆菌O157:H7菌种接种于mEC+n液体培养基中，培养48h后，取1mL 用无菌水溶液制成10倍系列梯度稀释液，按潍坊安普未来生物科技有限公司的超 快速通用型DNA核酸释放剂(产品编号：WLDR8202)提取DNA，作为细菌浓 度灵敏度检测的模板。取mEC+n培养的菌液1mL，按潍坊安普未来生物科技有 限公司的超快速通用型DNA核酸释放剂提取DNA，采用艾本德核酸蛋白测定仪 (Eppendorf Hellma TrayCell)测定DNA浓度，并对该DNA进行10倍系列梯度稀 释，作为DNA浓度灵敏度检测的模板。本发明的CRISPR/Cas12a测试方法对上述 DNA样本进行测定。同时，另取各稀释级的菌液0.1mL分别涂布于TSA琼脂培养 基上，培养48h，计数平板上生长的菌落数。

当DNA浓度≥0.9pg·μL

因此，本发明所采用的CRISPR/Cas12a检测方法定性试验的检测灵敏度可以 达到0.9pg·μL

验证实施例2

本实施例测试实施例1中提供的CRISPR/Cas12a方法在碎牛肉实际样品检 测中的效果，在市场上选取了1种碎牛肉产品进行检测。具体的检测过程和结果 如下：

样品的制备：按照国标方法GB 4789.36-2016《食品微生物学检验大肠埃希 氏菌O157:H7/NM检验》中的方法称取两份25g碎牛肉接种于225mL mEC+n液体 培养基中，其中一份接种14CFU·mL

采用实施例1中的Fe

检测结果显示添加了大肠杆菌O157:H7的样品CRISPR/Cas12a检测实时荧光 均有扩增曲线，且荧光值＞0，肉眼可见荧光，判定为阳性。在不添加大肠杆菌 O157:H7的样品中荧光值＝0，肉眼不可见荧光，判定为阴性样品。且通过 Fe

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不 限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的 等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围 下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

参考专利

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序列表

<110> 上海市食品药品检验所

<120> 一种大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas12a检测用引物组合物和检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

aacatatcga tagacagtta aatataagag 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

aatgaaatat ataccagttt accaaccgtc 30

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atgtcagtgt tggaacaata acttcatctc c 31

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ttatagcatt aactgatgct atatatgtc 29

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tttgccaagt ttcattatct gaatcaacg 29

<210> 6

<211> 44

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ggguaauuuc uacuaagugu agauccaacc gucauugaca ggaa 44