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用于检测细胞线粒体自噬的双荧光蛋白定位检测系统及应用

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本发明一种用于检测细胞线粒体自噬的双荧光蛋白定位检测系统，所述检测系统至少包括：（1）荧光蛋白A和指示蛋白A组成的融合蛋白；（2）荧光蛋白B和指示蛋白B组成的融合蛋白；所述荧光蛋白A和荧光蛋白B的荧光颜色不同，所述指示蛋白A用于指示自噬小体，所述指示蛋白B用于指示线粒体。本发明为观察线粒体自噬的研究提供了更加快速、便利和准确的途径。是对对线粒体自噬研究的方法学有很好的补充，为线粒体自噬研究方法学开拓了新思路。

著录项

公开/公告号CN112162096A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-01-01

原文格式PDF
申请/专利权人上海生物芯片有限公司;
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申请/专利号CN202010148310.3
发明设计人苏军;王珂;徐祎春;周佳菁;赵英楠;马晓卯;冯晨晨;
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申请日2020-03-05
分类号G01N33/68(20060101);G01N33/533(20060101);C12N15/62(20060101);
代理机构31219 上海光华专利事务所(普通合伙);
代理人朱凌娇;许亦琳
地址 201203 上海市浦东新区中国(上海)自由贸易试验区高科技园区李冰路151号
入库时间 2023-06-19 09:23:00

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于检测细胞线粒体自噬的双荧光蛋白定位检测系统及应用。

背景技术

线粒体作为细胞新陈代谢的“能量工厂”，是细胞三羧酸循环和氧化磷酸化的重要场所。线粒体功能正常与否直接关系到细胞、组织乃至机体损伤情况。所以，受损伤的线粒体必须被有效清除，以保证细胞正常生命活动的进行。而线粒体自噬(Mitophagy) 就是细胞选择性清除损伤线粒体以调节胞内线粒体数量和维持线粒体正常功能的一种动态生理平衡过程。

近年来，线粒体自噬已经成为细胞自噬新开拓的研究方向之一。大量的研究报道发现，线粒体自噬的异常可能与神经退行性疾病，糖尿病和肿瘤的发生有密切关系，也可能参与了红细胞(哺乳动物红细胞没有细胞核和线粒体)的正常发生和成熟过程。所以线粒体自噬不仅在疾病治疗和预防方面，而且在生理代谢和机体正常发育过程中都发挥着重要作用。

但是线粒体自噬的研究方法依然不够完善，目前的线粒体自噬最直观的检测方法是通过电镜观察具体的自噬小体形态或者免疫荧光实验观察自噬小体上关键蛋白Lc3b(microtubule associated protein 1light chain 3beta)是否定位在线粒体上，但是电镜检测过程繁琐且周期长，观察区域有限，免疫荧光的抗体效价要求较高，实验周期长、过程繁琐。现在市场上的线粒体染料只对活细胞染色有效果，对于含有细胞固定、通透的免疫荧光等实验效果很不理想。而且抗体和染料的荧光很容易发生猝灭，拍摄效果不佳。

开发一种新的线粒体自噬检测产品尤为重要。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供用于检测细胞线粒体自噬的双荧光蛋白定位检测系统及应用。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种用于检测细胞线粒体自噬的双荧光蛋白定位检测系统，其特征在于，所述检测系统至少包括：(1)荧光蛋白A和指示蛋白A组成的融合蛋白A；(2)荧光蛋白B和指示蛋白B组成的融合蛋白B；

所述荧光蛋白A和荧光蛋白B的荧光颜色不同，所述指示蛋白A用于指示自噬小体，所述指示蛋白B用于指示线粒体。

本发明第二方面，提供一种多核苷酸，能够编码前述的用于检测细胞线粒体自噬的双荧光蛋白定位检测系统中任一种融合蛋白。

本发明第三方面，提供一种核酸构建体，含有前述的多核苷酸。

本发明第四方面，提供一种宿主细胞，含有前述的核酸构建体或基因组中整合有外源的前述的多核苷酸。

本发明第五方面，提供前述用于检测细胞线粒体自噬的双荧光蛋白定位检测系统、前述的多核苷酸、前述的核酸构建体或前述的宿主细胞，在检测细胞线粒体自噬中的应用。

本发明第六方面，提供一种细胞线粒体自噬的检测方法，至少包括如下步骤：

(1)将前述的用于检测细胞线粒体自噬的双荧光蛋白定位检测系统在待测细胞中表达；

(2)培养步骤(1)得到的待测细胞，观察融合蛋白A和融合蛋白B的共定位情况，以判断细胞是否发生线粒体自噬和/或线粒体自噬水平。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的用于检测细胞线粒体自噬的双荧光蛋白定位检测系统及用途，有效解决了目前线粒体自噬研究手段的繁琐操作过程。本发明通过构建融合红色荧光的Mcherry-Lc3b质粒指示自噬小体，同时构建另一种间接参与线粒体自噬过程且融合绿色荧光蛋白的线粒体内膜蛋白PHB1-GFP用于指示线粒体，转染至细胞并观察两种融合荧光蛋白的共定位情况判断细胞是否发生线粒体自噬以及线粒体自噬水平，为观察线粒体自噬的研究提供了更加快速、便利和准确的途径。是对对线粒体自噬研究的方法学有很好的补充，为线粒体自噬研究方法学开拓了新思路。

附图说明

图1-1pcDNA3.1(+)-Mcherry-MCS融合表达质粒图谱。

图1-2pcDNA3.1(+)-Mcherry-MCS融合表达质粒荧光表达图。

图1-3pcDNA3.1(+)-Mcherry-MCS融合表达质粒测序序列比对。

图2-1pcDNA3.1(+)-Mcherry-Lc3b融合表达质粒图谱。

图2-2pcDNA3.1(+)-Mcherry-Lc3b融合表达质粒荧光图(图中，左图DAPI(细胞核染料) 染色显示的是细胞核，中图显示Mcherry-Lc3b的融合蛋白在细胞中的表达情况，右图显示二者叠加后的效果图)。

图2-3pcDNA3.1(+)-Mcherry-Lc3b融合表达质粒测序序列比对。

图3-1pcDNA3.1(+)-PHB1-EGFP融合表达质粒图谱。

图3-2pcDNA3.1(+)-PHB1-EGFP融合表达质粒线粒体定位荧光图(图中，这里左上图DAPI (细胞核染料)染色显示的是细胞核位置，右上图显示PHB1-GFP融合蛋白在细胞中的表达情况，右下图是Mito-Red染色(线粒体染料)显示线粒体的位置，而右下图是前三个图的叠加后的效果图(如图所示红色与绿色完全重合，显示黄色，指示发生了共定位))。图3-3pcDNA3.1(+)-Mcherry-Lc3b融合表达质粒测序序列比对。

图4-1营养条件下Hela细胞内Mcherry-Lc3b融合荧光蛋白表达(图中，这里左上图DAPI (细胞核染料)染色显示的是细胞核位置，右上图显示Mcherry-Lc3b融合蛋白在细胞中的表达情况(即细胞中自噬发生情况)，右下图是二者叠加后的荧光效果图；右下图是整体叠加图的局部放大图(可以比较清晰地看出细胞中的Lc3b颗粒数))。

图4-2饥饿条件下Hela细胞内Mcherry-Lc3b融合荧光蛋白表达(图中，这里左上图DAPI (细胞核染料)染色显示的是细胞核位置，右上图显示Mcherry-Lc3b融合蛋白在细胞中的表达情况(即细胞中自噬发生情况)，右下图是二者叠加后的荧光效果图；右下图是整体叠加图的局部放大图(可以比较清晰地看出细胞中的Lc3b稀释颗粒数))。

图5-1正常培养条件，共转Mcherry-Lc3b和PHB1-EGFP融合表达质粒的Hela细胞内荧光成像图(图中，左上图DAPI(细胞核染料)染色显示的是细胞核位置，右上图显示PHB1-GFP 融合蛋白在细胞中的定位情况(即线粒体定位)，左下图是Mcherry-Lc3b融合蛋白定位情况(即细胞中自噬发生情况)由右下图前三者叠加后的荧光效果图；最下图是整体叠加图的局部放大图)。

图5-2线粒体自噬诱导剂条件下，共转Mcherry-Lc3b和PHB1-EGFP融合表达质粒的Hela 细胞内荧光成像图。(图中，左上图DAPI(细胞核染料)染色显示的是细胞核位置，右上图显示PHB1-GFP融合蛋白在细胞中的定位情况(即线粒体定位)，左下图是Mcherry-Lc3b融合蛋白定位情况(即细胞中自噬发生情况)由右下图前三者叠加后的荧光效果图；最下图是整体叠加图的局部放大图。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

本发明一实施例的用于检测细胞线粒体自噬的双荧光蛋白定位检测系统，至少包括：(1) 荧光蛋白A和指示蛋白A组成的融合蛋白A；(2)荧光蛋白B和指示蛋白B组成的融合蛋白B；

所述荧光蛋白A和荧光蛋白B的荧光颜色不同，所述指示蛋白A用于指示自噬小体，所述指示蛋白B用于指示线粒体。

进一步的，所述指示蛋白A选自Lc3b蛋白。

可选的，所述指示蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；具体的：请给出 MPSEKTFKQRRTFEQRVEDVRLIREQHPTKIPVIIERYKGEKQLPVLDKTKFLVPDHVNMS ELIKIIRRRLQLNANQAFFLLVNGHSMVSVSTPISEVYESEKDEDGFLYMVYASQETFGMK LSV

和/或，所述指示蛋白B选自PHB1蛋白。

可选的，所述指示蛋白B的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；具体的：

MAAKVFESIGKFGLALAVAGGVVNSALYNVDAGHRAVIFDRFRGVQDIVVGEGTHFLIP WVQKPIIFDCRSRPRNVPVITGSKDLQNVNITLRILFRPVASQLPRIFTSIGEDYDERVLPSIT TEILKSVVARFDAGELITQRELVSRQVSDDLTERAATFGLILDDVSLTHLTFGKEFTEAVEA KQVAQQEAERARFVVEKAEQQKKAAIISAEGDSKAAELIANSLATAGDGLIELRKLEAAE DIAYQLSRSRNITYLPAGQSVLLQLPQ。

PHB1蛋白是(prohibitin-1)间接作用于自噬蛋白Lc3b(microtubule associatedprotein 1 light chain 3beta)且定位于线粒体内膜上的保守蛋白分子，其本身需要依赖PHB2

(prohibitin-2)作用才会与LC3b(microtubule associated protein 1lightchain 3beta)发生作用，所以不会主动诱发线粒体自噬。

荧光蛋白A、荧光蛋白B可以为各种颜色，采用各种现有技术中的荧光蛋白皆可。例如， GFP、YFP、RFP、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)或紫草素叶绿素(PerCP)等。

优选的，所述荧光蛋白A、荧光蛋白B的颜色优选为互补色或对比色，便于区分。对比色即为在24色色相环中，间隔120度的颜色。互补色即为24色色相环中，间隔180度的颜色。例如橙色和蓝色，红色和绿色，黄色和紫色。

进一步的，所述荧光蛋白A、荧光蛋白B为红色荧光蛋白或绿色荧光蛋白。

优选的，所述荧光蛋白A为红色荧光蛋白，荧光蛋白B为绿色荧光蛋白。色差明显且荧光稳定。

进一步优选的，所述红色荧光蛋白选自Mcherry蛋白，所述绿色荧光蛋白选自EGFP蛋白。

具体的，所述荧光蛋白A的氨基酸序列为如SEQ ID NO：12所示：

MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPL PFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSL QDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGG HYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELY K。

所述荧光蛋白B的氨基酸序列为SEQ ID NO：13所示：

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPT LVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDT LVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQL ADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELY K。

选用Mcherry融合Lc3b(microtubule associated protein 1light chain3beta)，不会因为溶酶体酸性环境而使EGFP荧光衰减，影响观察细胞内真实的自噬情况。根据两种融合荧光蛋白的共定位情况，可以直观地判断细胞是否发生线粒体自噬以及线粒体自噬水平。

本发明一实施例的多核苷酸，能够编码前述的用于检测细胞线粒体自噬的双荧光蛋白定位检测系统中任一种融合蛋白。

本发明一实施例的核酸构建体，含有前述的多核苷酸。

所述核酸构建体可以是将编码前述融合蛋白的基因片段克隆入已知载体获得。

可选的，已知载体为质粒。所述载体可以为哺乳动物细胞过表达质粒。例如，pcDNA3.1- (+)，pcDNA3.1-(-)等。

优选的，本发明实施例所示，所述载体选自pcDNA3.1(+)载体。

本发明一实施例的宿主细胞，含有前述的核酸构建体或基因组中整合有外源的如前所述的多核苷酸。

任何适用于核酸构建体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如，高等真核细胞，如哺乳动物细胞等。

前述的用于检测细胞线粒体自噬的双荧光蛋白定位检测系统、多核苷酸、核酸构建体或宿主细胞，可以应用于检测细胞线粒体自噬。

宿主细胞可以是哺乳动物细胞。具体的如CHO、COS.293细胞、Hela细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明一实施例的细胞线粒体自噬的检测方法，至少包括如下步骤：

(1)将前述的用于检测细胞线粒体自噬的双荧光蛋白定位检测系统在待测细胞中表达；

(2)培养步骤(1)得到的待测细胞，观察融合蛋白A和融合蛋白B的共定位情况，以判断细胞是否发生线粒体自噬和/或线粒体自噬水平。

具体的，若融合蛋白A和融合蛋白B发生共定位，则发生线粒体自噬；若融合蛋白A和融合蛋白B未发生共定位，则未发生线粒体自噬。

在一种实施方式中，可以分别构建前述检测系统中的融合蛋白的核酸构建体，将核酸构建体导入宿主细胞中，使融合蛋白表达。

所述核酸构建体可以是将编码前述融合蛋白的基因片段克隆入已知载体获得。

可选的，已知载体为质粒。所述已知载体为能够在真核细胞中表达的载体。具体的，所述载体可以为哺乳动物细胞过表达质粒。例如，pcDNA3.1-(+)，pcDNA3.1-(-)等。

优选的，本发明实施例所示，所述载体选自pcDNA3.1(+)载体。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述核酸构建体。这些方法包括重组DNA技术、DNA合成技术等。可将编码所述融合蛋白的DNA有效连接到载体中的多克隆位点上，以指导mRNA合成进而表达蛋白，或者用于同源重组。

可以通过本领域常规的方法将所述核算构建体导入到待测细胞中。例如采用脂质体转染法)、电穿孔法或病毒感染法等。

所述待测细胞是含有线粒体的哺乳动物细胞。具体的如CHO、COS.293细胞、Hela细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

在一种实施方式中，所述方法还包括以下步骤；向所述待测细胞中加入线粒体自噬诱导剂。可以加入到培养所述宿主细胞的培养基中。

线粒体自噬诱导剂可以是Salidroside等。

所述线粒体自噬诱导剂是在转染融合蛋白质粒后加入。诱导16h后观察荧光。表达蛋白需要时间，诱导过程与蛋白表达都在发生。

实施例1

利用pcDNA3.1(+)空载质粒，设计Mcherry引物，PCR产物割胶回收，构建 pcDNA3.1(+)-Mcherry-MCS融合表达质粒，酶切鉴定、测序比对、表达鉴定。

以PcDNA3.1-Tom20-Mcherry质粒的序列为模板(去除TAA终止密码子)，选用pcDNA3.1(+) 空载质粒上的HindⅢ和BamhⅠ两个酶切位点，利用Primer 5软件设计Mcherry引物，并且在正反向引物的5’端加上相应的酶切位点序列(HindⅢ：

Mcherry-HindⅢ-F：CCC

Mcherry-BamhⅠ-R：CG

PCR反应50μL体系后1％琼脂糖凝胶电泳回收目的片段(725bp)，经HindⅢ和BamhⅠ在37℃水浴双酶切2h后，再次1％琼脂糖凝胶电泳回收目的片段(718bp)。同样 pcDNA3.1(+)空载质粒也经HindⅢ和BamhⅠ在37℃水浴双酶切2h，片段和载体经过T4 DNA连接酶在16℃下连接过夜。将连接好的片段移至DH5α感受态大肠杆菌中，冰浴5min， 42℃水浴1min后立即冰浴5min，加入600μL空白LB培养基在37℃下摇菌1h，1200rpm 离心3min，弃上清，保留20μL吹匀后涂布到氨苄抗性的LB培养板上，37℃过夜培养14h。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，选取阳性克隆菌落扩大培养，抽提质粒，测序比对验证，转染Hela细胞完成表达验证。实验结果显示，pcDNA3.1(+)-Mcherry-MCS融合表达质粒转染后顺利表达红色荧光蛋白，且测序结果比对成功，无突变碱基。具体实验结果详见图1-1。图1-2，100X荧光镜检发现Mcherry红色荧光蛋白在Hela细胞中成功表达。如图1-3所示。通过pcDNA3.1-F通用引物测序，利用NCBI Blast质粒测序序列与原始设计序列信息，结果显示序列完全正确、无突变碱基。

具体的，

pcDNA3.1(+)-Mcherry-MCS融合表达质粒Mcherry序列(去除终止密码子)：

实施例2

利用pcDNA3.1(+)-Mcherry-MCS融合表达质粒，并设计LC3B全长引物，以人肺腺癌细胞株A549的cDNA为模板，PCR产物割胶回收，构建pcDNA3.1(+)-Mcherry-Lc3b融合表达质粒，酶切鉴定、测序比对验证、表达鉴定。

参考Homo sapiens microtubule associated protein 1light chain 3beta(NCBI Reference Sequence:NM_022818.5)CDS编码区序列信息，以人的肺腺癌细胞A549的cDNA为模板，选用pcDNA3.1(+)-Mcherry-MCS融合表达质粒上的EcorⅠ和XbaⅠ两个酶切位点，利用 Primer 5软件设计MAP1LC3B引物，并且保证LC3B不会发生移码突变(在正向引物5’端加上碱基T)，并且在正反向引物的5’端加上相应的酶切位点序列(EcorⅠ：GAATTC， XbaⅠ：TCTAGA)和相应的保护碱基序列(EcorⅠ：G，XbaⅠ：GC)，如下：

LC3B-Ecor1-F:GGAATTCTATGCCGTCGGAGAAGACCTTC；(SEQ ID NO：6)

LC3B-Xba1-R:GCTCTAGATTACACTGACAATTTCATCCCGAAC；(SEQ ID NO：7)

PCR反应50μL体系后1％琼脂糖凝胶电泳回收目的片段(394bp)，经EcorⅠ和Xba Ⅰ在37℃水浴双酶切2h后，再次1％琼脂糖凝胶电泳回收目的片段(389bp)。同样 pcDNA3.1(+)空载质粒也经EcorⅠ和XbaⅠ在37℃水浴双酶切2h，片段和载体经过T4 DNA 连接酶在16℃下连接过夜。将连接好的片段移至DH5α感受态大肠杆菌中，冰浴5min，42℃水浴1min后立即冰浴5min，加入600μL空白LB培养基在37℃下摇菌1h，1200rpm离心 3min，弃上清，保留20μL吹匀后涂布到氨苄抗性的LB培养板上，37℃过夜培养14h。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，选取阳性克隆菌落扩大培养，抽提质粒，测序验证，转染Hela 细胞，用4％多聚甲醛室温固定10min，再用1xPBS清洗2遍，再用0.2％Triton X-100通透液通透室温通透10min，再用1xPBS清洗2遍。利用5ug/mL细胞核染料DAPI (Beyotime,C1002)染色5min后弃去，再用1xPBS清洗细2遍。荧光显微镜拍摄荧光图。实验结果如图2-1、2-2和2-3所示，结果显示，pcDNA3.1(+)-Mcherry-Lc3b融合表达质粒测序结果比对成功，无突变碱基，转染后成功表达自噬蛋白颗粒。具体实验结果详见图2-1 和图2-2，图中箭头所示细胞为转染表达Mcherry-Lc3b融合荧光蛋白Hela细胞，Lc3b呈弥散状，部分细胞含有若干个小颗粒，证明了Mcherry-Lc3b融合蛋白质粒的成功构建和表达。如图2-3所示，通过pcDNA3.1-F通用引物测序，利用NCBI Blast质粒测序序列与原始设计序列信息，结果显示序列完全正确、无突变碱基。

具体的，

pcDNA3.1(+)-Mcherry-Lc3b融合表达质粒Mcherry-Lc3b序列：

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCA AGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGC GAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGG CCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCT ACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTT CAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGG ACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACT TCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCG AGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAG CTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAA GCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCAC AACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACC GGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTATGC CGTCGGAGAAGACCTTCAAGCAGCGCCGCACCTTCGAACAAAGAGTAGAAGATGTCC GACTTATTCGAGAGCAGCATCCAACCAAAATCCCGGTGATAATAGAACGATACAAGGG TGAGAAGCAGCTTCCTGTTCTGGATAAAACAAAGTTCCTTGTACCTGACCATGTCAAC ATGAGTGAGCTCATCAAGATAATTAGAAGGCGCTTACAGCTCAATGCTAATCAGGCCTT CTTCCTGTTGGTGAACGGACACAGCATGGTCAGCGTCTCCACACCAATCTCAGAGGTG TATGAGAGTGAGAAAGATGAAGATGGATTCCTGTACATGGTCTATGCCTCCCAGGAGACGTTCGGGATGAAATTGTCAGTGTAA(SEQ ID NO：8)。

实施例3

利用PcNA3.1-MCS-EGFP融合表达空载质粒，设计PHB1全长引物，以人肺腺癌细胞株A549的cDNA为模板，PCR产物割胶回收，构建pcDNA3.1(+)-PHB1-EGFP融合表达质粒，酶切鉴定、测序比对、表达鉴定。

参考Homo sapiens prohibitin(PHB),transcript variant 2(NCBI ReferenceSequence: NM_002634.4)CDS编码区序列信息(去除终止密码子TGA)，以人的肺腺癌细胞A549的 cDNA为模板，选用pcDNA3.1(+)-MCS-EGFP融合表达空载质粒上的HindⅢ和EcorⅠ两个酶切位点，利用Primer 5软件设计MAP1LC3B引物，并且保证EGFP不会发生移码突变(在反向引物5’端加上碱基C)，并且在正反向引物的5’端加上相应的酶切位点序列(HindⅢ：AAGCTT，EcorⅠ：GAATTC)和相应的保护碱基序列(HindⅢ：CCC，EcorⅠ：G)，如下：

PHB1-Hind3-F：CCCAAGCTTATGGCTGCCAAAGTGTTTGAGTC；(SEQ ID NO：9)

PHB1-Ecor1-R：GGAATTCCCTGGGGCAGCTGGAGGAG；(SEQ ID NO：10)

PCR反应50μL体系后1％琼脂糖凝胶电泳回收目的片段(833bp)，经HindⅢ和EcorⅠ在37℃水浴双酶切2h后，再次1％琼脂糖凝胶电泳回收目的片段(827bp)。同样 pcDNA3.1(+)空载质粒也经HindⅢ和EcorⅠ在37℃水浴双酶切2h，片段和载体经过T4 DNA 连接酶在16℃下连接过夜。将连接好的片段移至DH5α感受态大肠杆菌中，冰浴5min，42℃水浴1min后立即冰浴5min，加入600μL空白LB培养基在37℃下摇菌1h，1200rpm离心 3min，弃上清，保留20μL吹匀后涂布到氨苄抗性的LB培养板上，37℃过夜培养14h。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，选取阳性克隆菌落扩大培养，抽提质粒，测序验证，转染Hela 细胞,利用100nM的Mito-Red染料(Beyotime,C1049)在37℃下孵育25min后弃去，再用 0.1％1xPBST洗涤细胞2遍。再用4％多聚甲醛室温固定10min，再用1xPBS清洗2遍，再用0.2％Triton X-100通透液通透室温通透10min，再用1xPBS清洗2遍。利用5ug/mL细胞核染料DAPI(Beyotime,C1002)染色5min后弃去，再用1xPBS清洗细2遍。荧光显微镜拍摄荧光图。实验结果如图3-1，3-2和3-3，显示，pcDNA3.1(+)-PHB1-EGFP融合表达质粒测序结果比对成功，无突变碱基；且转染后顺利表达PHB1-EGFP融合蛋白。具体实验结果详见图3-1和图3-2，箭头所示Hela细胞中PHB1-EGFP绿色融合荧光蛋白与Mito-Red 线粒体红色荧光准确发生共定位，证明了PHB1-GFP融合蛋白质粒的成功构建和表达，指示该融合蛋白可以用来标记细胞的线粒体位置和形态。图3-3所示，通过pcDNA3.1-F通用引物测序，利用NCBI Blast质粒测序序列与原始设计序列信息，结果显示序列完全正确、无突变碱基。

具体的，

pcDNA3.1(+)-PHB1-EGFP融合表达质粒PHB1-EGFP序列：

ATGGCTGCCAAAGTGTTTGAGTCCATTGGCAAGTTTGGCCTGGCCTTAGCTGTTGCAG GAGGCGTGGTGAACTCTGCCTTATATAATGTGGATGCTGGGCACAGAGCTGTCATCTTT GACCGATTCCGTGGAGTGCAGGACATTGTGGTAGGGGAAGGGACTCATTTTCTCATCC CGTGGGTACAGAAACCAATTATCTTTGACTGCCGTTCTCGACCACGTAATGTGCCAGTC ATCACTGGTAGCAAAGATTTACAGAATGTCAACATCACACTGCGCATCCTCTTCCGGCCTGTCGCCAGCCAGCTTCCTCGCATCTTCACCAGCATCGGAGAGGACTATGATGAGCGT GTGCTGCCGTCCATCACAACTGAGATCCTCAAGTCAGTGGTGGCTCGCTTTGATGCTG GAGAACTAATCACCCAGAGAGAGCTGGTCTCCAGGCAGGTGAGCGACGACCTTACAG AGCGAGCCGCCACCTTTGGGCTCATCCTGGATGACGTGTCCTTGACACATCTGACCTT CGGGAAGGAGTTCACAGAAGCGGTGGAAGCCAAACAGGTGGCTCAGCAGGAAGCAG AGAGGGCCAGATTTGTGGTGGAAAAGGCTGAGCAACAGAAAAAGGCGGCCATCATCT CTGCTGAGGGCGACTCCAAGGCAGCTGAGCTGATTGCCAACTCACTGGCCACTGCAG GGGATGGCCTGATCGAGCTGCGCAAGCTGGAAGCTGCAGAGGACATCGCGTACCAGC TCTCACGCTCTCGGAACATCACCTACCTGCCAGCGGGGCAGTCCGTGCTCCTCCAGCT GCCCCAGGGaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccgggatccaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgcc acctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcg tgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccat cttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcat cgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaa gaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacaccccca tcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcac atggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa(SEQ ID NO：11)

实施例4

利用已构建的pcDNA3.1(+)-Mcherry-Lc3b融合表达质粒，Lipo2000转染Hela细胞，4-6h 换液，饥饿(无血清培养基)处理24h观察细胞内的荧光点数变化。

在24孔板中每孔加入2x10^4个Hela细胞，培养24h后换成OPTI-MEM培养，分别在两管50μL OPTI-MEM中单独加入pcDNA3.1(+)-Mcherry-Lc3b融合表达质粒500ng、1μLLipo2000，各自室温放置5min，再将含有质粒的MEM加入到含有lip2000的MEM中，轻轻吹匀后37℃孵育30min，每10min混匀一下。将其分为两份均匀铺到24孔板中，培养4-6h 后一孔换成10％FBS的DMEM培养基，另一孔换成无血清的DMEM培养基，37℃、5％CO2 培养24h，用4％多聚甲醛室温固定10min，再用1xPBS清洗2遍，再用0.2％Triton X-100 通透液通透室温通透10min，再用1xPBS清洗2遍。利用5ug/mL细胞核染料DAPI (Beyotime,C1002)染色5min后弃去，再用1xPBS清洗细2遍。荧光显微镜拍摄荧光图。荧光显微镜观察拍照两孔细胞内的荧光颗粒数的差异。实验结果如图4-1和图4-2，结果显示，质粒转染后，经饥饿处理的HeLa细胞内的LC3b蛋白表达明显增强，红色颗粒数明显增多，该质粒可以正确指示细胞自噬情况。如图4-1所示，右下方图为左图框出局部放大图，箭头所示Hela细胞在10％FBS营养条件下，胞内Lc3b蛋白颗粒较少，基本呈弥散状均匀分布，显示了营养条件下培养细胞，细胞内的自噬水平，这里用本发明构建的Mcherry-Lc3b 融合蛋白来指示。如图4-2所示，右下方图为左图框出局部放大图，箭头所示Hela细胞在无FBS培养条件下，胞内Lc3b蛋白颗粒较多，基本呈团聚状分布，显示在饥饿条件下培养细胞，细胞内的自噬水平，这里同样用本发明构建的Mcherry-Lc3b融合蛋白来指示。但是对比营养条件下培养细胞的Mcherry-Lc3b荧光图，可以明显看出细胞的自噬的发生水平的差异(已有文献报道饥饿环境能加重自噬)，证明本发明构建的Mcherry-Lc3b融合蛋白确实可以用来观察细胞的自噬水平。

实施例5

利用已构建的pcDNA3.1(+)-PHB1-EGFP融合表达质粒，Lipo2000转染Hela细胞，4-6h 换液，24h后用Mito-Red染色指示线粒体，观察线粒体定位情况。

在24孔板中每孔加入2x10^4个Hela细胞，培养24h后换成OPTI-MEM培养，分别在两管50μL OPTI-MEM中单独加入pcDNA3.1(+)-PHB1-EGFP融合表达质粒250ng、0.5μLLipo2000，各自室温放置5min，再将含有质粒的MEM加入到含有Lipo2000的MEM中，轻轻吹匀后37℃孵育30min，每10min混匀一下。将其分为两份均匀铺到24孔板中，培养 4-6h后换成10％FBS的DMEM培养基，37℃、5％CO

实施例6

利用已构建的pcDNA3.1(+)-Mcherry-Lc3b融合表达质粒和已构建的 pcDNA3.1(+)-PHB1-EGFP融合表达质粒，Lipo2000共转Hela细胞，4-6h换液，24h后观察两种荧光蛋白的共定位情况。

在24孔板中每孔加入2x10^4个Hela细胞，培养24h后换成OPTI-MEM培养，分别在一管50μL OPTI-MEM中加入pcDNA3.1(+)-PHB1-EGFP融合表达质粒125ng和 pcDNA3.1(+)-Mcherry-Lc3b融合表达质粒125ng，另一管50μL OPTI-MEM中加入0.5μ Lipo2000，各自室温放置5min，再将两种含有质粒的MEM加入到含有lip2000的MEM中混合，轻轻吹匀后37℃孵育30min，每10min混匀一下。将其分为两份均匀铺到24孔板中，培养4-6h后一孔换成10％FBS的DMEM培养基，另一孔换成无血清的DMEM培养基且加入终浓度为10μM线粒体自噬诱导剂Salidroside(MCE，HY-N0109)，37℃、5％CO

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 上海生物芯片有限公司

<120> 用于检测细胞线粒体自噬的双荧光蛋白定位检测系统及应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Pro Ser Glu Lys Thr Phe Lys Gln Arg Arg Thr Phe Glu Gln Arg

1 5 10 15

Val Glu Asp Val Arg Leu Ile Arg Glu Gln His Pro Thr Lys Ile Pro

20 25 30

Val Ile Ile Glu Arg Tyr Lys Gly Glu Lys Gln Leu Pro Val Leu Asp

35 40 45

Lys Thr Lys Phe Leu Val Pro Asp His Val Asn Met Ser Glu Leu Ile

50 55 60

Lys Ile Ile Arg Arg Arg Leu Gln Leu Asn Ala Asn Gln Ala Phe Phe

65 70 75 80

Leu Leu Val Asn Gly His Ser Met Val Ser Val Ser Thr Pro Ile Ser

85 90 95

Glu Val Tyr Glu Ser Glu Lys Asp Glu Asp Gly Phe Leu Tyr Met Val

100 105 110

Tyr Ala Ser Gln Glu Thr Phe Gly Met Lys Leu Ser Val

115 120 125

<210> 2

<211> 272

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Ala Lys Val Phe Glu Ser Ile Gly Lys Phe Gly Leu Ala Leu

1 5 10 15

Ala Val Ala Gly Gly Val Val Asn Ser Ala Leu Tyr Asn Val Asp Ala

20 25 30

Gly His Arg Ala Val Ile Phe Asp Arg Phe Arg Gly Val Gln Asp Ile

35 40 45

Val Val Gly Glu Gly Thr His Phe Leu Ile Pro Trp Val Gln Lys Pro

50 55 60

Ile Ile Phe Asp Cys Arg Ser Arg Pro Arg Asn Val Pro Val Ile Thr

65 70 75 80

Gly Ser Lys Asp Leu Gln Asn Val Asn Ile Thr Leu Arg Ile Leu Phe

85 90 95

Arg Pro Val Ala Ser Gln Leu Pro Arg Ile Phe Thr Ser Ile Gly Glu

100 105 110

Asp Tyr Asp Glu Arg Val Leu Pro Ser Ile Thr Thr Glu Ile Leu Lys

115 120 125

Ser Val Val Ala Arg Phe Asp Ala Gly Glu Leu Ile Thr Gln Arg Glu

130 135 140

Leu Val Ser Arg Gln Val Ser Asp Asp Leu Thr Glu Arg Ala Ala Thr

145 150 155 160

Phe Gly Leu Ile Leu Asp Asp Val Ser Leu Thr His Leu Thr Phe Gly

165 170 175

Lys Glu Phe Thr Glu Ala Val Glu Ala Lys Gln Val Ala Gln Gln Glu

180 185 190

Ala Glu Arg Ala Arg Phe Val Val Glu Lys Ala Glu Gln Gln Lys Lys

195 200 205

Ala Ala Ile Ile Ser Ala Glu Gly Asp Ser Lys Ala Ala Glu Leu Ile

210 215 220

Ala Asn Ser Leu Ala Thr Ala Gly Asp Gly Leu Ile Glu Leu Arg Lys

225 230 235 240

Leu Glu Ala Ala Glu Asp Ile Ala Tyr Gln Leu Ser Arg Ser Arg Asn

245 250 255

Ile Thr Tyr Leu Pro Ala Gly Gln Ser Val Leu Leu Gln Leu Pro Gln

260 265 270

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccaagctta tggtgagcaa gggcgagg 28

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgggatccct tgtacagctc gtccatgcc 29

<210> 5

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaag 708

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggaattctat gccgtcggag aagaccttc 29

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctctagatt acactgacaa tttcatcccg aac 33

<210> 8

<211> 1116

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8